Revista Biotecnologia Cincia & Desenvolvimento - Edio n 33 - julho/dezembro 2004 27

CONTROLE BACTERIANO DE
EFLUENTES
Mariana Roberta dos Reis
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC,
Sorocaba; Departamento de Microbiologia e
Imunologia, Instituto de Biologia
Universidade Estadual de Campinas, UNICAMP
marianarreis@aol.com
Elisabeth Pelosi Teixeira
Dra. Departamento de Sade
Faculdade de Tecnologia de Sorocaba, FATEC
epelosi@uol.com.br
Wanderley Dias da Silveira
Ph.D.Departamento de Microbiologia e Imunologia,
Instituto de Biologia, Universidade Estadual de
Campinas, UNICAMP, Campinas.
wds@unicamp.br
Ilustraes cedidas pelos autores
Pesquisa
Introduo
aumento populacional, jun-
tamente com o crescimento
desordenado das cidades,
tem levado, paulatinamente, ao des-
gaste qualitativo e ao consumo
irreversvel das fontes de abasteci-
mento, incluindo, aqui, as fontes
aqferas para consumo, uso domsti-
co e agricultura. O esgoto urbano bru-
to resultante dos despejos domsti-
cos e industriais, o qual lanado num
manancial contribui para sua degrada-
o, afetando sua qualidade (JORDO
et al., 1995).
Assim, com a finalidade de pou-
par as fontes naturais, a gua j utiliza-
da por seres humanos para consumo
prprio, ou outras finalidades, deve
passar por processos de tratamento
que permitam a sua reutilizao segu-
ra sem causar processos de morbidade
sade e/ou mortalidade.
A implantao de uma estao de
tratamento de efluentes (ETE) tem
por obj et i vo reduzi r a carga
contaminante ou poluente das guas
residurias, de modo que o efluente
final tratado possa retornar para o
corpo dgua, sem provocar a degra-
dao do meio e no causar riscos
sade do homem (BORSOI et al.,
2002; Von SPERLING, 1996).
O presente trabalho relata o uso
de bacterifagos (fagos lticos), vrus
que lisam bactrias, como mtodo
para a reduo de nmero de unida-
des formadoras de colnias (UFC) de
bactrias potencialmente patognicas
para os seres humanos e presentes em
estaes de tratamento de esgotos
(ETE), com o objetivo de minimizar
possveis processos de morbi-mortali-
dade causadas por essas mesmas bac-
trias quando da utilizao da gua
para consumo.
A principal vantagem de utilizar
fagos lticos como controle bacteriol-
gico, e ferramenta complementar em
tratamento de efluentes nas ETEs resi-
de na propriedade que eles possuem
de se replicarem apenas na presena
de seu hospedeiro especfico, levan-
do lise celular bacteriana com produ-
o de novos fagos, os quais mantm
seu ciclo de lise enquanto existirem
clulas bacterianas disponveis para
sua replicao, o que dever, teorica-
mente, levar a uma diminuio pro-
gressiva dos possveis contaminantes
bacterianos presentes as ETEs (DAVIS
et al., 1973). Por outro lado, os mes-
mos fagos podem estar presentes den-
Figura 1: Curva de avaliao de morte celular bacteriana de Staphylococcus aureus
(Sa), determinada atravs da contagem de UFC. A: Curva controle contendo apenas
Sa. B: Curva Sa contendo fago no mutante. C: Curva Sa contendo fago mutante ltico
obrigatrio. Os dados so mdias de 2 repeties desvio padro da mdia.
Grfico: Mariana Roberta dos Reis
Controle biolgico bacteriano e tratamento de efluentes atravs do uso de bacterifagos
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tro do genoma de sua clula hospedei-
ra, em estado quiescente ou profgico,
e no levar lise celular dele. Por esse
motivo, a obteno e utilizao de
fagos mutantes que realizem apenas o
ciclo ltico para posterior utilizao nas
ETEs um objetivo que deve ser
alcanado.
Como dentro dos resduos das
ETEs existem milhares de espcies
bacterianas diferentes, muitas das quais
potencialmente contendo um ou mais
fagos especficos, este trabalho teve
por objetivo selecionar fagos que pu-
dessem ser utilizados para o objetivo
acima e dentre esses, selecionar um
para a obteno de mutante que obri-
gatoriamente realizasse apenas o ciclo
ltico.
