Tese-Victor Hugo de Oliveira Munhoz PDF

Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Cincias Exatas

Departamento de Qumica

Victor Hugo de liveira Mun!o"

#n$lise Estrutural e %opol&gica de
'eptdeos (ioativos em Meios (iomim)ticos
de Mem*ranas

(elo Hori"onte+ ,-.,

UFMG/ICEx/DQ 0 1123
%4 5163

VIC%7 HUG DE 8IVEI7# MU9H: VIC%7 HUG DE 8IVEI7# MU9H: VIC%7 HUG DE 8IVEI7# MU9H: VIC%7 HUG DE 8IVEI7# MU9H:

#n$lise Estrutural e %opol&gica de 'eptdeos (ioativos
em Meios (iomim)ticos de mem*ranas

%ese apresentada ao Departamento de
Qumica do Instituto de Cincias Exatas da
Universidade Federal de Minas Gerais
como re;uisito parcial para a o*ten<=o do
grau de Doutor em Cincias 0 Qumica

(elo Hori"onte (elo Hori"onte (elo Hori"onte (elo Hori"onte
,-., ,-., ,-., ,-.,

i

Agradecimentos

>ou muito grato aos meus orientadores? pro@essores Dorila 'il& Veloso e #ntAnio Fl$vio
de Carval!o #lcBntara por me guiarem e me apoiarem desde os tempos de gradua<=o+ me
aCudando a superar as di@iculdades ;ue eu porventura encontrava durante o camin!o4
I am verD t!anE@ul to 'ro@essor (urE!ard (ec!inger @or accepting me in !is la* during
one Dear and @or t!e advises and discussions during mD ForE *e@ore+ during and a@ter mD staD in
>tras*ourg and mostlD guiding me into t!e >olid >tate 9M7 Forld4
#grade<o *astante ao pro@essor Marcelo 'orto (em;uerer pelas discussGes cient@icas e
sugestGes valiosas dadas ao longo deste tra*al!o4
#grade<o ao pro@essor F$*io Ceneviva 8acerda #lmeida pelo enorme auxlio dado
durante os experimentos de 7M9 presentes nesta tese e em outros tra*al!os e pelas valiosas
sugestGes dadas4
#grade<o ao C9'; e C#'E> pelas *olsas+ e H UFMG e ao Departamento de Qumica4
#grade<o ao pro@essor e amigo Iar*as Magal!=es 7esende por todo apoio+ pelos
ensinamentos em 7M9 e c$lculos estruturais+ sugestGes e experincias compartil!adas ao longo
de muitos anos4
#grade<o enormemente H 7egina #d=o pela imensa aCuda nos experimentos de I%C e
pelas &timas sugestGes e palpites dados4
>ou *astante grato ao pro@essor 7odrigo Moreira VerlD por anos de ami"ade+ apoio
mJtuo e por compartil!armos diversas !ist&rias+ como a viagem H 7Jssia+ 'ortugal e por sempre
se pronti@icar a me aCudar nos momentos mais desesperadores4
#grade<o *astante+ tam*)m+ a Mariana %or;uato Que"ado de Magal!=es por sempre
trocar id)ias+ experincias e diversos outros t&picos+ sempre ensinando um pouco o mundo da
*io;umica e me @a"endo lem*rar+ ;ue em*ora @alemos lnguas um pouco di@erentes+
cienti@icamente @alando+ nos re@erimos sempre H mesma coisa4
#grade<o ao pro@essor Carlos (loc!+ por me possi*ilitar o estudo dos peptdeos com os
;uais tra*al!o nessa tese4

ii

Um grande o*rigado ao 'ro@essor Ios) Dias de >ou"a Fil!o+ por me aCudar imensamente
em min!a @orma<=o acadmica+ me puxando cada ve" mais para o mundo da 7essonBncia
Magn)tica 9uclear+ al)m das muitas experincias e !ist&rias compartil!adas ao longo desses anos
em congressos ao redor do (rasil e do mundo4
I am verD grate@ul @or C!ristop!er #isen*reD and EvgeniD >alniEov @or t!e enormous !elp
during mD staD in >tras*ourg+ Fit!out F!ic! I FouldnKt *e a*le to per@orm a @raction o@ t!e
experiments+ and also @or Iesus 7aDa+ @or patientlD teac!ing me t!e EnoF0!oFs o@ solid0state
9M7 and also @or !is !ig!0;ualitD tomatoes4
I am also verD t!anE@ul to t!e ones IKve ForEed in >tras*ourg? #rnaud+ @or t!e !elp on
CD experiments and 9M7+ '!ilippe (ertani @or t!e aid on 9M7 experiments and discussion+ I
also t!anE to t!e la* mates #nna ItEin+ (ar*ara 'errone+ Llise Glattard+ mar 7i@@i+ Matt!ias
Mic!aleE and Delp!ine HateD @or receiving me verD Fell+ @or t!e @riends!ip and also @or !elping
me in t!e ForE and in manD ot!er mattersM
#grade<o aos meus colegas de la*orat&rio4 #o >amuel pela aCuda nas snteses e
puri@ica<Ges e ao (runo+ 9aira e Danniel pela aCuda e pelas conversas nos tempos de @olga+ ;ue
me aCudaram *astante a manter a ca*e<a no lugar4
#grade<o aos meus amigos do Departamento de Qumica? Geone+ Viviane+ %iago+
7o*erta+ 8aura e Giovanni pelas conversas+ almo<os e *ons momentos no geral4
#grade<o aos meus grandes e vel!os amigos e parceiros Caio+ Daniel+ 8ui" NMax >teelO+
(runo N'iruEaO+ #lan %erra+ Daniel (oFie+ Iucas+ 7odrigo e tam*)m H M$rcia+ >ilv=o+ 9a"aret! e
Marcos pelo apoio+ conversas+ noitadas+ discussGes+ @estas+ pelo NC!icoteia+ Ieov$O+ ;ue eu
prometo escrever mais de dois textos por ano+ pelas longas conversas musicais+ e por tudo mais
;ue n=o ca*eria em poucas p$ginasM
#grade<o aos novos e grandes amigos ;ue tive o pra"er de con!ecer esse ano? aos amigos
do 7am P'aim+ (etto+ Edu e 8)oQ+ por terem me tra"ido de volta H mJsica+ aos amigos do Espa<o
Fluxo P#na+ '!an!o+ Diego+ 'aulin!a+ Carou+ Mari+ Ga*i+ Camila+ #mandita e 7enato 9egr=oQ+
pelo apoio+ conversas+ @estas e tudo mais+ H Fa*ola+ pelo apoio e por compreender meus sumi<os
pr)0tese+ Hs grandes amigas Miriam e %ita+ pelas diversas conversas e sadas+ $ #na 8ui"a+ pelo
grande suporte e preocupa<=o+ ao Marcus Ppor morar no centro da cidade e por me indicar v$rios
&timos livrosQ+ Val)ria+ #na Queir&" e 8ui" 7amos+ pelas experincias musicais+ de s!oFs+ sadas

iii

Resumo

Este tra*al!o consiste no estudo de estrutura e intera<=o com meios mim)ticos de
mem*rana dos peptdeos antimicro*ianos Distinctina+ !eterodmero composto de duas cadeias
polipeptdicas Pcadeia . e cadeia ,Q ligadas covalentemente por meio de uma liga<=o de dissul@eto
entre resduos de cistena+ e isolada de secre<Ges epiteliais de anuros da esp)cie '!Dllomedusa
distincta+ nativa da Mata #tlBntica *rasileiraR Hilaseptina ', PH>',Q e das @enilseptinas+
constitudas pelo par de epmeros S80'!e
,
T0Fenilseptina P80'!esQ e SD0'!e
,
T0Fenilseptina PD0
'!esQ+ todas as trs isoladas de glBndulas epiteliais de anuros da esp)cie HDpsi*oas punctatus+
nativa da Floresta #ma"Anica4 %odos esses peptdeos apresentam consider$vel atividade contra
*act)rias Gram0positivas e Gram0negativas e+ por isso+ !$ interesse em se estudar o mecanismo
pelo ;ual essas su*stBncias exercem essa atividade *iol&gica4 modelo de mecanismo mais
aceito para esse tipo de peptdeo+ denominado modelo de >!ai0Matsu"aEi0Huang PMatsu"aEi+
.222R >!ai+ .222R Huang+ ,---R Uang+ ,---R 'apo+ ,--VQ leva em conta @orte in@luncia da
estrutura dos peptdeos so*re suas atividades *iol&gicas4 %endo isso em vista+ surge a necessidade
de se estudar as estruturas dessas *iomol)culas para se elucidar o mecanismo de suas atividades
antimicro*ianas4
s peptdeos em ;uest=o @oram estudados a nvel estrutural utili"ando0se t)cnicas de
Dicrosmo Circular PCDQ e 7essonBncia Magn)tica 9uclear P7M9Q em solu<=o4 7esultados
mostraram ;ue todos eles apresentam estruturas terci$ria ordenadas+ ricas em 0!)lice e de
car$ter altamente an@ip$tico4 modelo estrutural do peptdeo distinctina+ em*ora ten!a
apresentado ordena<=o consider$vel levando0se em conta cada cadeia monom)rica
separadamente+ n=o apresenta orienta<=o relativa entre as duas cadeias muito *em de@inida4
7esultados de CD+ no entanto+ indicam @orte estrutura<=o 0!elicoidal+ tanto do !eterodmero
;uanto de suas cadeias monom)ricas individuais+ apesar de sugerir ;ue a intera<=o peptdeo
@os@olipdeo se d$ por meio de um e;uil*rio envolvendo mais de dois estados4 'ara a H>',+
resultados de CD em vesculas unilamelares e 7M9 em ,+,+,0tri@luoretanol P%FEQ mostraram
alto conteJdo de 0!)lice e os modelos o*tidos a partir da 7M9 apresentam ainda alto grau de
an@ipaticidade4 Estudos de 7M9 em D'C das @enilseptinas levaram a modelos tam*)m ricos em
0!)lice+ sendo ;ue a D0'!es mostrou grau de estrutura<=o ligeiramente maior ;ue a 80'!es4

iv

s experimentos de 7M9 em @ase s&lida @oram reali"ados para a H>', e as @enilseptinas+
com amostras mecanicamente orientadas contendo *icamadas do @os@olipdeo .0palmitoil0,0
oleoil@os@atidilcolina P''CQ e os respectivos peptdeos seletivamente marcados com
.V
9 e
,
H4 #
partir da medi<=o de propriedades anisotr&picas como deslocamento ;umico de
.V
9 e
desdo*ramento ;uadrupolar de
,
H+ @oi possvel determinar as possveis orienta<Ges das
estruturas calculadas com *ase nos dados de 7M9 em solu<=o e in@erir a respeito da maneira pela
;ual a intera<=o peptdeo0mem*rana ocorre4 'ara a H>',+ a an$lise conCunta dos resultados de
7M9 em solu<=o e em @ase s&lida mostrou ;ue o peptdeo interage @ortemente com a *icamada+
de @orma ;ue sua @ace !idro@&*ica est$ em contato direto com o interior ali@$tico da estrutura
@os@olipdica e orientado ;uase totalmente paralelo H super@cie da *icamada4 s epmeros 80'!es
e D0'!es+ em*ora ten!am estruturas terci$rias pr&ximas+ mostraram orienta<Ges *astante
di@erentes entre si+ evidenciando ;ue os peptdeos interagem com mem*rana de @ormas distintas4
Uma outra parte do tra*al!o di" respeito aos estudos termodinBmicos da intera<=o
peptdeo0lipossoma da H>', por meio da t)cnica de Calorimetria de %itula<=o Isot)rmica PI%CQ4
Esses estudos mostraram ;ue a intera<=o em ;uest=o ) @ortemente dependente da concentra<=o
do peptdeo no meio e ;ue+ apesar de possuir um car$ter mais eletrost$tico em um momento
inicial+ ;ue envolve a aproxima<=o do peptdeo com a mem*rana+ ela ) mantida principalmente
por intera<Ges do tipo !idro@&*icas entre os resduos de cadeia lateral apolares e o interior
ali@$tico da *icamada @os@olipdicas4 # an$lise conCunta de todos os resultados o*tidos por
di@erentes metodologias permitiu construir um modelo mais detal!ado para a intera<=o entre o
peptdeo e a mem*rana *acteriana4

v

Abstract

%!is ForE consists o@ studies on t!e structure and interactions Fit! mem*rane0mimetic
media o@ t!e antimicro*ial peptides distinctin+ an !eterodimer composed o@ tFo peptide c!ains
Pc!ain . and c!ain ,Q covalentlD *onded t!roug! a dissul@ide *ond and isolated @rom t!e sEin o@
'!Dllomedusa distincta anurans+ native @rom t!e (ra"ilian #tlantic ForestR HDlaseptin ', PH>',Q
and t!e p!enDlseptins S80'!e
,
T0'!enDlseptin P80'!esQ and SD0'!e
,
T0'!enDlseptin PD0'!esQ+ all
t!ree isolated @rom HDpsi*oas punctatus anurans+ @ound on t!e #ma"on tropical @orest4 #ll t!ese
peptides s!oF considera*le activitD against *ot! Gram0positive and Gram0negative *acteria+
reason F!D t!ere is groFing interest in *etter understanding t!e mec!anistic pat!FaD t!ese
molecules @olloF on exerting t!eir *iological activities4 %!e most FidelD accepted model @or suc!
mec!anism is t!e >!ai0Matsu"aEi0Huang model PMatsu"aEi+ .222R >!ai+ .222R Huang+ ,---R Uang+
,---R 'apo+ ,--VQ+ F!ic! taEes into account a strong in@luence o@ t!e peptidesK structures on t!eir
*iological activities4 Hence t!e need to studD t!ese peptides on a structural level in order to
propose a consistent model4
%!e a@orementioned peptides !ad t!eir structures studied and determined *D means o@
Circular Dic!roism PCDQ and solution 9uclear Magnetic 7esonance P9M7Q4 %!e results s!oFed
t!at all peptides presented Fell0ordered tertiarD structures+ all o@ t!em also ;uite ric! on 0!elical
secondarD structure and Fit! a s!arp amp!ipat!ic c!aracter4 DistinctinKs structural model+ al*eit
s!oFing considera*le ordering F!en taEing into account eac! monomeric c!ain separatelD+ did
not present a verD Fell0de@ined overall orientation o@ one c!ain in relation to t!e ot!er4 %!e CD
results+ !oFever+ indicated starE 0!elical structuration @or *ot! t!e c!ains as Fell as @or t!e
!eterodimer+ alt!oug! it suggests t!at t!e interaction *etFeen t!e peptide and t!e p!osp!olipid
is *etter descri*ed as an e;uili*rium Fit! more t!an tFo states4 For t!e H>',+ t!e results o@ t!e
CD experiments on small unilamelar vesicles and t!e 9M7 experiments in ,+,+,0triluoroet!anol
P%FEQ s!oFed a !ig! content o@ 0!elix and t!e models derived @rom t!e 9M7 data also s!oFed
a s!eer amp!ipat!ic c!aracter4 For t!e p!enDlseptins+ t!e 9M7 experiments in D'C also led to
0!elix0ric! structures+ *eing t!at D0'!es s!oFed a slig!tlD !ig!er structuration degree t!an 80
'!es4
%!e solid0state 9M7 experiments Fere per@ormed @or H>', and t!e tFo p!enDlseptins+
Fit! mec!anicallD0oriented samples containing .0palmitoDl0,0oleoDlp!osp!atidDlc!oline P''CQ

vi

*ilaDers and t!e peptides selectivelD0la*eled Fit!
.V
9 and
,
H4 From t!e measurements o@
anisotropic properties suc! as
.V
9 c!emical s!i@ts+ and
,
H ;uadrupolar splitting+ it Fas possi*le to
calculate t!e possi*le orientations @or t!e structure determined @rom t!e solution 9M7 data4 For
H>',+ t!e concomitant analDsis o@ *ot! solid0state and solution 9M7 results s!oFed t!at t!e
peptide interacts stronglD Fit! t!e *ilaDer+ in FaD suc! t!at its !Ddrop!o*ic side is in direct
contact Fit! t!e p!osp!olipidsK alip!atic c!ains and in a ;uasi0paralell orientation in relation to
t!e *ilaDerKs sur@ace4 %!e epimers 80'!es and D0'!es+ al*eit s!oFing verD similar tertiarD
structures+ t!eir calculated orientations are signi@icantlD di@@erent+ F!ic! suggests t!at t!ese
peptides interact Fit! t!e *ilaDer in distinct manners F!en comparing one to t!e ot!er4
#not!er part o@ t!is ForE comprises t!e studD o@ t!e H>', peptide0lDposome
interactionKs t!ermodDnamics t!roug! Isotermal %itration CalorimetrD PI%CQ4 %!ese studies
s!oFed t!at t!e interaction in ;uestion is stronglD dependent on t!e concentration o@ t!e peptide
on t!e media and t!at+ in spite o@ !aving a s!arp electrostatic c!aracter at an initial moment
F!ic! consist on t!e approximation o@ t!e peptide to t!e mem*rane+ it is mostlD maintained *D
!Ddrop!o*ic interactions *etFeen t!e non0polar sidec!ains and t!e mem*raneKs !Ddrop!o*ic
core4 %!e analDsis o@ t!ese results toget!er Fit! t!e 9M7 ones+ alloFed us to *uild a more
complete and detailed model @or t!e interaction *etFeen t!e peptide and t!e *acterial
mem*rane4

Sumrio
8ista de #*reviaturas e #crAnomos 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .
%a*ela de #mino$cidos 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 5
#presenta<=o 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 W
.4Introdu<=o 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V
.4.4 Estrutura peptdica 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V
.4,4 'eptdeos #ntimicro*ianos 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .-
.4,4.4 7ela<=o estrutura0atividade de peptdeos antimicro*ianos4 444444444444444444444444444444444444444444 .W
.454 >ntese em @ase s&lida de peptdeos pela estrat)gia Fmoc4 444444444444444444444444444444444444444444444444444 .V
.4W4 Caractersticas angulares de estruturas de protenas e peptdeos44444444444444444444444444444444444444444 .1
.4V4 Determina<=o de estruturas de protenas e peptdeos 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 ,.
.4V4.4 Dicrosmo Circular 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 ,.
.4V4,4 7essonBncia Magn)tica 9uclear em solu<=o 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 ,,
.4V454 7essonBncia Magn)tica 9uclear no estado s&lido 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 W-
.4V4W Caracteri"a<=o termodinBmica do processo de intera<=o peptdeo/mem*rana por
calorimetria de titula<=o isot)rmica PI%CQ 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 W5
,4 Materiais e M)todos 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 WV
,4.4 Materiais 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 WV
,4, M)todos 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 W6
,4,4.4 'rocedimento Geral 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 W6
,4,4,4 >ntese das @enilseptinas e da Hilaseptina ', 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V.
,4,454 7ea<=o de Forma<=o da Distinctina4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V,
,4,4W4 'repara<=o de Vesculas para Experimentos de Dicrosmo Circular PCDQ 4444444444444444444 V5

,4,4V4 Experimentos de Dicrosmo Circular 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V5
,4,4X4 'rocessamento e #n$lise de Experimentos de 7M9 em >olu<=o 444444444444444444444444444444444 VW
,4,464 'repara<=o das amostras para 7M9 no estado s&lido 444444444444444444444444444444444444444444444444444 VV
,4,414 Experimentos de 7M9 no estado s&lido 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 VX
,4,424 >imula<=o de parBmetros da 7M9 em @ase s&lida e determina<=o da orienta<=o dos
peptdeos em *icamadas lipdicas 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V6
,4,4.- 'repara<=o de 8ipossomas para Experimentos de Calorimetria Isot)rmica de
%itula<=o PI%CQ 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 V1
,4,4..4 Calorimetria de %itula<=o Isot)rmica 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 X-
54 7esultados e Discuss=o 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 X5
54.4 >ntese em Fase >&lida dos 'eptdeos Distinctina+ Hilaseptina ', PH>',Q e Fenilseptinas 80
'!es e D0'!es 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 X5
54.4.4 >ntese da Distinctina 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 X5
54.4,4 >ntese e 'uri@ica<=o da Hilaseptina ', PH>',Q 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 X2
54.454 >ntese da S80'!e
,
T0Fenilseptina P80'!esQ44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 65
54,4 Estudos por Espectroscopia de Dicrosmo Circular PCDQ dos 'eptdeos Distinctina+
Hilaseptina ', PH>',Q e Fenilseptinas 80'!es e D0'!es 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 6V
54,4.4 Estudos por CD da Distinctina 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 6V
54,4,4 Estudos por CD da Hilaseptina ', PH>',Q 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 62
5454 Determina<Ges Estruturais por 7essonBncia Magn)tica 9uclear P7M9Q em >olu<=o dos
'eptdeos Distinctina+ Hilaseptina ', PH>',Q e Fenilseptinas 80'!es e D0'!es 4444444444444444444444444 1-
5454.4 Determina<=o Estrutural da Distinctina por 7M9 em >olu<=o 444444444444444444444444444444444444 1.
5454,4 Determina<=o Estrutural da Hilasptina ', PH>',Q444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .-.
545454 Determina<=o Estrutural da S80'!e
,
T0Fenilseptina P80'!esQ e da SD0'!e
,
T0Fenilseptina
PD0'!esQ por 7M9 em >olu<=o 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .-2

5454W4 C$lculo e Valida<=o Estrutural a partir dos Dados de 7M9 em >olu<=o 4444444444444444444 ..X
5454V4 Estudos %opol&gicos da Intera<=o 'eptdeo0(icamada Fos@olipdica por 7essonBncia
Magn)tica 9uclear P7M9Q em Fase >&lida 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .,W
54W4 Caracteri"a<=o %ermodinBmica do 'rocesso de Intera<=o 'eptdeo/Mem*rana por
Calorimetria de %itula<=o Isot)rmica 444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .5W
54W4. Determina<=o da entalpia de intera<=o peptdeo0mem*rana 44444444444444444444444444444444444444 .5W
W4 Conclus=o 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .WW
4.1. Distinctina e Cadeias 1 e 2 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .WW
4.2. Hilseptina P2 (HSP2) 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .WX
4.3. [L-Phe
2
]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe
2
]-Fenilseptina (D-Phes) 4444444444444444444444444444444 .W6
4.4. Consideraes Finais 44444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .W1
V4 7e@erncias (i*liogr$@icas 4444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444 .V-

Lista de Abreviaturas e Acrnomos
#C9 #cetonitrila
#'D (anco de dados de peptdeos
antimicro*ianos+ do ingls #ntimicro*ial
'eptide Data*ase
.D Unidimensional
,D (idimensional
5D %ridimensional
CD Dicrosmo Circular+ do ingls Circular
Dic!roism
C8#E Cromatogra@ia l;uida de alta e@icincia
C>U Espectroscopia de correla<=o+ do ingls
Co Co Co Correlation > >> >pectroscopD DD D
DCM Diclorometano
DIC 9+9K0 diisopropilcar*odiimida
DMF 9+90dimetil@ormamida
D0'!es SD0
,
'!eT0Fenilseptina
D'C dodecil@os@ocolina+ do ingls
dodecDlp!osp!oc!oline
DQF0C>U espectroscopia de correla<=o com @iltro de
duplo ;uantum+ do ingls Dou*le0
Quantum Filtered C>U
D>> W+W0dimetil0W0silapentano0.0sul@onato de
s&dio
E4 C>U C>U editado
EM Espectrometria de massas
FID decaimento livre da indu<=o+ do ingls
Free Induction DecaD
Fmoc 20@luorenilmetoxicar*onila
H(t . 0 !idroxi*en"otria"ol
H>', Hilaseptina ',
H>QC coerncia !eteronuclear de simples0
;uantum+ do ingls H HH Heteronuclear > >> >ingle0
Q QQ Quantum C CC Co!erence
I%C calorimetria de titula<=o isot)rmica do
ingls Isot!ermal %tiration CalorimetrD

