BIANCA DE MIRANDA PERES

Bactrias indicadoras e patognicas em biofilmes de sistemas de tratamento de gua, sistemas

contaminados e esgoto












rea de concentrao: Microbiologia
Orientador: Ren Peter Schneider





SO PAULO
2011




Dissertao apresentada ao Programa de
Ps-Graduao em Microbiologia do
Instituto de Cincias Biomdicas da
Universidade de So Paulo, para a
obteno do Ttulo de Mestre em
Cincias.

"Verso corrigida. Verso original se
encontra arquivada no Servio de
Comunicaes do ICB"

RESUMO

BIANCA, M. P. Bactrias indicadoras e patognicas em biofilmes de sistemas de
tratamento de gua, sistemas contaminados e esgoto. 2011. 105f. Dissertao (Mestrado
em Microbiologia) - Instituto de Cincias Biomdicas, Universidade de So Paulo, 2011.

Amostras de biofilme de biomassa suspensa de tanque de aerao de lodo ativado, de crrego
contaminado com esgoto e de superfcies de planta de tratamento de gua expostas gua
bruta ou parcialmente tratada, como tanque de floculao, tanques de areia, canais de ligao
entre os tanques e manacial, foram analisadas com relao presena de bactrias indicadoras
e patognicas. Nos testes presuntivos foram detectados todos os microrganismos-alvo
(Coliformes, Salmonella spp, Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp.,
Enterococcus spp., Vibrio spp., Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp.,
Campylobacter spp. e Legionella. spp.), porm nos testes confirmatrios por PCR e teste
bioqumico somente as espcies E. coli, Salmonella enterica subsp. Enterica serovar Typhi,
K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, e L. pneumophila foram confirmadas para
algumas cepas selecionadas dos testes presuntivos. S. flexneri foi somente confirmada por
teste bioqumico e S. aureus somente por PCR. Nenhuma amostra de C. jejuni foi confirmada
por nenhum dos testes. Estes resultados demonstram que os meios seletivos para testes
presuntivos no se mostraram confiveis uma vez que muitas amostras presuntivas no foram
confirmadas por PCR ou teste bioqumico especfico. Estes resultados demonstram o
potencial de biofilmes microbianos como reservatrio de patgenos.





Palavras-chave: Biofilmes. Patgenos. Esgoto. Sistemas de tratamento de gua. Bactrias
indicadoras.
ABSTRACT

BIANCA, M. P. Pathogenic and indicator bacteria in drinking water treatment plants, in
sewage treatment plants and in a creek contaminated with raw sewage. 2011. 105f.
Master thesis. Dissertao (Mestrado em Microbiologia) - Instituto de Cincias Biomdicas,
Universidade de So Paulo, 2011.

Biofilm samples from activated sludge reactors, surfaces from water treatment plants and
water samples from a creek contaminated with raw sewage were analyzed for the presence of
microbial indicator bacteria and pathogens. All target organisms (Coliforms, Salmonella spp,
Klebsiella spp., Staphylococcus spp., Pseudomonas spp., Enterococcus spp., Vibrio spp.,
Clostridium spp., Shigella spp., Aeromonas spp., Campylobacter spp. and Legionella. spp.)
were detected by using presumptive testing media. Only a small proportion of positive
colonies from presumptive tests were confirmed as pathogenic strains of E. coli, Salmonella
enterica subsp. Enterica serovar Typhi, K. pneumoniae, V. cholerae, A. hydrophila, and L.
pneumophila in confirmatory testing by selective PCR and biochemical tests. S. flexneri was
only confirmed in biochemical tests, S. aureus only by PCR and no colony of C. jejuni was
confirmed positive by either PCR or biochemical testing. Presumptive media are therefore not
safe means for assessing pathogen load in biofilm samples. These results demonstrate the
importance of microbial biofilms as reservoirs for microbial pathogens.






Key words: Biofilms. Pathogens. Sewage. Drinking water treatment plants. Indicator bactria
1 INTRODUO E REVISO BIBLIOGRFICA

1.1 gua potvel, tratamento da gua e monitoramento da qualidade da gua

A gua um bem necessrio para o sustento da vida e, portanto, deve atender a
padres de qualidade para no expor a populao a situaes de risco sade.
Empresas produtoras de gua potvel so responsveis por garantir a qualidade da
gua distribuda e o tratamento da gua visa retirada de slidos suspensos e dissolvidos,
microorganismos potencialmente prejudiciais sade, minerais como ferro e mangans e
poluentes. O tratamento bsico consiste nas seguintes etapas: pr-clorao, pr-alcalinizao,
coagulao, floculao, decantao, filtrao, ps-alcalinizao, desinfeco e por fim
fluoretao.
A qualidade da gua depende da combinao da proteo das fontes de gua, controle
dos processos de tratamento e da gesto da distribuio da mesma. O propsito dos programas
de monitoramento microbiano nos sistemas de distribuio garantir que os suprimentos de
gua estejam de acordo com as orientaes, padres ou regulamentaes.
medida que a gua atravessa o sistema de distribuio, a qualidade da gua pode ser
degradada. Esta degradao causada por vrios fatores, incluindo reduo da concentrao
do resduo de desinfetante, destacamento de biofilme, ressuspenso do sedimento da
tubulao causada por rpidas mudanas no fluxo, rupturas na tubulao, entrada de
contaminantes na rede da tubulao, conexes cruzadas, recrescimento de bactrias que
sobreviveram aos processos de tratamento e crescimento de biofilmes nas paredes das
tubulaes e superfcies de tanques e reservatrios (Fox et al., 2006).
Embora existam testes para a deteco direta dos microorganismos patognicos, estes
so caros, demorados e geralmente difceis de implementar (World Health Organization,
2004) alm disso, quando detectados, j foram disseminados pelo sistema de distribuio. Os
mtodos aplicados na rotina para monitoramento da qualidade microbiolgica de guas de
abastecimento so os que detectam e enumeram os indicadores fecais que no so
necessariamente causadores de doenas, porm so, assim como os patognicos, de origem
fecal.
1.2 Parmetros utilizados na avaliao da qualidade da gua

Para atender ao nvel de qualidade esttica (sabor, cor e odor) e de potabilidade, a gua
deve ser avaliada com respeito a aspectos qumicos, radiolgicos, de aceitabilidade e por fim,
e no menos importante, os microbiolgicos.
Com intuito de monitorar a qualidade da gua, as autoridades sanitrias e rgos de
saneamento realizam testes para deteco de microorganismos indicadores de poluio fecal,
sobretudo em guas destinadas ao consumo humano (WHO, 2004). Os mtodos aplicados so
os que detectam e enumeram os indicadores fecais.
De acordo com Bitton (2005) e Environmental Protection Agency (2002), os critrios
para que um microorganismo seja considerado um indicador ideal so: deve pertencer
microflora intestinal de animais de sangue quente exclusivamente, deve estar presente sempre
que um patgeno entrico esteja , deve estar presente em nmeros maiores que os patgenos,
deve ter, no mnimo, resistncia igual dos patgenos em relao aos fatores ambientais e
desinfeco da gua e deve ser rapidamente detectvel por mtodos simples e no deve
crescer em guas naturais.
No existe nenhum microorganismo que possua todas as caractersticas listadas acima,
mas a Escherichia coli um membro dos coliformes fecais que satisfaz a maioria destes
critrios. A ausncia de E.coli no pode ser tomada como uma indicao absoluta de que os
patgenos intestinais esto tambm ausentes (EPA, 2002).
1.3 Microorganismos utilizados como indicadores
1.3.1 Bactrias heterotrficas

Estes microorganismos esto sempre presentes em concentraes maiores que os
coliformes e um aumento em sua concentrao indica falha no tratamento da gua,
contaminao ps-tratamento ou presena de depsitos, biofilmes ou ainda corroso na
tubulao (WHO, 2004). No entanto, no existe evidncia de que os microorganismos
heterotrficos sejam responsveis por efeitos na sade atravs da ingesto da gua (WHO,
2003). Os rgos de monitoramento da qualidade da gua estabeleceram um valor limite de
at 500 UFC/100 mL uma vez que concentraes maiores interferem na recuperao dos
coliformes (LeChevallier, 1980).
Embora as bactrias heterotrficas no sejam indicadoras diretas de contaminao
fecal, indicam variao da qualidade da gua e potencial para a sobrevivncia e recrescimento
dos microorganismos patognicos (Maier et al., 2004).

