Para Paulo Martins, a automao uma realidade na medicina, pois possibilita analisar maior

nmero de exames com segurana

O hemograma, exame que avalia as clulas sanguneas de um paciente, o mais pedido por
mdicos de todo o mundo, j que atravs dele possvel obter uma viso geral do indivduo!
"ste exame til para a investigao de anemias, in#ec$es bacterianas e virais,
in#lama$es, distrbios plaquetrios e at mesmo leucemias! Por isso, os laborat%rios clnicos
necessitam de agilidade e preciso ao reali&ar esse tipo de procedimento!
" a que a tecnologia tem contribudo e conquistado espao no ambiente de trabalho
desses pro#issionais da rea da sade!
'tualmente, instrumentos automati&ados o#erecem alta sensibilidade e preciso na
quanti#icao das clulas sanguneas, bem como na contagem di#erencial de leuc%citos!
(iversas pesquisas reali&adas j concluram que os resultados dos hemogramas liberados por
esses tipos de aparelhos so satis#at%rios e con#iveis para a rotina em laborat%rios de
hematologia!
)egundo o mdico hematologista, Paulo *oberto +uliano Martins, a demanda diria de
hemograma gira em torno de ,-. a -.. exames por dia!
/" sem a habilidade e a velocidade de modernos contadores automati&ados em hematologia,
os laborat%rios clnicos seriam incapa&es de analisar com e#ici0ncia e segurana o grande
volume de amostras que recebem diariamente1, revela Martins! "le ressalta que, com as
novas tecnologias, possvel liberar um hemograma completo com velocidade acima de 2.
testes por hora!
Para o especialista, a automao j uma realidade na medicina, pois dinami&a o processo,
possibilitando analisar maior quantidade de exames com segurana dos resultados e,
consequentemente, atender um nmero maior de pacientes! /' partir da automao,
possvel selecionar os exames alterados para um diagn%stico mais apurado! "ntretanto, o
hemograma apenas um exame complementar, necessitando da avaliao e interpretao
de um mdico, que se detectar algum tipo de alterao, passar a investigar a sade do
paciente1, completa o hematologista!

*evista 3rasileira de 4ematologia e 4emoterapia
Print version 5))6 7-7892,2,
Rev. Bras. Hematol. Hemoter. vol.23 no.2 So Jos do Rio Preto May/Aug. 2001
http:;;dx!doi!org;7.!7-<.;)7-7892,2,=..7...=...7.
Artigo Educacional
Avanos tecnolgicos em hematologia
laboratorial
Paulo C. Naoum


O recente avano cientfico e tecnolgico direcionado identificao imuno-
hematolgica de rodutos celulares !e".# citocinas$ interleucinas$ interferons$ entre
outros% sinteti&ados or determinadas c'lulas sanguneas$ (em como na
identificao de antgenos de mem(rana de leuccitos e c'lulas rogenitoras
hematooi'ticas$ romoveram e"cecional desenvolvimento no diagnstico
la(oratorial de diversas doenas hematolgicas. )omam-se a esse fato as
alica*es das t'cnicas de (iologia molecular +ue se tornam cada ve& mais
instrumentos la(oratoriais de grande definio no diagnstico e na reveno de
doenas hematolgicas$ notadamente a+uelas de origem heredit,ria. O resente
artigo teve o o(-etivo de e"or as rinciais alica*es de novas tecnologias +ue
devero ser adotadas raidamente ela moderna hematologia la(oratorial$ (em
como a de sensi(ili&ar os rofissionais hematologistas$ clnicos e la(oratoriais$ ara
a necessidade de se atuali&arem numa nova ci.ncia$ a dos rodutos celulares.
Palavras-chave: /ematologia$ (iologia molecular$ citocinas