[
Constante de acoplamento escalar
K
p

Coe@iciente de parti<=o
80'!es S80
,
'!eT0Fenilseptina
8UVs Vesculas grandes unilamelares+ do ingls
8arge Unilamellar Vesicles
M#8DI Dessor<=o/ioni"a<=o de matri" assistida
por laser+ do ingls Matrix #ssisted
8aser Dessorption/Ioni"ation
M8Vs Vesculas multilamelares do ingls Multi
8amellar Vesicles
9E>U espectroscopia de e@eito nuclear

ver!auser+ do ingls 9 99 9uclear
ver!auser E EE E@@ect > >> >pectroscopD DD D
'D( *anco de dados de protenas+ do ingls
'rotein Data (anE
'?8 7a"=o peptdeo?lipdeos
7M9 7essonBncia Magn)tica 9uclear
''C .0palmitoil0,0oleoil0@os@atidilcolina
''G .0palmitoil0,0oleoil0@os@atidilglicerol
dI

calor de dilui<=o relativa H intera<=o
peptdeo0lipdeo
n]

calor total relativo H intera<=o peptdeo0
lipdeo
nt

;uantidade de calor relativa H intera<=o
peptdeo0lipdeo
QUEE9 valida<=o ;uantitativa de restri<Ges
experimentais de 7M9+ do ingls
Qu Qu Qu Quantitative E EE Evaluation o@ E EE Experimental
9 99 9M7 7estraints
7DC acoplamentos dipolares residuais+ do
ingls 7esidual Dipolar Coupling
7M>D rai" ;uadrada dos desvios m)dios
;uadrados+ do ingls 7oot Mean >;uare
Deviation+
># arre@ecimento simulado do ingls
simulated annealing
>D> dodecilsu@ato de s&dio+ do ingls >odium
DodecDl >ulp!ate
>UVs vesculas unilamelares pe;uenas+ do
ingls >mall Unimolecular Vesicules
%F# $cido tri@luoroac)tico
%FE ,+,+,0tri@luoroetanol
%I> tri0isopropilsilano
%C>U espectroscopia de correla<=o total+ do
inls %o %o %o %otal C CC Correlation > >> >pectroscopD DD D
%F tempo de vAo+ do ingls time o@ @lig!t
tr tempo de reten<=o
%ris tris0!idroxiaminometilmetano

Tabela de Aminocidos

#mino$cido #mino$cido #mino$cido #mino$cido
>m*olo de >m*olo de >m*olo de >m*olo de
uma letra uma letra uma letra uma letra
>m >m >m >m*olo de *olo de *olo de *olo de
trs letras trs letras trs letras trs letras
Massa monoisot&pica Massa monoisot&pica Massa monoisot&pica Massa monoisot&pica
Ycido asp$rtico D #sp ..V+-,X
Ycido glutBmico E Glu .,2+-W,
#lanina # #la 6.+-56
#rginina 7 #rg .VX+.-.
#sparagina 9 #sp ..W+-W,
Cistena C CDs .-5+--2
Fenilalanina F '!e .W6+-X1
Glicina G GlD V6+-,.
Glutamina Q Gln .,1+-V1
Histidina H His .56+-V1
Isoleucina I Ile ..5+-1W
8eucina 8 8eu ..5+-1W
8isina Z 8Ds .,1+-2W
Metionina M Met .5.+-W-
'rolina ' 'ro 26+-V,
>erina > >er 16+-5,
%irosina U %Dr .X5+-X5
%reonina % %!r .-.+-W6
%ripto@ano [ %rp .1X+-62
Valina V Val 22+-X1

Apresentao

Esta tese teve como o*Cetivo estudar a estrutura e a intera<=o com meios mim)ticos de
mem*rana de ;uatro peptdeos antimicro*ianos? Distinctina+ !eterodmero composto de duas
cadeias polipeptdicas PCadeia . e Cadeia ,Q ligadas covalentemente por meio de uma liga<=o de
dissul@eto entre resduos de cistenaR Hilaseptina ', PH>',Q e das @enilseptinas+ constitudas pelo
par de epmeros S80'!e
,
T0Fenilseptina P80'!esQ e SD0'!e
,
T0Fenilseptina PD0'!esQ4 %odos esses
peptdeos apresentam consider$vel atividade contra *act)rias Gram0positivas e Gram0negativas e+
por isso+ !$ interesse em se estudar o mecanismo pelo ;ual exercem essa atividade *iol&gica4
modelo de mecanismo mais aceito para esse tipo de peptdeo+ denominado modelo de >!ai0
Matsu"aEi0Huang PMatsu"aEi+ .222R >!ai+ .222R Huang+ ,---R Uang+ ,---R 'apo+ ,--VQ leva em
conta @orte in@luncia da estrutura dos peptdeos so*re suas atividades *iol&gicas4 %endo isso em
vista+ surge a necessidade de se estudar as estruturas dessas *iomol)culas para se elucidar o
mecanismo de suas atividades antimicro*ianas4
Este tra*al!o consta da Introdu<=o+ ;ue apresenta uma *reve explana<=o dos
@undamentos te&ricos das diversas t)cnicas utili"adas+ constituindo o Captulo .R4da 'arte
Experimental+ ;ue ) relatada no Captulo ,R de um terceiro captulo+ a*rangendo 7esultados e
Discuss=o+ de uma Conclus=o e+ por @im+ das 7e@erncias (i*liogr$@icas4

1.Introduo
1.1. Estrutura peptdica

s peptdeos s=o *iomol)culas ;ue contm de dois a de"enas de resduos de amino$cidos
PQuadro .4.+ p4 XQ ligados covalentemente+ atrav)s de liga<Ges peptdicas entre um grupo
car*oxila de um amino$cido e um grupo amino de outro por meio de uma rea<=o de
condensa<=o4 Como resultado dessa rea<=o+ a cadeia peptdica possui duas termina<Ges
di@erentes? uma extremidade amino Pgrupamento al@a0aminoQ+ denominada de extremidade 90
terminal e uma extremidade car*oxi Pgrupamento al@a0ca*oxilaQ+ tam*)m denominada
extremidade de C0terminal4 'or conven<=o+ a extremidade 90terminal ) considerada como o
incio de uma cadeia peptdica e a extremidade C0terminal+ o seu @inal4 Uma cadeia peptdica )
constituda por um conCunto @ormado pela repeti<=o regular dos ;uatro $tomos ;ue compGem a
liga<=o peptdica PC+ + 9+ HQ por toda a sua extens=o+ ;ue ) denominado cadeia principal+ e de
uma parte vari$vel+ dependente do resduo de amino$cido presente+ ;ue corresponde Hs distintas
cadeias laterais+ representadas como R na Figura .4. P9elson \ Cox+ ,--,Q4

Figura .4.4 Figura .4.4 Figura .4.4 Figura .4.4 7epresenta<=o es;uem$tica de uma se;uncia peptdica de um tripeptdeo+ com as
cadeias laterais representadas como R4

Sentido da cadeia
N H
2
NH
NH
OH
O O
R
1
R
2
R
3
O
ligao
peptdica
Terminao
amnica
Terminao
carboxi

Quadro .4.4 Quadro .4.4 Quadro .4.4 Quadro .4.4 Estrutura e nomenclaturas dos amino$cidos comumente encontrados em protenas
e peptdeos4

s peptdeos s=o classi@icados de acordo com ;uatro nveis estruturais? estruturas
prim$rias+ secund$rias+ terci$rias e ;uatern$rias4 Denomina0se estrutura prim$ria apenas a
se;uncia de resduos de amino$cidos do peptdeo+ em geral representada do grupo 90terminal
para o C0terminal P(erg et al4+ ,--XQ4
# estrutura secund$ria indica con@orma<=o local de alguma por<=o de um polipeptdeo4+
constituindo @ormas ou padrGes mais recorrentes+ sendo ;ue os mais importantes s=o a 0!)lice e
a @ol!a04 # ado<=o dessas di@erentes @ormas ocorre devido H varia<=o dos Bngulos diedros e
PFigura .4,+ p4 6Q ;ue+ por sua ve"+ ) *astante in@luenciada tanto pelo meio em ;ue se encontra a
protena ;uanto pela sua estrutura prim$ria4

O
NH
2
C H
3
OH
Alanina
(Ala) A
N H
O
NH
NH
2
NH
2
OH
Arginina
(Arg) R
O
O
N H
2
NH
2
OH
Asparagina
(Asn) N
OH
O H
NH
2
O
O
cido Asprtico
(Asp) D
O
NH
2
S H OH
O O
OH O H
NH
2
cido Glutmico
(Glu) E
O
O
NH
2
NH
2
OH
Glutamina
(Gln) Q
O
N H
2
OH
Glicina
(Gly) G
O
NH
2
N
H
N
OH
Histidina
(His) H
O
NH
2
CH
3
C H
3
OH
Isoleucina
(Ile) I
O
NH
2
C H
3
CH
3
OH
Leucina
(Leu) L
O
NH
2
N H
2
OH
Lisina
(Lys) K
O
NH
2
S
C H
3
OH
Metionina
(Met) M
O
NH
2
OH
Fenilalanina
(Phe) F
O
N
H
OH
Prolina
(Pro) P
O
NH
2
O H OH
Serina
(Ser) S
O
NH
2
O H
CH
3
OH
Treonina
(Thr) T
O
NH
2
NH
OH
Triptofano
(Trp) W
O
NH
2
CH
3
C H
3
OH
Valina
(Val) V
O
NH
2
O H
OH
Tirosina
(Tyr) Y
Cistena
(Cys) C
O
NH
2
R
OH
Nome
(Abreviao)
Smbolo

Figura .4,4 Figura .4,4 Figura .4,4 Figura .4,4 7epresenta<=o dos Bngulos de tor<=o dos resduos de amino$cido4

# estrutura 0!)lice PFigura .45Q ) @ormada por liga<Ges !idrognio+ atrav)s da intera<=o
intramolecular entre o oxignio da car*onila e o !idrognio do grupo amino das liga<Ges
peptdicas4 # liga<=o de !idrognio proporciona uma !)lice em torno de um eixo imagin$rio+
tendo entre cada volta da !)lice+ uma distBncia de cerca de V+W ]+ ou+ aproximadamente+ 5+X
resduos de amino$cidos P(erg et al4+ ,--XQ4

Figura .454 Figura .454 Figura .454 Figura .454 Quatro modelos de 0!)lice+ mostrando di@erentes aspectos de sua estrutura4 PaQ PaQ PaQ PaQ
@orma<=o de 0!)lice em torno de um eixoR P*Q P*Q P*Q P*Q modelo *ola e vareta+ explicitando as liga<Ges
!idrognio intracadeiasR PcQ PcQ PcQ PcQ 0!)lice vista de uma de suas termina<Ges+ ol!ando0se para *aixo
atrav)s do eixo longitudinalR PdQ PdQ PdQ PdQ vis=o lateral da 0!)lice pelo modelo espa<o preenc!ido P9elson
\ Cox+ ,--,+ p4 .,6Q4

# existncia de @orma !elicoidal em protenas depende das cadeias laterais+
desempen!ando um papel importante na esta*ili"a<=o ou desesta*ili"a<=o da 0!)lice4 7esduos
de amino$cidos com cadeias laterais com a mesma carga Ppositiva ou negativaQ ;ue esteCam

muito pr&ximos entre si podem desesta*ili"ar a @orma devido a intera<Ges repulsivas4 7esduos
de prolina e glicina apresentam normalmente impedimento para a ocorrncia de @ormas
!elicoidais4 9o caso do resduo de prolina+ o $tomo de nitrognio @a" parte de um anel rgido+
impedindo a rota<=o em torno da liga<=o N C
u
e+ conse;uentemente+ a ocorrncia de @orma
!elicoidal4 #l)m disso+ a ausncia de !idrognio ligado ao nitrognio do resduo de prolina n=o
proporciona esta*ili"a<=o de @ormas !elicoidais por liga<Ges !idrognio4 9o caso da glicina+ a
@lexi*ilidade con@ormacional des@avorece a @orma !elicoidal+ proporcionando @re;uentemente a
ocorrncia de @ormas glo*ulares ou+ simplesmente+ a ausncia de uma @orma pre@erencial em
se;uncias polipeptdicas ;ue a conten!am P9elson \ Cox+ ,--,Q4
# ocorrncia de @orma !elicoidal pode ser in@luenciada tam*)m pelos dipolos oriundos
das car*onilas4 #ssim+ dipolos el)tricos presentes nas liga<Ges peptdicas e nas cadeias laterais
resultam em intera<Ges eletrost$ticas com as extremidades da cadeia polipeptdicas+
desestruturando @ormas !elicoidais P9elson \ Cox+ ,--,Q4
9a estrutura secund$ria do tipo @ol!a0+ as cadeias polipeptdicas apresentam uma
disposi<=o em "igue0"ague4 Essas cadeias podem ser dispostas lado0a0lado+ @ormando estruturas
;ue se assemel!am a @ol!as4 9esse caso+ as liga<Ges de !idrognio s=o @ormadas entre resduos
das cadeias polipeptdicas adCacentes4 #s liga<Ges !idrognio ocorrem entre resduos distantes
entre si na cadeia+ podendo ocorrer tam*)m entre cadeias di@erentes4 emparel!amento de
resduos resultante desse tipo de intera<Ges pode resultar em dois padrGes di@erentes de
disposi<=o das @itas0? a @orma antiparalela e a @orma paralela+ am*as mostradas na Figura .4W Pp4
2Q4 9a @orma antiparalela+ as @itas0 encontram0se em sentidos contr$rios+ en;uanto ;ue+ na
paralela+ essas cadeias peptdicas encontram0se dispostas de @orma alin!ada ;uanto ao sentido
Pi4e4 9 para CQ4 Esse tipo de estrutura secund$ria+ no entanto+ n=o costuma ser muito comum em
peptdeos constitudos por poucos resduos de amino$cido+ sendo mais recorrentes em protenas
de altas massas moleculares P9elson \ Cox+ ,--,Q4

4

Figura .4W Figura .4W Figura .4W Figura .4W4 Estruturas de cadeias polipeptdicas+ mostrando em PaQ PaQ PaQ PaQ a con@orma<=o 0
antiparalela+ em ;ue os $tomos de car*ono+ oxignio e nitrognio do es;ueleto peptdico n=o se
encontram alin!ados Pcomo pode ser visto pela perspectiva lateralQ e em P*Q P*Q P*Q P*Q a con@orma<=o
paralela4 P9elson \ Cox+ ,--,+ p4 .,2Q4

utro padr=o de estrutura secund$ria ) denominado de do*ra PFigura .4VQ+ sendo um
elemento de conex=o entre @ragmentos de resduos apresentando con@orma<Ges 0antiparalelas4
# estrutura apresenta um do*ramento de .1-^+ envolvendo geralmente ;uatro resduos de
amino$cido4 oxignio da car*onila entre o primeiro e o segundo resduo @orma uma liga<=o
!idrognio com o !idrognio do grupo amino locali"ado a trs ou ;uatro resduos de distBncia4
s demais grupos presentes na se;uncia n=o participam da @orma<=o dessa estrutura secund$ria
PFigura .4VaQ4 utro tipo de do*ra pode ser @ormado tam*)m pela ado<=o da con@orma<=o cis de
resduos de prolina+ con@orme mostrado na Figura .4V* P9elson e Cox+ ,--,Q4

Figura Figura Figura Figura .4V4 .4V4 .4V4 .4V4 Pa Pa Pa PaQ QQ Q Estrutura geral de uma do*ra + indicando os ;uatro resduos de amino$cidos
Prepresentados envoltos nos crculos a"uisQ ;ue a constituem4 P*Q P*Q P*Q P*Q @ormas em ;ue os resduos de
prolina podem se encontrar Pcis e transQ4 P9elson e Cox+ ,--,+ p4 .5-Q4

PaQ

Denomina0se de estrutura terci$ria ao arranCo tridimensional de todos os $tomos em uma
protena4 # estrutura terci$ria indica o arranCo espacial relativo entre os motivos estruturais
de@inidos como estruturas secund$rias+ *em como o arranCo tridimensional de regiGes entre tais
motivos4
'eptdeos contendo duas ou mais cadeias polipeptdicas ligadas entre si adotam arranCos
com su*unidades em complexos tridimensionais4 Esse nvel mais elevado de organi"a<=o )
denominado estrutura ;uatern$ria P9elson \ Cox+ ,--,Q4
1.2. Peptdeos Antimicrobianos

'eptdeos antimicro*ianos s=o componentes de sistemas de imunode@esa inatos a
diversos organismos multicelulares4 >ua ampla distri*ui<=o em diversas esp)cies+ tanto do reino
animal ;uanto do reino vegetal sugere o importante papel ;ue essas su*stBncias tm na evolu<=o
de organismos multicelulares complexos4 #pesar de estarem presentes nesses organismos !$
muitas eras+ essas su*stBncias tm mantido e@icientemente seus pap)is imuno0de@ensivos4
Existe uma diversidade enorme de peptdeos antimicro*ianos4 *anco de dados de
peptdeos antimicro*ianos P#'D _ #ntimicro*ial 'eptide Data*ase+
!ttp?//aps4unmc4edu/#'/main4p!pQ registra atualmente .V.1 peptdeos+ sendo ;ue 21
apresentam propriedades antivirais+ WW, propriedades anti@Jngicas+ ..X1 anti*acterianas e 21
mostram atividade anticBncer4 s peptdeos antimicro*ianos podem se diversi@icar
principalmente pela composi<=o e estrutura4 %ais caractersticas re@letem a adapta<=o das
esp)cies ao microam*iente em ;ue vivem4 Uma classe importante destas su*stBncias ) os
peptdeos an@ip$ticos lineares ou dim)ricos encontrados em muitas esp)cies+ inclusive plantas+
an@*ios+ insetos ou !umanos P(evins \ :aslo@@+ .22-Q4
s an@*ios apresentam uma enorme diversidade desses peptdeos PCsordas \ Mic!l+
.26-R Ho@@mann et al4+ .215Q4 9a pele de anuros encontram0se muitos peptdeos *iologicamente
ativos+ sendo os peptdeos antimicro*ianos considerados como os mais avan<ados participantes
do sistema imunol&gico desses animais P(oman+ .22VR :aslo@@+ ,--,Q4 Em .222+ @oi descrito o
isolamento de diversos peptdeos antimicro*ianos isolados da pele de anuros da esp)cie
'!Dllomedusa distincta P(atista et al4+ .222Q+ dentre eles a distinctina P(atista et al4+ ,--.Q+
peptdeo !eterodim)rico+ com am*as as cadeias amidadas na extremidade C0terminal+ cuCa
estrutura prim$ria encontra0se representada na Figura .4X Pp4 ..Q4

ENREVPPGFTALIKTLRKCKII
NLVSGLIEARKYLEQLHRKLKNCKV

Figura .4X4 Figura .4X4 Figura .4X4 Figura .4X4 >e;uncia peptdica da distinctina+ com a representa<=o da liga<=o dissul@eto entre os
resduos de cistena4

Considerando os resultados de testes de atividade *iol&gica+ veri@icou0se ;ue a distinctina
possui atividade antimicro*iana contra diversos tipos de *act)ria+ Gram0positvas ou Gram0
negativas P(atista et al4+ ,--.Q4 #l)m disso+ v$rios outros estudos @oram @eitos+ como dicrosmo
circular PCDQ e espectroscopia na regi=o do in@ravermel!o PIVQ+ ;ue indicaram grande presen<a
de estruturas secund$rias do tipo @ol!a0+ al)m da ocorrncia em menor escala da estrutura
secund$ria 0!)lice P(atista et al4+ ,--.Q4 estudo por ressonBncia magn)tica nuclear P7M9Q em
meio a;uoso @orneceu estruturas tridimensionais do peptdeo+ indicando a predominBncia de
estruturas 0!)lice nas cadeias+ por)m com uma intera<=o entre as mol)culas da distinctina+ duas
a duas+ sugerindo a presen<a do peptdeo na @orma tetram)rica P7aimondo et al4+ ,--VQ+
con@orme mostrado na Figura .464

Figura .464 Figura .464 Figura .464 Figura .464 Estruturas o*tidas por 7M9 do !eterodmero distinctina em $gua4 Em PaQ PaQ PaQ PaQ )
representado o conCunto de estruturas so*repostas+ visuali"ando0se somente a cadeia principal
das estruturas+ com a @orma<=o do tetrBmero envolvendo duas mol)culas da distinctina4 #
Cadeia . est$ representada em a"ul0escuro e verde escuro+ e a Cadeia ,+ em ciano e verde0claro+
de acordo com a su*unidade de distinctina em ;ue se encontram4 Em P*Q P*Q P*Q P*Q ) mostrada a estrutura
tetram)rica mais representativa+ com a Cadeia . em roxo e a Cadeia , em vermel!o P7aimondo
et al4+ ,--VQ4
aQ
*Q

7ecentemente+ parte do mecanismo de intera<=o com mem*ranas @os@olipdicas @oi
elucidada por meio de estudos de 7M9 em estado s&lido+ onde pAde0se identi@icar uma
con@orma<=o distinta da o*tida por 7M9 em solu<=o P7esende et al4+ ,--2Q4 Esse estudo indica
;ue a distinctina altera signi@icativamente sua con@orma<=o ;uando interage com a *icamada
@os@olipdica+ interagindo em sua @orma monom)rica Pdi@erentemente da @orma tetram)rica
descrita em am*iente a;uosoQ+ com as cadeias orientadas paralelamente uma em rela<=o H outra+
de @orma ;ue as 90termina<Ges encontram0se em posi<Ges opostas entre si con@orme mostrado
na Figura .414

Figura .414 Figura .414 Figura .414 Figura .414 7epresenta<=o do peptdeo distinctina Pcadeias laterais polares em verde e apolares
em a"ulQ interagindo com *icamada lipdica Prepresentada em cin"aQ P7esende et al4+ ,--2Q4
utra classe de peptdeos antimicro*ianos isolados de pele de anuros ) a das @enilseptinas4
Esses peptdeos @oram isolados de anuros da esp)cie HDpsi*oas punctatus+ nativas da Floresta
#ma"Anica4 Dois peptdeos compGem essa rec)m0desco*erta classe? S80
,
'!eT0Fenilseptina P80
'!esQ e SD0
,
'!eT0Fenilseptina PD0'!esQ4 Esses dois peptdeos+ tam*)m amidados na extremidade
C0terminal e cuCas estruturas prim$rias est=o representadas na %a*ela .4.+ constituem um par de
epmeros+ e di@erenciam0se pela con@igura<=o do segundo resduo de @enilalanina PF,+ ou
,
'!e+
con@orme a nomenclatura utili"ada para esses peptdeosQ4 9a 80'!es+ encontra0se presente o
esteroisAmero 8 da @enilalanina e na D0'!es+ o estereoisAmero D4 # caracterstica ;ue de@ine esta
nova classe de peptdeos ) o alto conteJdo de resduos de @enilalanina+ presente na extremidade
90terminal+ constituindo um motivo estrutural conservado cuCa se;uncia ) '!e0'!e0'!e4
#m*os os peptdeos s=o encontrados na secre<=o epitelial dessa esp)cie de anuro4
%a*ela .4.4 %a*ela .4.4 %a*ela .4.4 %a*ela .4.4 >e;uncia de amino$cidos dos peptdeos 80'!es e D0'!es+ com as numera<Ges dos
resduos de amino$cido seguindo a ordem convencional da extremidade 90terminal H C0
terminal+ com a amida<=o desta Jltima representada pelo grupo _9H, H direita da representa<=o
do Jltimo resduo

isolamento desses peptdeos est$ descrito em Pde Magal!=es et al4+ ,-.,Q e @oram
estudadas+ tam*)m+ no mesmo tra*al!o+ as propriedades gustativas+ *em como as atividades
antimicro*ianas dessas su*stBncias4 Em rela<=o Hs propriedades gustativas+ muitos dos peptdeos
antimicro*ianos isolados da pele de anuros apresentam o sa*or amargo ;uando experimentado
por !umanos e este sa*or ) normalmente associado com resduos de cadeias laterais
!idro@&*icas+ em especial resduos de @enilalanina PIs!i*as!i+ .211R Zim+ ,--XR Mae!as!i+ ,--2Q4
#l)m da in@luncia do car$ter !idro@&*ico dos resduos de amino$cido+ @oi o*servado ;ue a
locali"a<=o desses resduos na cadeia polipeptdica tam*)m ) determinante para o sa*or amargo
P8elC+ .21-R tagiri+ .21VQ4 Essa propriedade gustativa evidencia o possvel papel dessas
su*stBncias no mecanismo de de@esa contra certos predadores+ uma ve" ;ue o sa*or amargo
propiciado por esses peptdeos tornaria o sa*or de indivduos dessa esp)cie repulsivo para certos
predadores4 Dessa maneira+ o papel *iol&gico desses peptdeos n=o seria apenas relativo H de@esa
desses animais contra agentes patognicos+ mas contra potenciais predadores4
De @ato+ tais propriedades aversivas devido ao sa*or amargo @oram o*servadas para
am*os os peptdeos ;uando testados em camundongos geneticamente modi@icados ;ue n=o
possuem o canal n=o0seletivo %rpmV+ ;ue teria papel importante na percep<=o do amargor em
mam@eros P7ossler+ .221R 'ere"+ ,--,Q e comparando os resultados com os o*servados em
camundongos ;ue possuem tal canal4 #pesar da di@eren<a estrutural no motivo ;ue teria
in@luncia so*re o sa*or amargo P'!e0'!e0'!eQ+ n=o @oram o*servadas di@eren<as entre o
potencial aversivo das duas su*stBncias Pde Magal!=es et al4+ ,-.,Q4
'or outro lado+ os resultados de atividade antimicro*iana mostraram consider$vel
di@eren<a entre os dois epmeros4 D0'!es apresentou atividade duas ve"es maior contra *act)rias
>4 aureus Pconcentra<=o ini*it&ria mnima PCIMQ de 5,+V M para D0'!es e de XV+V M para a 80
'!esQ e oito ve"es maior para `4 axonopodis ;ue a 80'!es Pde Magal!=es et al4+ ,-.,Q4 Esses
resultados indicam ;ue a di@eren<a na con@igura<=o do car*ono al@a do resduo de F, tem
consider$vel e@ic$cia nas atividades *actericidas das @enilseptinas+ uma ve" ;ue se perce*e @orte
in@luncia da estrutura<=o de peptdeos antimicro*ianos em geral no momento da intera<=o com
os agentes patognicos so*re suas respectivas atividades *iol&gicas+ con@orme ser$ discutido no
item .4,4. Pp4 .WQ4
%am*)m isolado de anuros da esp)cie HDpsi*oas punctatus+ o peptdeo Hilaseptina ',
PH>',+ cuCa se;uncia ) mostrada na %a*ela .4,+ p4 .WQ apresenta consider$vel atividade

antimicro*iana contra *act)rias Gram0positivas e Gram0negativas P(loc! Ir4+ ,-..Q4 %rata0se de
um peptdeo ainda in)dito na literatura+ ;ue apresenta grande !omologia em sua estrutura
prim$ria+ com outros peptdeos encontrados na pele de anuros como a Dermadistinctina Z
PVerlD et al4+ ,--2Qe as pr&prias @enilseptinas4 #l)m disso+ a representa<=o da sua mol)cula na
proCe<=o de Edmundson PFigura .42Q mostra ;ue este peptdeo+ na @orma 0!elicoidal+ apresenta
estrutura altamente an@ip$tica+ sendo+ portanto+ coerente com as propriedades normalmente
o*servadas em peptdeos antimicro*ianos de peles de anuros4
%a*ela .4,4 %a*ela .4,4 %a*ela .4,4 %a*ela .4,4 >e;uncia de amino$cidos dos peptdeos H>',+ com a numera<=o dos resduos de
amino$cido seguindo a ordem convencional da extremidade 90terminal H C0terminal+ com a
amida<=o desta Jltima representada pelo grupo _9H, H direita da representa<=o do Jltimo
resduo