1.3.2 Coliformes totais e termotolerantes

Conforme mencionado, os coliformes so utilizados como indicadores de
contaminao fecal. No entanto, este grupo dividido entre coliformes totais e
termotolerantes. Os coliformes totais so definidos como bacilos Gram-negativos, no
formadores de esporos, capazes de crescer aerobicamente e anaerobicamente na presena de
sais biliares ou agentes tensoativos. Geralmente fermentam a lactose a 35-37C, com
produo de cido, gs e aldedo em 48h. Possuem a enzima -galactosidase e so oxidase
negativos. As bactrias coliformes pertencem famlia Enterobacteriacea e os gneros
geralmente encontrados em suprimentos de gua so Citrobacter, Enterobacter, Escherichia,
Hafnia, Klebsiella, Serratia e Yersinia. (CETESB, 2009).
Uma fonte potencial de coliformes no abastecimento de gua resulta de uma operao
sub-tima do processo de tratamento da gua ou ingresso atravs de quebras na integridade do
sistema de distribuio. Isto inclui: vazamentos nos reservatrios, contaminao das vlvulas,
infiltrao nos reservatrios, conexes cruzadas e efeitos de refluxo (EPA, 2002).
O grupo dos coliformes tem sido usado como um padro para a avaliao da
contaminao fecal para guas potveis e recreacionais desde o comeo do sculo XX. No
entanto, existem muitas deficincias no uso desses indicadores. Como exemplos podemos
citar o recrescimento deste grupo nos ambientes aquticos e sistemas de distribuio,
supresso por um alto crescimento de bactrias heterotrficas e inexistncia de relao de
proporcionalidade com a infestao da gua com protozorios patognicos entricos e vrus
entricos (Maier et al., 2004).
Os coliformes termotolerantes possuem caractersticas dos coliformes totais, mas so
capazes de fermentar a lactose a 44-45 C com formao de cido/gs e provas bioqumicas
positivas para indol, -glucuronidase e ausncia de urease. O termo coliforme fecal no
preciso porque somente E.coli, de origem exclusivamente fecal. Sabe-se que os outros
membros do grupo coliforme esto presentes no solo e em outros materiais ambientais e so
capazes de crescer em guas eutrficas e biofilmes.
A E.coli encontrada nas fezes de todos os mamferos frequentemente em nmero
elevado (10
9
por grama de fezes) e mesmo que possa ser detectada mais facilmente que outros
membros do grupo dos coliformes, possui as mesmas limitaes dos coliformes totais como
indicador de contaminao fecal (Maier et al., 2004).

1.3.3 Enterococos intestinais

Os enterococos intestinais so um subgrupo dos estreptococos fecais, definidos como
cocos Gram-positivos que tendem a formar pares ou cadeias, no formadores de esporos,
oxidase negativos e catalase negativos. Podem crescer tanto aerobicamente quanto
anaerobicamente na presena de sais biliares e so relativamente tolerantes a cloreto de sdio
e pH alcalino (CETESB, 2009).
Incluem espcies que ocorrem em fezes humanas e de animais de sangue quente como
Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Enterococcus durans e Enterococcus hirae.
Alm disso, podem ser encontrados em alimentos onde sua presena geralmente no est
relacionada com contaminao fecal direta.
A principal razo para sua enumerao avaliar a significncia da presena de
bactrias coliformes na ausncia de E.coli ou prover informao adicional na avaliao de
uma potencial contaminao fecal. Sua sobrevivncia 10 vezes menor que a da E.coli nos
ambientes aquticos e estes organismos so mais resistente clorao. Estes microorganismos
possuem algumas vantagens sobre os coliformes, pois raramente se multiplicam em gua, so
mais resistentes aos estresses ambientais e clorao que os coliformes e geralmente
persistem por mais tempo no ambiente (Maier et al., 2004).


1.3.4 Clostridium perfringens

C. pefringens um bacilo Gram positivo, anaerbio, formador de esporo e sulfito
redutor exclusivamente de origem fecal. Os esporos so extremamente resistentes ao calor e a
desinfetantes e, por isso, sua deteco indica deficincias no tratamento e a possvel presena
de organismos mais resistentes como protozorios parasitas ou vrus (Maier, 2004).
Graas sua resistncia, so teis em avaliaes complementares, como indicadores
de poluio remota ou intermitente (CETESB, 2009).

1.4 Recrescimento

O recrescimento o aumento do nmero de bactrias que ocorre depois do ponto de
tratamento. Estes organismos derivam de clulas viveis e clulas dormentes ou ainda de
clulas injuriadas que passaram pela planta de tratamento (Power, 1995).
Este fenmeno mais comumente observado em coliformes totais, seguidos pelas
bactrias heterotrficas e raramente os coliformes fecais. A deteco do recrescimento destes
organismos pode ser devido natureza seletiva dos programas de monitoramento de gua que
somente enumeram certos organismos ou devido s caractersticas fisiolgicas das clulas que
resulta na sobrevivncia de alguns organismos ao tratamento enquanto outras morrem (Power
et al., 1996).
No caso de bactrias heterotrficas, o recrescimento ocorre quando a concentrao de
cloro residual encontra-se abaixo de 0,2 mg/L, a temperatura da gua excede 10 C e o
carbono orgnico assimilvel maior que 50 g/L (Maier et al., 2004). O recrescimento
destes microorganismos pode inibir ou mascarar a deteco dos organismos indicadores. Esta
inibio pode ser resultado tanto da produo de substncias semelhantes bacteriocinas
quanto pelo crescimento em altos nmeros de antagonistas aos coliformes (LeChevallier e
McFeters, 1985a). A no deteco dos microorganismos indicadores pode, por sua vez,
implicar em surtos de doenas de transmisso hdrica uma vez que os microorganismos
patognicos poderiam estar presentes, porm foram subestimados. Outra razo pela qual se
deve evitar o recrescimento bacteriano a habilidade dos organismos que fazem parte da
microbiota natural heterotrfica dos sistemas de distribuio em se comportar como
patgenos oportunistas. Estes organismos so considerados patgenos emergentes que
apresentam um srio problema de sade pblica (Reasoner, 1992).
Um dos principais parmetros ligados ao recrescimento a desinfeco da gua e a
presena de cloro residual. A manuteno do resduo desinfetante importante para controlar
uma possvel contaminao e na desativao de qualquer clula que tenha sobrevivido ao
tratamento ou ainda clulas que venham a se dispersar dos biofilmes. A manuteno
inadequada de um resduo tambm permitir a recuperao ou reativao de bactrias
parcialmente injuriadas (LeChevallier e McFeters, 1985b).
A carga orgnica da gua tratada tambm possui um efeito sobre o recrescimento por
interferir com a eficincia dos desinfetantes e tambm por representar uma fonte de nutriente
ao crescimento bacteriano (Power, 1995). Os nveis de carbono orgnico assimilvel so
reduzidos medida que a gua se move atravs do sistema sendo estes valores
correlacionados ocorrncia de coliformes e de bactrias heterotrficas (LeChevallier et al.,
1991).
A temperatura da gua no s importante devido correlao com o crescimento
bacteriano, mas tambm por afetar a taxa das reaes qumicas relativas destruio dos
microorganismos pelos desinfetantes ou a atividade das enzimas de crescimento dos
organismos (Hutchinson e Ridgway, 1977).
Os biofilmes presentes em um sistema de distribuio so os principais contribuidores
do recrescimento (Power, 1995).
1.5 Biofilmes

