EKM Servicios Veterinarios

Dr. Eduardo J. Kwiecien, MV, MAASV

1,3,
Dra. Carolina Gutierrez, MV
4
Dr. Victor Bermdez, PhD
2,3

Especialista en Medicina y Produccin Porcina Servicios Tcnicos Patlogo Veterinario Consultor

1. EKM Servicios Veterinarios. Aptdo. Postal 462. Maracay. Aragua 2101. Venezuela. Tel-Fax.: 58-243-2184339
Mvil: 58-414-3335737. Email: ekm.serviciosveterinarios@gmail.com. 2. Patlogo Veterinario. Ctedra de
Anatoma Patolgica. Dpto. Patologa Veterinaria. FCV UCV. Email: vbermu2001@yahoo.com. 3. BERKWI
Consultores. Asistencia Porcina Especializada. Maracay. Telf. 0414-4576982 - 0414-3335737. Email:
berkwi.consultores@gmail.com. 4. Coordinadora Lnea Premix. Carval Venezuela S.A. Valencia. Venezuela. Telf.
58-241-6110097. Email: carolinagutierrez@carval.com.ve, carogutileon@hotmail.com.

FLUDOS ORALES:
NUEVO TCNICA DE TOMA DE MUESTRAS PARA EL DIAGNSTICO DE
ENFERMEDADES EN EL CERDO

INTRODUCCIN:

Los fluidos corporales (orina, saliva, secreciones nasales, etc.) han sido utilizados como fuente para
la deteccin de anticuerpos o antgenos de diversos patgenos virales, para monitoreo de drogas y para
medir el nivel de hormonas en humanos (Detmer et al, 2010). En especial, se han utilizado los fluidos
orales para la deteccin de virus en humano como los de HIV, Herpesvirus, Hepatitis A, B y G, Rubeola,
Sarampin, Varicela Zoster, el virus del SARS, entre otros (Zimmerman et al, 2007). Recientemente, un
procedimiento basado en la recoleccin de fluidos orales para la deteccin del virus de PRRS y su
respuesta de anticuerpos fue desarrollada en los laboratorios de la Universidad Estatal de Iowa (Prickett
et al. 2006, Zimmerman et al 2007).
Esta novedosa tcnica ideada por el Dr. Jeffrey J. Zimmerman ha podido ampliar y cambiar la visin en
cuanto a la recoleccin de muestras para el diagnstico y monitoreo de enfermedades virales y
bacterianas en el cerdo, y su seguimiento epidemiolgico en los rebaos porcinos.

Este procedimiento se apoya en la premisa llamada Perfil Pronstico que es el proceso de
monitorear la circulacin de patgenos en poblaciones porcinas con el objeto de estimar o pronosticar la
salud y productividad de esa poblacin en el futuro inmediato (Prickett et al, 2007).
Por otro lado, el procedimiento se aprovecha del comportamiento curioso e indagador del cerdo cuando
se le colocan objetos extraos en el corral. Como se observa en la Fig. 1, un grupo de lechones muerden
una cadena colgante.



Figura 1. Lechones destetados mordiendo una cadena.
(Cortesa del Dr. Jeffrey J- Zimmerman, ISU, USA)


Las evidencias del pasaje de anticuerpos sricos a los fluidos de la cavidad oral fueron
demostradas por Challacombe et al en 1978 cuando detect anticuerpos IgG, IgM e IgA radiomarcados
en fluidos orales 30 minutos despus de haberlos inyectados en macacos Rhesus.

Corthier (1976) report por primera vez la deteccin de anticuerpos contra el virus de la Peste Porcina
Africana en fluidos orales de cerdos despus de la inoculacin intranasal de la Cepa Thiverval.
Del mismo modo, Loftager et al (1993) detectaron anticuerpos IgA en fluidos orales de cerdos que
previamente fueron inoculados con una cepa de Actinobacillus pleuropneumoniae (App). Una cosa
relevante de este reporte es que estos anticuerpos fueron detectados antes de que aparecieran en suero,
por lo que los autores concluyen que la deteccin de anticuerpos IgA en fluidos orales podra servir como
un mtodo prctico para monitorear la infeccin temprana por App.

EL PROCEDIMIENTO Y SUS ALCANCES:

La toma de muestra mediante la coleccin de fluidos orales consta de cuatro etapas primordialmente, las
cuales se describen a continuacin.