Figura .424 Figura .424 Figura .424 Figura .424 7epresenta<=o do peptdeo H>', na proCe<=o de Edmundson+ com os resduos
apolares em amarelo+ os positivamente carregados em verde+ os negativamente carregados em
roxo+ os polares n=o0carregados em a"ul e os resduos de glicina em rosa4

1.2.1. Relao estrutura-atividade de peptdeos antimicrobianos.
motivo de se estudarem as pre@erncias con@ormacionais de peptdeos reside no @ato de
a estrutura da;ueles ;ue s=o antimicro*ianos estar intrinsecamente relacionada ao seu
mecanismo de a<=o4 V$rios estudos dessa nova classe de su*stBncias *iologicamente ativas
mostraram ;ue muitos desses peptdeos exercem sua atividade por meio de permea*ili"a<=o de

mem*ranas *acterianas P(ec!inger+ .222R Vogt et al4+ .222Q4 Grande parte desses peptdeos adota
pre@erencialmente @ormas 0!elicoidais em meios ;ue mimeti"am mem*ranas P[rig!t+ .212R
[at!ric!+ .212R Clore \ Gronen*orn+ .22.Q4 #credita0se ;ue a permea*ili"a<=o da mem*rana )
@acilitada pela ado<=o dessa estrutura secund$ria P[ester!o@@ et al4+ .212Q4
modelo de mecanismo ;ue explica a atividade da maior parte dos peptdeos
antimicro*ianos ) o modelo >!ai0Matsu"aEi0Huang P>MHQ PMatsu"aEi+ .222R >!ai+ .222R Uang et
al4+ ,---Q ;ue propGe a intera<=o do peptdeo com a mem*rana+ seguida por deslocali"a<=o de
lipdeos+ altera<=o da estrutura da mem*rana e+ em alguns casos+ a entrada do peptdeo no
interior da c)lula4 Entretanto+ n=o se sa*e de @orma detal!ada o mecanismo+ especialmente como
se d$ a intera<=o entre peptdeo e mem*rana4 'ara explicar essa etapa+ surgiram v$rias !ip&teses+
incluindo despolari"a<=o da mem*rana P[ester!o@@+ Iuretic et al4+ .212Q+ @orma<=o de poros
P(ier*raum \ >a!l+ .21VR Uang+ [eiss et al4+ ,---Q+ ativa<=o de processos como a indu<=o de
!idrolases ;ue degradam a parede celular P(ier*raum \ >a!l+ .21VQ+ desordenamento da
estrutura da *icamada lipdica PMatsu"aEi+ .222Q e destrui<=o da c)lula por interiori"a<=o do
peptdeo PZragol et al4+ ,--.Q4
%endo em vista a necessidade de se elucidar+ de @orma completa+ os mecanismos de a<=o
desses peptdeos+ ) necess$ria a determina<=o de suas estruturas tridimensionais em condi<Ges
;ue mimeti"em meios @isiol&gicos4

1.3. Sntese em fase slida de peptdeos pela estratgia Fmoc.
# sntese em @ase s&lida *aseia0se na constru<=o de uma cadeia peptdica+ resduo a
resduo+ so*re um suporte s&lido insolJvel4 Esse m)todo tem algumas vantagens claras?
possi*ilita separar as cadeias peptdicas intermedi$rias somente pela retirada de solventes ou por
@iltra<=o e utili"a um menor volume de solventes+ em compara<=o com as snteses em solu<=o4
Esse m)todo consiste em acoplamentos de amino$cidos+ lavagens da resina e desprote<Ges dos
grupos 90terminais sucessivos+ sendo possvel automati"ar todo o procedimento4 'elo @ato de
sempre se utili"ar reagentes em excesso+ os rendimentos dessa modalidade de sntese s=o+ em
geral+ consideravelmente altos4 Contudo+ existem algumas desvantagens+ tais como a perda
sucessiva de rendimento ;uando um determinado acoplamento @or incompleto e o acJmulo de
impure"as na resina+ ;ue pode ocasionar rea<Ges secund$rias com o produto+ e especialmente a
@orma<=o de produtos com dele<=o de resduos de amino$cidos PC!an \ [!ite+ ,---Q4

Em geral+ para se certi@icar do sucesso das rea<Ges+ utili"am0se testes ;ualitativos simples
e de @$cil execu<=o de @orma a poderem ser utili"ados a cada acoplamento ou desprote<=o4
teste mais utili"ado para esse @im ) o %este de Zaiser P%roll \ Cannan+ .2V5Q+ ;ue identi@ica
aminas prim$rias na estrutura por meio de uma varia<=o da colora<=o da resina4
%oda sntese em @ase s&lida+ independentemente da estrat)gia empregada+ tem o mesmo
@undamento4 'rimeiramente+ todas as resinas empregadas tm uma *ase polim)rica insolJvel e
ligada a ela+ v$rios grupos reativos+ denominados ligantes+ ;ue ir=o reagir com os amino$cidos e
prend0los ao suporte insolJvel4 %odos os amino$cidos utili"ados tm seus grupos reativos
Pamino ou car*oxila e alguns grupos de cadeias lateraisQ protegidos para n=o ocorrerem muitas
rea<Ges secund$rias4 s grupos protetores da extremidade respons$vel pelo acoplamento
Pextremidade amino ou car*oxiQ devem ser l$*eis em um meio ;ue n=o cause a desprote<=o dos
grupos protetores das cadeias laterais+ de @orma ;ue estes Jltimos devem permanecer ligados aos
resduos de amino$cidos at) o @inal da sntese+ sendo denominados protetores permanentes4 Cada
derivado de amino$cido da se;uncia ) adicionado H cadeia pelo grupo n=o protegido+ sendo ;ue+
ao @inal do acoplamento+ tem0se a outra extremidade ainda protegida4 L @eita+ ent=o+ a
desprote<=o dessa extremidade e o su*se;uente acoplamento do pr&ximo resduo4 #o @inal da
sntese+ ) @eita a clivagem do peptdeo+ separando0o da resina+ e+ concomitantemente+ a
desprote<=o de todos os grupos protetores das cadeias laterais4 # Figura .4.- mostra uma
representa<=o es;uem$tica da sntese de peptdeos em @ase s&lida+ com a liga<=o do grupo H
resina+ ;ue ) a mais amplamente utili"ada4

Figura .4.-4 Figura .4.-4 Figura .4.-4 Figura .4.-4 7epresenta<=o es;uem$tica do incio da sntese de peptdeos em @ase s&lida4
Modi@icado de !ttp?//FFF4cem4com4

Ligante
Ligante
Ligante
Desproteo do grupo protetor -amino
Acoplamento do aminocido seguinte
X= Grupo protetor temporrio -amino
Y= Grupo protetor permanente de cadeia lateral
A= Grupo ativador da carboxila
Repetir
= Suporte polimrico
Ligante Ligante
Ligante Ligante
Ligante Ligante
Desproteo do grupo protetor -amino
Acoplamento do aminocido seguinte
X= Grupo protetor temporrio -amino
Y= Grupo protetor permanente de cadeia lateral
A= Grupo ativador da carboxila
Repetir
= Suporte polimrico

# estrat)gia Fmoc ) uma metodologia ;
PFmoc+ Figura .4..Q como protetor do grupo
meio *$sico+ en;uanto ;ue os grupos protetores das cadeias laterais
$cido4 Em geral+ utili"a0se para a desprote<=o uma solu<=o de piperidina e+ para a clivagem @inal+
emprega0se $cido tri@luoroac)tico P%F#Q+ ;ue provoca a ;ue*ra da liga<=o entre o peptdeo e a
resina e retira os grupos protetores
extremamente vol$til+ podendo ser retirada do meio por evapora<=o simples4 Iuntamente com os
derivados de amino$cidos s=o utili"ados compostos denominados ativadores+ ;ue ativa o
componente car*oxlico ;ue i
Comumente+ utili"am0se compostos como car*odiimidas+ sais de @os@Anio ou urAnio e
!idroxi*en"otria"ol como ativadores4 s principais ativadores utili"ados nessa estrat)gia de
sntese s=o mostrados na Figura .4., Pp4

Figura .4..4 Figura .4..4 Figura .4..4 Figura .4..4 Grupo protetor 20@luorenilmetoxicar*onila PFmocQ de termina<=o

# estrat)gia Fmoc ) uma metodologia ;ue envolve o uso do 20@luorenil
PFmoc+ Figura .4..Q como protetor do grupo 0amino4 Esse grupo ) removido @acilmente em
meio *$sico+ en;uanto ;ue os grupos protetores das cadeias laterais devem ser l$*eis em meio
se para a desprote<=o uma solu<=o de piperidina e+ para a clivagem @inal+
se $cido tri@luoroac)tico P%F#Q+ ;ue provoca a ;ue*ra da liga<=o entre o peptdeo e a
resina e retira os grupos protetores das cadeias laterais+ al)m de ser uma su*stBncia
componente car*oxlico ;ue ir$ reagir com a extremidade 90terminal desprotegida4
se compostos como car*odiimidas+ sais de @os@Anio ou urAnio e
ura .4., Pp4 .1Q4
@luorenilmetoxicar*onila PFmocQ de termina<=o
@luorenilmetiloxicar*onila
amino4 Esse grupo ) removido @acilmente em
devem ser l$*eis em meio
se para a desprote<=o uma solu<=o de piperidina e+ para a clivagem @inal+
se $cido tri@luoroac)tico P%F#Q+ ;ue provoca a ;ue*ra da liga<=o entre o peptdeo e a
das cadeias laterais+ al)m de ser uma su*stBncia
terminal desprotegida4
se compostos como car*odiimidas+ sais de @os@Anio ou urAnio e
@luorenilmetoxicar*onila PFmocQ de termina<=o 0amino4

Figura .4.,4 Figura .4.,4 Figura .4.,4 Figura .4.,4 7eagentes ativadores da car*onila mais utili"ados na sntese em @ase s&lida de
peptdeos+ na estrat)gia Fmoc4

1.4. aractersticas angulares de estruturas de protenas e
peptdeos

#pesar de essas *iomacromol)cula
con@ormacionais+ normalmente apenas uma pe;uena @ra<=o das possi*ilidades de estrutura<=o )
possvel+ devido a diversos @atores estruturais+ como repulsGes est)ricas+ aromaticidade+
intera<Ges eletrost$ticas+ de Van der [aals e liga<Ges !idrognio+ dos tipos intra e
intermoleculares4 Em seu estado nativo+ ou seCa+ H temperatura am*iente+ em solu<=o e sem
intera<Ges com outra protena+ para a maior parte desses compostos+ as distri*ui<Ges dos Bngulos
diedros da cadeia principal P+
Bngulo ) o Bngulo relativo H liga<=o peptdica+ envolvendo os $tomos
N(i +1) C
u
(i +1) PFigura .4,+ p4 6
7eagentes ativadores da car*onila mais utili"ados na sntese em @ase s&lida de

#pesar de essas *iomacromol)culas possurem uma gama enorme de possi*ilidades
e Van der [aals e liga<Ges !idrognio+ dos tipos intra e
e Q s=o restritas a apenas alguns valores4
) o Bngulo relativo H liga<=o peptdica+ envolvendo os $tomos
.4,+ p4 6Q+ e ) dependente do tipo de resduo de amino$cido4 Dev
7eagentes ativadores da car*onila mais utili"ados na sntese em @ase s&lida de
s possurem uma gama enorme de possi*ilidades
e Van der [aals e liga<Ges !idrognio+ dos tipos intra e
) o Bngulo relativo H liga<=o peptdica+ envolvendo os $tomos C
u
(i) C(i)
Q+ e ) dependente do tipo de resduo de amino$cido4 Devido

ao @ato de ser uma liga<=o amdica e apresentar e@eitos de ressonBncia+ a liga<=o peptdica possui
um car$ter parcial de liga<=o dupla4 Isso signi@ica ;ue sua rota<=o livre n=o ) possvel+ o ;ue
resulta em uma geometria da liga<=o peptdica sempre perto da planaridade4 9ormalmente+ o
Bngulo tem o valor de .1-^+ caracteri"ando uma con@orma<=o trans4 Entretanto+ con@orma<Ges
cis P b -^Q tam*)m s=o encontradas+ e s=o consideradas como parte importante na @un<=o da
protena4 7esduos de prolina+ em especial+ tm uma tendncia maior a adotar essa con@orma<=o+
principalmente em seu lado 90terminal+ con@orme mostrado na Figura .4V Pp4 2Q4 De @ato+ estudos
;ue se *asearam em considera<Ges termodinBmicas+ estimam ;ue+ em peptdeos acclicos+
aproximadamente 5-c das liga<Ges entre um resduo de prolina e um outro resduo de
amino$cido ;ual;uer podem estar na @orma cis+ en;uanto ;ue apenas .+Vc de liga<Ges peptdicas
entre dois resduos ;ue n=o seCam prolinas apresentam esse tipo de con@orma<=o P[eiss et al4+
.221Q4
utra caracterstica interessante do Bngulo diedro da liga<=o peptdica ) ;ue+ na
realidade+ existe uma distri*ui<=o de valores de ao redor de seu valor ideal4 #n$lises de diversas
estruturas prot)icas resolvidas por di@ra<=o de raios0` mostraram ;ue o desvio0padr=o desse
Bngulo de tor<=o ) de V+X^+ o ;ue resulta em desvios de planaridade de at) .,^ PMorris et al4+
.22,R Mac#rt!ur \ %!ornton+ .22XR [ilson et al4+ .221Q4
s Bngulos e + por sua ve"+ representam vari$veis mais importantes nas estruturas
dessas *iomacromol)culas4 >uas com*ina<Ges caracteri"am principalmente a estrutura
secund$ria de peptdeos e protenas e+ at) mesmo+ estruturas terci$rias4 Com *ase em
considera<Ges est)ricas+ 7amac!andran e cola*oradores P7amac!andran et al4+ .2X5Q mostraram
;ue com*ina<Ges de e dos resduos de amino$cido das cadeias polipeptdicas s=o restritas a
certas @aixas de valores+ ;ue podem ser visuali"adas no c!amado diagrama de 7amac!andran
PFigura .4.5+ p4 ,-Q4

Figura .4.54 Figura .4.54 Figura .4.54 Figura .4.54 Diagramas de 7amac!andran espec@icos para os resduos P PP PaQ aQ aQ aQ GlD+ *Q *Q *Q *Q 'ro+ cQ cQ cQ cQ Val+ dQ dQ dQ dQ
#la e P PP PeQ eQ eQ eQ diagrama de 7amac!andran generali"ado4 De P PP PaQ aQ aQ aQ a P PP PdQ dQ dQ dQ+ as cores a"ul e amarela
representam as regiGes mais @avorecidas do digrama+ a cor verde+ as regiGes adicionalmente
permitidas+ a cor cin"a as regiGes generosamente permitidas e a cor *ranca+ a regi=o proi*ida4 Em
P PP PeQ eQ eQ eQ as cores vermel!a+ amarela+ marrom0claro e *ranca representam as regiGes mais @avorecidas+
adicionalmente permitidas+ generosamente permitidas e proi*idas4 Figuras P PP PaQ aQ aQ aQ a P PP PdQ dQ dQ dQ o*tidas pelo
iCing para a estrutura de c&digo 'D( .#,W e @igura P PP PeQ eQ eQ eQ o*tida pelo programa '7CHECZ+ para
a estrutura de c&digo 'D( .#.'4

#l)m das restri<Ges est)ricas+ os Bngulos e exi*em pre@erncias de com*ina<Ges entre
si ;ue dependem do tipo de resduo envolvido e dos elementos de estrutura secund$ria+
resultando em uma distri*ui<=o mais espec@ica desses Bngulos diedros4 Como ser$ discutido

posteriormente+ o diagrama de 7amac!andran tem extrema importBncia na an$lise estrutural de
modelos experimentais e puramente te&ricos de peptdeos e protenas4

1.!. "etermina#$o de estruturas de protenas e peptdeos
Com o o*Cetivo de se o*ter um mel!or entendimento das @un<Ges *iol&gicas e
mecanismos de a<=o de peptdeos e protenas+ tornou0se imprescindvel a determina<=o de
estruturas tridimensionais em diversas condi<Ges4 Muitas s=o as t)cnicas ;ue s=o capa"es de
@ornecer tais in@orma<Ges+ por)m a 7essonBncia Magn)tica 9uclear P7M9Q vem0se consolidando
cada ve" mais como uma poderosa @erramenta para o*ten<=o de dados estruturais de peptdeos e
protenas em variados meios4 'or)m+ previamente ao estudo estrutural por 7M9+ s=o reali"ados
rotineiramente experimentos de Dicrosmo Circular PCDQ com o o*Cetivo de o*ter in@orma<Ges a
respeito de sua estrutura secund$ria e e;uil*rio entre di@erentes estados con@ormacionais de
peptdeos e protenas em um dado am*iente a ser empregado no experimento de 7M94

1.5.1. Dicrosmo Circular
# espectroscopia de dicrosmo circular PCDQ *aseia0se na a*sor<=o pre@erencial de uma
das componentes circulares da lu" plano0polari"ada por grupos crom&@oros de uma amostra
opticamente ativa4 Entrando em contato com a amostra+ essa lu" passa a apresentar certa
di@eren<a de @ase entre as amplitudes de suas componentes circulares P(ra!ms \ (ra!ms+ .21-R
Cantor \ %imas!e@@+ .21,Q4 Essa di@eren<a ) denominada elipticidade+ 0+ podendo assumir
valores positivos ou negativos+ dependendo da componente pre@erencialmente a*sorvida4
# espectroscopia CD ) muito utili"ada no estudo estrutural de peptdeos4 9esta classe de
su*stBncias+ o grupo crom&@oro de maior importBncia ) o grupo amida (R
1
(C = 0) NE
R
2
)+ correspondente H liga<=o peptdica4 #pesar de existir in@luncia de grupos arom$ticos
pertencentes Hs cadeias laterais de determinados resduos de amino$cido+ ) a an$lise das
a*sor*Bncias das liga<Ges peptdicas ;ue @ornece in@orma<Ges valiosas a respeito da estrutura
secund$ria dos peptdeos4
# intensidade e energia re@erentes Hs a*sor<Ges desses crom&@oros dependem dos valores
adotados pelos Bngulos diedros e PFigura .4,+ p4 6Q4 Isso ocorre por;ue esses Bngulos diedros
de@inem as condi<Ges de coplanaridade dos or*itais envolvidos na liga<=o peptdica4 Como os

valores desses Bngulos dependem das intera<Ges intramoleculares+ do estado de agrega<=o e das
intera<Ges ;ue o peptdeo pode @a"er com o solvente+ as a*sor<Ges s=o dependentes das
con@orma<Ges adotadas4
#trav)s do estudo por CD+ pode0se in@erir so*re a predominBncia das estruturas
secund$rias 0!)lice e @ol!a0 ou a ausncia de um padr=o estrutural recorrente Pdenominado
estrutura randAmicaQ4 Cada estrutura secund$ria Pou ausncia delaQ corresponde a determinadas
transi<Ges eletrAnicas ;ue implicam em a*sor*Bncias+ de sinal positivo ou negativo em
determinado comprimento de onda PQ4 # determina<=o da estrutura secund$ria predominante
ou estrutura secund$ria m)dia ) reali"ada por compara<=o com espectros padrGes de CD de
outras amostras cuCas estruturas secund$rias s=o con!ecidas e *em de@inidas4 Essa compara<=o )
reali"ada por meio de c$lculos de desconvolu<=o PCantor+ .21,R >reerama+ ,---Q+ em ;ue se
considera ;ue o espectro CD ) uma com*ina<=o linear de di@erentes caractersticas espectrais
indu"idas pela estrutura secund$ria de um peptdeo4 Esses espectros de CD padrGes e suas
respectivas a*sor<Ges e transi<Ges s=o mostrados na Figura .4.W4

Figura .4.W4 Figura .4.W4 Figura .4.W4 Figura .4.W4 Espectros padr=o de dicrosmo circular+ em ;ue se re@ere H 0!)liceR r+ a estruturas
randAmicas e [+ a estruturas @ol!a04

1.5.2. Ressonncia Magntica !uclear em soluo
# ressonBncia magn)tica nuclear P7M9Q ) uma t)cnica ;ue tem sido usada de @orma
crescente para a elucida<=o estrutural de *iomacromol)culas como peptdeos+ protenas e $cidos
nucl)icos PCavanag! et al4+ ,--XQ+ especialmente devido a sua versatilidade em proporcionar a
o*ten<=o de dados nos mais diversos meios+ al)m de @ornecer in@orma<Ges a respeito de aspectos
mais dinBmicos da estrutura+ *em como estados de agrega<=o e reatividade de stios4 # 7M9 tem
Negativo a 222 n*
Negativo a 209 *
Positivo a 192 * -hlice
Negativo a 218 n*
Positivo a 196 * Folha
Negativo a 195 *
Positivo a 212 n* Randmico
/nm Transio Estrutura
Negativo a 222 n*
Negativo a 209 *
Positivo a 192 * -hlice
Negativo a 218 n*
Positivo a 196 * Folha
Negativo a 195 *
Positivo a 212 n* Randmico
/nm Transio Estrutura

sido uma @erramenta poderosa para determinar a estrutura de peptdeos e protenas ativos em
mem*ranas+ sendo empregada nas @ases l;uida e s&lida4
#penas oito anos ap&s a primeira descri<=o do e@eito do spin nuclear por Isidor 7a*i em
.252 PGil+ .216Q+ estudos de elucida<=o estrutural de su*stBncias orgBnicas @oram reali"ados com
amostras s&lidas e l;uidas PGantert+ .221Q4 Em .2VW+ Iaco*son e cola*oradores utili"aram pela
primeira ve" a 7M9 em solu<=o para estudar uma *iomacromol)cula+ investigando o e@eito do
solvente nas propriedades do D9# PIaco*son et al4+ .2VWQ4 9esse estudo empregando 7M9 de
.
H+ veri@icou0se ;ue a alta viscosidade presente em solu<Ges de D9# deve0se H @orma<=o de
camadas de !idrata<=o com uma ordena<=o superior H da $gua pura4 Em .2V6 @oi o*tido o
primeiro espectro de 7M9 de
.
H de uma protena+ a ri*onuclease P>aunders et al4+ .2V6Q4 #t)
.2XV @oram pu*licados 5- tra*al!os descrevendo aplica<Ges da 7M9 a *iomacromol)culas4 9o
incio da d)cada de .26- !avia ,-- pu*lica<Ges e+ em .21-+ esse nJmero se aproximava a W4---
pu*lica<Ges+ utili"ando in@orma<Ges dos espectros de 7M9 em uma dimens=o P7M9 .DQ para
investigar propriedades espec@icas dessas estruturas PGantert+ .221Q4
s primeiros tra*al!os ;ue utili"aram a 7M9 para a o*ten<=o de estruturas
tridimensionais de *iomacromol)culas datam do incio da d)cada de .21-4 # determina<=o
estrutural do glucagon P(raun et al4+ .21.Q e o estudo con@ormacional de uma toxina de escorpi=o
em solu<=o a;uosa P#rseniev et al4+ .21WQ @oram reali"ados aplicando0se 7M9 a metodologias de
restri<Ges con@ormacionais4 Um tra*al!o de maior complexidade @oi reali"ado por :uiderFeg e
cola*oradores+ ;ue analisaram a in@luncia do lac repressor na estrutura de trs cadeias na @orma
0!elicoidal P:uiderFeg et al4+ .21WQ4 'osteriormente+ @oram reali"adas a elucida<=o estrutural da
aI0purotionina+ com resultados similares H o*tida por di@ra<=o de raios0` PClore et al4+ .21XQ e a
determina<=o do ini*idor protease II# P[illiamson et al4+ .21VQ4
# partir de meados da d)cada de .21-+ veri@icou0se o uso crescente de 7M9 em duas
dimensGes P7M9 ,DQ na an$lise tridimensional de *iomacromol)culas4 #pesar da convers=o de
dados o*tidos dos mapas de contornos de 7M9 em in@orma<Ges estruturais n=o ser um
procedimento trivial+ o uso de m)todos computacionais+ incluindo re@inamentos *aseados em
simula<Ges te&ricas+ tem sido uma @erramenta importante nesses estudos4 Esses m)todos
computacionais tiveram maior aceita<=o ap&s a determina<=o estrutural do tendamistato por
7M9 PZline et al4+ .21XQ+ com resultados similares aos o*tidos por raios0` P'@lugrat! et al4+ .21XQ4
9essa mesma )poca+ [at!ric! introdu"iu a metodologia de atri*ui<=o se;uencial+ *aseada na
identi@ica<=o de se;uncias Jnicas de resduos em cadeias polipeptdicas e de $cidos nucl)icos