Um biofilme microbiano constitudo por clulas envoltas em uma matriz de
exopolmeros produzida pelos prprios microorganismos, que as mantm unidas. Pode estar
aderido ou no a um substrato e seu desenvolvimento depende do carbono orgnico
assimilvel.
Seu desenvolvimento ocorre em estgios (Figura 1). No primeiro e no segundo
estgios, ocorre uma associao frouxa ou transiente entre o microorganismo e a superficie
seguida de uma adeso forte. A ligao reversvel mediada pela atrao fsico-qumica,
ocorrendo em funo de uma atrao inicial da bactria pela superfcie e controlada por
diversas foras competitivas como foras repulsivas eletrostticas e foras atrativas de van der
Waals.
As propriedades da superfcie podem ser modificadas pela adsoro de um filme
condicionante de compostos orgnicos. A ligao bacteriana promovida quando o material
orgnico cobre a superfcie dos slidos uma vez que a solubilidade da gua tenha se tornado
limitante (Maier, 2009).
A ligao reversvel dos organismos s superfcies pode, com o tempo, se tornar
permanente. Esta ltima inicia-se pela excreo dos polmeros extracelulares produzidos pelas
bactrias ligadas ainda de modo reversvel. A excreo da matriz prov a ligao das bactrias
e forma a arquitetura interna da comunidade. O desenvolvimento de um biofilme maduro
devido no somente proliferao das clulas aderidas mas tambm pela contnua deposio
de clulas planctnicas (Maier, 2009).
Os exopolmeros tambm influenciam no funcionamento e sobrevivncia do biofilme
em ambientes hostis (Sandrin et al, 2009).
Nos estgios trs e quatro, h a agregao das clulas em microcolnias e subseqente
crescimento e maturao (Stoodley et al., 2004). O ltimo estgio caracteriza-se pela
possibilidade de ocorrer disperso do biofilme por eroso (apenas uma clula) ou por
sloughing (pedao de biofilme). O exato mecanismo de como e porque ocorre a disperso
ainda est sob investigao, mas est provavelmente ligado a fatores de presso ambiental
como diminuio da matria orgnica disponvel ou superpopulao (Richards e Melander,
2009).






Figura 1 - Estgios da formao de um biofilme. Legenda: 1) e 2) Adeso inicial e fraca dos
microorganismos ao substrato. 3) e 4) Agregao de microcolnias e subseqente crescimento
e maturao do biofilme. 5) Estgio final caracterizado por eroso ou sloughing.








FONTE: Fairley (2010).
A estrutura do biofilme depende da natureza dos microorganismos presentes, da
concentrao de nutrientes, das propriedades hidrodinmicas e presena de alguma fora
mecnica, portanto pode variar de um tipo achatado at uma organizao complexa em forma
de cogumelo envolvendo agregados separados por canais de gua, sendo que este ltimo
forma-se em ambientes de baixa concentrao de nutrientes, alto estresse hidrodinmico e
ausncia de foras mecnicas, abrasivas e compressivas (Wilson, 2001).
Por causa do gradiente dos nutrientes e de fatores fsico-qumicos, as clulas em
diferentes profundidades dentro do biofilme esto expostas a diferentes condies e, portanto,
apresentaro padres diferentes de expresso de genes e consequentemente diferentes
fentipos (Wilson, 2001).
Uma componente chave, que permite certo grau de homeostase dentro do biofilme, a
matriz exopolimrica (Davey e OToole, 2000). A matriz desempenha diversas funes: pode
estar relacionada ao desenvolvimento e estrutura do biofilme, concentrao de nutrientes
essenciais e fatores de crescimento (Wolfaardt et al., 1998), preveno da entrada de agentes
antimicrobianos dentro do biofilme (Gilbert et al., 1997), adsoro de metais, ctions e
toxinas e proteo contra estresses ambientais, como UV, variao de pH, choque osmtico
e dessecao (Flemming H-C.,1993).

Devido aos canais de gua, a troca de nutrientes e metablitos com a massa de gua
mais eficiente, o que aumenta a disponibilidade de nutrientes e a remoo de substncias
potencialmente txicas (Costerton et al., 1995).
Muito do que se sabe do incio do desenvolvimento do biofilme, origina-se de estudos
a respeito do quorum sensing (QS). QS o termo empregado para descrever como as
bactrias se comunicam com as outras para coordenar a expresso gnica dentro da
populao. A inibio do QS atravs do uso de homoserinolactonas a base para o controle
dos biofilmes (Simes et al., 2007).

1.5.1 Fatores que contribuem para a formao dos biofilmes nos sistemas de
tratamento e distribuio de gua potvel

A maioria das bactrias em ambientes oligotrficos cresce em biofilmes em vez de
crescerem como clulas individuais planctnicas. Isto porque os biofilmes podem prover um
grau de proteo e estabilidade em relao s mudanas do ambiente (Stoodley e Stoodley,
2004). Os principais fatores que favorecem o crescimento de biofilmes nos sistemas de
tratamento e distribuio de gua potvel so: fatores ambientais, presena de nutrientes,
interaes microbianas, material da tubulao, hidrulica do sistema, resduo desinfetante e
acumulao de sedimentos (EPA, 2002).
Temperaturas mais amenas facilitam o crescimento microbiano e diminuem a
eficincia dos desinfetantes. Outros fatores ambientais que afetam o desenvolvimento do
biofilme so turbidez da gua final e pH. A turbidez pode interferir com a desinfeco j que
as partculas podem proteger os patgenos adsorvidos a elas, impedindo que eles entrem em
contato com o desinfetante enquanto o pH influencia a efetividade dos desinfetantes ou
mesmo podem causar o destacamento dos coliformes dos biofilmes (EPA, 2002).
Os nutrientes tendem a se acumular na interface slido/lquido, criando um ambiente
favorvel para o crescimento do biofilme (Lechevallier, 1989). A acumulao de depsitos
nos sistemas gerada por muitos mecanismos, entre eles, a precipitao, floculao e
sedimentao de material durante o tratamento da gua ou corroso da superfcie da tubulao
(Batt et al., 2003).
A ausncia ou presena de nutrientes especficos pode selecionar uma populao
microbiana, incluindo os patgenos. No entanto, alguns microorganismos, como a P.
aeruginosa, especialmente verstil em relao aos nutrientes orgnicos que ela pode usar
(WHO, 2002).
Alguns microorganismos oportunistas como L. pneumophila e patgenos primrios
como V. cholerae e E. coli 0157:H7 sobrevivem e at crescem dentro de certas amebas e
portanto, esto protegidos da desinfeco (Barker e Brown, 1994).
Em relao ao material da tubulao, alguns so especialmente favorveis ao
desenvolvimento de biofilme. Enquanto alguns provm um nicho onde o crescimento pode
ocorrer, outros provm nutrientes que mantm o crescimento microbiano (WHO, 2002). A
tubulao antiga e de ferro, facilita a formao de tubrculos que so primariamente xidos de
ferro (Tuovinen et al., 1980) que adsorvem matria orgnica (Geldreich, 1996). O
sloughing dentro da coluna d`gua tambm pode ocorrer como resultado de um alto nvel
de biofilmes sobre a tubulao de ferro (Norton e Lechevallier, 2000).
Uma variedade de fatores relacionados hidrulica do sistema como longos tempos de
residncia devido a baixas taxas de fluxo ou tubulao em looping, altas taxas de fluxo, ou
mesmo taxas flutuantes de fluxo, podem influenciar a sobrevivncia e crescimento de
microorganismos em biofilmes. Uma velocidade muito elevada de gua na tubulao pode
aumentar o nvel de nutrientes e desinfetantes em contato com o biofilme, bem como causar o
despreendimento dos biofilmes que podem conter patgenos da superfcie da tubulao. A
reverso do fluxo tambm pode causar o espalhamento de biofilmes que por sua vez, levam
ao desprendimento de microorganismos dos biofilmes que podem se acumular em reas de
baixo fluxo (WHO, 2002).
Uma vez que o biofilme estabilizado, ele pode demandar uma alta taxa de cloro
residual (maior que 0,2 mg/L) para reduzir os nveis microbianos significativamente
(Lechevallier, 1989). No entanto, a manuteno de altos nveis de cloro pode ser complicada
pela necessidade de controlar os subprodutos e a corroso da tubulao e tambm os
problemas relacionados ao sabor e odor da gua (WHO, 2002).