5ntroduo
Os principais avanos cient#icos e tecnol%gicos so as principais causas de
mudanas na prtica da moderna hematologia, in#luindo especialmente no
diagn%stico laboratorial e nos procedimentos terap0uticos de algumas patologias
com destaques para anemia #alci#orme, hemo#ilias e leucemias! O progresso obtido
pela imunologia tem alavancado o desenvolvimento do diagn%stico laboratorial de
diversas doenas hematol%gicas mielo e lin#oproli#erativas, bem como determinando
especi#icidades da #isiologia leucocitria diante das toxicidades de proveni0ncias
bacterianas e virais! "ssas conquistas ultrapassaram as #ronteiras das aplica$es
laboratoriais e #orneceram conhecimentos importantes nos procedimentos
terap0uticos >7, -, 2?!
O crescimento das aplica$es tecnol%gicas que resultaram na automao dos
laborat%rios, alm de produ&ir maior grau de reprodutibilidade dos resultados de
exames e rapide& nas suas determina$es, avanou para um grau de especi#icidade
tal que dever exigir dos mdicos e dos pro#issionais de laborat%rios constantes
atuali&a$es! Os exemplos mais recentes se baseiam na moderna
imunohematologia direcionada @ di#erenciao das clulas, em especial dos
leuc%citos, por meio da identi#icao de seus antgenos conhecidos por Acluster o#
di##erentiationA ou B(, bem como da caracteri&ao #uncional das citocinas! Por
outro lado, a biologia molecular se torna cada ve& mais um instrumento laboratorial
de grande de#inio!

(i#erenciao celular ou B(
Codas as clulas possuem em suas composi$es estruturais de membranas
protenas espec#icas capa&es de serem reconhecidas por anticorpos sinteti&ados em
laborat%rios D os anticorpos monoclonais! Para os anticorpos monoclonais as
protenas de membrana de clulas blsticas, lin#%citos, mon%citos, entre outras, so
identi#icadas como Aantgenos celularesA! Porm, observou9se que grupos de
di#erentes anticorpos monoclonais reconheciam o mesmo antgeno celular presente
em mais de uma clula, quer #ossem normais, malignas ou clulas de linhagens
evolutivas! "sses antgenos de di#erenciao celular reconhecidos por grupos de
anticorpos monoclonais #oram denominados por grupo de di#erenciao celular
ou CD >8, E?! Foram reconhecidos em experimentao laboratorial perto de 7E.
di#erentes tipos de B(, conhecidos por B(7, B(=, B(G, B(,, etc!, cujas rela$es
entre as clulas identi#icadas e suas #un$es espec#icas tambm #oram
relacionadas! ' tabela 7 mostra a relao entre alguns antgenos B( selecionados
com distribuio celular e #un$es espec#icas! Hm dos exemplos mais conhecidos
da aplicao de marcadores B( se re#ere @ avaliao laboratorial da resist0ncia
imunol%gica em pacientes com '5() por meio da determinao dos lin#%citos B(,
>auxiliar? e B( 2 >citot%xico?! (a mesma #orma, a determinao do marcador B( G,
tem sido importante na determinao da presena de clulas progenitoras do
sistema hematopoitico em sangue de medula %ssea >2?! 's #iguras
7a e 7b mostram a expresso dos antgenos de super#cie durante a maturao dos
lin#%citos C e 3!


"ntretanto, com relao aos lin#%citos e macr%#agos que possvel antever a
importIncia da determinao dos B( para di#erenciar subpopula$es das
importantes clulas do nosso sistema imunol%gico, con#orme mostra atabela = >G,
8?!


'tualmente o uso de anticorpos monoclonais para identi#icar antgenos de
di#erenciao celular est sendo aplicado para investigar e caracteri&ar
laboratorialmente a maioria das leucemias agudas e crJnicas de origens miel%ide e
lin#%ide >Cabela G?!