P[at!ric!+ .21XQ4 #trav)s dessa metodologia pAde0se sistemati"ar a o*ten<=o de in@orma<Ges
estruturais dos mapas de contornos de 7M9 ,D4 Desde ent=o+ a espectroscopia de 7M9 e sua
aplica<=o nos estudos de *iomacromol)culas desenvolveram0se consideravelmente+ o*tendo0se
espectros em aparel!os de altas resolu<Ges e mapas de contornos multidimensionais sem
so*reposi<=o de sinais4
Uma diversi@ica<=o crescente de t)cnicas de 7M9 com*inadas a m)todos computacionais
tem sido veri@icada para determina<=o estrutural de *iomacromol)culas+ Custi@icando uma revis=o
dos seus usos em an$lises con@iguracional e con@ormacional4 #ssim sendo+ a seguir s=o descritas
as principais metodologias da 7M9 na determina<=o estrutural de peptdeos+ a*ordando as
restri<Ges con@ormacionais a partir de dados de 7M9+ as in@orma<Ges estruturais contidas em
mapas de contornos de 7M9 ,D+ a an$lise sistem$tica de con@orma<Ges locais+ as consistncias
dos dados para atri*ui<Ges estereoespec@icas n=o determinadas diretamente pelos dados de
7M9+ a convers=o dos parBmetros o*tidos experimentalmente em in@orma<Ges tridimensionais+
c$lculos te&ricos de otimi"a<=o de geometria das estruturas resultantes e as metodologias de
an$lise para validar ou n=o o modelo @inal4

1.5.2.1 "tribuio #e$uencial
m)todo de atri*ui<=o se;uencial @oi proposto por Zurt [at!ric! em .21X P[at!ric!+
.21XQ e+ utili"ando da com*ina<=o de espectros *idimensionais+ permite a o*ten<=o de
in@orma<Ges so*re as conectividades intra e inter0residuais de $tomos de !idrognio4 s espectros
C>U ou %C>U permitem o*ter conectividades intrarresiduais+ atrav)s das liga<Ges
Pacoplamento escalar IQ+ permitindo+ dessa @orma+ a identi@ica<=o do sistema de spins de cada
resduo na se;uncia peptdica4 9o mapa de contornos 9E>U+ as conectividades o*tidas se d=o
atrav)s do espa<o Pdevidas H relaxa<=o cru"ada via dipolo0dipoloQ+ podendo ser tanto do tipo
intrarresidual ;uanto inter0residual PJ
NN,
Figura .4.V*+ p4 ,VQ4 9essa etapa+ s=o identi@icadas as
correla<Ges 9E do tipo se;uencial PJ
NN
(i, i +1)+ J
uN
(i, i +1) e J
[N
(i, i + 1)Q+ ;ue permitem
identi@icar ;uais resduos de amino$cido est=o ligados entre si4 #l)m disso+ s=o utili"ados
concomitantemente mapas de contorno de experimentos !eteronucleares como
.
H+
.5
C0H>QC e
.
H+
.V
90H>QC+ por exemplo4 Esses experimentos aCudam a resolver pro*lemas de am*iguidade
de atri*ui<=o ;ue podem ser resultantes de so*reposi<Ges dos sinais4

N C C N
H
H
CH
O
H

i i
N-Terminal
C-Terminal

N C
C H
2
C
O
N C
C H
2
C
O
N C
C H
2
C
O
N C
C H
2
H H H H H H H
C
O
N
H
H

dN
dN(i,i+2)
dN(i,i+3)
dN(i,i+4)
dNN
dN
d(i,i+3)
i i i+1 i+1 i+2 i+2 i+3 i+3 i+4

Figura .4.V4 Figura .4.V4 Figura .4.V4 Figura .4.V4 7epresenta<=o de possveis intera<Ges entre $tomos de !idrognio intraresiduais PaQ PaQ PaQ PaQ4
Es;uema da representa<=o de 9Es tpicos de estrutura secund$ria 0!)lice P*Q P*Q P*Q P*Q4

%endo sido determinada a estrutura prim$ria da protena ou peptdeo+ tem0se incio H
atri*ui<=o de correla<Ges 9E caractersticas de cada estrutura secund$ria4 Como neste tra*al!o+
estudou0se somente peptdeos com estruturas secund$rias do tipo 0!)lice+ a Figura .4.V mostra
apenas os 9Es tpicos dessa estrutura secund$ria4
'or @im+ tendo sido atri*udos os sinais relativos H estrutura secund$ria+ passa0se H
atri*ui<=o de 9Es re@erentes a estruturas terci$ria e ;uatern$ria4 Devido ao @ato de esses nveis
estruturais n=o apresentarem padrGes recorrentes como as estruturas secund$rias+ a atri*ui<=o de
sinais nessa etapa+ *em como o tratamento posterior dos dados+ ) *em mais tra*al!oso+ como
ser$ discutido nos estudos reali"ados para este tra*al!o4

1.5.2.2 Converso de dados de RM! para in%orma&es estruturais
tridimensionais
#o contr$rio das t)cnicas de di@ra<=o+ grande parte dos resultados espectrosc&picos da
7M9 n=o ) usada diretamente na determina<=o das estruturas secund$ria e terci$ria de peptdeos
e protenas4 'ara tal+ restri<Ges geom)tricas con@ormacionais s=o calculadas a partir desses dados
e+ su*se;uentemente+ usadas para o c$lculo das estruturas P[at!ric!+ .21XR Cavanag! et al4+
,--XQ
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q

Existem atualmente trs principais classes de restri<Ges estruturais ;ue podem ser
distinguidas? restri<Ges de distBncia+ restri<Ges de Bngulos diedros Pou Bngulos de tor<=oQ e
restri<Ges orientacionais4
1.!.2.2.1 %estri#&es de dist'ncia
#s restri<Ges de distBncia podem ser divididas em duas classes principais? restri<Ges
derivadas de 9Es e restri<Ges de liga<=o !idrognio+ di@erenciando0se entre si tanto pela
metodologia utili"ada na a;uisi<=o dos dados de 7M9 ;uanto pelo seu e@eito no c$lculo @inal das
estruturas4
Como comentado na se<=o anterior+ as restri<Ges derivadas de 9Es tm como princpio
o @ato de+ no e@eito nuclear ver!auser+ a trans@erncia de magneti"a<=o ocorre pelo espa<o+ o
;ue propicia dois nJcleos interagirem entre si+ mesmo ;ue eles esteCam distantes entre si na
estrutura prim$ria do peptdeo4 #l)m disso+ a intensidade ou volume I do sinal de 9E )
dependente do valor m)dio da sexta potncia do inverso da distBncia r
]
entre os dois nJcleos i e
] ;ue interagem entre si+ multiplicado por um @ator (
c
)+ ;ue leva em conta e@eitos glo*ais e
movimentos internos moleculares+ con@orme representado pela E;ua<=o .4.4
I = (r
-6
)(
c
) P PP PE; E; E; E;4 4 4 4 . .. .4 44 4. .. .Q QQ Q
Em*ora seCa possvel calcular diretamente os volumes dos sinais de 9E pela E;ua<=o
.4.+ ) muito mais comum classi@icar os 9Es de acordo com sua intensidade? @ortes+ m)dios e
@racos PMarEleD et al4+ .221Q+ correspondendo+ respectivamente+ a limites superiores de distBncia
de ,+1-+ 5+W- e V+-- ]4 Em*ora+ H primeira vista+ essa metodologia possa parecer menos precisa
;ue a convers=o pela E;ua<=o .4.+ a classi@ica<=o semi;uantitativa dos 9Es re@lete mel!or as
incerte"as experimentais advindas de e@eitos como di@us=o de spin e dinBmicas locais+ *em como
erros de integra<=o dos sinais e so*reposi<Ges nos espectros P9a*uurs et al4+ ,--WQ4 L importante
notar ;ue v$rios tratamentos s=o utili"ados para uma convers=o mais e@etiva dos sinais+ levando
em conta diversos @atores+ como por exemplo degenerescncias espectrais de grupos metila e
an)is arom$ticos em resduos de amino$cido PFletc!er et al4+ .22XR Guntert+ .221Q4
#s restri<Ges de liga<=o !idrognio tam*)m levam em conta valores m$ximos e mnimos
de distBncia+ por)m+ ao contr$rio das restri<Ges de distBncia derivadas de correla<Ges 9E+ um
conCunto de duas restri<Ges ) considerado conCuntamente+ con@orme mostrado na Figura .4.X Pp4
,6Q4 Esses limites m$ximos e mnimos de distBncia s=o estipulados de @orma ;ue os $tomos ;ue
participam desse tipo de intera<=o P$tomo doador de el)trons e !idrognio aceptor de el)tronsQ

ten!am entre si distBncias consideradas &timas para ;ue ocorra a liga<=o de !idrognio Pentre .+1
e ,+- ]Q4 Em estruturas 0!)lice+ este tipo de restri<=o ) de grande utilidade+ uma ve" ;ue s=o
o*servadas comumente liga<Ges de !idrognio inter0residuais na cadeia principal dos tipos i+
i +SR i, i +4 e i, i +S+ entre $tomos de !idrognios amdicos e oxignios car*onlicos+ con@orme
mostrado na Figura .4.64

Figura .4.X4 Figura .4.X4 Figura .4.X4 Figura .4.X4 8imites de valores de distBncia para as restri<Ges de liga<=o de !idrognio em
liga<Ges peptdicas4

Figura .4.64 Figura .4.64 Figura .4.64 Figura .4.64 Estrutura 0!)lice determinada univocamente+ com representa<=o+ em tu*o
amarelo+ das trs restri<Ges de liga<=o de !idrognio possveis de ocorrer4 Figura retirada de
P9a*uurs+ >pronE et al4+ ,--WQ4
s $tomos ;ue participam da liga<=o !idrognio podem ser determinados por
experimentos ;ue permitam identi@icar $tomos de !idrognio ;ue n=o so@rem troca com
deut)rio Pou ;ue tro;uem mais lentamenteQ em solventes pr&ticos deuterados P[agner \
[ut!ric!+ .21,R Zonrat et al4+ .222Q+ por valores de deslocamento ;umico P[is!art et al4+ .22,Q+
ou constantes de acoplamento do tipo [
2h
(C'- EN) e [
3h
(C'- N) PCordier \ Gr"esieE+ .222R
Cordier et al4+ .222Q4
H
N
O
1,8 < d
OH
< 2,0
2,7 < d
OH
< 3,0
H
N
O
1,8 < d
OH
< 2,0
2,7 < d
OH
< 3,0

1.!.2.2.2. %estri#&es de 'ngulos diedros
#ssim como as distBncias interatAmicas+ os Bngulos e podem ter tam*)m seus
valores restritos+ com *ase em dados advindos de experimentos de 7M94 %radicionalmente+
utili"am0se valores de constante de acoplamento escalar do tipo [
3
+ ;ue podem ser convertidos
em valores angulares por meio da rela<=o de Zarplus PZarplus+ .2V2Q+ descrita na E;ua<=o .4,?
[(0) =
3
A cos
2
0 +B cos
2
0 +C PE;4 .4,Q PE;4 .4,Q PE;4 .4,Q PE;4 .4,Q
em ;ue corresponde ao Bngulo de tor<=o entre os ;uatro $tomos envolvidos e os trs
parBmetros A+ B e C s=o empiricamente determinados+ utili"ando0se modelos de estruturas
provenientes de experimentos de di@ra<=o de raios0`4
s valores de [
3
s=o o*tidos normalmente por experimentos de 7M9 de
.
H
unidimensionais acoplados e+ ;uando !$ resolu<=o espectral su@iciente+ t)cnicas como DQF0
C>U+ %QF0C>U e E4C>U PGriesinger et al4+ .21VR MuCee* et al4+ .222Q e '!ase >ensitive
C>U PDelaglio et al4+ ,--.Q s=o empregadas4 Entretanto+ experimentos de 7M9 de
.
H
unidimensionais s=o muitas ve"es invi$veis+ devido H grande so*reposi<=o de sinais e

os
experimentos DQF0C>U+ %QF0C>U e E4C>U n=o costumam @ornecer resultados
satis@at&rios+ em especial ;uando se tra*al!a com macromol)culas em a*undBncia natural+ em
;ue+ muitas ve"es+ as correla<Ges cru"adas n=o exi*em estrutura @ina e a maior parte das
diagonais dos multipletos se so*repGem PDelaglio et al4+ ,--.Q4 #l)m disso+ a convers=o desses
dados em restri<Ges deve ser @eita de @orma manual+ sem levar em considera<=o a imprecis=o do
experimento+ devido H @alta de algoritmos ;ue reali"em esse tipo de convers=o4 9o caso do '!ase
>ensitive C>U+ ) possvel reali"ar a convers=o dos valores de constante de acoplamento [
3
em
restri<Ges+ mas os diversos tratamentos ;ue devem ser dispensados ao espectro para ;ue se
extraiam as restri<Ges+ tornam essa t)cnica um tanto proi*itiva e pouco utili"ada4
#s restri<Ges angulares podem+ no entanto+ ser o*tidas por meio de valores de
deslocamento ;umico dos $tomos pertencentes H cadeia principal do peptdeo em estudo4 s
programas ;ue reali"am essa convers=o s=o %#8> PCornilescu et al4+ .222Q e sua vers=o mais
recente %#8>d P>!en et al4+ ,--2Q4 #m*os os programas *aseiam0se no @ato de ;ue os valores
de deslocamento ;umico s=o grande"as extremamente sensveis ao am*iente ;umico em ;ue se
encontra o nJcleo PVranEen \ 7ieping+ ,--2Q4 #ssim sendo+ com*ina<Ges dos Bngulos diedros
e contri*uem signi@icativamente para os valores de deslocamento ;umicos dos $tomos ;ue

compGem a cadeia principal da *iomol)cula4 Esses programas @a"em uso de uma *ase de dados
de deslocamentos ;umicos de $tomos de protenas cuCas estruturas @oram elucidadas com alta
resolu<=o+ utili"ando diversos c$lculos e tratamentos estatsticos e determinam com precis=o as
restri<Ges angulares4

1.!.2.2.3. %estri#&es orientacionais
%odas as restri<Ges geom)tricas descritas anteriormente s=o de curto alcance4 Em*ora elas
muitas ve"es seCam su@icientes para a determina<=o estrutural de protenas glo*ulosas e peptdeos
de massas moleculares *aixas+ o mesmo n=o pode ser dito para *iomol)culas com geometria
mais linear4 9esses casos+ @a"0se necess$ria a o*ten<=o de in@orma<Ges geom)tricas de longo
alcance envolvendo especialmente suas extremidades PClore et al4+ .222Q4 Uma grande"a medida
por 7M9 ;ue permite a o*ten<=o de in@orma<Ges dessa nature"a ) o acoplamento dipolar entre
nJcleos4 #coplamentos dipolares dependem tanto da distBncia entre dipolos magn)ticos ;uanto
de suas orienta<Ges em rela<=o ao campo magn)tico externo B
4 Entretanto+ em solu<Ges
isotr&picas+ a dependncia do valor do acoplamento dipolar em rela<=o a B
) nula+ devido ao
@ato de as amostras solu*ili"adas n=o ad;uirirem ordena<=o em ra"=o da rota<=o das suas
mol)culas e do movimento *roFniano P8ipsit" \ %Candra+ ,--WQ4
9a @orma cristalina+ por)m+ devido Hs signi@icativas restri<Ges de movimento das
*iomol)culas+ *em como ao total alin!amento de vetores dipolo magn)tico em rela<=o a B
+ os
acoplamentos dipolares resultantes s=o demasiadamente grandes+ a ponto de inter@erirem na
an$lise de 7M94 Dessa maneira+ a medida dessas grande"as em amostras na @orma cristalina )
*astante di@cil e impratic$vel na maioria dos casos4 9o entanto+ ) possvel ordenar amostras em
meios l;uidos @racamente orientados como cristais l;uidos e *icelas+ o ;ue @a" com ;ue os
acoplamentos dipolares seCam pe;uenos e mensur$veis+ sendo assim denominados de
acoplamentos dipolares residuais P7DCQ4 Esse acoplamento relaciona0se diretamente Hs colisGes
entre mol)culas da amostra e do solvente+ resultando em uma ordena<=o mnima e acoplamento
dipolar mensur$vel P%Candra \ (ax+ .226Q4 s 7DCs podem ser medidos pelos mapas de
contornos
.
H+
.V
90H>QC ou
.
H+
.5
C0H>QC sem desacoplamento na dimens=o do car*ono ou
nitrognio+ respectivamente PFigura .4.1+ p4 5-Q4

Figura .4.14 Figura .4.14 Figura .4.14 Figura .4.14 Mapas de contornos
.
H+
.V
90H>QC? PaQ PaQ PaQ PaQ desacoplado em am*as as dimensGes+ com
desdo*ramentos
.V
90
.
H n=o o*servadosR P*Q P*Q P*Q P*Q sem desacoplamento na dimens=o
.V
9+ em solu<=o
isotr&pica+ com desdo*ramentos
.V
90
.
H iguais ao acoplamento escalar
.V
90
.
H Pe2, H"QR PcQ sem
desacoplamento na dimens=o
.V
9+ meio parcialmente orientador+ desdo*ramentos
.V
90
.
H
somados aos 7DCs4

1.!.2.2.4. onstru#$o dos modelos estruturais a partir dos dados de restri#$o
conformacional( Arrefecimento Simulado
#p&s se o*terem as restri<Ges con@ormacionais+ elas s=o utili"adas para o c$lculo dos
modelos estruturais4 Diversas metodologias de c$lculo @oram utili"adas desde os primeiros
tra*al!os de determina<=o estrutural por 7M9+ sendo ;ue os protocolos mais largamente
empregados s=o o c$lculo em geometria de distBncias P(raun et al4+ .21.R Havel \ [at!ric!+
.21WQ o c$lculo por @un<Ges0alvo vari$veis P(raun \ Go+ .21VQ e o arre@ecimento simulado+
tam*)m con!ecido pela express=o em ingls simulated annealing P9ilges et al4+ .211R (runger et
al4+ .226Q4 # metodologia mais largamente utili"ada+ no entanto ) o arre@ecimento simulado4
arre@ecimento simulado ) um procedimento de minimi"a<=o de energia *aseado em
dinBmica molecular4 nome desse m)todo deriva de uma t)cnica comum em metalurgia para
preparo de estruturas met$licas mais resistentes e est$veis por meio de a;uecimentos r$pidos
alternados com res@riamentos lentos e controlados4 Durante o c$lculo dos modelos+ essa varia<=o
de temperatura ) simulada teoricamente+ mostrando0se *astante e@iciente para a o*ten<=o de
estruturas est$veis P(runger et al4+ .22-Q4 # Figura .4.2 Pp4 5.Q mostra um exemplo das mudan<as
de con@orma<=o so@ridas durante uma simula<=o de >#4 Como resultado s=o o*tidas geometrias
com energias pr&ximas ao mnimo glo*al da estruturas estudadas P9ilges et al4+ .211Q4

Figura .4.24 Figura .4.24 Figura .4.24 Figura .4.24 7epresenta<=o das mudan<as so@ridas por uma mol)cula durante o processo de
c$lculo por reco"imento simulado? PaQ PaQ PaQ PaQ na con@orma<=o e P*Q P*Q P*Q P*Q na energia P9ilges+ ,--.Q4
#pesar de o arre@ecimento simulado ser *astante e@iciente e r$pido na *usca de mnimos
locais de *aixa energia+ todo o c$lculo estrutural ) @eito sem considerar e@eito algum do solvente
ou de ;ual;uer outra mol)cula4 Uma conse;ancia disso pode ser a gera<=o de estruturas de
*aixas energias+ mas ;ue n=o condi"em com o sistema real+ uma ve" ;ue o solvente tem e@eito
consider$vel so*re a estrutura<=o dessas *iomol)culas4 'ara contornar isso+ ) recomend$vel
analisar detal!adamente os parBmetros de ;ualidade estrutural e reali"ar re@inamentos em
solvente explcito+ con@orme ser$ descrito na pr&xima se<=o4

1.!.2.2.!. An)lise* +alida#$o e ,ualidade Estrutural.
# convers=o de in@orma<Ges de 7M9 de protenas em estruturas tridimensionais tem se
mostrado dependente de metodologias computacionais+ *em como os su*se;uentes
re@inamentos e an$lises4 >e essas in@orma<Ges n=o @orem su@icientes para se o*terem estruturas
de@inidas ou se as geometrias resultantes @orem inconsistentes com essas restri<Ges+ ent=o se deve
determinar novamente o conCunto de dados de entrada at) ;ue se o*ten!a uma geometria
satis@at&ria4 8ogo ap&s se o*ter esse conCunto de estruturas+ estas s=o su*metidas H etapa
posterior de an$lise+ para determinar o grau de dispers=o entre os con@Armeros calculados+ para
in@erir a ;ualidade do conCunto resultante de estruturas e+ por @im+ validar ou n=o o m)todo4