1.6 Doenas transmitidas pela gua

Muitas doenas esto relacionadas gua. De acordo com a causa, estas doenas
podem ser classificadas em quatro tipos (Maier et al., 2009):
Transmisso hdrica. Os microorganismos patognicos so de origem fecal; transmisso
por ingesto.
Privao hdrica. Microorganismos de origem fecal; transmisso por contato devido
falta de saneamento ou higiene.
Base hdrica. Organismos originrios da gua ou com parte do ciclo de vida na gua;
transmisso por contato dos humanos com gua ou por inalao.
Criao hdrica. Microorganismos com ciclos de vida associados a insetos que vivem ou
proliferam na gua.
A via de transmisso mais relevante das doenas de transmisso hdrica a fecal-oral.
Os microorganismos atingem a gua atravs das excretas de humanos ou outros animais
infectados e esta gua ao ser ingerida ou utilizada no preparo de alimentos, pode causar
distrbios gastrointestinais. Outras vias correspondem inalao e contato direto (Figura 2).

Figura 2 - Vias de transmisso de microorganismos patognicos








FONTE: WHO (2004)

Os organismos que podem ser transmitidos pela via fecal-oral atravs da gua de
consumo humano esto listados na Tabela 1.

Tabela 1 - Patgenos de transmisso fecal-oral e sua significncia nos suprimentos de gua
potvel

FONTE: adaptado de WHO, 2004
(a) Perodo de deteco da forma infecciosa na gua a 20 C: baixa-at uma semana, moderada-1 semana a 1
ms, elevada>1 ms.
(b) Dose para causar infeco em 50% em voluntrios sadios
Patgeno Significncia
sanitria
Persistncia
na gua
Resistncia
ao cloro (a)
Dose
infectante
(b)
Reservatrio
animal
Bactrias
Campylobacter
jejuni
Alta Moderada Baixa Moderada Sim
E. coli
patognica
Alta Moderada Baixa Alta Sim
Salmonella
typhi
Alta Moderada Baixa Alta No
Outras
Salmonellae
Alta Prolongada Baixa Alta Sim
Shigella spp. Alta Curta Baixa Moderada No
Vibrio cholerae Alta Curta Baixa Elevada No
Yersinia
enterocolitica
Alta Prolongada Baixa Elevada
(?)
No
Pseudomonas
aeruginosa
Moderada Pode
multiplicar-
se
Moderada Elevada
(?)
No
Aeromonas spp Moderada Pode
multiplicar-
se
Baixa Elevada
(?)
No
1.6.1 Surtos de doenas de transmisso hdrica

Surtos causados por bactrias de transmisso hdrica continuam ocorrendo na
atualidade, apesar de todos os aprimoramentos da tecnologia de tratamento de gua e de
desinfeco. Estes surtos no esto confinados a pases em desenvolvimento, onde a
infraestrutura de tratamento e distribuio de gua mais precria, mas ocorrem tambm em
pases desenvolvidos.
Em janeiro de 1991, uma epidemia de clera iniciada no Per, resultou em mais de
533.000 casos e 4700 mortes dentre 19 pases da Amrica do Sul. Na cidade de Trujillo, a
gua no era clorada e sua contaminao era comum (Swerdlow et al., 1992a). Outros fatores
que contriburam para o espalhamento da contaminao foram ligaes cruzadas irregulares, e
baixa e intermitente presso da gua na rede (WHO, 2004).
Outro grande surto ocorreu nos EUA, em 1992, em um pequeno povoado em
Missouri, onde havia um abastecimento de gua no clorada (Swerdlow et al., 1992b). O
microorganismo em questo foi a cepa enterohemorrgica E.coli O157:H7 que provocou 243
casos. Um estudo mostrou que durante o pico do surto, a diarria sanguinolenta ocorreu 18.2
vezes mais nas pessoas que viviam na cidade e que e que usavam a gua municipal do que nas
pessoas que viviam fora da cidade e utilizavam gua de fontes particulares. O nmero de
casos declinou quando os residentes foram ordenados a ferver a gua e a gua de
abastecimento foi clorada.
Em 2000, Walkerton, uma pequena cidade do Canad, sofreu um surto onde quase
metade da populao apresentou gastroenterite causando a morte de seis pessoas. Os
patgenos primeiramente identificados foram E. coli O157:H7 e Campylobacter jejuni
embora outros patgenos tambm estavam presentes. O surto foi atribudo contaminao de
um poo raso por esterco de gado de uma fazenda prxima seguida de um intenso perodo de
chuvas (Hrudey et al., 2003).
Embora P.aeruginosa no tenha sido conclusivamente relacionada em um surto de
veiculao hdrica, est muito relacionada a surtos em hospitais (EPA, 2002).
O caso clssico causado por L. pneumophila ocorreu em 1976 em Filadlfia, EUA.
Um surto de pneumonia acometeu a American Legion Convention e, por isso, a doena foi
denominada Doena dos Legionrios. O microorganismo s foi identificado depois de uma
exaustiva investigao microbiolgica.

1.7 Crescimento de microorganismos nos sistemas tratamento e distribuio de gua
potvel

Os sistemas de distribuio de gua potvel podem representar um hbitat favorvel ao
desenvolvimento dos microorganismos. Os principais fatores que controlam o crescimento
bacteriano neste ambiente so: temperatura, pH, oxignio, nutrientes, variaes hidrulicas e
caractersticas dos materiais.
O crescimento microbiano na superfcie das tubulaes da rede de distribuio pode
causar vrios problemas como corroso (Beech e Sunner, 2004), formao de biofilmes
(Camper, 2004) e a consequente persistncia dos patgenos (Emtiazi et al., 2004),
deteriorao da qualidade esttica da gua (sabor, odor e descolorao) e interferncia nos
mtodos utilizados para monitorar os parmetros de potabilidade da gua (WHO, 2004). Uma
vez que os microorganismos patognicos podem tambm estar presentes nos sistemas de
distribuio, isto se torna um problema de sade pblica, pois podem ocorrer surtos de
doenas de veiculao hdrica.
Nos sistemas de distribuio, a relao volume:superfcie drasticamente diferente
dos reatores e reservatrios; estima-se que 95% da biomassa presente nos sistemas esteja
aderida s paredes em contato prximo com a gua (Flemming et al., 2002), contribuindo para
a contaminao da mesma (Block, 1992).