Bitocinas
Bitocinas o termo genrico empregado para designar um grupo muito extenso de
molculas envolvidas na emisso de sinais entre as clulas durante o
desencadeamento das respostas imunes >#igura =?! Codas as citocinas so pequenas
protenas ou peptdeos, algumas contendo molculas de acar ligadas
>glicoprotenas?! 's di#erentes citocinas podem ser enquadradas em diversas
categorias: inter#erons >5F6?, interleucinas >5K?, #ator estimulador de colJnias
>B)F?, #ator de necrose tumoral >C6F e C6F?, e #ator de trans#ormao de
crescimento >CLF ?!
Os interferons so molculas proteicas particularmente importantes na limitao
da propagao de determinadas in#ec$es virais! Hm grupo de inter#erons >5F6 e
5F6? produ&ido por clulas in#ectadas por vrus, e um outro grupo >5F6 ?
sinteti&ado por determinadas clulas ou lin#%citos C ativados! Os inter#erons
indu&em um estado de resist0ncia antiviral em clulas teciduais no in#ectadas! Os
5F6 so produ&idos na #ase inicial da in#eco e constituem a primeira linha de
resist0ncia a muitas viroses >G, ,?!
's interleucinas comp$em um grande grupo de citocinas denominadas por 5K97 a
5K97-, produ&idas principalmente por clulas C, embora algumas sejam sinteti&adas
tambm por macr%#agos e clulas teciduais! 's interleucinas possuem uma
variedade de #un$es, mas a maioria delas est envolvida na induo da diviso de
outras clulas! Bada interleucina atua sobre um grupo limitado e espec#ico de
clulas que expressam receptores adequados para cada interleucina >tabela ,?! M
importante destacar que a hematopoiese regulada por mais de uma interleucina!
's 5K97 e 5K98 esto envolvidas na ativao do ciclo celular das clulas9tronco em
repouso >ou autorenovveis?! ' 5K9G est envolvida no crescimento dos precursores
das linhagens hemopoiticas da mesma #orma que o #ator estimulador de colJnias
de granul%citos;macr%#agos >LM D B)F?! 6a medida em que as clulas se
di#erenciam, citocinas espec#icas de linhagens apresentam atividades importantesN
a eritropoietina para os eritr%citos, o #ator estimulador de colJnias de macr%#agos
>M D B)F? para os macr%#agos, o #ator estimulador de colJnias de granul%citos >L D
B)F? para os granul%citos, entre outros >7, 8?!


Os fatores estimuladores de colnias >B)F? esto diretamente relacionados na
diviso e di#erenciao das clulas9tronco na medula %ssea, bem como dos
precursores dos leuc%citos sanguneos! ' quantidade de di#erentes B)F
parcialmente responsvel pelas propor$es dos di#erentes tipos celulares que sero
produ&idos! 'lguns B)F tambm promovem a di#erenciao extramedular de clulas
>G, 2?!
Finalmente outras citocinas alm das acima citadas, como so os casos do fator de
necrose tumoral 9 C6F e C6F e do fator de transformao de
crescimento >CLF ? que, embora possuem vrias #un$es, so particularmente
importantes nas rea$es in#lamat%rias e citot%xicas >8?!
6esse contexto espec#ico das citocinas, o #uturo da hematologia laboratorial
certamente dever estar direcionada na monitorao quantitativa e na
determinao qualitativa das di#erentes interleucinas, bem como nas respostas @s
rea$es #isiopatol%gicas causadas por processos in#lamat%rios e citot%xicos!