1.3.2.2.-. +iola#&es de %estri#&es
Uma viola<=o de restri<=o signi@ica ;ue o algoritmo utili"ado n=o satis@e" as condi<Ges
con@ormacionais impostas pelas restri<Ges4 # maior parte dos erros inerentes aos c$lculos pode
Geometria Inicial
Aquecimento
Resfriamento controlado
Estrutura minimizada
Geometria Inicial
Aquecimento
Resfriamento controlado
Estrutura minimizada
alta temperatura baixa temperatura alta temperatura baixa temperatura
PaQ PaQ PaQ PaQ
P*Q P*Q P*Q P*Q

levar a dois tipos de viola<=o4 # viola<=o randAmica ) veri@icada normalmente ao @inal dos
c$lculos+ ocorrendo em regiGes di@erentes de apenas algumas con@orma<Ges o*tidas4 Quando o
desvio dos valores @inais das vari$veis geom)tricas n=o di@ere consideravelmente das restri<Ges+
essas viola<Ges randAmicas n=o comprometem a an$lise con@ormacional4 Contudo+ a
discrepBncia muito grande entre as geometrias @inais e as restri<Ges con@ormacionais
correspondentes pode surgir de erros em etapas anteriores ou do @ato de ;ue os dados utili"ados
n=o @oram su@icientes para gerar um grupo de@inido de con@orma<Ges similares4
#s viola<Ges consistentes s=o assim consideradas caso ocorram em aproximadamente
6Vc das con@orma<Ges do conCunto @inal calculado+ indicando @al!as mais graves em regiGes
de@inidas+ principalmente na atri*ui<=o nos mapas de contornos de 7M94 Esse tipo de viola<=o
pode advir de inconsistncias nos dados de entrada+ erros de atri*ui<=o+ pro*lemas de cali*ra<=o
das intensidades de sinais 9E+ ou a presen<a de diversos monAmeros no meio em ;ue @oram
ad;uiridos os dados4 nJmero e magnitude das viola<Ges de restri<=o de um conCunto de
con@orma<Ges podem indicar o grau de concordBncia entre os dados experimentais e os modelos
te&ricos empregados4 Entretanto+ a interpreta<=o desse nJmero de viola<Ges pode ser di@icultada
pelos crit)rios de sele<=o das con@orma<Ges *aseada em energia4
s programas computacionais de identi@ica<=o de viola<Ges utili"am um parBmetro
denominado valor de corte4 #s distBncias ou Bngulos a*aixo do valor de corte n=o s=o
considerados viola<Ges+ por)m+ a;ueles valores acima s=o tratados como viola<Ges4 Isto permite
avaliar se+ no conCunto @inal de geometrias de uma estrutura+ !$ viola<Ges de restri<Ges4 9o
entanto+ a utili"a<=o de um valor de corte demasiado grande pode enco*rir restri<Ges oriundas
de viola<Ges consistentes+ resultando em an$lises estruturais incorretas4 #ssim sendo+ torna0se
apropriada tam*)m a veri@ica<=o de ocorrncia de viola<Ges de restri<=o a valores de corte mais
*aixos4
#s geometrias geradas a partir das in@orma<Ges dos dados de 7M9 podem apresentar
viola<Ges estruturais+ resultando em imprecisGes de algumas regiGes espec@icas do conCunto de
geometrias geradas ou+ at) mesmo+ em estruturas terci$rias totalmente incorretas4 Desta @orma+ a
valida<=o das geometrias o*tidas pelas in@orma<Ges dos dados de 7M9 torna0se muito
importante para ;ue a an$lise con@ormacional ten!a um grau satis@at&rio de ;ualidade4
s programas utili"ados no c$lculo estrutural possuem uma gama de algoritmos ;ue
medem a ;ualidade dos resultados da an$lise4 Este n=o ) um procedimento trivial+ pois envolve
aspectos como a ;ualidade da teoria ou modelo+ amostragem e convergncia dos resultados+ *em

como a exatid=o do campo de @or<a+ a e@icincia e ade;ua<=o do so@tFare utili"ado nos c$lculos
P>pronE et al4+ ,--WQ4 # valida<=o pode resultar em uma concordBncia entre o experimento e o
modelo4 Isso pode indicar ;ue a simula<=o re@lete realmente o sistema experimental+ a t)cnica de
simula<=o utili"ada ) insensvel H propriedade estudada ou !ouve compensa<=o de erros4 'or sua
ve"+ a n=o concordBncia entre os resultados te&ricos e experimentais pode ser devida ao modelo
estar incorreto+ a um campo de @or<a inade;uado+ H n=o convergncia da simula<=o+ a pro*lemas
e a usos incorretos do so@tFare+ a dados incorretos+ ou at) mesmo uma estrutura pouco comum
PVan Gunsteren+ .221Q4
1.!.2... onte/do de 0nforma#$o como Par'metro de ,ualidade
Devido ao @ato de a determina<=o estrutural de peptdeos e protenas por 7M9 depender
de uma densa rede de restri<Ges geom)tricas de v$rios tipos+ existe uma tendncia em considerar
;ue ;uanto maior @or o nJmero de restri<Ges utili"adas+ mel!or ) a ;ualidade do modelo
construdo4 9em sempre isso ) verdade4 Em um estudo @eito com cinco estruturas de protenas
depositadas no 'D( P9a*uurs et al4+ ,--5Q+ o*servou0se ;ue cerca de 5-c das restri<Ges de
distBncia desses peptdeos s=o do tipo intrarresidual+ uma porcentagem pr&xima H das restri<Ges H
longa distBncia Prestri<=o entre $tomos de !idrognio separados entre si por mais de ;uatro
resduos na se;uncia polipeptdicaQ4 Entretanto+ en;uanto o conCunto de restri<Ges H longa
distBncia @or respons$vel por cerca de 5-c das in@orma<Ges estruturais+ o conCunto das
intrarresiduais conteria no m$ximo -+Wc dessa in@orma<=o4 Interessantemente+ o conCunto de
restri<Ges de liga<=o de !idrognio+ ;ue constitua+ no m$ximo+ 6+Vc de todas as restri<Ges+ @or
respons$vel por cerca de 5-c da in@orma<=o estrutural do modelo4
Essa di@eren<a entre o impacto de di@erentes tipos de restri<=o so*re o conCunto @inal de
estruturas deve0se principalmente ao @ato de as estruturas ;ue servem de entrada para o c$lculo
C$ serem previamente parametri"adas+ com valores @ixos de comprimento de liga<=o+ !i*ridi"a<=o
e rela<Ges angulares &timos C$ de@inidos4 'ortanto+ grande parte das in@orma<Ges estruturais a
curta distBncia est$ de@inida antes mesmo de o c$lculo ter incio4 # essas restri<Ges ;ue contm
pouca in@orma<=o estrutural+ d$0se o nome de restri<Ges redundantes4
#ssim como existem restri<Ges ;ue contm pouca ou nen!uma in@orma<=o a respeito da
estrutura+ existem a;uelas ;ue+ so"in!as+ s=o respons$veis pela maior parte da estrutura terci$ria
da macromol)cula4 Essas restri<Ges s=o denominadas de restri<Ges inconsistentes e devem ser
examinadas cuidadosamente+ uma ve" ;ue elas podem ser resultantes de uma atri*ui<=o

incorreta+ ou podem simplesmente ser a Jnica restri<=o encontrada para certa caracterstica
geom)trica presente na estrutura4
# determina<=o do conteJdo de in@orma<=o em um conCunto de restri<Ges ) reali"ada
pelo programa QUEE9 PQuantitative Evaluation o@ Experimental 9M7 7estraintsQ P9a*uurs+
>pronE et al4+ ,--5Q4 c$lculo da in@orma<=o em si ) @eito tendo como *ase a %eoria da
In@orma<=o desenvolvida por Claude E4 >!annon P>!annon+ .2W1Q e desenvolvido em espa<o de
distBncia+ em ve" do espa<o cartesiano4
desenvolvimento completo da metodologia utili"ada para a determina<=o do grau de
in@orma<=o das restri<Ges est$ @ora do escopo deste tra*al!o+ mas+ de @orma simpli@icada+ a
t)cnica empregada consiste na utili"a<=o da incerte"a E da %eoria da In@orma<=o e su*se;uente
de@ini<=o de uma medida de incerte"a para cada $tomo PE
n
Q+ ;ue pode ser expandida para uma
incerte"a da estrutura PE
cstutuu
Q+ ao se considerar ;ue as incerte"as atAmicas s=o grande"as
independentes entre si Ppara mais detal!es+ consultar 9a*uurs et al4+ ,--5Q4 'or @im+ a in@orma<=o
total PI
totuI
+ E;4.45Q contida em um conCunto de R restri<Ges experimentais ) dada pela e;ua<=o
.45?
I
totuI
= E
cstutuu|0
E
cstutuu|R
PE; .45Q PE; .45Q PE; .45Q PE; .45Q
em ;ue E
cstutuu|0
) a incerte"a da estrutura sem nen!uma restri<=o experimental e
E
cstutuu|R
) a incerte"a da estrutura com R restri<Ges experimentais4
>imilarmente+ a in@orma<=o PI
+ E;4.4WQ de uma Jnica restri<=o experimental r pode ser

de@inida da seguinte maneira?
I
= E
cstutuu
E
cstutuu|
PE; .4W PE; .4W PE; .4W PE; .4WQ
em ;ue E
cstutuu|
) a incerte"a da estrutura+ dada uma restri<=o r e E
cstutuu
+ a incerte"a da
estrutura antes da adi<=o da restri<=o r4
'odem ainda ser desenvolvidos dois conceitos mais Jteis na pr$tica? a unicidade de
in@orma<=o PI
un,
+ E;4.4VQ e a in@orma<=o m)dia PI
mcd,
+ E;4.4XQ4 # unicidade+ ou in@orma<=o
Jnica+ re@erente a uma restri<=o r ) de@inida como a in@orma<=o adicionada por essa restri<=o+
tendo0se con!ecimento das demais restri<Ges PR rQ no conCunto de dados?
I
un,
= E
cstutuu|R-
E
cstutuu|R
PE; .4V PE; .4V PE; .4V PE; .4VQ

# importBncia de uma restri<=o+ considerando0se a totalidade do conCunto de restri<Ges+ )
o*tida calculando0se o conteJdo m)dio de in@orma<Ges amostrado pelo conCunto de dados
completo PI
mcd
Q4 # in@orma<=o m)dia da restri<=o pode ser calculada para um conCunto de R
restri<Ges pela m)dia do conteJdo de in@orma<=o em cada permuta<=o possvel da lista de
restri<Ges?
I
mcd,
= (E
cstutuu
E
cstutuu|
) PE;4 .4XQ PE;4 .4XQ PE;4 .4XQ PE;4 .4XQ
Essas duas grande"as s=o utili"adas para identi@icar possveis restri<Ges incorretas ou
pouco suportadas pelo conCunto total de restri<Ges P9a*uurs et al4+ ,--VQ e devem+ sempre ;ue
possvel+ ser analisadas conCuntamente+ uma ve" ;ue a unicidade permite identi@icar restri<Ges
inconsistentes ou ;ue simplesmente constituem a Jnica @onte de in@orma<=o para uma
caracterstica estrutural4 9o entanto+ se !ouver+ por exemplo+ duas restri<Ges ;ue contm alto
grau de in@orma<=o+ mas ;ue s=o mutuamente coerentes+ o c$lculo de unicidade n=o ser$ capa"
de identi@ic$0las como restri<Ges de alta in@orma<=o Pe4g4 duas restri<Ges do tipo oN (i, i +4) e
No (i, i 4)+ mesmo ;ue seCam as Jnicas restri<Ges caractersticas de 0!)lice em uma
determinada estrutura e ;ue+ por isso+ contm alto grau de in@orma<=o+ n=o ser=o identi@icadas
como tal pelo c$lculo de unicidade+ por serem mutuamente coerentesQ4 parBmetro in@orma<=o
m)dia+ no entanto+ apesar de isoladamente n=o promover uma distin<=o @$cil de restri<Ges
inconsistentes+ ) capa" de identi@icar o impacto das restri<Ges so*re a estrutura+ mesmo se estas
constiturem um conCunto consistente entre si4

1.!.2.2.1. Par'metros estatsticos utili2ados na an)lise da 3ualidade estrutural
# maioria dos m)todos ;ue analisa a ;ualidade estrutural de peptdeos utili"a grande"as
estatsticas para ;uanti@icar a distri*ui<=o dos dados geom)tricos dos modelos+ *em como sua
normalidade em rela<=o a estruturas consolidadas e determinadas em alta resolu<=o4 Este t&pico
explica sucintamente alguns desses parBmetros utili"ados na an$lise estrutural e ;ue @oram
empregados neste tra*al!o4

.4V4,4,414.4 : .4V4,4,414.4 : .4V4,4,414.4 : .4V4,4,414.4 :0 00 0score score score score
:0score ) um dos principais parBmetros utili"ados pelo programa [H#%IF+
possi*ilitando Culgar ;uando determinada propriedade de uma estrutura pode ser considerada
*oa+ ruim ou anormal PHoo@t et al4+ .226R 8inge et al4+ ,--5Q4 :0score relaciona um valor x de

um parBmetro a uma distri*ui<=o gaussiana de um *anco de dados PE;ua<=o .46Q4 9esta e;ua<=o+
(x
bd
) e o(x
bd
) s=o respectivamente a m)dia e o desvio padr=o desse valor4 'elos valores de :0
score calculados sa*e0se ;uais dados s=o valores isolados PoutliersQ+ ou seCa+ ;uais s=o improv$veis
de ocorrer4
Z =
x (x
bd
)
o(x
bd
)
P PP PE; E; E; E;4 4 4 4 . .. .4 44 46 66 6Q QQ Q

7M> :0score permite a an$lise da ;ualidade dos dados e do :0score+ veri@icando se a
distri*ui<=o de valores tem mais ou menos valores isolados ;ue o esperado e ) dado pela
E;ua<=o .414 parBmetro Z
]
) o :0score de@inido pela E;ua<=o .46 para a o*serva<=o ]+ sendo
;ue N ) o nJmero total de o*serva<Ges4
RHSZ =
_
_ Z
]
2 N
]=1
N
P PP PE; E; E; E;4 4 4 4 . .. .4 44 41 11 1Q QQ Q
.4V4,4,414,4 Desvio Quadr$tico M)dio P7M>D .4V4,4,414,4 Desvio Quadr$tico M)dio P7M>D .4V4,4,414,4 Desvio Quadr$tico M)dio P7M>D .4V4,4,414,4 Desvio Quadr$tico M)dio P7M>D _ __ _ 7oot Mean >;uare DeviationQ 7oot Mean >;uare DeviationQ 7oot Mean >;uare DeviationQ 7oot Mean >;uare DeviationQ
desvio ;uadr$tico m)dio P7M>DQ ) uma grande"a utili"ada geralmente para ;uanti@icar as
di@eren<as entre as geometrias de um conCunto de estruturas te&ricas4 s c$lculos do 7M>D
dependem da @orma da @un<=o restringente4 # @un<=o potencial *i0!armAnica inclui todos os
desvios em rela<=o a uma distBncia de@inida4 9o caso da @un<=o do tipo Npotencial de po<o
;uadradoO+ s=o considerados somente os desvios ;ue se encontrarem @ora dos limites superior e
in@erior P(runger+ #dams et al4+ .226Q+ resultando a E;ua<=o .424 parBmetro J
kI
) a distBncia
calculada para a restri<=o E no modelo l+ r
k
sup
o limite superior da restri<=o k e r
k
n]
) o limite
in@erior da restri<=o k4 # soma ) calculada para todas as N
restri<Ges de distBncia e para todos os

9m modelos4 Como resultado+ tem0se a medida m)dia da di@eren<a das posi<Ges entre os $tomos
nas estruturas4
RHS
N0L
=
_
1
N
N
m
(A
kI
)
2
N
m
I=1
N
r
k=1
com _
J
kI
> r
k
sup
A
kI
= (J
kI
r
k
sup
)
r
k
n]
< J r
k
sup
A
kI
= u
r
k
< r
k
n]
A
kI
= (r
k
n]
J
kI
)
P PP PE; E; E; E;4 4 4 4 . .. .4 44 42 22 2Q QQ Q

valor de 7M> n=o @ornece in@orma<Ges so*re a consistncia dos dados experimentais+
tampouco corresponde necessariamente ao espa<o con@ormacional permitido pelas restri<Ges
con@ormacionais4 #l)m disso+ a amostragem das geometrias pelo algoritmo de c$lculo pode estar

viciada+ com restri<Ges de geometria em acordo com os dados+ mas ;ue di@erem
signi@icativamente das resultantes do c$lculo estrutural4 Isso pode ocorrer ;uando s=o
empregadas poucas geometrias para o tratamento estatstico4 De modo geral+ a
;ualidade/con@ia*ilidade dos resultados desse m)todo est$ relacionada H menor dispers=o das
geometrias e+ conse;uentemente+ a valores menores de 7M>4 9ormalmente+ um valor de 7M>
at) 5 ] sugere @orte similaridade entre as geometrias P%sai+ ,--,Q4 Entretanto+ ) importante
salientar ;ue um valor *aixo de 7M>D n=o necessariamente ) sinAnimo de um conCunto
estrutural de alta ;ualidade4 >e o conCunto de restri<Ges utili"ado no c$lculo contiver restri<Ges
erradas+ essas incorre<Ges se propagar=o igualmente por todas as estruturas ;ue compGem o
conCunto @inal do modelo+ @a"endo com ;ue ele possua um 7M>D *aixo+ mas com geometria
incorreta4 L ainda mais importante notar ;ue um valor de 7M>D muito *aixo+ em muitos casos+
n=o ) deseC$vel4 Vale a pena lem*rar ;ue grande parte das estruturas resolvidas por 7M9 @oi
determinada em solu<=o e+ portanto+ espera0se ;ue o modelo ;ue representa o sistema ;ue @oi
medido re@lita caractersticas de mol)culas em solu<=o4 Dessa maneira+ espera0se ;ue essas
mol)culas possuam certo grau de mo*ilidade estrutural4 Em outras palavras+ valores *aixos de
7M>D signi@icam ;ue o modelo pode estar superestimando a precis=o da t)cnica experimental+
ou a estrutura<=o da macromol)cula4 De @ato+ C$ @oi proposto ;ue+ em prol de uma ;ualidade
estrutural maior e tam*)m de modelos mais realistas+ o 7M>D seCa maximi"ado+ mas ao mesmo
tempo+ mantendo a con@ormidade com os dados derivados dos experimentos P>pronE et al4+
,--5Q4

.4V4,4,41454 Distri*ui<=o de fngulos Diedros .4V4,4,41454 Distri*ui<=o de fngulos Diedros .4V4,4,41454 Distri*ui<=o de fngulos Diedros .4V4,4,41454 Distri*ui<=o de fngulos Diedros
Com*ina<Ges dos Bngulos diedros e s=o indicadores importantes da ;ualidade da
con@orma<=o de regiGes de@inidas de cadeias peptdicas4 Con@orme visto anteriormente+ as
possveis com*ina<Ges desses dois Bngulos est=o restritas por @atores est)ricos a certas regiGes do
diagrama de 7amac!andran PFigura .4.5e+ p4 ,-Q4 # an$lise da ;ualidade dos modelos ) @eita
geralmente com *ase nas classi@ica<Ges de com*ina<Ges dos Bngulos e em ;uatro regiGes do
diagrama? as regiGes mais @avor$veis+ as adicionalmente permitidas+ as generosamente permitidas
e a proi*ida4 # regi=o adicionalmente permitida indica con@orma<Ges permitidas nos limites
extremos para os contatos atAmicos des@avor$veis4 # regi=o generosamente permitida re@lete
con@orma<Ges ;ue s=o permitidas somente se !ouver certa @lexi*ilidade nos Bngulos de liga<=o4
9a regi=o proi*ida+ as con@orma<Ges s=o ;uase totalmente impedidas por @atores est)ricos4

Em geral+ para ;uanti@icar a distri*ui<=o de pontos no diagrama de 7amac!andran+
utili"am0se :0scores calculados tanto para cada resduo ;uanto para a cadeia peptdica4
9ormalmente+ utili"am0se valores de :0score com*inados H representa<=o gr$@ica do diagrama
de 7amac!andran4 # Figura .4,- mostra um exemplo da rela<=o entre a distri*ui<=o de Bngulos
em um diagrama de 7amac!andran e o valor de :0score4

Figura .4,-4 Figura .4,-4 Figura .4,-4 Figura .4,-4 7ela<=o entre o valor de :0score e a distri*ui<=o de pontos no diagrama de
7amac!andran4 PaQ PaQ PaQ PaQ Diagrama de 7amac!andran com :0score b .+1 e P*Q P*Q P*Q P*Q com :0score b 01+54 #s
regiGes @avor$veis+ adicionalmente permitidas+ generosamente permitidas e proi*idas+ est=o
representadas+ respectivamente+ por cin"a0escuro+ cin"a0m)dio+ cin"a0claro e *ranco4 Figura
retirada de P>pronE+ 9a*uurs et al4+ ,--WQ4

s dados em regiGes proi*idas podem signi@icar con@orma<Ges anormais ou erros de
c$lculo+ o ;ue ser$ veri@icado apenas pela an$lise dos dados de entrada4 s resduos de D0
amino$cidos s=o um exemplo de valores em regiGes proi*idas ;ue n=o necessariamente
constituem um erro4 %odavia+ resduos em regiGes permitidas do diagrama de 7amac!andran
n=o signi@icam necessariamente ausncia de erros4 Em todos os casos+ os :0scores calculados+
*em como a dispers=o desses valores no diagrama+ devem ser levados em considera<=o4
Uma valida<=o pode ser *aseada tam*)m nos Bngulos 4 Con@orme discutido
anteriormente+ esse Bngulo pode assumir valores de -g P@orma cisQ e .1-g P@orma transQ devido ao
car$ter parcial de liga<=o dupla entre o car*ono e o nitrognio da liga<=o peptdica+ por)m
o*serva0se certo desvio de planaridade+ de at) .,^4 9a verdade+ a presen<a desse desvio )
deseC$vel em um conCunto de estruturas+ o ;ue ;uase nunca ) o*servado em estruturas
determinadas por 7M94 Isso ocorre devido ao @ato de as estruturas de entrada do c$lculo serem
parametri"adas+ com os valores de de@inidos previamente4 #l)m disso+ o campo de @or<a
utili"ado no c$lculo n=o permite normalmente varia<Ges em torno desse Bngulo4 utra

di@iculdade presente nesse tipo de determina<=o de estruturas ) ;ue+ a menos ;ue especi@icado o
contr$rio+ todas as liga<Ges peptdicas est=o na @orma trans4

.4V4,4,414W4 9ormalidade da Cadeia 'rincipal .4V4,4,414W4 9ormalidade da Cadeia 'rincipal .4V4,4,414W4 9ormalidade da Cadeia 'rincipal .4V4,4,414W4 9ormalidade da Cadeia 'rincipal
utra grande"a considerada neste tra*al!o @oi a normalidade da cadeia principal4 %rata0se
de um parBmetro de de@ini<=o simples+ mas de grande utilidade na an$lise das estruturas
calculadas4 Ela consiste *asicamente na descri<=o da cadeia principal das estruturas calculadas+
em rela<=o a um *anco de dados de estruturas de alta resolu<=o4 c$lculo desse parBmetro
consiste em comparar as posi<Ges relativas dos C
u
de cinco resduos se;uenciais+ com todas as
posi<Ges dos C
o
de cinco resduos se;uenciais na *ase de dados de re@erncia4 # medida da
normalidade da cadeia principal ) medida geralmente pelo nJmero de se;uncias de cinco
resduos similares na *ase de dados4 'or conven<=o+ todos os resultados s=o normali"ados+ sendo
o valor m$ximo 1- e o valor mnimo "ero4

1.!.2.2.4. %efinamento de estruturas
re@inamento de estruturas no c$lculo a partir de dados de 7M9 consiste *asicamente
em su*met0las a outro procedimento de c$lculo ;ue possua um campo de @or<a mais realista+
ainda mantendo as restri<Ges geom)tricas derivadas de dados experimentais4 Essa etapa tem0se
tornado essencial+ uma ve" ;ue grande parte dos pro*lemas encontrados em estruturas
determinadas por 7M9 s=o origin$rias do campo de @or<a aplicado durante o c$lculo inicial4 Uma
das principais causas disso ) ;ue+ a @im de diminuir o tempo computacional despendido na
determina<=o estrutural+ v$rias simpli@ica<Ges tiveram ;ue ser @eitas+ resultando+ por exemplo+
em tratamentos pouco realistas de intera<Ges eletrost$ticas e de Van der [aals+ o ;ue pode levar
as estruturas de 7M9 a possurem alto nJmero de so*reposi<Ges estericamente des@avor$veis
entre diversos grupos e padrGes de liga<=o de !idrognio longe da situa<=o &tima4
re@inamento pode ser @eito considerando tanto o solvente de @orma explicita P8inge et
al4+ ,--5Q e considerando a mol)cula no v$cuo+ por)m com m)todos mais e@icientes de
minimi"a<=o de energia e de varia<=o de posi<Ges atAmicas+ al)m do campo de @or<a mais realista
mencionado anteriormente P>c!Fieters et al4+ ,--5R >c!Fieters et al4+ ,--XQ4 #m*as as
metodologias consistem+ em termos gerais+ de dinBmica molecular+ com restri<Ges de posi<=o

determinadas pela lista de restri<Ges geom)tricas+ e com varia<Ges de temperatura+ a @im de
minimi"ar a energia das estruturas4
1.5.'. Ressonncia Magntica !uclear no estado s(lido
9este t&pico ser=o mostradas algumas das possveis utili"a<Ges da 7M9 em @ase s&lida para o
estudo de peptdeos reconstitudos em *icamadas @os@olipdicas orientadas em rela<=o ao campo
magn)tico externo4 Em*ora esta se<=o trate apenas de uma das metodologias de estudo usando a
7M9+ outras s=o relatadas na literatura para amostras pulveri"adas+ na @orma cristalina+ ou em
*icamadas n=o orientadas4
'ara amostras contendo o peptdeo e a *icamada @os@olipdica e orientadas em rela<=o ao
campo magn)tico do espectrAmetro+ a 7M9 em @ase s&lida tem sido utili"ada para estudar e
dedu"ir a orienta<=o e topologia de *iomacromol)culas4 'ara tanto s=o usados peptdeos
marcados com
.V
9 e
,
H+ ;uando possvel+ associados a *icamadas lipdicas PCross+ .226R Munster
et al4+ ,--,R #isen*reD et al4+ ,-.-Q4
Com*inando resultados advindos de experimentos de 7M9 de
.V
9 e de
,
H+ ) possvel o*ter
in@orma<Ges so*re a orienta<=o de peptdeos !elicoidais em rela<=o Hs mem*ranas mim)ticas+
isto )+ so*re a topologia da intera<=o peptdeo0mem*rana4 Essa com*ina<=o propicia+ assim+ uma
investiga<=o mais completa relacionando parBmetros estruturais e topol&gicos de peptdeos+ *em
como de peptdeos associados Hs mem*ranas+ com seus mecanismos de a<=o *iol&gica4