1.7.1 Patgenos

Nos estudos dos patgenos nos sistemas de distribuio so analisados os seguintes
aspectos: monitoramento da qualidade higinica da gua, avaliao dos padres de
transmisso dos surtos de doenas de veiculao hdrica, esclarecimento das fontes
microbianas de contaminao e por fim, entendimento da emergncia de novos
microorganismos patognicos (Brettar e Hfle, 2008).
As maiores fontes de bactrias patognicas so o esgoto, principalmente o oriundo de
hospitais e o inadequadamente tratado das grandes reas urbanas (Brettar e Hfle, 2008).
A maioria das bactrias nos sistemas de distribuio ocorrem dentro de biofilmes
(Szewzyk et al., 2000) e estes podem atuar como uma forma de proteo contra condies
ambientais extremas (September et al., 2007) para os patgenos alvo deste estudo. Sendo
assim, os biofilmes podem se tornar um reservatrio para o susbsequente espalhamento de
organismos patognicos (Camper et al., 1996).
Alm disso, patgenos que sobreviveram ao tratamento podem colonizar um biofilme
pr-existente, onde podem crescer e mais tarde serem liberados no fluxo de gua. Os
patgenos liberados na gua representam um risco aos consumidores (September et al., 2007).
A maioria dos microorganismos em biofilmes de gua potvel so bactrias Gram
negativas, particularmente patgenos oportunistas como Pseudomonas spp. Pseudomonas
aeruginosa sensvel desinfeco e sua entrada no sistema de distribuio pode ser
minimizada por desinfeco adequada, medidas de controle de crescimento de biofilmes
restrio do tempo de residncia da gua no sistema e manuteno dos resduos desinfetantes
(WHO, 2006).
September et al. (2007) coletaram amostras de biofilme de sistemas de distribuio
assim como de reservatrios domsticos na frica do Sul a fim de determinar a prevalncia de
patgenos, dentre eles: Aeromonas, E.coli, Pseudomonas, Salmonella, Shigella e Vibrio. Estes
microorganismos foram selecionados com base na anlise da qualidade da gua bruta nos
mananciais de abastecimento. Os autores concluram que os sistemas de distribuio menores
apresentam nmeros maiores de patgenos do que os grandes sistemas. Outra concluso
importante foi a constatao da inadequao dos meios seletivos utilizados; nenhuma das
amostras putativas de Salmonella e Shigella puderam ser confirmadas, indicando que estes
patgenos no podem ser recuperados por mtodos de cultivo em se tratando de biofilmes
relacionados aos sistemas de distribuio.
Legionella spp. tambm um patgeno tipicamente encontrado em biofilmes e em
sistemas de distribuio j que muito resistente ao cloro (Maier et al., 2009). Como os
biofilmes demonstram ser um fator importante no crescimento de Legionella nos ambientes
de gua potvel (Rogers e Keevil, 1992), medidas de controle do crescimento dos biofilmes
assim como controle da temperatura podem minimizar o risco de infeco por este
microorganismo. De acordo com Steinert et al. (1998), Acanthamoeba polyphaga pode conter
altos nveis de L. pneumophila, protegendo as clulas contra os desinfetantes. Havendo
depleo do desinfetante, pode ocorrer a recolonizao dos biofilmes pelos patgenos que
estavam protegidos na ameba (Thomas et al, 2004).
Geralmente as espcies de Klebsiella detectadas em gua potvel so organismos
localizados em biofilmes, porm estes no representam um risco sade, pois so organismos
razoavelmente sensveis aos desinfetantes e sua entrada nos sistemas de distribuio pode ser
prevenida pelo tratamento adequado da gua (WHO, 2006).
Embora Shaphylococcus aureus possa ocorrer nos sistemas de distribuio, no h
evidncia de transmisso atravs do consumo de gua potvel. Apesar de ser altamente
resistente aos resduos de cloro, sua presena na gua controlada por tratamentos
convencionais e processos de desinfeco
A habilidade de Aeromonas sp crescer e sobreviver na gua potvel, tem sido
demonstrada em diversos estudos devido ao potencial de se desenvolver em biofilmes (Sen e
Rodgers, 2004). Havelaar et al. (1990), reportaram o recrescimento na maior parte do sistema
de distribuio analisado.
Resultados baseados em estudos de laboratrio sugerem que os biofilmes representam
um mecanismo eficaz de persistncia das espcies de Vibrio no ambiente. Uma pesquisa
epidemiolgica e ecolgica no ecossistema da costa da baa de Bengala produziu evidncias
de que Vibrio cholerae O1 em estado no cultivvel, estava presente em biofilmes coletados
de corpos d`gua que serviam de fonte de gua potvel para uma rea de Bangladesh onde
surtos de clera ocorrem anualmente (Alam et al., 2006).
Estudos recentes tm reportado a sobrevivncia de Campylobacter spp. em biofilmes
(Buswell et al., 1998). A deteco de Campylobacter jejuni na gua problemtica devido aos
baixos nmeros e ao crescimento lento do organismo. As tcnicas de cultivo apresentam
falhas no que diz respeito ao isolamento de microorganismos de amostras provenientes de
guas contaminadas que possam ser a causa de epidemias recorrendo-se, portanto, aos
mtodos moleculares (Ferreira Miguel, 2007).

1.7.1.1 Shigella spp.

Pertencentes famlia Enterobacteriacea, so bacilos Gram negativos, no mteis,
que crescem tanto na presena quanto na ausncia de oxignio. Os membros deste gnero
possuem um padro antignico complexo e so divididos em 4 espcies: S. flexneri, S. sonnei,
S. dysenteriae e S. boydii (WHO, 2006). Shigella spp. um gnero muito relacionado E.
coli, no entanto as espcies de Shigella so geralmente patognicas ao homem podendo causar
uma gastroenterite grave (Madigan, 2004).
geralmente encontrada em guas poludas com esgoto humano e transmitida pela
rota fecal-oral (Maier, 2009).
Sua presena em gua potvel sugere contaminao recente uma vez que so
particularmente instveis em ambientes aquticos e so sensveis desinfeco. E. coli um
ndice adequado indicao da presena de Shigella spp. nos sistemas de abastecimento de
gua potvel.

1.6.1.2 Salmonella spp.

Salmonella um grande grupo de bacilos, Gram negativos, no mteis, que no
fermentam a lactose, mas produzem gs ou H
2
S a partir da fermentao de carboidratos.
Compreendem mais de 2000 sorotipos conhecidos que so membros da famlia
Enterobacteriaceae. Todos os sorotipos so patognicos a humanos e podem causar uma srie
de sintomas variando desde uma gastroenterite branda a uma doena severa ou mesmo morte
(Maier, 2009).
Est amplamente distribuda no ambiente e particularmente S. typhi e paratyphi so
restritas a humanos, embora S. paratyphi possa ser raramente encontrado em animais
domsticos. Os patgenos tipicamente entram no sistema de distribuio de gua potvel
atravs da contaminao fecal por descargas de esgotos, de gado e animais selvagens, sendo a
rota de transmisso fecal oral. Esta transmisso, mais comumente envolvendo S. typhimurium,
tem sido associada com o consumo de gua subterrnea e abastecimento de guas superficiais
contaminados (WHO, 2006).
Salmonella spp. relativamente sensvel desinfeco e E.coli um ndice adequado
para a indicao da presena de salmonelas em sistemas de fornecimento de gua potvel
(WHO, 2006).

1.7.1.3 Aeromonas spp.

Aeromonas spp. so bacilos anaerbios facultativos no formadores de esporos, Gram-
negativos e pertencentes famlia Aeromonadacae. As espcies mais importantes para a
sade humana so A.hydrofila, A. caviae, A. veronii subsp. sobria, A. jandaei, A.veronii
subsp. veronii and A. schubertii (CETESB, 2009).
So geralmente encontradas em guas doces e tm sido detectadas em sistemas de
distribuio, porm os dados disponveis no so suficientes para comprovar sua transmisso
hdrica. Medidas de controle para otimizar a remoo de carbono orgnico, restrio do tempo
de residncia na gua do sistema de distribuio e manuteno dos resduos desinfetantes,
podem limitar o crescimento desta bactria neste ambiente (WHO, 2006).
Tem sido considerada problemtica uma vez que pode gerar resultados falsos positivos
na contagem de coliformes e, por isso, a E. coli no um ndice adequado para indicar sua
presena (WHO, 2006).

1.7.1.4 Pseudomonas aeruginosa

um bacilo Gram negativo, aerbio, no esporulante e membro da famlia
Pseudomonadacea. Algumas linhagens produzem um pigmento no fluorescente denominado
piocianina enquanto outras adicionalmente produzem um pigmento fluorescente verde, a
pioverdina. Pseudomonas aeruginosa, assim como outras linhagens fluorescentes, produz
catalase, oxidase e amnia a partir de degradao da arginina e pode crescer com citrato como
fonte de carbono (Madigan, 2004).
Por ser um microorganismo ubquo, pode ser isolado de diversas fontes, inclusive de
ambientes hospitalares, sistemas de aquecimento de gua e piscinas. Raramente causa doenas
em indivduos saudveis, mas o patgeno oportunista que mais causa infeces em
indivduos imunocomprometidos e vtimas de queimaduras e geralmente causa infeces nos
olhos e sistema respiratrio. Numerosos casos de foliculite, dermatite e infeces do trato
urinrio foram reportados devido P.aeruginosa associada gua de piscina contaminada
(Maier et al., 2009). Trata-se de organismo extremamente resistentes maioria dos
antibiticos pela transferncia de plasmdeos de resistncia (Madigan, 2004).
Apesar da ingesto no ser uma fonte importante de infeco, a presena de altos
nmeros em gua potvel pode estar relacionada com queixas em relao ao sabor, odor e
turbidez. sensvel desinfeco e medidas de controle do crescimento de biofilmes
incluindo tratamento para otimizao da remoo do carbono orgnico, reduo de tempo de
residncia da gua nos sistemas de distribuio e manuteno dos resduos desinfetantes
dever reduzir o crescimento deste microorganismo. Por ser um microorganismo comum no
ambiente, E. coli no adequada para detectar sua presena (WHO, 2006).

