PONTIFCIA UNIVERSIDADE CATLICA DO RIO GRANDE DO SUL

FACULDADE DE FARMCIA

RICARDO VIEIRA REICHELT

ESTUDOS DE DEGRADAO FORADA: CONSIDERAES ANALTICAS DA

VALIDAO DE METODOLOGIA NA ANLISE DE MEDICAMENTOS

Porto Alegre
2014

RICARDO VIEIRA REICHELT

ESTUDOS DE DEGRADAO FORADA: CONSIDERAES ANALTICAS DA

VALIDAO DE METODOLOGIA NA ANLISE DE MEDICAMENTOS

Trabalho de concluso de curso apresentado

como requisito para obteno do grau de
Bacharel em Farmcia, pela Pontifcia
Universidade Catlica do Rio Grande do Sul.

Orientador: Prof. Dr. Pablo Machado

Porto Alegre
2014

De um certo ponto adiante no h mais retorno. Esse o ponto que deve ser
alcanado.
Franz Kafka

AGRADECIMENTOS

RESUMO
Palavras-chave:

ABSTRACT
Keywords:.

LISTA DE ABREVIATURAS

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

SUMRIO

1 INTRODUO:
O estudo de estabilidade de insumos um dos itens mais importantes para
garantir a eficcia e a segurana das molculas. Esta segurana determinada pelo
perfil farmacolgico-toxicolgico da substncia, assim como os efeitos adversos
causados por impurezas nos produtos acabados. Guias internacionais como o ICH
foram criados com a inteno de direcionar o trabalho das empresas que
desenvolvem novas drogas e produtos. O conhecimento da estabilidade da molcula
essencial para o desenvolvimento da formulao a ser usada bem como as
condies de estocagem.
O estudo de degradao forada uma ferramenta complementar utilizada
para prevenir problemas de estabilidade, desenvolver mtodos analticos e
identificar rotas de degradao. Alm disso, permite diferenciar produtos de
degradao do ativo daqueles que so gerados na formulao do produto acabado.
As anlises desenvolvidas e validadas devem promover degradao em extenso
suficiente a fim de permitir avaliao da formao de produtos de degradao.
importante salientar que, os produtos de degradao sob condies de estresse
podem ser classificados como potencial, pois podem ou no ser formados sob
condies de estocagem. Jain & Basniwal publicaram uma reviso que descreve os
avanos recentes nos estudos de impurezas em medicamentos entre 2008 e 2012
sob uma perspectiva analtica. O estudo mostra o crescente interesse nas anlises
de degradao forada, as quais tendem a aumentar nos prximos anos devido ao
maior rigor dos rgos reguladores.
No final de 2013, a Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria (ANVISA)
publicou a RDC 58/2013, que estabelece parmetros de notificao, identificao e
qualificao de produtos de degradao em medicamentos. No entanto, assim como
nos guias internacionais, a poltica adotada nos testes de degradao forada da
ANVISA no especifica como conduzir os ensaios em relao preparao das
amostras bem como as condies necessrias para as degradaes. Deve ser
considerada, tambm, a anlise crtica dos perfis de degradao das molculas, as
quais incluem a verificao da pureza cromatogrfica do pico do insumo, balano de
massas e fatores que podem interferir na estabilidade do medicamento.
Este artigo tem como objetivo criar um guia cientfico para auxiliar no
desenvolvimento, execuo e interpretao dos estudos de degradao forada.

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2 Estudos preliminares de degradao forada.