1. Suspender una torunda o gaza en una ubicacin accesible a los lechones. La torunda se coloca
en una zona limpia lejos del comedero y bebedero.
2. La torunda o gaza debe estar a una altura por encima del lomo del cerdo para que estos
puedan morderla y depositar los fluidos. El tiempo de exposicin de la torunda es de 20 a 30
minutos. En este tiempo se estima que alrededor del 70% de los lechones alojados habrn
estado en contacto con la torunda.
3. Extraccin de los fluidos de la torunda insertando la torunda en una bolsa plstica limpia y
exprimindola tratando de recolectar los fluidos en una de las esquinas de la bolsa.
4. Drenaje de los fluidos en un contenedor estril cortando una esquina de la bolsa.

Con esta tcnica, Zimmerman et al (2007) mostraron que los niveles de virus de PRRS en suero y fluidos
orales correlacionaban positivamente cuando se utilizo la prueba de PCR reversa cuantitativa en un
rebao con circulacin del virus de PRRS. Es decir, que la cantidad de virus en los fluidos orales se mova
en funcin de la cantidad presente en sangre, por lo que esta tcnica soporta el concepto que el
muestreo de fluidos orales en corrales, a intervalos determinados puede, efectivamente detectar una
infeccin aguda de PRRS en situaciones como esta.

Ms recientemente, se pudo demostrar la valiosa utilidad del uso del muestreo de fluidos orales
en los programas de monitoreo y aclimatacin de primerizas. En este caso, cerdas primerizas que
provenan de 5 diferentes sitios fueron alojadas en corrales segn su procedencia y fueron vacunadas con
una vacuna comercial a virus vivo de PRRS. Las lechonas fueron monitoreadas al da 0, 20 y 27 das post
vacunacin. Los resultados mostraron que el porcentaje de positividad para PCR fue de 53.7 73.3% para
las muestras de suero individuales o en pool respectivamente, y de 43.4 y 50% para las muestras de
fluidos orales, individuales o en pool respectivamente. Estos resultados sugieren que el muestreo de
fluidos orales para PRRS puede ser un sustituto prctico a la extraccin de sangre y que el hacer pool de
las muestras provee adecuada sensibilidad comparado con el suero (Weeks et al, 2010).


El uso de los fluidos orales en el estudio de otras patologas tale como el Circovirus Porcino tipo 2
(PCV2) y el Mycoplasma hyopneumoniae han sido temas tratados en los ltimos aos.

En este particular, Opriessnig et al (2007) pudieron detectar ADN viral del virus PCV2 comenzando a los 2
das post infeccin (DPI) hasta los 98 das. La cantidad de ADN viral fue ms alta entre el da 12 y 18 DPI.
Los trabajos de Kim et al (2007) sugieren que los fluidos orales pueden ser una alternativa para la
deteccin de ADN del Circovirus Porcino- PCV2 o de anticuerpos contra este virus, adems que esta
tcnica provee una manera costo efectiva para el monitoreo de la actividad viral y del estatus inmune en
poblaciones porcinas.

En el caso del Mycoplasma, Roe et al. (2010) despus de desafiar a cerdos con una cepa de Mycoplasma
hyopneumoniae va intratraqueal observaron que a las 8 semanas post desafo resultaron positivos 45%
de los sueros, 72 % de las muestras nasales y 100% de los fluidos orales. Una mayor positividad a la
prueba de PCR fue detectada en las muestras de los fluidos orales que en las de muestras nasales.
Esto ltimo demuestra el potencial para monitorear la excrecin en el rebao de M hyopneumoniae a
travs del uso de fluidos orales.

En el trabajo con el virus de la Influenza Porcina realizado por Detmer et al 2010, se logr detectar el virus
de Influenza Porcina H1N1 en 3 de 4 cerdos infectados, a los 4, 5 y 6 das post-infeccin, obteniendo una
fuerte correlacin con los resultados de muestreo nasales, demostrando as que el uso de fluidos orales
es una alternativa para el muestreo de grupos de cerdos para esta enfermedad.


En nuestra experiencia particular, pudimos iniciar los primeros estudios con esta tcnica en el ao 2007.
Con las orientaciones del Dr. Zimmerman, y a pedido de un productor de cerdos muy importante en
Venezuela, comenzamos las pruebas pilotos en Mayo de ese ao.