1.5.'.1 )undamentao *e(rica
# espectroscopia de 7M9 em @ase s&lida pode ser utili"ada para identi@icar a disposi<=o
espacial adotada por peptdeos em amostras orientadas com respeito H dire<=o do campo
magn)tico4 Esta t)cnica @ornece in@orma<Ges valiosas em rela<=o H dinBmica+ ao am*iente
eletrAnico local+ H nature"a das liga<Ges intra0 e intermoleculares e H estrutura molecular
P(ec!inger et al4+ .222Q4 # caracterstica mais pronunciada dos espectros de 7M9 em @ase s&lida )
@re;uentemente devida Hs contri*ui<Ges anisotr&picas do deslocamento ;umico e das intera<Ges
dipolares e ;uadrupolares P8aFs et al4+ ,--,Q4
s espectros de 7M9 em @ase s&lida mostram geralmente lin!as largas devidas
principalmente Hs intera<Ges dipolo0dipolo e tendem a exi*ir um alto grau de sinais so*repostos
PDuer+ ,--WQ4 9ovos m)todos e t)cnicas est=o sendo desenvolvidos para mel!orar a resolu<=o

espectral+ tais como a utili"a<=o de marcadores isot&picos+ espectroscopia de 7M9
multidimensional+ desacoplamento de nJcleos e outros m)todos ;ue s=o utili"ados para
selecionar intera<Ges entre spins nucleares PZetc!em et al4+ .22WQ4

deslocamento ;umico em 7M9 no estado s&lido ) tratado matematicamente como
um tensor+ representado por um elips&ide como mostrado na Figura .4,. a aa a e * ** *4 tensor )
tratado em um sistema de eixos cartesianos de tal @orma ;ue ele possa ser descrito pelas trs
componentes Po
11
+ o
22
e o
33
Q+ con@orme mostrado na Figura .4,.a aa a+ para o nJcleo de
.V
9
relativamente ao eixo principal da estrutura !elicoidal de um peptdeo4 deslocamento ;umico
detectado pelo espectrAmetro de 7M9 ) denominado o
zz
+ sendo de@inido como a proCe<=o da
componente tensorial o
33
no eixo do campo magn)tico externo B
P PP PFigura .4,.*Q *Q *Q *Q4 De@inindo0se

Bngulos de Euler Pm+ 0 e +Q para descrever trans@orma<Ges do tensor deslocamento ;umico em
outro sistema de coordenadas+ pode0se c!egar H rela<=o angular de o
zz
com m e 0+ con@orme
mostrado na E;ua<=o .4.-4

Figura .4,.4 Figura .4,.4 Figura .4,.4 Figura .4,.4 7epresenta<=o do tensor de deslocamento ;umico de
.V
9 na cadeia peptdica PaQ PaQ PaQ PaQ e
na @orma elipsoidal P*Q P*Q P*Q P*Q+ mostrando os Bngulos de Euler m e 0 entre as componentes tensoriais e
o deslocamento ;umico detectado+ o
zz
P(ec!inger \ >i"un+ ,--5Q4

o
zz
= o
11
sen
2
0cos
2
m+o
22
sen
2
0sen
2
m+o
33
cos
2
0 PE; .4.-Q PE; .4.-Q PE; .4.-Q PE; .4.-Q

Devido ao @ato de a componente o
33
ser aproximadamente paralela ao eixo principal da
!)lice em estruturas 0!elicoidais P7EFQ+ ) possvel+ portanto+ de@inir o Bngulo 0 como sendo o
Bngulo @ormado entre o eixo principal da !)lice e o campo magn)tico externo B
4 4 4 4 'ara o caso de
amostras em ;ue a normal da *icamada @os@olipdica est$ alin!ada paralelamente a B
+ pode0se
a@irmar+ por extens=o+ ;ue 0 re@ere0se ao Bngulo entre o eixo principal da !)lice e a normal da
*icamada @os@olipdica presente na amostra4 Devido a essa dependncia entre a orienta<=o do
peptdeo e o deslocamento ;umico de
.V
9+ essa grande"a ) um indicador sensvel da orienta<=o
aQ aQ aQ aQ *Q *Q *Q *Q

do eixo da !)lice com rela<=o H *icamada lipdica+ propiciando in@erir in@orma<Ges de topologia
da intera<=o peptdeo0mem*rana P(ec!inger \ >eelig+ .22.Q4 'eptdeos 0!elicoidais
transmem*rana exi*em ressonBncia de
.V
9 com deslocamentos ;umicos maiores ;ue ,-- ppm
PFig4 .4,,a aa aQ+ ao passo ;ue peptdeos orientados paralelamente H super@cie da *icamada
@os@olipdica s=o caracteri"ados por deslocamentos ;umicos de X- a 1- ppm PFigura .4,,* ** *Q
P#isen*reD \ (ec!inger+ ,--WQ4

Figura .4, Figura .4, Figura .4, Figura .4,, ,, ,4 44 4 7epresenta<Ges do peptdeo 0!elicoidal interagindo de @orma transmem*rana PaQ PaQ PaQ PaQ e
paralelamente H super@cie da *icamada @os@olipdica P*Q P*Q P*Q P*Q cuCa normal coincide com o campo
magn)tico externo B
4 'ara am*as as orienta<Ges do peptdeo s=o mostradas+ H direita+ os

espectros de 7M9 de
.V
9 simulados P(ec!inger \ >i"un+ ,--5Q4

En;uanto resultados de anisotropia do deslocamento ;umico de
.V
9 @ornecem
in@orma<Ges a respeito da orienta<=o do eixo principal da !)lice em rela<=o H *icamada
@os@olipdica+ a an$lise de espectros de 7M9 de
,
H relativos a amostras contendo o peptdeo com
um resduo de alanina+ isotopicamente marcado com trs $tomos de deut)rio+ na metila da
cadeia lateral+ permite a de@ini<=o da orienta<=o da liga<=o C
C
[
da alanina em rela<=o ao
eixo principal da !)lice4 Isso ) possvel devido ao @ato de o grupo metila possuir r$pido
movimento rotacional H temperatura am*iente+ @a"endo com ;ue os nJcleos de
,
H seCam
;uimicamente e;uivalentes e com ;ue o tensor resultante seCa coincidente com o vetor da
liga<=o C
C
[
4
Em meios mim)ticos de mem*rana !idratados+ o peptdeo !elicoidal di@unde em torno
da normal da mem*rana+ de @orma ;ue a liga<=o C
C
[
mova0se descrevendo um cone de
semi0Bngulo relativamente a esta dire<=o+ sendo denominado Bngulo polar de rota<=o interna4
# grande"a medida em experimentos de 7M9 de
,
H para amostras com o peptdeo incorporado
em *icamadas @os@olipdicas ) o acoplamento ;uadrupolar de deut)rio PAv
Q+ ;ue dependente
tanto do Bngulo polar ;uanto do Bngulo [

;ue descreve a orienta<=o da normal da *icamada
em rela<=o ao campo magn)tico B
+ con@orme mostrado na E;ua<=o .4..+

aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q

Av
=
S
2
c
2
q
b
(S cos
2
1)
2
(S cos
2
[ 1)
2
P PP PE; E; E; E;4 4 4 4 . .. .4 44 4.. .. .. ..Q QQ Q
em ;ue c
2
q b / ) a constante de acoplamento ;uadrupolar de deut)rio4
s resultados o*tidos por 7M9 de
.V
9 e
,
H s=o complementares entre si+ sendo
utili"ados para descrever a orienta<=o do peptdeo !elicoidal em rela<=o H *icamada @os@olipdica+
atrav)s da determina<=o das vari$veis 0 PE;4 .4.-+ p4 W.Q e PE;4 .4..Q4 Uma descri<=o mais
detal!ada a respeito de como essa orienta<=o ) calculada ) apresentada no item ,4,41+ p4 VX4

1.5.+ Caracteri,ao termodinmica do processo de interao
peptdeo-membrana por calorimetria de titulao isotrmica ./*C0
# calorimetria de titula<=o isot)rmica PI%CQ constitui0se em uma excelente t)cnica para
caracteri"ar intera<Ges em solu<=o+ visto ;ue ) possvel o*ter o per@il termodinBmico completo
destas intera<Ges+ mesmo sendo intera<Ges de a@inidades *aixas P>eelig+ .226R [!ite et al4+ .221Q4
# an$lise do per@il das curvas calorim)tricas e dos parBmetros termodinBmicos o*tidos+
com*inada com as propriedades @sico0;umicas dos compostos e as caractersticas do processo de
intera<=o+ permitem compreender como as esp)cies interagem4
Um passo importante na caracteri"a<=o da intera<=o peptdeo0mem*rana ) con!ecer a nature"a e
a magnitude das energias livres de intera<=o+ separ$0las nas suas componentes ent$lpica P AEQ e
entr&pica P ASQ+ sendo possvel tam*)m o*ter a espontaneidade destas intera<Ges PA 0Q+ o
coe@iciente este;uiom)trico da intera<=o PnQ e a constante de parti<=o PK
p
Q4 9a calorimetria de
titula<=o isot)rmica+ estes parBmetros termodinBmicos s=o o*tidos a partir de dados
experimentais com*inados com modelos matem$ticos4
9os experimentos de titula<=o calorim)trica isot)rmica+ podem ser e@etuados dois tipos de
titula<=o+ com ra"Ges molares peptdeo?lipdeo P'?8Q distintas4 9o primeiro tipo+ o lipossoma+
com concentra<=o elevada+ ) colocado na c)lula de titula<=o+ sendo adicionadas ;uantidades @ixas
de peptdeo? # ra"=o '?8 permanece muito *aixa+ de modo a n=o ocorrer satura<=o da
mem*rana pelo peptdeo4 peptdeo adicionado distri*ui0se entre a @ase a;uosa e lipdica de
maneira semel!ante no decorrer da titula<=o4 calor li*erado ou a*sorvido em cada inCe<=o )
praticamente constante+ visto ;ue !$ excesso de lipdeo4 'ara o*ter a ;uantidade de calor P
nt
)

relativa H intera<=o peptdeo0lipdeo+ deve0se su*trair o calor de dilui<=o P
dI
Q do peptdeo e do
lipdeo+ o*tidos em experincias independentes+ do calor total
n]
+ con@orme E;ua<=o .4.,
a*aixo?
nt
=
n]

dI

(Eq. 1.12)
# varia<=o da entalpia experimental ou de intera<=o (A
cxp
E) do processo ) a ra"=o entre o calor

nt
da intera<=o e o nJmero de mols de peptdeo Pn
pcp
) em cada inCe<=o+ con@orme a E;ua<=o
.4.5?
A
cxp
E =

nt
n
pcp

(Eq. 1.13)

9o segundo tipo de titula<=o o peptdeo ) colocado na c)lula e titulado com volumes
@ixos da suspens=o de lipossomas4 Veri@ica0se ao longo da titula<=o ;ue a ;uantidade de calor
envolvida se torna cada ve" menor+ dado ;ue se relaciona com a ;uantidade de peptdeo ainda
livre na c)lula ap&s cada inCe<=o de suspens=o de lipossoma4 # ;uantidade de peptdeo ;ue
interage com a mem*rana diminui a cada inCe<=o e a diminui<=o da $rea dos picos da curva de
titula<=o est$ relacionada com o processo de intera<=o e inser<=o do peptdeo na mem*rana4 9o
@inal da titula<=o veri@ica0se+ por ve"es+ uma invers=o no sinal do calor envolvido+ indicando ;ue
todo o peptdeo interagiu com a mem*rana e ;ue !$ um excesso de lipdeo4 #ssim+ os Jltimos
picos representam o calor de dilui<=o da suspens=o de lipossomas+ nas condi<Ges @inais do ensaio
de titula<=o4

2. ateriais e !todos

2.1. 5ateriais

%odas as pesagens para as snteses @oram @eitas em *alan<a analtica Metler P(arueri+
(rasilQ+ modelo #E.XX+ com precis=o de -+---.4
Em todas as snteses+ @oi utili"ada a resina 7inE0amide+ da marca Iris (iotec! Gm*H
PMarEtredFit"+ #leman!aQ com grau de su*stitui<=o de -+X5 mmol/g4
s derivados de amino$cidos tendo Fmoc como grupo protetor da extremidade 90
terminal @oram ad;uiridos das marcas Iris (iotec! Gm*H+ 9ova*ioc!em0MercE PDarmstadt+
#leman!aQ e >igma0#ldric! P>t4 8ouis+ Estados UnidosQ4
# lavagem da resina antes e depois das etapas de desprote<=o @oi @eita com
dimetil@ormamida PDMFQ+ diclorometano PDCMQ e ,0propanol PI'#Q alternadamente4
DMF utili"ado @oi da marca >U9%H+ sendo previamente puri@icado por destila<=o a
press=o redu"ida4
DCM utili"ado @oi das marcas >U9%H P>=o 'aulo+ (rasilQ e ME7CZ PDarmstadt+
#leman!aQ 4
I'# utili"ado @oi da marca >U9%H4
9as etapas de acoplamento+ utili"aram0se como reagentes ativadores o .0
!idroxi*en"otria"ol PH(%Q+ da marca 9ova*ioc!em0MercE+ e a 9+9K0dimetilcar*odiimida
PDICQ+ da marca >igma0#ldric!4 s solventes utili"ados para a solu*ili"a<=o desses reagentes
@oram DMF e DCM+ respectivamente4
'ara a desprote<=o dos grupos 90terminais antes de cada acoplamento+ utili"ou0se uma
solu<=o ,-c v/v de W0metil0piperidina Pda marca MercEQ em DMF4
'ara uma avalia<=o ;ualitativa das rea<Ges de acoplamento e desprote<=o+ @oi utili"ado o
teste de Zaiser PZaiser et al4+ .26-Q+ ;ue emprega trs solu<Ges? ZC9 -+-. M em piridina+ @enol -+1
M em etanol e nin!idrina 5 mM em piridina+ adicionadas em pe;uenos volumes+ na propor<=o

.?,?.+ respectivamente+ e+ em seguida+ a;uecia0se o sistema a cerca de .--gC por
aproximadamente W min4
'ara a clivagem dos peptdeos da resina e remo<=o dos grupos protetores das cadeias
laterais+ utili"ou0se como reagente o triisopropilsilano P%I>Q+ da marca Iris (iotec! solu*ili"ado
em uma solu<=o composta por $cido tri@luoroac)tico P%F#Q e $gua+ na propor<=o de
aproximadamente .2?. Pv?vQ4
# puri@ica<=o dos produtos de sntese @oi reali"ada em cromatogra@ia l;uida de alta
e@icincia PC8#EQ4 m)todo de identi@ica<=o de su*stBncias utili"ado @oi detec<=o por
ultravioleta na @aixa ,.-0,.V nm4 # puri@ica<=o @oi reali"ada em escala semipreparativa+ en;uanto
;ue a escala analtica @oi utili"ada para se o*tere per@is iniciais da amostra4
'ara a cromatogra@ia l;uida+ utili"ou0se um cromat&gra@o Varian P>anta Clara+ Estados
UnidosQ+ modelo 'ro>tar ,.-+ com detector na regi=o do ultravioleta do modelo 'ro>tar 55- e
uma v$lvula de inCe<=o da marca Idex07!eodDne PaE Har*our+ Estados UnidosQ
# coluna analtica utili"ada @oi uma Microsor* .--0V C.1 ,V-hW+X mm e a coluna
semipreparativa utili"ada @oi uma DDnamax .--0V C.1 ,V-h.- mm+ acompan!adas+
respectivamente+ de loops de V 8 e ,V- 84
'ara as @ases m&veis da C8#E @oram utili"adas solu<Ges de -+.c v/v de %F#+ em $gua
MI88I0Q+ e de -+-1c v/v de %F#+ em acetonitrila+ para compor os gradientes utili"ados4
# $gua em nvel de pure"a Milli0Q @oi o*tida em aparel!o Q'#Z+ da marca Millipore0
MercE P(illerica+ Estados UnidosQ4
s espectros de dicrosmo circular PCDQ @oram o*tidos em um aparel!o I#>C modelo I0
1.- PEaston+ Estados UnidosQ+ com um sistema de controle acoplado de temperatura da marca
'eltier Iasco modelo 'FD0W,V>4
s @os@olipdeos utili"ados nos experimentos de calorimetria PI%CQ e de dicrosmo
circular+ com grau de pure"a de 22c+ @oram ad;uiridos da #vanti 'olar 8ipids+ Inc4 P#la*aster+
Estados UnidosQ4 'ara a prepara<=o dos lipossomas @oram utili"ados .0palmitoil0,0oleoil0sn0
glicero050@os@ocolina P''CQ+ .0palmitoil0,0oleoil0sn0glicero050@os@oglicina P''GQ e uma mistura
5?. Pmol?molQ destes @os@olipdeos4

s espectros de 7M9 de
.
H e de
.5
C @oram o*tidos no Centro 9acional de 7essonBncia
Magn)tica 9uclear PC97M9Q+ no Centro de Cincias da >aJde da UF7I em um e;uipamento
(ruEer modelo #V#9CE III + operando a uma @re;uncia de 1--+.5 MH" para !idrognio4
Como solvente+ @oram utili"adas solu<Ges de ,+,+,0tri@luoretanol0d, P%FEQ em $gua Milli0Q+ sem a
presen<a de tamp=o e solu<Ges a;uosas com a presen<a de micelas de dodecil@os@ocolina PD'CQ
na concentra<=o de .- mM4 'ara a a;uisi<=o dos espectros+ utili"ou0se uma solu<=o de W mM de
cada peptdeo e o volume utili"ado dessa solu<=o @oi de aproximadamente -+V m84 padr=o
utili"ado para re@erncia interna @oi o ,+,0dimetil0,0isopentano0V0sul@onato de s&dio PD>>Q
P#ldric!Q para os espectros de
.
H e de
.5
C4
'ara os peptdeos estudados+ @oram reali"ados experimentos de %C>U+ utili"ando0se a
se;uncia de pulsos M8EV+ 9E>U e
.
H+
.5
C0H>QC editado+ apenas para a distinctina e
@enilseptinas4
tempo de mistura para a a;uisi<=o do mapa de contornos ,D
.
H h
.
H 9E>U @oi de
.,- ms4 experimento de %C>U teve um tempo de mistura de 1- ms4
s espectros de 7M9 em @ase s&lida @oram o*tidos na Universidade de >tras*ourg+ no
8a*orat&rio de 7M9 e (io@sica de Mem*ranas+ nos e;uipamentos (ruEer #V#9CE W-- Fide0
*ore Ppara
5.
' e
.V
9Q e (ruEer #V#9CE 5-- Fide0*ore Ppara
,
HQ4

2.2 5todos

2.2.1. 1rocedimento 2eral
%odos os peptdeos estudados @oram sinteti"ados em @ase s&lida+ utili"ando a estrat)gia
Fmoc PC!an+ ,---Q+ iniciando0se do resduo de amino$cido C0terminal em dire<=o H extremidade
90terminal+ de @orma a serem o*tidas cadeias com as extremidades C0terminais amidadas4 #s
snteses @oram reali"adas em seringas com @iltro sinteri"ado acoplado H regi=o interna pr&xima a
sua ponta4

2.2.1.1. 1reparao da Resina
primeiro procedimento da sntese envolveu a prepara<=o da resi
primeiramente colocando0se a resina P7inE
rea<=o ocorreu4 Em seguida+ verteu
para ;ue ela @osse totalmente co*erta pelo solvente4 #
cerca de .- min4 #o @im desse perodo+ removeu
@oi repetido por mais trs ve"es4 Essa etapa ) importante+ pois o DCM aumenta o volume de
contato da resina+ o ;ue @acilita o

2.2.1.2. Desproteo da Resina
#p&s o preparo acima descrito
derivados de amino$cidos+ resinas ;ue originam peptdeos amidados na extremidade
encontram0se protegidas pelo grupo Fmoc4 # remo<=o desse grupo @oi @eita utili"ando
solu<=o de W0metil0piperidina em
solu<=o para a desprote<=o @oi adicionada ao recipiente de rea<=o+ a um volume su@iciente par
co*rir toda a resina4 >u*meteu
em seguida+ removeu0se a solu<=o de W
deve garantir a desprote<=o de toda a resina+ para ;ue n=o !aCa dim
da rea<=o4 Em seguida+ lavou0
alternadamente+ por trs ve"es4 'or @im reali"ou
da resina4 9esse caso+ o teste deve ser p
Esse procedimento de preparo da resina encontra

Es;uema ,4.4 Es;uema ,4.4 Es;uema ,4.4 Es;uema ,4.4 'repara<=o da resina amidada+ com grupo protetor Fmoc+ para a sntese de
peptdeos4
2.2.1.1. 1reparao da Resina
primeiro procedimento da sntese envolveu a prepara<=o da resi
se a resina P7inE0amide+ -+X5 mmol/gQ seca no recipiente em ;ue a
rea<=o ocorreu4 Em seguida+ verteu0se so*re a resina um pe;ueno volume de DCM+ o su@iciente
para ;ue ela @osse totalmente co*erta pelo solvente4 # resina @icou em contato com o DCM por
cerca de .- min4 #o @im desse perodo+ removeu0se o solvente por suc<=o a v$cuo
por mais trs ve"es4 Essa etapa ) importante+ pois o DCM aumenta o volume de
contato da resina+ o ;ue @acilita o acoplamento dos amino$cidos4
2.2.1.2. Desproteo da Resina
#p&s o preparo acima descrito+ procedeu0se H desprote<=o da resina4 #ssim como os
derivados de amino$cidos+ resinas ;ue originam peptdeos amidados na extremidade
idas pelo grupo Fmoc4 # remo<=o desse grupo @oi @eita utili"ando
piperidina em 9+90dimetil@ormamida PDMFQ+ na concentra<=o ,-c v/v4 Esta
solu<=o para a desprote<=o @oi adicionada ao recipiente de rea<=o+ a um volume su@iciente par
co*rir toda a resina4 >u*meteu0se a seringa H agita<=o moderada+ duas ve"es durante .V min e+
se a solu<=o de W0metil0piperidina por suc<=o a v$cuo4 Este procedimento
deve garantir a desprote<=o de toda a resina+ para ;ue n=o !aCa diminui<=o do rendimento @inal
0se a resina com DMF+ ,0propanol PI'#Q e DCM+ nesta ordem e
alternadamente+ por trs ve"es4 'or @im reali"ou0se o teste de Zaiser para averiguar a desprote<=o
da resina4 9esse caso+ o teste deve ser positivo+ ou seCa+ os gr=os da resina devem estar *em a"uis4
Esse procedimento de preparo da resina encontra0se resumido no Es;uema ,4.4
'repara<=o da resina amidada+ com grupo protetor Fmoc+ para a sntese de
primeiro procedimento da sntese envolveu a prepara<=o da resina4 Isto @oi @eito
amide+ -+X5 mmol/gQ seca no recipiente em ;ue a
se so*re a resina um pe;ueno volume de DCM+ o su@iciente
resina @icou em contato com o DCM por
se o solvente por suc<=o a v$cuo e o processo
por mais trs ve"es4 Essa etapa ) importante+ pois o DCM aumenta o volume de
desprote<=o da resina4 #ssim como os
derivados de amino$cidos+ resinas ;ue originam peptdeos amidados na extremidade C0terminal
idas pelo grupo Fmoc4 # remo<=o desse grupo @oi @eita utili"ando0se uma
dimetil@ormamida PDMFQ+ na concentra<=o ,-c v/v4 Esta
solu<=o para a desprote<=o @oi adicionada ao recipiente de rea<=o+ a um volume su@iciente para
se a seringa H agita<=o moderada+ duas ve"es durante .V min e+
piperidina por suc<=o a v$cuo4 Este procedimento
inui<=o do rendimento @inal
propanol PI'#Q e DCM+ nesta ordem e
se o teste de Zaiser para averiguar a desprote<=o
ositivo+ ou seCa+ os gr=os da resina devem estar *em a"uis4
se resumido no Es;uema ,4.4
'repara<=o da resina amidada+ com grupo protetor Fmoc+ para a sntese de