1.7.1.5 Staphylococcus aureus

Este gnero de coco Gram positivo, no esporulante, aerbio, catalase positivo
relativamente resistentes a potenciais de gua reduzidos , exibindo tolerncia ao dessecamento
e s condies de alta salinidade (Madigan, 2004).
Apesar de S.aureus ser membro da flora microbiana normal da pele humana, pode ser
liberado por contato humano em ambientes aquticos e tambm tem sido detectado em gua
potvel (WHO, 2006).
O contato com as mos a via mais comum de transmisso e no existem relatos de
transmisso de doena pela ingesto de gua contaminada. Como o microorganismo no
originado de material fecal, a E. coli no uma indicadora adequada de sua presena
(CETESB, 2009).


1.7.1.6 Campylobacter spp.

Campylobacter spp. um bacilo curvado e espiral com um flagelo polar
desembainhado, Gram negativo e microaeroflico.
frequentemente isolado de gado saudvel, frangos e aves e, portanto, carne e leite
no pasteurizado so importantes fontes de infeco. gua potvel contaminada tem sido
implicada como fonte de organismos em surtos (WHO, 2006).
Medidas de controle podem ser aplicadas para gerenciar o risco potencial de
Campylobacter spp. incluindo proteo das guas brutas de dejetos animais e humanos,
tratamento adequado e proteo da gua durante a distribuio. Os estoques de guas tratadas
e desinfectadas devem ser protegidos das fezes de aves. Campylobacter spp. so patgenos de
origem fecal e no so particularmente resistentes desinfeco. Deste modo, a E.coli um
indicador apropriado da presena/ausncia de Campylobacter spp. nos suprimentos de gua
potvel (WHO, 2006).

1.7.1.7 Legionella spp.

Legionella spp, um gnero pertencente famlia Legionellaceae , e que compreende
bacilos Gram negativos, no formadores de esporos e que requerem L cistena para o
crescimento. So heterotrficas encontradas em ambientes aquticos e podem proliferar a
temperaturas acima de 25 C (WHO, 2006).
No mnimo 40 espcies de legionelas tm sido relacionadas a doenas, mas a espcie
mais proeminente L. pneumophila. o agente causador da febre Pontiac (casos brandos e
autolimitantes) e doenas dos legionrios (infeces com pneumonia). A rota mais comum de
infeco a inalao de aerossis sendo a aspirao identificada como rota em alguns casos.
No h evidncia de transmisso intrapessoal (WHO, 2006).
Este microorganismo est associado ao ambiente aqutico tanto natural como artificial
e tem sido isolado de gua potvel, gua subterrnea e superficial. Muitos autores tm isolado
Legionella spp. de ambientes artificiais como reservatrios de torres de resfriamento,
condensadores evaporativos, aquecedores de gua, chuveiros etc (Kim et al., 2002; Mampel et
al., 2006; Pereira et al., 1990).
Esta bactria pode ser de vida livre, planctnica, estar associada a biofilmes ou ainda
ser parasita intracelular de protozorios (Carvalho et al., 2007). Estes protozorios podem
providenciar um ambiente intracelular para a multiplicao bem como manuteno e seleo
de cepas virulentas (Lau e Ashbolt, 2009). Legionella spp. pode se desenvolver em pelo
menos 20 espcies de amebas, duas espcies de protozorios ciliados e uma espcie de bolor
(Lau e Ashbolt, 2009).
Legionella spp. no detectada por tcnicas de isolamento de heterotrficas e E. coli
no um ndice adequado para indicar presena deste organismo.

1.7.1.8 Linhagens patognicas de Escherichia coli

E.coli est presente em grandes nmeros na microbiota intestinal de humanos e
animais de sangue quente onde geralmente no causa danos. Entretanto, em algumas partes do
corpo, pode causar doenas graves como infeces do trato urinrio, bacteremia e meningite.
Um nmero limitado de linhagens enteropatognicas pode causar diarria aguda. Muitas
classes de E.coli enteropatognicas tm sido identificadas com base na diferenciao dos
fatores de virulncia incluindo E. coli enterohemorrgica (EHEC), enterotoxignica (ETEC),
enteropatognica (EPEC), enteroinvasiva (EIEC), enteroagregativa (EAEC) e por fim,
difusamente aderente DAEC (CETESB, 2009).
Para todas, o via de trasmisso fecal-oral (Maier et al. 2004) e podem causar desde
uma diarria at colite hemorrgica ou disenteria.
A transmisso pela gua das E.coli enteropatognicas tm sido documentadas para
guas recreacionais e gua potvel contaminada. Em sistemas de distribuio, medidas de
controle podem ser aplicadas para gerenciar o risco potencial incluindo proteo da gua bruta
dos dejetos de animais e humanos, tratamento adequado e proteo da gua durante a
distribuio.

1.7.1.9 Vibrio spp.

O grupo Vibrio composto de bacilos Gram negativos aerbios facultativos e bacilos
curvos com metabolismo fermentativo, sendo que a maioria apresenta flagelos polares
(Madigan, 2004). So classificados de acordo com o antgeno O, destacando-se os sorotipos
O1 e O139 de V. cholerae que causam clera (CETESB, 2009).
O sorotipo O1 ainda dividido em dois biotipos, o clssico e o El Tor. Os humanos
so os nicos hospedeiros naturais conhecidos, embora reservatrios ambientais podem
existir, aparentemente em associao com coppodos e fitoplanctn (Maier, 2004).
A clera tipicamente transmitida pela rota fecal-oral e predominantemente
contrada pela ingesto de gua ou alimentos contaminados por fezes, disseminando-se
rapidamente nos locais onde as condies sanitrias so inadequadas (CETESB, 2009).
V. cholerae altamente sensvel aos processos de desinfeco. Os sorotipos O1 e no-
O1 tm sido detectados na ausncia de E.coli e, portanto, este no um ndice adequado para
vibrios em gua potvel (WHO, 2006).

1.7.1.10 Klebsiella spp.

Klebsiella spp., so bacilos Gram negativos, no mteis que pertencem famlia
Enterobacteriaceae. Aproximadamente 60-80 % de todas as Klebsiella spp. isoladas de fezes
ou espcimes clnicas, so K. pneumoniae. K. oxytoca tambm tem sido identifiada como
patognica. No considerada uma fonte de doena gastrointestinal pela ingesto de gua
potvel, mas pode causar infeces nosocomiais por causa da colonizao de torneiras (WHO,
2006)
Klebsiella spp. capaz de sobreviver e at crescer em biofilmes de sistemas de
tratamento de gua potvel e tanques de armazenamento (LeChevallier, 1987).
Como Klebsiella spp. um coliforme, pode ser detectado por mtodos tradicionais
para coliformes totais (WHO, 2006).