Os estudos de degradao forada so delineados para produzir testes
indicadores de estabilidade em condies extremas e para simular possveis
produtos de degradao durante a produo e estocagem do produto. Segundo a
RDC n 58/2013 as amostras a serem testadas devem ser submetidas s condies
de aquecimento, umidade, hidrlise cida e bsica, oxidao, fotlise e ons
metlicos.
O objetivo atingir, no mnimo, 10% do insumo degradado devendo-se,
porm, estabelecer um limite de degradao, uma vez que, ao estressar em excesso
uma molcula, pode haver a perda dos produtos primrios. Os problemas
relacionados estabilidade encontrados durante o estudo iro formar a base do
desenvolvimento na otimizao do estudo indicador de estabilidade.
A estratgia inicial semelhante para o insumo ativo e o produto acabado. A
estrutura molecular do insumo ativo se torna pea chave no delineamento do estudo,
pois a partir dela podemos deduzir se o composto ir absorver radiao UV para ser
detectada. A presena de grupos funcionais ionizveis fornece uma informao
valiosa na predio do comportamento da molcula.
O mtodo mais utilizado na literatura o de cromatografia lquida de alta
eficincia de fase reversa (RP-HPLC) com detector de arranjo de fotodiodos (PDA).
O mtodo cromatogrfico ideal deve mostrar junto com o insumo ativo principal
todos os produtos de degradao, baseando-se na lei da conservao de massas,
isto , qualquer perda do insumo ativo, em rea cromatogrfica, ser convertida em
produtos de degradao em propores iguais. De fato, torna-se praticamente
impossvel um mtodo cromatogrfico que possa cumprir tais requisitos, por
diversos motivos que sero discutidos no guia sobre balano de massas.
3 Escolha das condies de degradao
A escolha da concentrao inicial do ativo a ser degradada deve ser de 1.0
mg/mL. Se a solubilidade for uma limitao, inerente prpria molcula pode-se
utilizar metanol em quantidades variadas. Testes devem ser realizados nas
concentraes em que o insumo ativo vai estar presente na formulao final. (x)
Outro aspecto prtico que amostras que necessitam de grandes concentraes de
cido, lcali e agentes oxidantes para os testes de estresse, so recomendadas a

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serem reduzidas a nveis tolerveis pela coluna para serem injetados. Recomendase diluio com a fase mvel utilizada.
3.1 Condies de hidrlise cida/bsica
Condies cidas, bsicas e neutras devem ser empregadas para produzir
reaes hidrolticas. Isso especialmente importante quando o composto a ser
testado possui grupos funcionais ionizveis. As reaes de degradao dependem
de uma variedade de fatores como a constante dieltrica, a polaridade do solvente e
a energia de superfcie. A figura 1 mostra um exemplo de delineamento do estudo
hidroltico sob condio cida e bsica.
Muitos

insumos

ativos

apresentam

problemas

de

solubilidade

em

concentraes analticas. Logo, para analisar as caractersticas de hidrlise, pode

ser necessria a adio de um co-solvente para facilitar a dissoluo. Os solventes
mais comuns utilizados nas anlises so o metanol e acetonitrila.
Um cuidado necessrio a ser considerado de que o metanol possui
potencial de participao na qumica de degradao da molcula atuando como
agente nucleoflico, portanto deve ser utilizado com ressalvas. A acetonitrila, por ser
considerada inerte, recomendada. A neutralizao da soluo antes da injeo do
HPLC no recomendada devido possibilidade de precipitao ou de reaes
secundrias.

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Figura 1 - Modelo sugerido para estudos de degradao forada por

hidrlise cida/bsica. * em rea cromatogrfica degradada do insumo ativo.

3.2 Condies de oxidao

Reaes de oxidao so um dos mais comuns mecanismos de degradao
de medicamentos e insumos. Existem trs rotas de degradaes principais a
considerar para testes de estresse: oxidao induzida por radicais, oxidao
mediada por perxidos e oxidao por transferncia de eltrons. As impurezas
presentes sejam no insumo ativo, sejam no produto acabado, so as principais
causas de oxidao nas condies normais de estocagem.
O objetivo principal dos ensaios forados acelerar o processo natural de
oxidao e identificar impurezas que podem ser formadas durante testes acelerados
e de longa durao.
3.2.1 Reaes induzidas por radicais (autoxidao)
As reaes de autoxidao possuem um mecanismo complexo que consiste
em uma reao em cadeia mediada por radicais livres, divididas em trs etapas. A
figura 2 mostra, em termos gerais, o processo de oxidao a partir de um iniciador.