2.2.1.'. #ntese dos peptdeos
Feita a prepara<=o da resina+ deu
acoplamentos consecutivos dos derivados de amino$cido H resina4 # cada acoplamento+ verteu
so*re a resina desprotegida uma solu<=o contendo o deriva
e as su*stBncias ativadoras dissolvidos em DCM e DMF na propor<=o .?. Pv?vQ4 'ara as duas
cadeias+ utili"aram0se como ativadores .
diisopropilcar*odiimida PDICQ+ ;ue @oram misturados a ca
acoplado nas mesmas ;uantidades de e;uivalente molar4 recipiente de sntese @oi ent=o
su*metido H agita<=o moderada durante todo o tempo de rea<=o4 #o @inal+ reali"aram
lavagens com DMF+ I'# e DCM intercaladas+ t
resina e+ em seguida+ o teste de Zaiser ;ue+ ap&s a rea<=o de acoplamento+ deve apresentar
resultados negativos+ ou seCa+ os gr=os da resina devem ser claros+ em suas cores originais4 >e o
resultado @or negativo+ su*mete
acoplado4 Caso contr$rio+ deve
# desprote<=o @oi @eita utili"ando
a resina+ a um volume su@iciente para co*ri
su*metido H agita<=o moderada4 Em geral+ a desprote<=o ) reali"ada em duas etapas de ., min
cada+ sendo ;ue a solu<=o para a desprote<=o ) retirada do @ras
9ovamente+ reali"ou0se o teste de Zaiser e+ em seguida+ acoplou
amino$cido4 #s etapas desse procedimento repetiram
@ossem acoplados4 #o @im da sntese+ a resina P
clivagem e desprote<=o dos grupos protetores permanentes+ li*erando+ ent=o+ o peptdeo
amidado na extremidade C0terminal4 Este protocolo ) ilustrado no Es;uema ,4,4

Es;uema ,4,4 Es;uema ,4,4 Es;uema ,4,4 Es;uema ,4,4 rganograma do protoco
derivado de amino$cido e ap&s o acoplamento tem
dos peptdeos
Feita a prepara<=o da resina+ deu0se incio H sntese propriamente dita+ ;ue consiste em
acoplamentos consecutivos dos derivados de amino$cido H resina4 # cada acoplamento+ verteu
so*re a resina desprotegida uma solu<=o contendo o derivado de amino$cido PFmoc
se como ativadores .0!idroxi*en"otria"ol PH(tQ e
diisopropilcar*odiimida PDICQ+ ;ue @oram misturados a cada derivado de amino$cido a ser
su*metido H agita<=o moderada durante todo o tempo de rea<=o4 #o @inal+ reali"aram
lavagens com DMF+ I'# e DCM intercaladas+ tal ;ual a lavagem @eita na etapa de prepara<=o da
ativo+ su*mete0se o sistema H desprote<=o do grupo amino do Jltimo resduo
acoplado4 Caso contr$rio+ deve0se repetir a rea<=o de acoplamento at) ;ue o teste seCa negativo4
# desprote<=o @oi @eita utili"ando0se uma solu<=o ,-c v/v de W0metilpiperidina adici
a resina+ a um volume su@iciente para co*ri0la completamente4 sistema @oi+ em seguida+
cada+ sendo ;ue a solu<=o para a desprote<=o ) retirada do @rasco entre as duas etapas4
se o teste de Zaiser e+ em seguida+ acoplou0se o pr&ximo derivado de
amino$cido4 #s etapas desse procedimento repetiram0se at) ;ue todos os resduos de amino$cido
@ossem acoplados4 #o @im da sntese+ a resina Pcom a cadeia peptdica ligada a elaQ ) su*metida H
terminal4 Este protocolo ) ilustrado no Es;uema ,4,4
rganograma do protocolo utili"ado nas snteses dos peptudeos4 #copla
derivado de amino$cido e ap&s o acoplamento tem0se um resduo de amino$cido4
se incio H sntese propriamente dita+ ;ue consiste em
acoplamentos consecutivos dos derivados de amino$cido H resina4 # cada acoplamento+ verteu0se
do de amino$cido PFmoc0amino$cidoQ
!idroxi*en"otria"ol PH(tQ e 9+9K0
da derivado de amino$cido a ser
su*metido H agita<=o moderada durante todo o tempo de rea<=o4 #o @inal+ reali"aram0se ;uatro
al ;ual a lavagem @eita na etapa de prepara<=o da
se o sistema H desprote<=o do grupo amino do Jltimo resduo
se repetir a rea<=o de acoplamento at) ;ue o teste seCa negativo4
metilpiperidina adicionada so*re
la completamente4 sistema @oi+ em seguida+
co entre as duas etapas4
se o pr&ximo derivado de
se at) ;ue todos os resduos de amino$cido
com a cadeia peptdica ligada a elaQ ) su*metida H
terminal4 Este protocolo ) ilustrado no Es;uema ,4,4
lo utili"ado nas snteses dos peptudeos4 #copla0se um
se um resduo de amino$cido4

2.2.1.+. Clivagem dos peptdeos
%odos os peptdeos @oram clivados com solu<=o de 2V+-c de $cido tri@luoroac)tico P%F#Q+
,+Vc de $gua deioni"ada Pgrau Milli
protocolo padr=o de clivagem da estrat)gia de sntese
clivagem+ utili"ou0se um volume dessa solu<=o de .- a ,V m8/g de peptidil
esse volume ao @rasco em ;ue se encontrava a resina a ser clivada e manteve
agita<=o moderada durante o tempo de rea<=o+ ;ue )+ em geral+ de .+V! a 5 !4 #o @inal+ o
peptdeo encontra0se solu*ili"ado nessa solu<=o de clivag
rea<=o entre os grupos protetores das cadeias laterais e os nucle&@ilos se;uestradores de
car*oc$tions e n=o mais ligado H resina4 >eparou
para um tu*o Falcon e su*metendo
a restar+ na @ase l;uida+ *asicamente $gua+ o peptdeo e os demais produtos secund$rios4
Considera0se ;ue se c!egou a esta condi<=o ;uando o volume da solu<=o de clivagem n=o mais
se redu"ir4 Foi ent=o adicionado ao tu*o certo volume Paproximadamente .- m8Q de )ter
diisoproplico previamente res@riado em *an!o de gelo4 sistema ) centri@ugado e as @ases s&lida
e l;uida s=o separadas4 9ovamente+ adicionou
uma ve"+ centri@uga0se a amostra e separou
pelo menos mais trs ve"es4 Quando o s&lido estava *em compactado+ ele @oi dissolvido em $gua
deioni"ada e a amostra @oi+ por @im+ lio@ili"ada+ para
procedimento de clivagem est$ rep

Es;uema ,45 Es;uema ,45 Es;uema ,45 Es;uema ,45 7epresenta<=o do protocolo da rea<=o de clivagem dos peptdeos
2.2.1.+. Clivagem dos peptdeos
+Vc de $gua deioni"ada Pgrau Milli0QQ e ,+Vc de triisopropilsilano P%I>Q+ seguindo
protocolo padr=o de clivagem da estrat)gia de sntese Fmoc PC!an+ ,---Q
se um volume dessa solu<=o de .- a ,V m8/g de peptidil
esse volume ao @rasco em ;ue se encontrava a resina a ser clivada e manteve
se solu*ili"ado nessa solu<=o de clivagem Cuntamente com os produtos de
car*oc$tions e n=o mais ligado H resina4 >eparou0se+ ent=o+ a @ase l;uida da resina+ trans@erindo
para um tu*o Falcon e su*metendo0a a a<=o de nitrognio gasoso para evaporar o %F#+ de @orma
se ;ue se c!egou a esta condi<=o ;uando o volume da solu<=o de clivagem n=o mais
i ent=o adicionado ao tu*o certo volume Paproximadamente .- m8Q de )ter
e l;uida s=o separadas4 9ovamente+ adicionou0se o )ter diisoproplico ao s&lido resta
se a amostra e separou0se o l;uido do s&lido+ repetindo
deioni"ada e a amostra @oi+ por @im+ lio@ili"ada+ para o produto ser caracteri"ado e puri@icado4
procedimento de clivagem est$ representado no Es;uema ,454
7epresenta<=o do protocolo da rea<=o de clivagem dos peptdeos
QQ e ,+Vc de triisopropilsilano P%I>Q+ seguindo0se o
PC!an+ ,---Q4 'ara se reali"ar a
se um volume dessa solu<=o de .- a ,V m8/g de peptidil0resina4 #diciona0se
esse volume ao @rasco em ;ue se encontrava a resina a ser clivada e manteve0se o @rasco so*
em Cuntamente com os produtos de
se+ ent=o+ a @ase l;uida da resina+ trans@erindo0a
a a a<=o de nitrognio gasoso para evaporar o %F#+ de @orma
se ;ue se c!egou a esta condi<=o ;uando o volume da solu<=o de clivagem n=o mais
i ent=o adicionado ao tu*o certo volume Paproximadamente .- m8Q de )ter
se o )ter diisoproplico ao s&lido restante e+ mais
se o l;uido do s&lido+ repetindo0se este passo por
o produto ser caracteri"ado e puri@icado4
7epresenta<=o do protocolo da rea<=o de clivagem dos peptdeos

2.2.2. #ntese das %enilseptinas e da 3ilaseptina 12

#s @enilseptinas P80'!es e D0'!esQ e Hilaseptina ', PH>',Q+ cuCas se;uncias encontram0
se na %a*ela ,4.+ @oram sinteti"adas utili"ando0se .W5+X mg de resina da marca 7inE0amide+ com
grau de su*stitui<=o -+X5 mmol/g+ para o*ter cerca de .V- mg de peptdeo *ruto ao @inal da
sntese4 Utili"ou0se+ para todos os reagentes envolvidos nas snteses+ uma ;uantidade de ;uatro
e;uivalentes molares em rela<=o H ;uantidade esperada do produto @inal4 Como ativadores @oram
utili"ados+ para cada acoplamento+ VV+W mg de .0!idroxi*en"otria"ol PH(tQ anidro e V6 8 de
9+9K0diisopropilcar*odiimida PDICQ4 Foram utili"ados ainda derivados de amino$cidos com as
cadeias laterais protegidas ;uando necess$rio4 'ara os experimentos de 7M9 no estado s&lido+
@oram sinteti"ados peptdeos marcados isotopicamente em determinados stios+ sendo ;ue+ para
80'!es e D0'!es+ os resduos marcados @oram 802 P
.V
9Q e #0.- P
,
H5Q e+ para H>',+ os resduos #0
.X PC0
,
H5Q e 80.1 P
.V
9Q+ con@orme mostrado na %a*ela ,4.4
%a*ela ,4.4 %a*ela ,4.4 %a*ela ,4.4 %a*ela ,4.4 >e;uncias dos peptdeos estudados+ em ;ue 80F e D0F representam+
respectivamente+ os resduos de amino$cido @enilalanina com os estereoisAmeros 8 e D do
resduo de @enilalanina+ e o grupo 09H, ao @inal das se;uncias indicam a amida<=o da
extremidade C0terminal4 # letra H indica a extremidade amino0terminal n=o modi@icada4 s
resduos em negritos representam os amino$cidos marcados com
.V
9 e os su*lin!ados+ os com o
grupo metila deuterado
9ome 9ome 9ome 9ome >e;uncia 'eptdica >e;uncia 'eptdica >e;uncia 'eptdica >e;uncia 'eptdica
80'!es H0FP80FQFD%8Z98 88 8#GZVIG#8%09H,
D0'!es H0FPD0FQFD%8Z98 88 8#GZVIG#8%09H,
H>', H0GIGDI8Z98#Z##GZ##8 88 8H#VGE>809H,

#s condi<Ges de rea<=o @oram as mesmas para todos os acoplamentos+ variando0se
somente o derivado de amino$cido utili"ado em cada etapa4 tempo de rea<=o para o primeiro
acoplamento de cada sntese @oi de 5+V ! e+ para os demais acoplamentos+ @oi de cerca de .+V !4
#p&s o t)rmino das snteses+ deu0se incio H etapa de clivagem e desprote<=o dos grupos
protetores permanentes4 #s clivagens @oram reali"adas utili"ando0se a solu<=o descrita
anteriormente4

2.2.'. Reao de )ormao da Distinctina

peptdeo !eterodim)rico distinctina @oi sinteti"ado por meio da rea<=o de condensa<=o
por @orma<=o de liga<=o dissul@eto entre as Cadeias . e ,+ previamente sinteti"adas por meio de
sntese em @ase s&lida+ pela estrat)gia Fmoc4 # dimeri"a<=o deu0se por oxida<=o ao ar+ incu*ando0
se as cadeias+ previamente puri@icadas+ a uma concentra<=o de V mg/m8 cada+ em uma solu<=o
aerada+ tamponada por .- mM de *icar*onato de amAnio+ a pH 1+54 # solu<=o @oi agitada por ,W
! H temperatura am*iente e+ em seguida+ neutrali"ada com $cido ac)tico diludo4
# @orma<=o do produto @oi acompan!ada por C8#E+ inCetando0se al;uotas do meio
reagente no aparel!o+ durante certos intervalos de tempo4 'ara o acompan!amento da rea<=o+
utili"ou0se o gradiente descrito na %a*ela ,4,+ em ;ue as Cadeias . e , apresentam+
respectivamente+ tempos de reten<=o de ,-+- min e ,-+6 min4 Foi monitorado o aparecimento de
um pico a ,,+, min Pproduto de dimeri"a<=oQ e o aumento de sua intensidade com o passar do
tempo+ acompan!ado da diminui<=o de intensidade dos picos relativos Hs Cadeias . e ,4
# @ra<=o relativa a esse tempo de reten<=o @oi coletada em uma coluna semipreparativa
de @ase reversa+ do tipo C0.1 PGrace VDdac
i
,.1%'VWQ4 Essa @ra<=o @oi lio@ili"ada e analisada por
espectrometria de massas M#8DI0%F/%F UltraFlex III+ (ruEer Daltonics4

%a*ela ,4,4 %a*ela ,4,4 %a*ela ,4,4 %a*ela ,4,4 Gradiente utili"ado para o acompan!amento cin)tico da rea<=o de dimeri"a<=o da
distinctina4 @luxo para este gradiente @oi de .+- m8/min
Tempo (min) TFA, 0,1% em gua (%) TFA, 0,08% em gua (%)
0 100 0
15 60 40
55 40 60
60 0 100
65 0 100

2.2.+. 1reparao de 4esculas para 56perimentos de Dicrosmo
Circular .CD0

#s vesculas dos @os@olipdeos .0palmitoil0,0oleoil0sn0glicero050@os@ocolina P''CQ e .0
palmitoil0,0oleoil0sn0glicero050@os@oglicina P''GQ para os experimentos de CD @oram preparadas
dissolvendo0se a ;uantidade apropriada dessas su*stBncias em DCM+ misturando0se as solu<Ges
resultantes at) apresentarem aspecto !omogneo4 @ilme lipdico @oi preparado durante a
remo<=o do solvente H press=o redu"ida4 solvente residual @oi removido por suc<=o a v$cuo
por aproximadamente . ! e os @ilmes @oram+ em seguida+ !idratados com $gua4
Vesculas unilamelares grandes @oram preparadas su*metendo0se a suspens=o a oito ciclos
de congelamento em nitrognio l;uido+ seguidos por a;uecimento em $gua a ,6 ^C4 #
suspens=o resultante @oi+ ent=o+ su*metida a um processo de extrus=o+ por .- ve"es+ atrav)s de
duas mem*ranas de policar*onato de .-- nm4

2.2.5. 56perimentos de Dicrosmo Circular

s experimentos de CD @oram ad;uiridos na presen<a de ''C?''G 5?. Pmol?molQ e
%FE para as Cadeias . e , da distinctina+ em um espectropolarmetro Iasco06.V+ utili"ando0se
uma cu*eta retangular de ;uart"o+ de camin!o &tico de .+- mm em $gua deioni"ada4 %odos os
espectros @oram ad;uiridos na @aixa de ,X- a .2- nm+ utili"ando0se uma largura de *anda de V+-
nm para os experimentos com vesculas e ,+- nm para os experimentos com %FE+ com resolu<=o
de -+, nm+ .-- nm/min de velocidade e W s de tempo de resposta4 Medidas de lin!a de *ase
@oram reali"adas em todos os dias de experimento para averiguar a esta*ilidade do instrumento4
%odos os espectros o*tidos constituem uma m)dia de cinco leituras+ com o *ranco Plin!a de *ase
do aparel!o e dos solventes e vesculas utili"adosQ su*trado4
'ara os experimentos+ prepararam0se solu<Ges esto;ue de concentra<Ges W1- jM para as
Cadeias . e , e W5- jM para a distinctina+ *em como para a mistura de vesculas de @os@olipdeos
P. mMQ4 #s concentra<Ges dos peptdeos @oram de+ aproximadamente+ 5-0W- M+ com os valores
exatos calculados por medidas de a*sor<=o em trs di@erentes comprimentos de onda P,-V+ ,-2 e

,,- nmQ4 V$rios espectros @oram ad;uiridos pela adi<=o em pe;uenos volumes+ da solu<=o de
lipdeos H solu<=o dos peptdeos4
# desconvolu<=o tanto dos experimentos em %FE ;uanto dos experimentos em vesculas+
@oi condu"ida pelo programa CD'ro P>reerama \ [oodD+ ,--WQ a @im de estimar o percentual de
estruturas secund$rias em cada meio4

2.2.7. 1rocessamento e "n8lise de 56perimentos de RM! em #oluo

# convers=o e processamento dos dados de 7M9 @oram @eitos pelo programa 9M7'ipe
PDelaglio et al4+ .22VQ4 # interpreta<=o dos mapas de contorno @oi e@etuada no programa
9M7VieF V4- PIo!nson+ .22WQ4 %odos os programas e algoritmos utili"ados nesta etapa @oram
criados para serem executados em plata@orma 8inux+ e @oram executados na distri*ui<=o Fedora+
versGes 2+ .- e ..4
#s restri<Ges de distBncia @oram o*tidas diretamente por meio dos sinais de 9E4 s
volumes desses sinais @oram determinados por integra<=o+ utili"ando0se a metodologia de
cali*ra<=o proposta por Gantert e cola*oradores PGantert et al4+ .22.Q4 Essa etapa @oi e@etuada
pelo programa 9M7VieF V4-+ sendo ;ue os sinais relativos a grupos metila tiveram suas
intensidades divididas por trs4
#s restri<Ges angulares @oram o*tidas pelo programa %#8>d P>!en+ Delaglio et al4+
,--2Q+ por meio da an$lise dos valores de deslocamento ;umico dos $tomos da cadeia principal
C
+ H
+ C
+ 9+ H9 e CK+ em rela<=o a um *anco de dados de deslocamentos ;umicos desses

$tomos em estruturas de protenas determinadas em alta resolu<=o4
c$lculo do conCunto de estruturas o*tidas por an$lise de 7M9 @oi reali"ado utili"ando0
se o programa `plor09IH vers=o ,4.6 P>c!Fieters et al4+ ,--5Q e o algoritmo de arre@ecimento
simulado Psimulated annealingQ em coordenadas cartesianas sakneF4inp para a distinctina+ e o
algoritmo de arre@ecimento simulado em espa<o de Bngulos de tor<=o nmrktorsion4inp P7ice \
(runger+ .22WR >tein et al4+ .226Q4 Utili"ou0se uma estrutura de partida randAmica gerada pelo
algoritmo generatekinput e com uma topologia protein4top e parametri"a<Ges protein4par+ ;ue
levava em conta a termina<=o amidada da extremidade C0terminal de am*as as cadeias4

s c$lculos de arre@ecimento simulado tiveram como parBmetros temperatura inicial de
.--- Z+ nJmero total de etapas PstepsQ a altas temperaturas igual a .W4---+ nJmero total de etapas
durante cada res@riamento igual a X4---4 res@riamento simulado @oi @eito de V- em V- Z at) ;ue
se c!egasse a uma temperatura de .-- Z4 c$lculo @oi reali"ado em trs etapas principais? uma
levando em conta valores de limite de viola<=o de restri<Ges de distBncia e angulares de -+V ] e
V^+ respectivamente+ a etapa seguinte considerando um valor de -+5 ] e 5^ para esses limites e
uma etapa @inal+ considerando limites de viola<=o de -+. ] e .^4 Considerou0se o c$lculo
concludo somente ;uando as vinte estruturas mais est$veis n=o apresentaram mais viola<Ges
sistem$ticas em nen!um dos limites estipulados4
'ara an$lise dos conCuntos de restri<Ges geom)tricas+ utili"ou0se o programa QUEE9
P9a*uurs et al4+ ,--5Q+ concomitantemente H inspe<=o visual das viola<Ges das restri<Ges
geom)tricas4
%odos os c$lculos estruturais @oram reali"ados para serem geradas ,-- estruturas4 Desse
nJmero+ @oram selecionadas as ,- estruturas de menor energia total e+ por meio dos programas
M8M8 PZoradi et al4+ .22XQ+ elas @oram agrupadas de modo a se o*ter a mel!or so*reposi<=o
das estruturas4 Dessas estruturas so*repostas+ @oi o*tido o valor de 7M>D P7oot Mean >;uare
Deviation+ desvio ;uadr$tico m)dioQ para parte da valida<=o do c$lculo4
# valida<=o e an$lises estruturais @oram @eitas atrav)s da p$gina iCing
P!ttp?//nmr4cm*i4ru4nl/icing/iCing4!tmll@ileQ+ utili"ando0se as metodologias dos programas
'7CHECZ P8asEoFsEi et al4+ .22XQ e [H#% IF PVriend+ .22-Q+ *em como os crit)rios de
classi@ica<=o do programa CI9G PCommon Inter@ace @or 9M7 >trucure GenerationQ4
2.2.9. 1reparao das amostras para RM! no estado s(lido

'ara os estudos de 7M9 em estado s&lido+ @oram utili"adas amostras dos peptdeos
orientados em *icamada lipdica de .0palmitoil0,0oleoil0sn0glicero050@os@ocolina P''CQ+ cada
amostra contendo di@erentes propor<Ges de peptdeo e @os@olipdeo+ con@orme mostrado na
%a*ela ,45 Pp4 VXQ4

%a*ela ,454 %a*ela ,454 %a*ela ,454 %a*ela ,454 7ela<=o das massas de peptdeo e @os@olipdeo P''CQ utili"adas nas amostras de
7M9 no estado s&lido+ com suas respectivas porcentagens molares
'eptdeo 'eptdeo 'eptdeo 'eptdeo
Massa de Massa de Massa de Massa de
peptdeo peptdeo peptdeo peptdeo
Massa de Massa de Massa de Massa de
''C ''C ''C ''C
'orcentagem molar do peptdeo em 'orcentagem molar do peptdeo em 'orcentagem molar do peptdeo em 'orcentagem molar do peptdeo em
''C ''C ''C ''C
80'!es ., mg .V. mg 5c
D0'!es .. mg .51 mg 5c
H>', ., mg .,, mg 5c

Inicialmente+ dissolveu0se o peptdeo em cerca de , m8 de ,+,+,0tri@luoroetanol P%FEQ e
mediu0se o pH utili"ando pap)is indicadores4 'ara isso+ distri*uiu0se uma pe;uena ;uantidade da
solu<=o alco&lica resultante so*re o papel e+ ap&s a evapora<=o do solvente+ o papel @oi
umedecido com $gua desioni"ada para determinar o pH do sistema em meios com alto grau de
!idrata<=o4 pH @oi ent=o aCustado a pH6 com volumes mnimos de solu<Ges de $cido clordrico
ou !idr&xido de s&dio . mol/84 Em seguida+ na mesma solu<=o+ dissolveu0se a ;uantidade pesada
de ''C e a solu<=o resultante @oi su*metida a um @luxo *rando de nitrognio gasoso at) ;ue o
sistema se tornasse ligeiramente viscoso4 Em seguida+ distri*uram0se volumes aproximadamente
iguais da mistura de peptdeo e @os@olipdeo so*re .V a ,V placas de vidro ultra@inas P1 h ,, mmm+
Marien@eld+ 8auda0Znnigs!o@en+ #leman!aQ e su*meteram0se as amostras a press=o redu"ida por
uma noite para retirar todo o %FE presente4 #s amostras @oram ent=o trans@eridas para uma
cBmara de !idrata<=o com umidade relativa de 25c e deixadas a !idratar por cerca de sete dias4
'or @im+ as placas de vidros @oram empil!adas e seladas com @ita te@lon e pl$stico4