Metodologia e resultados
Seleo de fagos
Para essa finalidade, suspenses
contendo material bruto de diferentes
ETEs (industriais, hospitalares e
municipais) foram coletados em
condies de assepsia, filtradas em
membranas Millipore de 0,2m e o
sobrenadante resultante mantido em
condies de refrigerao (4C). Um
volume de 200L dessas suspenses
foi, a seguir, adicionadas a culturas
bacterianas lquidas purificadas
(Shigella flexneri, Shigel l a
sonnei, Klebsiella pneumoniae,
Salmonella typhimurium, Escherichia
coli, Streptococcus pyogenes,
Staphylococcus aureus) e mantidas
em cultivo (37C) por 12 horas. A
seguir, os meios foram centrifugados e
os sobrenadantes armazenados entre
4C e 8C, aps filtrao. A confirmao
de fagos especficos na cultura de cada
uma das bactrias foi realizada atravs
do mesmo procedimento observando-
se agora, ou o no crescimento
bacteriano, ou a diminuio da turbidez
do meio de cultura lquido. A obteno
de fagos purificados especficos foi
realizada atravs da metodologia
descrita por DAVIS et al., 1973 e a
observao do sobrenadante lquido
atravs de microscopia eletrnica
(PALMER, 1988). Posteriormente, cada
fago isolado em uma determinada
cultura bacteriana foi testado contra as
demais culturas para confirmar a sua
especificidade.
Obteno de fago ltico mutante
obrigatrio
Para isto, uma suspenso
bacteriana contendo Staphylococcus
aureus, com um bacterifago em seu
interior, foi submetida ao tratamento
com luz ultravioleta (260nm) (5% de
sobrevivncia de UFC/mL) e o
sobrenadante obtido, aps filtrao,
novamente testado contra essa cultura
bacteriana, usando-se como controle
uma cultura contendo essa bactria e
a suspenso do fago no-ltico obriga-
trio. A seguir, aps nova filtrao, o
sobrenadante (300L) foi adicionado a
200L da cultura bacteriana receptora
e a mistura adicionada a 4mL de meio
LA semi-slido e, ento, incubada a
37C por 30min, para haver a interao
do fago com a clula bacteriana. Esta
suspenso final foi, ento, adicionada
sobre uma placa contendo 15mL de
meio LA (conforme metodologia des-
crita por SAMBROOK et al., 1989, com
modificaes). Aps incubar a 37C
durante a noite uma placa de lise (a
que apresentou halo o mais translcido
possvel) foi retirada do gar e adicio-
nada a uma cultura bacteriana em fase
exponencial de crescimento. Aps
cultivo (37C) por 12 horas e
centri fugao (12. 000rpm), o
sobrenadante foi novamente filtrado e
mantido em estoque a 4C.
Utilizao do fago ltico mutante
obrigatrio no controle de
clulas bacterianas especficas
Suspenses fgicas, no mutante
e mutante, obtidas como descrito an-
teriormente, foram, separadamente,
adicionadas em culturas contendo
Staphylococcus aureus (1:1000) em
fase exponencial de crescimento
(5x10
6
UFC/mL) e alquotas (100L)
retiradas, diludas seqencialmente, na
razo 1:10, e semeadas em placas de
Petri contendo meio LA. Aps cresci-
mento (37C, 12h) as UFC/mL foram
determinadas.
Resultados e discusso
Assim, como h preocupao no
sentido de tornar pura a gua captada
em rios, fontes ou poos, antes de
servi-la populao, tambm h pre-
ocupao quanto ao destino dos esgo-
tos sanitrios, sabendo-se que o des-
pejo in natura, nos rios, tem conse-
qncias danosas sade das popula-
es, ocorrendo, no raras vezes, uma
relao entre manifestaes de doen-
as de transmisso fecal-oral e a exis-
tncia de focos de contaminao. Tal
situao, porm, pode ser minimizada
com o tratamento de esgotos sanitri-
os.
H vrias opes disponveis para
tratamento de efluentes, que devem
ser avaliadas segundo critrios de via-
bilidade tcnica e econmica, alm de
adequao s caractersticas topogrfi-
cas e ambientais da regio. Depen-
dendo das necessidades locais, o trata-
mento pode se resumir aos estgios
preliminar, primrio e secundrio (COS-
TA, 2004).
No entanto, quando o lanamen-
to dos efluentes tratados se der em
corpos dgua importantes para a po-
pulao, seja porque deles se capta a
gua para o consumo, seja porque so
espaos de lazer, recomenda-se tam-
bm o tratamento tercirio caracteri-
zados pelo uso de hipoclorito de sdio,
ozonizao, luz ultravioleta, etc.
(LINSLEY et al., 1992).
A abundncia e a importncia
ecolgica dos vrus nos meios aquti-
cos tm sido atestadas com o aumento
do nmero de estudos voltados para
eles. Segundo TEDIASHVILI et al.,
2003, os fagos apresentam um papel
importante no controle da densidade
e diversidade da populao bacteriana
no meio. Eles tambm so considera-
dos indicadores naturais da populao
microbiolgica do efluente.