3iologia Molecular
' aplicao cada ve& mais abrangente de tcnicas de biologia molecular em anlises
clnicas pode ser resumida por meio do uso de tr0s mtodos cienti#icamente
aprovados para este #im: A)outhern blottingA, *eao em Badeia da Polimerase ou
PB*, e 4ibridi&ao A5n )ituA por Fluoresc0ncia ou F5)4!
Southern blotting: 6esta metodologia, o (6' extrado de clulas e tratado com
en&imas que rompem as liga$es qumicas entre determinadas bases nitrogenadas
da molcula de (6'! "ssas en&imas, extradas de bactrias, so conhecidas por
endonucleases de restrio! Os #ragmentos da molcula de (6' resultantes do
tratamento en&imtico so separados >ou #racionados? eletro#oreticamente!
"ntretanto, a separao dos #ragmentos de (6' somente poder ser revelada por
meio das suas impress$es extradas do gel de agarose da eletro#orese para uma
membrana de nilon ou de nitrocelulose, como se #osse um Amata borroA ou
AblottingA >em ingl0s? e reveladas por sondas radioativas! "ssa tcnica #oi descrita
pelo pesquisador "! M! )outhern em 7<E-, surgindo da o A)outhern blottingA! O
grande problema atual deste mtodo o tempo consumido para a revelao dos
resultados que chega a ser de aproximadamente uma semana >7, =, -?!
Reao em Cadeia da Polimerase PCR: O advento do PB* revolucionou a
tecnologia molecular em muitas especialidades mdicas! )eu uso laboratorial teve
grande progresso devido @ simplicidade tcnica e @ rapide& em se obter os
resultados! ' tcnica do PB* um processo rpido de replicao seletiva de um
determinado trecho do (6' genJmico Ain vitroA! ' replicao se #a& por etapas, tal
como se segue:
a? 'p%s a extrao do (6' seleciona9se o trecho que se deseja reprodu&ir ou
ampli#icar at obter a quantidade su#iciente para anliseN
b? Bom drogas espec#icas desnatura9se a dupla hlice do (6', separando9a em
duas #itas simples e correspondentes de bases nitrogenadasN
c? Bom o uso da (6' polimerase >obtido da bactria 0hermus a+uaticus D Caq
polimerase? submetida a condi$es espec#icas de tempo e temperatura >ou ciclos?,
cada #ita simples se duplica em duas novas molculas de (6'N e este processo
repetido em nmero su#iciente de ve&es para obter a quantidade necessria para
anlise, cerca de um milho de c%pias do original!
Os produtos obtidos pela tcnica do PB* podem ser analisados por vrias tcnicas
suplementares das quais a mais comum a eletro#orese em gel de agarose! Hma
variao do PB* o PB*9transcriptase reversa ou *C9PB*, que usa o *6' extrado
da amostra que se deseja analisar e dele se #a& c%pias de (6'! O (6' copiado
posteriormente replicado con#orme exposio acima! O *C9PB* particularmente
usado para anlises de transloca$es cromossJmicas >-?!
!ibridi"ao #in situ# por fluoresc$ncia %&S!: ' tcnica de F5)4 se resume
na deteco de sequ0ncias espec#icas de (6' ou *6' diretamente nos
cromossomos de clulas previamente isoladas para este #im! ' anlise reali&ada
em microsc%pio por meio da gerao de um sinal brilhante e colorido nos ncleos
das clulas em meta#ase e inter#ase! ' F5)4 particularmente til na demonstrao
de monossomias ou trissomias cromossJmicas, bem como nas transloca$es D
notadamente para a identi#icao da leucemia miel%ide crJnica D e tambm na
deteco de dele$es e ampli#ica$es de genes espec#icos >,?!
Aplicao da biologia molecular em hematologia: 's aplica$es da tecnologia
molecular em hematologia podero elucidar o conhecimento das altera$es
moleculares de doenas, tal como ocorre atualmente na caracteri&ao das les$es
do gene da globina beta nas talassemias do tipo beta e na identi#icao dos
hapl%tipos da 4b )! "ntre as tcnicas de biologia molecular, o PB* revolucionou as
tend0ncias de aplicabilidade da biologia molecular, no somente pela sua
simplicidade, mas pelo rpido diagn%stico de doenas in#ecciosas, na deteco de
doena residual mnima em diversas malignidades hematol%gicas onde se conhece
o de#eito molecular, e notadamente na deteco de portadores e no diagn%stico
pr9natal de hemo#ilias e anemias hereditrias! Finalmente, os objetivos mais
pro#undos das aplica$es dos conhecimentos de biologia molecular se direcionam
na clonagem e sequenciamento de genes para identi#icar, caracteri&ar e manipular
os gene responsveis por doenas e produtos t%xicos espec#icos >7, -?!