5 CONCLUSES

Apesar da deteco dos coliformes totais e termotolerantes serem o principal alvo nos
programas de monitoramento, tambm deve ser dada ateno aos microorganismos
patognicos e populao geral de microorganismos visto que alguns deles so patgenos
oportunistas. Alm disso, a E. coli no um ndice adequado para indicar a presena da
maioria dos microorganismos deste estudo.
Os meios seletivos para testes presuntivos no se mostraram confiveis uma vez que
muitas amostras presuntivas no foram confirmadas por PCR ou teste bioqumico especfico.
Como algumas bactrias podem entrar em estado vivel, mas no cultivvel, os
resultados dependentes de cultivo devem ser complementados com mtodos que no
dependam de cultura.
A desagregao se mostrou eficiente na homogeneizao das amostras de biofilme
afetando muito pouco a viabilidade das clulas.
A tcnica de PCR se mostrou sensvel deteco de DNA em baixas concentraes.
Para a extrao de DNA, as bactrias Gram negativas, com exceo de S. flexneri, o mtodo
de choque trmico teve um maior rendimento de cido nuclico.
Devido ao alto nmero de deteco de bactrias potencialmente patognicas, os
biofilmes possivelmente servem como reservatrio de patgenos. Muitos destes organismos
podem persistir nos biofilmes e serem liberados na gua, representando um problema de
sade pblica que deve ser includo na avaliao de risco aplicado aos patgenos relacionados
gua. No entanto, os resultados no so ainda conclusivos uma vez que o seqenciamento
no foi realizado.






REFERNCIAS*

Alam M, Hasan NA, Sadique A, Bhuiyan N, Ahmed KU, Nusrin S. Seasonal cholera caused
by Vibrio cholerae serogroups O1 and O139 in the coastal aquatic environment of
Bangladesh. Applied and Environmental Microbiology, 2006;72(6):40964104.

American Public Health Associaton. Standard methods for the examination of water and
wastewater. Disponvel em: <http://www.standardmethods.org/store/ > [2010 mar 9].

Barker J, Brown M, et al. Trojan horses of the microbial world: protozoa and the survival of
bacterial pathogens in the environment. Microbiology,1994;140:1253.

Batt M, Appenzeller B, Grandjean D, Fass S, Gauthier V, Jorand F, et al. Biolms in
drinking water distribution systems. Reviews in Environmental Science and Biotechnology,
2003;2(2):147168.

Beech IB, Sunner J. Biocorrosion: towards understanding interactions between biolms and
metals. Current Opinion in Biotechnology, 2004;15(3):181186.

Binsztein N, et al. Viable but nonculturable Vibrio cholerae O1 in the aquatic environment of
Argentina. Applied and Environmental Microbiology. 2004;70(12):7481.

Bitton G. Wastewater Microbiology. New Jersey: Wiley Online Library; 1994.746 p.

Block JC. Biofilms in drinking water distribution systems. Em: Melo, L.M., Fletcher, M.M.,
Bott, T.R., Capdeville, L. (eds.): Biofilms science and technology. Kluwer Acad. Publ.,
Doordrecht; 469486.

Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of
protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry.
1976;72(1):248254.
*De acordo com: International Committee of Medical Journal Editors. Uniform requirements for manuscripts
submetted to Biomedical Journal: sample references. Available from: http//www.icmje.org [2007 May 22].
Brettar I, He M. Inuence of ecosystematic factors on survival of Escherichia coli after
large-scale release into lake water mesocosms. Applied and Environmental Microbiology,
1992;58(7):22012210.

Brettar I, Hoe MG. Molecular assessment of bacterial pathogensa contribution to drinking
water safety. Current Opinion in Biotechnology, 2008;19(3):274280.

Buswell CM, Herlihy YM, Lawrence LM, McGuiggan J, Marsh PD, Keevil CW, et al.
Extended survival and persistence of Campylobacter spp. in water and aquatic biolms and
their detection by immunouorescent-antibody and-rRNA staining. Applied and
Environmental Microbiology, 1998;64(2):733.

Camper AK, Jones WL, Hayes JT. Effect of growth conditions and substratum composition
on the persistence of coliforms in mixed-population biolms. Applied and Environmental
Microbiology, 1996;62(11):4014.

Camper AK. Involvement of humic substances in regrowth. International journal of food
microbiology, 2004;92(3):355364.

Carvalho FRS, Foronda AS, Pellizari VH. Detection of Legionella pneumophila in water and
biolm samples by culture and molecular methods from man-made systems in So Paulo-
Brazil. Brazilian Journal of Microbiology, 2007;38(4):743751.

CETESB (1993). Enterococos - determinao pela tcnica de membrana filtrante: mtodo de
ensaio. Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental.

CETESB (2009). Tcnicas de anlises bacteriolgicas da gua: membrana filtrante.
Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental. Apostila.

Costerton JW, Lewandowski Z, Caldwell DE, Korber DR, Lappin-Scott HM. Microbial
biolms. Annual Reviews in Microbiology, 1995;49(1):711745.

Davey ME, Otoole GA. Microbial biolms: from ecology to molecular genetics.
Microbiology and Molecular Biology Reviews, 2000;64(4):847.

Dogsa I, Kriechbaum M, Stopar D, Laggner P. Structure of bacterial extracellular polymeric
substances at different pH values as determined by SAXS. Biophysical Journal,
2005;89(4):27112720.

Vital M, Stucki D, Egli T, Hammes F. Evaluation the growth potential of pathogenic bacteria
in water. Applied and Environmental Microbiology, 2010; 76(19):6477.

Egli T. How to live at a very low concentration. Water Research, 2010; 44: 4826-4837.

Emtiazi F, Schwartz T, Marten SM, Krolla-Sidenstein P, Obst U. Investigation of natural
biolms formed during the production of drinking water from surface water embankment
ltration. Water Research, 2004;38(5):11971206.

Evans RC, Holmes CJ. Effect of vancomycin hydrochloride on Staphylococcus epidermidis
biofilm associated with silicone elastomer. Antimicrobial. Agents Chemotheraphy,
1987;31(6):889.

Environmental Protection Agency: 2002. Health risks from microbial growth and biofioms in
drinking water distribution systems environmental protection agency. Pennsylvania, 2002.

Flemming HC. Biolms and environmental protection.. Water Science & Technology,
1993;27(7-8):110

Flemming H, Percival S, Walker J. Contamination potential of biolms in water distribution
systems. Water Supply, 2002;2(1):271280.

Fox KR, Reasoner DJ, Gerting KR . Water, quality in source water, treatment and distribution
systems. In Waterborne Pathogens 2nd ed. Denver: American Water Works Association,
2006; 21-34.
Geldreich EE. Microbial quality of water supply in distribution systems. Boca Raton: Lewis
Publishers, 1996.

Gilbert P, Das J, Foley I. Biolm susceptibility to antimicrobials. Advances in Dental
Research, 1997;11(1):160167.

Hall-Stoodley L, Costerton JW, Stoodley P. Bacterial biolms: from the natural environment
to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology, 2004;2(2):95108.

Hartman AB, Venkatesan M, Oaks E, Buysse J. Sequence and molecular characterization of a
multicopy invasion plasmid antigen gene, ipaH, of Shigella exneri. Journal of Bacteriology,
1990;172(4):1905.

Harwood V, Delahoya N, Ulrich R, Kramer M, Whitlock J, Garey J. Molecular conrma tion
of Enterococcus faecalis and E. faecium from clinical, faecal and environmental sources.
Letters in Applied Microbiology, 2004;38(6):476482.

Havelaar A, Versteegh J, During M. The presence of Aeromonas in drinking water supplies in
The Netherlands. Zentralblatt fr Hygiene und Umweltmedizin. International Journal of
Hygiene and Environmental Medicine, 1990;190(3):236.

Heuer H., Krsek M., Baker P., Smalla K. Wellington M. H. E. Analysis of actinomycete
communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel-electrophoretic
separation in denaturating gradients. Applied Environment Microbiology, 1997; 63:3233-
3241.

Hutchinson M, Ridgway J. Microbiological aspects of drinking water supplies. Aquatic
Microbiology, 1977;p. 179218.

Kapley A, Lampel K, Purohit HJ. Development of duplex PCR for the detection of
Salmonella and Vibrio in drinking water. World Journal of Microbiology and Biotechnology,
2000;16(5):457458.

Kim B, Anderson J, Mueller S, Gaines W, Kendall A. Literature reviewefcacy of various
disinfectants against Legionella in water systems. Water Research, 2002;36(18):44334444.

Koneman EW, Allen SD, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. Color atlas and textbook of
diagnostic microbiology. Riverwoods: Lippincott Williams & Wilkins; 1988.