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Figura 2 Sequncia da reao em cadeia mediada por radicais livres

Para formao de radicais livres na simulao de autoxidao so utilizados

compostos nitrogenados (Tabela 1). Originalmente, esta prtica foi sugerida por
Boccardi et al. A molcula mais utilizada e popularmente conhecida a
azobisisobutironitrila (AIBN). Os autores demonstraram que estes iniciadores de
radicais baseados em compostos nitrogenados so capazes de produzir produtos de
degradao primrios observados nos estudos de estabilidade de longa durao.
A Figura 3 mostra o mecanismo de formao de radicais livres atravs do
AIBN. Ao aquecer a amostra a 40C o AIBN expele o nitrognio da sua estrutura
gerando carbonos reativos que rapidamente so oxidados por oxignio molecular,
formando um radical perxi que mimetiza o processo de autoxidao em condies
de estocagem. A quantidade de compostos nitrogenados adicionados deve ser
aproximadamente 10 vezes a concentrao de amostra. A acetonitrila

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Tabela 1 Compostos nitrogenados comumente utilizados para produo

de radicais livres nos testes de degradao forada.
Nome qumico

Estrutura qumica

Solubilidade

em gua

em gua

em gua

em gua

em metanol

em metanol

Figura 3 - Mecanismo de formao de radicais perxidos atravs do AIBN.

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3.2.2 Reaes mediadas por perxidos

As anlises de degradao forada envolvendo perxidos, juntamente com
os estudos com iniciadores de radicais iro formar uma base mais completa da
susceptibilidade da molcula oxidao. O perxido de hidrognio o composto
mais empregado nos testes.
As reaes de oxidao com a utilizao de perxido de hidrognio so
relativamente rpidas temperatura ambiente, logo no necessrio aquecer as
amostras testadas. Ao elevar a temperatura de reao pode ocorrer a formao de
radicais hidroxilas, que so indesejados, pois so mais fortes e no seletivos, que
reagem muito rapidamente em soluo levando a resultados diferentes em relao
ao perxido de hidrognio. A figura 4 mostra a formao de radicais hidroxilas
atravs do calor.
Figura 4 Formao de radicais hidroxila a partir do perxido de hidrognio.

As concentraes de perxido utilizadas nos ensaios podem variar de 0,3 a

30%. Temperaturas de, no mximo, 40C so utilizadas para acelerar a reao. Um
perodo de 24h suficiente para demonstrar a degradao com perxido de
hidrognio. A figura 5 mostra uma sugesto de delineamento de estudo de oxidao.
Quando necessrio estressar uma molcula com perxidos em uma ampla
faixa de pH, deve-se levar em considerao o solvente utilizado. O metanol o
solvente de escolha. A acetonitrila, em solues de pH elevado, reage com o
perxido de hidrognio, formando um radical instvel que no ocorre no processo
natural de oxidao.
Figura 5 Modelo sugerido para degradao forada por oxidao * em rea cromatogrfica
degradada do insumo ativo.

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3.2.3 Reaes de transferncia de eltrons

O mecanismo de oxidao por transferncia de eltrons ocorre na presena
de metais. Forbes et.al demonstrou que a exposio de insumos a metais de
transio tais como cobre e/ou ferro podem levar oxidao. A concentrao de
metal adicionada deve ser de 1 ppm de Cu(II)Cl 2 ou Fe(III)Cl3. A figura 6 mostra o
mecanismo de oxidao do arzoxifeno na presena do on cobre. O on se complexa
com a amina da acetonitrila, utilizada como diluente. Na segunda reao ocorre a
transferncia de eltrons do oxignio da molcula, gerando um radical que ataca a
estrutura interna, formando dmeros.
Figura 6 Oxidao de transferncia de eltrons mediada por metais.