En principio utilizamos una granja Sitio 3 con corrales en donde se alojaban entre 20 a 25 lechones de
desarrollo (25 a 30 Kg p.v.). Decidimos colocar una barra de hierro o cabilla de 1 pulgada de grosor a una
altura apropiada para el tamao de los cerdos y localizada equidistante a los comederos, los bebederos y
la zona sucia. De esta barra se colg una torunda de gaza a la altura adecuada (Ver Fig. 1). Al poco tiempo
de iniciar la prueba nos dimos cuenta que la barra de hierro no era lo suficientemente resistente, por lo
que optamos por colocar una viga de 3x2 pulgadas (Ver Fig. 2). En este caso se solventaron los problemas
anteriores y se pudo observar el comportamiento de los cerdos que prontamente comenzaron a morder
la gaza y a depositar los fluidos (Fig. 4). La gaza se dej por espacio de 25 a 30 minutos. Una vez
transcurrido este tiempo, se retir la gaza completamente humedecida y se coloc en una bolsa plstica e
inmediatamente se procedi a extraer los fluidos contenidos en la gaza mediante presin, exprimindola
hasta que dejaba de destilar (Ver Fig 6 y 7).

El procedimiento se repiti en 8 corrales por cada semana evaluada (Semana 10, 12, 14, 16 y 18). En total
se obtuvieron 40 muestras.

Una vez separados los fluidos de la gaza, se efectu la decantacin de los fluidos en envases estriles
(colectores de orina) los cuales fueron refrigerados para su transporte al laboratorio en donde fueron
separadas las muestras en alcuotas iguales en tubos vacutainer y congeladas hasta su ulterior
procesamiento. Posteriormente, las muestras fueron descongeladas, centrifugadas y varias alcuota de
unos 0.3 ml del sobrenadante fue colocada en tarjetas de papel de filtro FTA (Flinders Technology
Associates)**. Por cada muestra de cada corral se efectuaron 3 rplicas a objeto de tener mayor capacidad
de deteccin ARN viral y ADN bacteriano. En total se procesaron 120 tarjetas de FTA.
Todas las muestras fueron probadas para Mycoplasma hyopneumoniae y PRRS mediante la tcnica de
PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) y RT-PCR.

Los resultados obtenidos nos indicaron una negatividad para PRRS en las edades evaluadas, pero con
positividad de circulacin de Mycoplasma en cada una de las semanas escrutadas, siendo las semanas 14,
16 y 18 en donde la positividad fue ms alta para este germen.

En definitiva, la utilizacin del muestreo de fluidos orales puede ser un mtodo efectivo para el
monitoreo de diversas enfermedades en el cerdo. Adems es una tcnica que per se disminuye las
labores de recoleccin de muestras cuando se compara a la extraccin sangunea, se requiere menos
destrezas para ejecutarla y su costo es relativamente ms bajos que las tcnicas de recoleccin de
muestras convencionales (sangunea, nasal, etc.). Por otro lado, esta tcnica puede ser llevada a cabo por
personal no tcnico, requiere menos tiempo y es una tcnica no invasiva por lo que se reduce
enormemente la labor y el stress tanto para el personal como para los animales.














Figura 2. Prueba Piloto. La torunda cuelga de una Figura 3. Se mejor la recoleccin cuando
barra de metal (cabilla) de 1. se utiliz una viga 3x2.



Figura 4. Lechones mordiendo la torunda de gaza.


Figura 5. Despus de 30 minutos se recoge la gaza Figura 6. La gaza es exprimida para extraer los
en una bolsa plstica. fluidos contenidos.


Figura 7. Se observa el fluido recolectado tras exprimir la gaza (flecha)


Figura 8. Drenaje de los fluidos en un tubo recolector.
(Foto cortesa del Dr. Jeffrey Zimmerman, ISU, Ames, USA)












Agradecimiento:
Los autores desean expresar su agradecimiento al Dr. Jeffrey J. Zimmerman (Iowa State University) por su
apoyo y colaboracin en el desarrollo de las pruebas efectuadas y por compartir informacin y las
fotografas publicadas en este artculo.


** Inoque Ryo; Tsukahara Takamitsu; Sunaba Chinatsu; Itoh Mitsugi; Ushida Kazunari. 2007. Simple and rapid detection of the
porcine reproductive and respiratory syndrome virus from pig whole blood using filter paper. Journal of Virological Methods.
2007, vol. 141, n
o
1, pp. 102-106