Lane A. N. Solution conformation and dynamics of the octadeoxy-nucleotide
d(CACTAGTG)2: A multinuclear n.m.r. relaxation study. Carbohydrate Research, 1991; 221:
123-144.

LeChevallier MW, McFeters GA. Enumerating injured coliforms in drinking water. Journal of
the American Water Works Association, 1985;77(6):817.

LeChevallier MW, McFeters GA. Interactions between heterotrophic plate count bacteria and
coliform organisms. Applied and Environmental Microbiology, 1985;49(5):1338.

LeChevallier MW, Babcock TM, Lee RG. Examination and characterization of distribution
system biolms. Applied and Environmental Microbiology, 1987;53(12):27142724.

LeChevallier M. Treatment to meet the microbiological MCL in the face of a coliform
regrowth problem. In: Proc. AWWA Water Quality Tech. Conf., Philadelphia, PA. American
Waterworks Association Denver, CO; 1989.

LeChevallier MW. Coliform regrowth in drinking water: a review. Journal-American Water
Works Association, 1990;82(11):7486.

Lee DY, Shannon K, Beaudette LA. Detection of bacterial pathogens in municipal wastewater
using an oligonucleotide microarray and real-time quantitative PCR. Journal of
Microbiological Methods, 2006;65(3):453467.

Madigan MT, Martinko JM, Dunlap PV, Clark DP. Microbiologia de Brock. 2 ed. So Paulo:
Pearson Education, 2004.

Maier RM, Pepper IL, Gerba CP. Environmental microbiology. 2nd ed. San Diego: Academic
Press; 2009.

Mampel J, Spirig T, Weber SS, Haagensen JAJ, Molin S, Hilbi H. Planktonic replication is
essential for biolm formation by Legionella pneumophila in a complex medium under static
and dynamic ow conditions. Applied and Environmental Microbiology, 2006;72(4):2885.

Martinez FO, Lema J, Mndez R, Cuervo-Lopez F, Role of exopolymeric protein on the
settleability of nitrifying sludges. Bioresources Technology, 2004; 94:4348.

Michalowski WD, Bressler D, Broekman S, Flemming H-C, Wingender J. Extracellular
polymeric substances in drinking water biofilms. Disponvel em:
<www.uni-due.de/imperia/md/content/biofilm-centre/michalowski_et_al.__2008__-
_poster_biofilmsiii_garching.pdfC>

Norton CD, LeChevallier MW. A pilot study of bacteriological population changes through
potable water treatment and distribution. Applied and Environmental Microbiology,
2000;66(1):268.

Oliver JD. Recent findings on the viable nut nonculturable state in pathogenic bacteria. FEMS
icrobiology, 2010; 34:415-425.

Ortiz N, Godi EL, Polakiewicz L, Pires MAF. Monitoramento de guas de superfcie
densamente poludas O crrego Pirajuara localizado na Regio Metropolitana de So
Paulo. Exacta, 2008;6(2):245-257.

Pepper IL, Gerba CP, Brusseau, ML. Environmental and Pollution Science. Academic Press,
San Diego, CA.; 2006.

Pratt LA, Kolter R. Genetic analyses of bacterial biolm formation. Current Opinion in Micro
biology, 1999;2(6):598603.

Reasoner D. Pathogens in drinking water: Are there any new ones. Environmental Protection
Agency, Cincinnati, OH (United States). Risk Reduction Engineering Lab.; 1993.
Richards JJ, Melander C. Controlling bacterial biolms. Chembiochem, 2009;10(14):2287
2294.

Rogers J, Keevil C. Immunogold and uorescein immunolabelling of Legionella pneumophila
within an aquatic biolm visualized by using episcopic differential interference contrast
microscopy. Applied and Environmental Microbiology, 1992;58(7):23262330.

Saarman N. Molecular ecology and Evolutionary genetics: Laboratory handbook. Department
of ecology and evolucionary biology. Disponvel em:
< http://bio.research.ucsc.edu/meeg/handbook.pdf > [2011 nov 22].

Salhani N. e Uelker-Deffur. Improved quantification of aggregated bacteria by combined.
enzymatic and mechanical treatment of flocs and biofilm from a rotating drum bioreactor.
Water Research, 1998; 32(4): 1287-1295.

Sen K, Rodgers M. Distribution of six virulence factors in Aeromonas species isolated from
US drinking water utilities: a PCR identication. Journal of Applied Microbiology,
2004;97(5):10771086.

September S, Brozel V, Venter S. Diversity of nontuberculoid Mycobacterium species in
biolms of urban and semiurban drinking water distribution systems. Applied and
Environmental Microbiology, 2004;70(12):7571.

Simes LC, Simes M, Vieira M. Microbial interactions in drinking water biolms.
BiofilmClub; 2007.

Singh, D. V., M. H. Matte, G. R. Matte, S. Jiang, F. Sabeena, B. N. Shukla, S. C. Sanyal, A.
Huq, and R. R. Colwell. 2001. Molecular analysis of Vibrio cholerae O1, O139, non-O1, and
non-O139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates. Appl.
Environ. Microbiol. 67: 910921.

Spilker T, Coenye T, Vandamme P, LiPuma JJ. PCR-based assay for differentiation of
Pseudomonas aeruginosa from other Pseudomonas species recovered from cystic brosis
patients. Journal of Clinical Microbiology, 2004;42(5):2074.
Szewzyk U, Szewzyk R, Manz W, Schleifer KH. Microbiological safety of drinking water.
Annual Reviews in Microbiology, 2000;54(1):81127.

Tantawiwat S, Tansuphasiri U, Wongwit W, Wongchotigul V, Kitayaporn D. Development of
multiplex PCR for the detection of total coliform bacteria for Escherichia coli and
Clostridium perfringens in drinking water, Southeast Asian Journal of Tropical Medicine and
Public Health 2005; 36(1):162169

Technology Enabled Universal Access to Sfae Water (TECHNEAU). Disponvel em: <
http://www.techneau.org/fileadmin/files/Publications/Publications/Deliverables/D5.5.4.pdf>
[2011 nov 11].

Thomas V, Bouchez T, Nicolas V, Robert S, Loret J, Lvi Y. Amoebae in domestic water
systems: resistance to disinfection treatments and implication in Legionella persistence.
Journal of applied microbiology. 2004;97(5):950963.

Tuovinen OH, Button KS, Vuorinen A, Carlson L, Mair DM, Yut LA. Bacterial, chemical,
and mineralogical characteristics of tubercles in distribution pipelines. Journal American
Water Works Association, 1980;72(11):626635.

Toze S, Sly LI, MacRae IC, Fuerst JA. Inhibition of growth ofLegionella species by
heterotrophic plate count bacteria isolated from chlorinated drinking water. Current
Microbiology, 1990;21(2):139143.

Vital M, Stucki D, Egli T, Hammes F. Evaluation the growth potential of pathogenic bacteria
in water. Applied and Environmental Microbiology, 2010; 76(19):6477.

WHO (2004). Safe Piped Water. Managing Microbial Water Quality in Piped Distribution
Systems. World Health Organization, Geneva, IWA Publishing

WHO (2006). Guidelines for drinking water quality: Recommendations. 3
rd
edition. World
Health Organization, Geneva, IWA Publishing. Wilson M. Bacterial biolms and human
disease. Science progress, 2001;84(3):235254.

Wingender J. Hygienically relevant microorganisms in biofilms of manmade water systems.
Em: Flemming H-C, Wingender J, Szewzyk U (Eds). Biofilm Perspectives. New York:
Springer International. 2004.

Windenger J e Flemming H-C. Biofilms in drinking water and their role as reservoir for
pathogens. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2011;
doi:10.1016/j.ijheh.2011.05.009.

Wolfaardt G, Lawrence J, Robarts R, Caldwell D, et al. In situ characterization of biolm
exopolymers involved in the accumulation of chlorinated organics. Microbial ecology,
1998;35(3):213223.

Zhang W, DiGiano FA. Comparison of bacterial regrowth in distribution systems using free
chlorine and chloramine: a statistical study of causative factors. Water Research,
2002;36(6):14691482.