Estes metais podem ser encontrados em vidrarias ou estar presentes em

impurezas dos solventes utilizados nas anlises por HPLC. importante haver um
procedimento padro de limpeza das vidrarias que evitem quaisquer contaminaes
que possam comprometer a qualidade dos ensaios.
4 Condies de fotoestabilidade
A fotoestabilidade de insumos e produtos acabados pode ter impacto sobre
o prazo de validade, manuseio, estocagem e at a segurana do produto devido a
fototoxicidade e fotogenotoxicidade. Em 1998, com a implementao do ICH Q1B,
que define os parmetros para conduo dos estudos de degradao forada, houve

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um avano significativo na padronizao dos procedimentos em relao s outras

condies.
No Brasil, a ANVISA publicou a RDC n 48/2012, que segue os mesmos
padres do ICH para a conduo dos estudos de fotoestabilidade. A molcula deve
ser exposta a uma mistura de UV-B (280-320 nm), UV-A (320-400 nm) e luz visvel
(400-800nm) em propores variadas. No entanto, a absoro de luz pela molcula
no leva, necessariamente, a fotodegradao. Em alguns casos, o excipiente
absorve radiao e transfere a energia para o insumo ativo, podendo gerar
degradao indireta. Os testes devem ser realizados na embalagem primria e
secundria e, quando em soluo, utilizar uma amostra controle, protegida da fonte
de luz. A acetonitrila o solvente indicado, pois o metanol pode produzir artefatos de
degradao a partir de radicais metxi formados devido a exposio luz. A figura 8
mostra um exemplo de fotodegradao e o mecanismo proposto do medicamento
fenoprofeno, a partir da radiao UV. O tempo de exposio deve ser suficiente para
haver uma degradao entre 10 e 20%, no qual, dependendo da susceptibilidade da
molcula a decomposio, pode variar significativamente.
Quando os testes so feitos no produto acabado, tanto o insumo ativo como
os excipientes podem levar degradao. recomendado expor o placebo nas
mesmas condies e tempo para verificar uma possvel interferncia no mtodo de
identificao.
4.1 FONTES DE LUZ
Como citado anteriormente, a molcula deve ser estressada numa faixa de
luz de 400 a 800 nm, as quais compreendem o espectro de luz UV e vsivel.
Entretanto, dificil predizer qual parte do espectro mais destrutivo para uma
molcula especfica. Logo, fontes de luz com diferentes distribuies de intensidade
no espectro podem levar a fotodegradaes com perfis diferentes.
A RDC n 48/2012 da ANVISA especifica que a exposio mnima de 1,2
milhes de lux/h integrados a uma energia UV de aproxidamente 200 watt h/m para
testes confirmatrios, que so os mesmos parmetros sugeridos pelo ICH Q1B. O
guia fornece duas opes de fontes de luz, as quais devem possuir o certificado da
ISO 10977 (1993). necessrio manter um controle de temperatura para garantir
que no haja degradao trmica. Pode-se utilizar papel alumnio para proteger as

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amostras-controle deste efeito, colocando-as junto a amostra testada, sob o mesmo

tempo e intensidade de exposio.
Figura 7 Degradao do fenoprofeno sob radiao UV. Abaixo mostrado
o mecanismo proposto que leva a instabilidade da molcula.

5 CONSIDERAES ANALTICAS NA VALIDAO DE METODOLOGIA

Como descrito anteriormente, a cromatografia lquida de alta eficincia com
detector

de

arrranjo

de

fotodiodos

preferencialmente

utilizada

para

desenvolvimento de um mtodo indicador de estabilidade. A vantagem deste tipo de

detector dar o poder ao analista de fazer uma vaerredura em uma ampla faixa do
espectro UV em uma nica corrida.
. De acordo com o FDA, o mtodo indicador de estabilidade um
procedimento analtico capaz de discriminar o insumo ativo de quaisquer produtos

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de degradao. Alm disso, deve ter uma sensibilidade suficiente para detectar e
quantificar estes produtos.
O conhecimento das propriedades fsico-qumicas do insumo ativo o ponto
de partida do processo de desenvolvimento do mtodo. O objetivo principal obter
uma condio de separao capaz de determinar o maior nmero de picos possveis
em uma anlise. As variveis mais comuns de separao incluem o tipo de solvente,
o pH da fase mvel, o tipo de coluna utilizada e a temperatura do forno. Deve-se
variar drasticamente estas condies para forar mudanas no perfil de separao
dos picos.

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6. CONCLUSO

24

REFERNCIAS
ALSANTE, M. K.; ANDO, A.; BROWN, R.; ENSING, J.; HATAJIK, T. D.; KONG, W.;
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