Neste trabalho, procuramos obter
fagos que pudessem ser utilizados
como tratamento complementar, aos
j disponveis, para a diminuio do
nmero de bactrias potencialmente
patognicas presentes em ETEs. Para
isso, a primeira etapa foi a obteno
de bacterifagos a partir da gua de
diferentes ETEs sendo obtidos fagos
com capacidade de lise de todas as
amostras bacterianas estudadas, a mai-
oria dos quais com especificidade para
uma determinada bactria utilizada
como hospedeiro. A exceo a esse
comportamento foi um bacterifago,
isolado em Shigella flexneri, que tam-
bm apresentou capacidade de lise de
Shigella sonnei e Escherichia coli.
Existem muitos estudos com efei-
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tos da luz UV em diferentes microrga-
ni smos (ANGEHRN, 1984;
MASSCHELEIN, 2002; OPPENHEIMER
et al., 1993). Lmpadas UV emitem
radiao num comprimento de onda
entre 240-260nm, comprimento de
onda no qual o cido nuclico absorve
a energia (ANGEHRN, 1984). A luz UV
causa mutao atravs da formao de
dmeros de pirimidinas nas bases
nitrogenadas existentes ao longo da
cadeia de DNA (MASSCHELEIN, 2002).
Assim, o uso dessa luz pode causar
mutao nos genes responsveis pela
manuteno adequada do vrus no
estado de profago e liberar vrus que
possuam apenas a capacidade ltica.
Dessa maneira, entre todos os
fagos especficos que foram isolados,
e com a finalidade de simplificar os
resultados obtidos, utilizamos aqueles
originrios de Staphylococcus aureus
para a irradiao com luz UV e obten-
o de fagos lticos obrigatrios.
Verificou-se que, aps irradiao
para a determinao da dose letal que
levava sobrevivncia de 5% das
UFC/mL (7,75 x 10
5
UFC/mL), um
elevado nmero de placas de lise em
cultura sensvel (Staphylococcus
aureus).
No teste realizado in vivo, os
fagos mutantes lticos obrigatrios de
Staphylococcus aureus foram utiliza-
dos, sendo obtida uma diminuio do
nmero de UFC/mL de 55,4% do cres-
cimento bacteriano, em relao ao
controle A utilizado.
Uma diminuio maior do nme-
ro de UFC/mL pode no ter sido obtida
devido provvel existncia da pre-
sena de bacterifagos integrados ao
genoma de uma parcela da populao
da bactria hospedeira, Staphylococcus
aureus, o que torna essas bactrias
imunes lise fgica (LEWIN, 1987).
Isso, porm, no inviabiliza nossos
resultados, pois diferentes tipos de
fagos lticos obrigatrios, especficos
para a bactria hospedeira, podem ser
selecionados e utilizados com o pro-
psito de provocar o aumento da lise
bacteriana, minimizando, assim, a pos-
svel presena de fagos em estado
profgico.
Nosso trabalho demonstra que
fagos lticos obrigatrios podem ser
obtidos a partir de fagos no mutantes,
pr-existentes, como j descrito na
literatura (NAKASHIMA et al., 1998) e
que o uso deles em uma cultura celular
in vivo pode levar a uma diminuio
no nmero de unidades formadoras de
colnias e, consequentemente, dimi-
nuio do nmero de bactrias
patognicas presentes em uma deter-
minada ETE.
Dessa maneira, sugerimos que o
uso de fagos lticos especficos pode
ser obtido para qualquer tipo
bacteri ano, i ncl usi ve aquel es
patognicos presentes no esgoto bru-
to, e que o uso deles pode ser utilizado
de maneira complementar queles j
preconizados em estaes de trata-
mento de guas residuais. Outrossim,
suspenses contendo diferentes fagos,
para diferentes espcies bacterianas,
poderiam ser utilizados para tal finali-
dade, levando a uma diminuio glo-
bal de provveis patgenos.
Concluso
Os resultados aqui obtidos de-
monstram que o isolamento de fagos
especficos pode ser realizado a partir
de fagos presentes em guas residuais
obtidas a partir de estaes de trata-
mento de esgotos.
A partir destes isolados de fagos
podem ser obtidos fagos lticos obriga-
trios, de maneira prtica, rpida e de
baixo custo.
Os fagos lticos podem ser utiliza-
dos de maneira complementar aos
mtodos j existentes para a diminui-
o do nmero de bactrias patognicas
presentes em uma determinada esta-
o de tratamento, o que torna esse
tratamento mais eficiente e, portanto,
a gua a ser liberada dela com menor
potencial patognico.
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