2.2.:. 56perimentos de RM! no estado s(lido

Experimentos de 7M9 de
5.
' desacoplados de !idrognio das amostras de *icamadas
lipdicas orientadas @oram reali"ados a .X, MH" em um espectrAmetro (ruEer #M`W-- Fide0
*ore+ utili"ando0se uma sonda comercial est$tica de ressonBncia dupla para 7M9 no estado
s&lido4 Medidas @oram e@etuadas para a orienta<=o da normal da mem*rana paralela ao campo
magn)tico externo4 Uma se;uncia de pulsos de eco de Ha!n @oi empregada4 s seguintes
parBmetros @oram utili"ados? Canela espectral de 6V EH"+ tempo de a;uisi<=o de .5+X ms+ ,4-W1
pontos+ pulsos de 2- com largura de ,+V s+ intervalo de tempo de eco de W- s+ intervalo de

tempo de espera de V s e XW transientes4 Uma solu<=o de $cido @os@&rico a 1Vc Pem volumeQ @oi
utili"ada como re@erncia externa P- ppmQ4
Experimentos de 7M9 de
.V
9 desacoplados de !idrognio @oram ad;uiridos a W- MH"
em um espectrAmetro (ruEer #M`W-- Fide0*ore+ utili"ando0se uma sonda comercial E0@ree de
ressonBncia dupla para 7M9 no estado s&lido4 Medidas @oram condu"idas para orienta<=o
normal da mem*rana paralela ao campo magn)tico externo4 s seguintes parBmetros @oram
empregados? pulsos de 2-^ com largura de 1 s+ tempo de c!aveamento de campo de 6-- s+
intervalo de tempo de espera de 5+V s+ V., pontos de domnio de tempo+ .14--- a;uisi<Ges e
Canela espectral de 55 EH"4 Utili"ou0se como re@erncia externa uma amostra de
.V
9HWCl em cuCo
espectro !$ um sinal em W.+V ppm4
Espectros de 7M9 de
,
H em @ase s&lida @oram o*tidos no espectrAmetro (ruEer #M`W--
Fide0*ore Ppeptideo 80'!esQ+ e em um espectrAmetro (ruEer #vance 5-- Fide0*ore Pdemais
peptdeosQ utili"ando0se uma sonda est$tica comercial de ressonBncia tripla4 Medidas @oram
reali"adas para orienta<=o da normal da mem*rana paralela ao campo magn)tico externo4
Utili"ou0se uma se;uncia de eco ;uadrupolar com os seguintes parBmetros?
,
H (. de V- EH"+
tempo de eco de W- s+ Canela espectral de .-- EH"+ W4-2X pontos+ 1-4--- transientes e intervalo
de tempo de repeti<=o de . s4 s espectros @oram cali*rados com rela<=o H
,
H, no valor de -
ppm+ e a se;uncia de eco @oi averiguada pelo @ormato do espectro de uma amostra de plexiglass
deuterado4 Fun<Ges exponenciais de apodi"a<=o correspondentes a um alargamento de lin!a de
5-- H" @oram aplicadas antes da trans@ormada de Fourier4
2.2.;. #imulao de parmetros da RM! em %ase s(lida e determinao
da orientao dos peptdeos em bicamadas lipdicas

s possveis alin!amentos dos peptdeos @oram calculados usando0se o programa
Mat!ematica P[ol@ram 7esearc!+ Inc4Q e as estruturas 'D( dos peptdeos @oram orientadas de
acordo com as rela<Ges angulares calculadas+ utili"ando0se o programa 'DM8 P%!e 'DM8
Molecular Grap!ics >Dstem+ V4 -422+ >c!rndinger+ 8CCQ4 'ara a orienta<=o das estruturas+
primeiro alin!ou0se o vetor da !)lice do peptdeo com o eixo "+ e+ em seguida+ reali"aram0se as
rota<Ges re@erentes ao Bngulo polar de rota<=o interna e ao Bngulo de inclina<=o PFigura ,4.Q+
nesta ordem4

Figura ,4.4 Figura ,4.4 Figura ,4.4 Figura ,4.4 7epresenta<=o de um peptdeo 0!elicoidal+ com a representa<=o do eixo "
Pcoincidente com a normal da mem*ranaQ e do vetor H+ de@inido como eixo principal da !)lice4
Bngulo 0+ Bngulo de inclina<=o+ ) de@inido pela orienta<=o de H em rela<=o a "+ e + Bngulo
polar de rota<=o interna+ ) o semi0Bngulo do cone @ormado pela rota<=o da liga<=o C
u
C
[
em
torno da normal da *icamada @os@olipdica4

2.2.1< 1reparao de =ipossomas para 56perimentos de Calorimetria
/sotrmica de *itulao ./*C0
'ara a prepara<=o dos lipossomas+ @oram utili"ados uma mistura de ''C e ''G 5?.
Pmol?molQ destes @os@olipdeos4 #s mem*ranas mim)ticas PlipossomasQ @oram preparadas so* a
@orma de vesculas unilamelares de diBmetro aproximadamente .-- nm4 # prepara<=o destes
lipossomas envolveu ;uatro @ases distintas4

2.2.1<.1. >bteno do %ilme lipdico
# ;uantidade de @os@olipdeo utili"ada @oi calculada de modo a @ornecer a concentra<=o de
5V mM4 @os@olipdeo @oi dissolvido em cloro@&rmio e o excesso de solvente @oi eliminado com
um @luxo *rando de 9, gasoso4 @ilme lipdico o*tido ap&s elimina<=o do excesso de solvente @oi
mantido so* press=o redu"ida+ em rotavapor+ a 5- C+ durante 5!+ para completa secagem4

2.2.1<.2. 3idratao do %ilme lipdico
@ilme seco @oi !idratado com solu<=o de tamp=o %ris0HCl+ de pH 6+X e a;uecido em
*an!o de $gua termostati"ado durante .!+ a 5-
o
C4 a;uecimento da suspens=o lipdica @oi

alternado com a agita<=o em vortex para assegurar o descolamento total do @ilme das paredes do
*al=o+ o*tendo0se nesta @ase vesculas multilamelares PM8VsQ4

2.2.1<.'. Ciclos de a$uecimento-congelamento .?Free2e67a8@0
# suspens=o de @os@olipdeos @oi trans@erida para um tu*o Falcon de .V m8 e as vesculas
multilamelares PM8VsQ @oram su*metidas a cinco ciclos de congelamento0descongelamento
Po@ree"e0taFKQ? mergul!ou0se o tu*o em nitrognio l;uido para congelamento muito r$pido da
suspens=o e+ em seguida+ no *an!o de $gua termostati"ado H temperatura re@erida at) o
completo descongelamento4

2.2.1<.+. 56truso
#p&s os ciclos de congelamento0descongelamento+ a suspens=o @oi su*metida v$rias
ve"es+ a 5- C+ por um extrusor termostati"ado PFigura ,4,Q+ e;uipado com mem*ranas de
policar*onato P9ucleopore+ 'leasanton+ C#+ Estados UnidosQ com poros de diBmetros
decrescentes4 # extrus=o @oi e@etuada so* press=o com 9,+ cinco ve"es com cada uma das
mem*ranas de W-- nm e ,-- nm+ so* press=o de W e 1 atm de 9,+ respectivamente+ e de" ve"es
pela mem*rana de .-- nm+ so* press=o de ., atm de 9,+ para o*ten<=o das vesculas
unilamelares grandes P8UVsQ4

Figura ,4,4 Figura ,4,4 Figura ,4,4 Figura ,4,4 Extrusor com capacidade para .- m8 P8ipex (iomem*ranes+ Vancouver+ (C+
Canad$Q+ podendo ser operado em uma @aixa larga de temperatura por liga<=o a um *an!o de
$gua termostati"ado circulante4 # press=o 9, PgQ permite a passagem r$pida da amostra atrav)s
da mem*rana de policar*onato

# suspens=o de lipossomas @oi mantida so* re@rigera<=o a W
o
C at) a sua utili"a<=o+ por um
perodo nunca superior a ., !4 #s suspensGes preparadas @oram sempre usadas no perodo de
cinco dias ap&s prepara<=o+ para n=o comprometer a integridade e taman!o m)dio das vesculas4
# concentra<=o @oi determinada para cada prepara<=o+ pelo m)todo de (artlett+ tam*)m
con!ecido como m)todo do @os@omoli*dato P9eF+ .22-Q4 # distri*ui<=o de taman!os das
vesculas unilamelares grandes P8UVsQ o*tidas ap&s extrus=o @oi determinada por espal!amento
de lu" dinBmica PDDnamic 8ig!t >cattering _ D8>Q4

2.2.11. Calorimetria de *itulao /sotrmica
#s experincias de titula<=o calorim)trica isot)rmica @oram e@etuadas no calormetro V'0
I%C da Microcal0GE Healt!care P'iscataFaD+ Estados UnidosQ4 'ara e@etuar a caracteri"a<=o
termodinBmica dos sistemas mem*ranas modelo/peptdeos+ @oram @eitos dois tipos de ensaios de
I%C?
Em um tipo+ a suspens=o de lipossomas de concentra<=o elevada ) colocada na c)lula
calorim)trica+ sendo titulada com a solu<=o do peptdeo4 9este ensaio+ a ra"=o
peptdeo/lipossoma ) muito *aixa+ n=o ocorrendo assim satura<=o nem altera<Ges signi@icativas
da mor@ologia da mem*rana4 # ;uantidade de calor envolvida ) constante em todas as inCe<Ges
Ppraticamente todo o peptdeo titulado particiona para a mem*ranaQ e a entalpia m)dia da
intera<=o PA
nt
EQ pode ser calculada pela $rea m)dia dos picos o*servados+ dividida pelo nJmero
de mol de peptdeo por inCe<=o4
9o outro tipo de ensaio+ a solu<=o do peptdeo ) colocada na c)lula calorim)trica em
concentra<=o *aixa e pe;uenos volumes da solu<=o do lipossoma s=o inCetados4 # concentra<=o
de lipossoma varia signi@icativamente ao longo da titula<=o+ o*servando0se diminui<=o
progressiva da $rea de pico com a diminui<=o da ;uantidade de peptdeo disponvel para a
parti<=o4 # partir deste tipo de experincia podem ser construdas curvas de intera<=o para o*ter
simultaneamente a constante de parti<=o+ K
p
e a varia<=o de entalpia da intera<=o PA
nt
EQ4
# entalpia de dilui<=o deve ser medida em ensaios independentes+ em ;ue a solu<=o de
peptdeo Pou solu<=o de lipossomaQ ) titulada em tamp=o+ nas mesmas condi<Ges das
experincias anteriores com o respectivo titulante4 Esta entalpia+ se n=o @or despre"vel+ deve ser

comparada com a o*tida nas inCe<Ges @inais da titula<=o ou+ at) com a o*tida por aCuste+ para
testar a validade dos e@eitos intera<=o/dilui<=o+ su*Cacente H corre<=o com entalpia de dilui<=o
determinada em ensaios independentes4 #p&s su*tra<=o do calor de dilui<=o o*tm0se as
entalpias de intera<=o+ ;ue s=o analisadas por modelos termodinBmicos de intera<=o ade;uados
aos sistemas estudados.

2.2.11.1. *itula&es e%etuadas no calormetro 41-/*C
9o calormetro V'0I%C mostrado na @igura ,45 Pp4 X,Q @oram e@etuadas as titula<Ges de
lipossomas de ''C?''G P5?.+ mol?molQ+ com o peptdeo H>',4 9as experincias de titula<=o
isot)rmica com este calormetro+ @oi seguido o protocolo descrito a seguir+ para assegurar uma
*oa precis=o e exatid=o nos resultados?
#s amostras para serem colocadas na c)lula e na seringa @oram desgasei@icadas num
aparel!o Microcal apropriado PFigura ,45+ p4 X,Q4 # primeira inCe<=o @oi de 5 8+ um volume
menor do ;ue o das inCe<Ges su*se;uentes+ por;ue o sistema autom$tico de enc!imento da
seringa causa imprecis=o no volume da primeira inCe<=o e+ al)m disso+ !$ di@us=o durante o
perodo de esta*ili"a<=o antes do incio da titula<=o4 Esta inCe<=o n=o ) considerada na avalia<=o
dos resultados calorim)tricos+ em*ora a ;uantidade de soluto inCetado o seCa4
# c)lula de re@erncia contin!a solvente idntico ao da c)lula de amostra4 # concentra<=o da
amostra do titulante a ser usada depende das caractersticas do processo em estudo4 Como regra
de partida+ pode considerar0se ;ue ela deve ser de .- a 5- ve"es maior ;ue a concentra<=o do
titulado para garantir a co*ertura de todo o processo4
s parBmetros experimentais s=o inseridos no programa V'VieFer ;ue @a" a;uisi<=o dos
dados e o controle da opera<=o do aparel!o4 programa rigin0I%C PMicrocal0GE Healt!care+
'iscataFaD+ Estados UnidosQ @oi usado para o tratamento inicial dos resultados+ @ornecendo a $rea
integrada e a varia<=o de entalpia o*servada+ por mol de titulante Pou titulado+ H escol!a do
operadorQ+ assim como as concentra<Ges de titulante e titulado na c)lula+ ap&s cada inCe<=o4 Com
estes resultados+ @oi @eito o aCuste de curvas ;ue descrevam o processo em estudo+ com vista H
o*ten<=o dos parBmetros termodinBmicos ;ue o caracteri"am4

Figura ,454 P#Q Figura ,454 P#Q Figura ,454 P#Q Figura ,454 P#Q Computador usado no controle da experincia de titula<=o e para a
a;uisi<=o de dados4 P(Q P(Q P(Q P(Q Calormetro V'0I%C com seringa girat&ria4 PCQ perspectiva do
aparel!o com *om*a a v$cuo+ agita<=o e controle de temperatura para desgasei@ica<=o
das amostras4 4 4 4
#s experincias de calorimetria de titula<=o isot)rmica @oram condu"idas com os
lipossomas na seringa em concentra<Ges de 5-05V mM e os peptdeos na c)lula+ com
concentra<Ges de 5W- M a , mM4 nJmero de inCe<Ges variou entre .- e V- e os volumes de
inCe<Ges variaram entre V a ,6 84 volume e@etivo da c)lula do calormetro usado ) de .+W,WW
m84 s ensaios de titula<=o experincias @oram e@etuados a ,V e 5V
o
C4
# constante de parti<=o PK
p
Q e a respectiva varia<=o de entalpia para o processo de
intera<=o peptdeo/mem*rana @oram o*tidas usando um modelo de parti<=o simples Pp4 .5XQ4

#
C
(

". Resultados e #iscusso

3.1. Sntese em Fase Slida dos Peptdeos "istinctina*
9ilaseptina P2 :9SP2; e Fenilseptinas <=P>es e "=P>es

'.1.1. #ntese da Distinctina
# distinctina @oi sinteti"ada em duas etapas+ a primeira constituiu0se na sntese em @ase
s&lida das duas cadeias Pestrutura prim$ria representada na %a*ela 54.+ utili"ando0se a estrat)gia
Fmoc4 # uma segunda constituiu0se na rea<=o de @orma<=o da liga<=o dissul@eto entre os resduos
C.2+ da Cadeia .+ e CWV+ da Cadeia ,4
%a*ela 54.4 %a*ela 54.4 %a*ela 54.4 %a*ela 54.4 >e;uncia dos monAmeros Cadeias . e , da distinctina
Monmero Sequncia Peptdica
Cadeia 1 H-ENREVPPGFTALIKTLRKCKII-NH
2
Cadeia 2 H-NLVSGLIEARKYLEQLHRKLKNCKV-NH
2

# primeira etapa @oi reali"ada anteriormente+ estando descrita em Mun!o" P,--1Q4 #
rea<=o de sntese do !eterodmero constituiu0se de uma rea<=o de oxida<=o ao ar4 'ara isso+
@oram preparados volumes iguais de , m8 de duas solu<Ges tamp=o 9HWHC5 a .- mM+ pH 1+5+
cada uma com um dos peptdeos Pcadeia . ou ,Q H concentra<=o de V mg/m84 #s duas solu<Ges
@oram ent=o misturadas em um Jnico recipiente e o meio reagente @oi mantido so* agita<=o+ em
contato com ar+ por cerca de ,W !4 Como a rea<=o demora um perodo consider$vel de tempo+
esta etapa necessitou ser su*metida a um controle cin)tico+ o ;ual @oi @eito por C8#E4
acompan!amento @oi reali"ado com inCe<Ges em longos intervalos de tempo+ mantendo0se
sempre o gradiente representado na %a*ela 54, Pp4 XWQ 'Ade0se o*servar+ simultaneamente+ a
diminui<=o na intensidade de a*sor<=o nos picos correspondentes Hs cadeias . e , Ptempo de
reten<=o de ,-+- e ,-+6 min+ respectivamenteQ e a intensi@ica<=o na a*sor<=o do pico relativo ao
!eterodmero Ptempo de reten<=o de ,,+, minQ+ con@orme mostrado na Figura 54. Pp4 XWQ4

%a*ela 54,4 %a*ela 54,4 %a*ela 54,4 %a*ela 54,4 Gradiente utili"ado para o acompan!amento cin)tico da rea<=o de dimeri"a<=o da
distinctina4 @luxo para este gradiente @oi de .+- m8/min
Tempo (min) TFA, 0,1% em gua (%) TFA, 0,0% em acetonitri!a (%)
0 100 0
15 60 40
55 40 60
60 0 100
65 0 100

Figura 54.4 Figura 54.4 Figura 54.4 Figura 54.4 Cromatogramas C8#E do acompan!amento da rea<=o de @orma<=o do !eterodmero
distinctina coletados em diversos intervalos de tempo durante a rea<=o+ mostrando os tempos de
reten<=o das Cadeias . e , P,-+- min e ,-+6 min+ respectivamenteQ e o tempo de reten<=o do sinal
supostamente relativo ao !eterodmero P,,+, minQ4

Devido ao @ato de os tempos de reten<=o relativos aos monAmeros estarem pr&ximos aos
o*servados nas suas an$lises cromatogr$@icas individuais so* as mesmas condi<Ges de gradiente+
considerou0se ;ue os sinais com os tempos de reten<=o o*servados correspondem Hs cadeias
separadas4 # @ra<=o correspondente ao produto com tempos de reten<=o ,,+, @oi coletada e
analisada por espectrometria de massas M#8DI0%F/%F PFigura 54,+ p4 XVQ4 Entretanto+ apesar
de se o*servar um sinal a SMT
d
b VW61 g/mol correspondente H massa molecular da distinctina+
perce*em0se tam*)m diversos outros sinais+ de intensidades compar$veis ao da distinctina+
indicando ;ue+ apesar de no cromatograma estar presente apenas um sinal no tempo de reten<=o

,,+,+ a @ra<=o correspondente a esse sinal )+ na verdade+ constituda por uma mistura de diversos
compostos4

Figura 54,4 Figura 54,4 Figura 54,4 Figura 54,4 Espectro de massas da amostra da solu<=o da rea<=o de @orma<=o da distinctina
coletada em tempo de reten<=o ,,+, min para esp)cies de massa maior ;ue W Eg/mol PaQ PaQ PaQ PaQ e
esp)cies de massas menores ;ue W Eg/mol P*Q P*Q P*Q P*Q4 Est=o indicadas ;uatro esp)cies principais+ com
valores de m/" V2-X+ VW61+ ,2W2 e ,V,,4
5477.836
5905.959
0
200
400
600
800
In
te
n
s
. [a
.u
.]
5000 6000 7000 8000 9000 10000
m/z
2948.671
2522.457
0
500
1000
1500
2000
In
te
n
s
. [a
.u
.]
1500 2000 2500 3000 3500
m/z
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q

# @ra<=o coletada a ,,+, min @oi ent=o su*metida novamente a uma an$lise
cromatogr$@ica4 Desta ve"+ utili"ou0se um cromat&gra@o do tipo UF8C e+ utili"ando0se um
gradiente de .-c a 1-c de acetonitrila -+-1c %F# e com @luxo de -+W m8/min+ reali"ou0se uma
varredura de temperatura+ de W- a 1- ^C+ com incrementos de .- ^C+ con@orme mostrado na
Figura 5454 sinal Jnico o*servado a temperatura am*iente desdo*ra0se em trs sinais distintos
com o aumento de temperatura4 Isso pode se deve ao @ato de peptdeos ;ue interagem com
mem*rana possurem uma tendncia consider$vel em se agregar4 Com o aumento da
temperatura+ algumas das intera<Ges respons$veis pela agrega<=o s=o ;ue*radas+ podendo0se+
assim+ separar os di@erentes estados de agrega<=o entre as di@erentes mol)culas do peptdeo ;ue
compGem a @ra<=o analisada4

Figura 5454 Figura 5454 Figura 5454 Figura 5454 Cromatogramas de UF8C das amostras da solu<=o da rea<=o de @orma<=o da
distinctina coletada a um tempo de reten<=o de ,,+, min+ mostrando o per@il das curvas em
@un<=o da temperatura de an$lise4 #s cinco @ra<Ges coletadas para an$lise de espectrometria de
massas est=o representadas pelos nJmeros . _ V4
%odas as @ra<Ges @oram coletadas separadamente e analisadas por espectrometria de
massas M#DI0%F/%F4 # Figura 54Wa Pp4 X6Q mostra os espectros de massa de cada @ra<=o no
modo linear+ onde se pode o*servar sinais relativos a esp)cies de massas moleculares maiores e a
Figura 54W* Pp4 X6Q+ no modo re@letido onde se encontram os sinais relativos a esp)cies de massas
moleculares menores4

Figura 54W4 Figura 54W4 Figura 54W4 Figura 54W4 Espectro de massas das @ra<Ges . _ V coletadas na an$lise pelo UF8C+ com varia<=o de
temperatura+ para esp)cies de massa maior ;ue W Eg/mol PaQ PaQ PaQ PaQ e esp)cies de massas menores ;ue W
Eg/mol P*Q P*Q P*Q P*Q4

'ela an$lise da Figura 54W podem ser perce*idos v$rios outros sinais al)m do sinal SMT
d
b
VW1- g/mol+ relativo ao on molecular da distinctina4 #s esp)cies do contaminante mais
a*undante na maior parte das amostras corresponde aos sinais SMT
d
b 5-.- g/mol+ SMdHT
d
b
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q
.
,
5
W
V
.
,
5
W
V

5-.. g/mol+ SMT
,d
b .V-V g/mol e SMdHT
,d
b .V-X g/mol4 # massa molar de SMT
d
dessa esp)cie
di@ere cerca de VX g/mol da massa do on molecular da Cadeia , PSMT
d
b ,2VW g/molQ+ podendo
corresponder a essa cadeia com um grupo protetor terc0*utila Pt(uQ na cadeia lateral de algum
resduo de amino$cido4 'ossivelmente+ a etapa de clivagem n=o @oi su@iciente para desproteger a
cadeia lateral de algum resduo da Cadeia ,4 utro contaminante encontrado possui o sinal
re@erente ao on molecular em SMdHT
d
b V2-2 g/mol+ atri*udo ao !omodmero @ormado pela
condensa<=o entre duas mol)culas da Cadeia ,4 #l)m disso+ puderam ser identi@icados sinais
relativos Hs Cadeias . e , em suas @ormas monom)ricas SMT
d
b ,V,6 g/mol e SMT
d
b ,2VW g/mol+
respectivamente4 #s esp)cies encontradas em cada @ra<=o est=o listadas na %a*ela 5454 Em*ora
seCa *em prov$vel ;ue estas esp)cies esteCam presentes em pe;uenas ;uantidades em mais
alguma outra @ra<=o+ a Jnica @ra<=o cuCa resolu<=o do espectro de massas permitiu a identi@ica<=o
dessas esp)cies @oi a @ra<=o V4
%a*ela 5454 %a*ela 5454 %a*ela 5454 %a*ela 5454 7ela<=o das esp)cies encontradas em cada @ra<=o cromatogr$@ica+ na an$lise a 1-^C
de acordo com a numera<=o de sinais representada na Figura 54W Pp4 X6Q
Frao Espcie presente*
1 CH2-tBu
2 CH2-tBu
CH2-tBu! Homodim-CH2
4 "#$! Homodim-CH2
5 "#$! CH1
%
! CH2
%
* CH,0t(u b Cadeia , com um grupo protetor terc0*utila ligado a uma cadeia lateral de algum
resduo de amino$cidoR Homodim0CH, b Homodmero @ormado pela condensa<=o de duas
mol)culas de Cadeia ,R Dtn _ distinctinaR CH. b Cadeia .R CH, b Cadeia ,4

9as @ra<Ges . a 5+ a esp)cie mais a*undante @oi a Cadeia , com o grupo terc0*utila PCH,0
t(uQ4 # distinctina+ por sua ve"+ @oi identi@icada somente nas @ra<Ges W e V4 Em*ora a distinctina
aparente estar mais a*undante na @ra<=o W+ pela an$lise dos cromatogramas e ionogramas+ a Jnica
@ra<=o ;ue cont)m a distinctina em um grau de pure"a aceit$vel para an$lise ) a @ra<=o V4 Essa
@ra<=o @oi coletada e lio@ili"ada para ser ent=o su*metida aos estudos por 7M94

'.1.2. #ntese e 1uri%icao da 3ilaseptina 12 .3#120

# sntese do peptdeo H>', @oi @eita manualmente+ pela estrat)gia Fmoc PC!an \ [!ite+
,---Q4 sentido de acoplamento ) apresentado na %a*ela 54W4 acoplamento e a desprote<=o
@oram acompan!ados pelo teste de Zaiser+ um teste ;ualitativo para a identi@ica<=o de aminas
prim$rias4 #ssim+ a presen<a de grupos amino livres na se;uncia peptdica ) evidenciada pela cor
pJrpura nos gr=os em ;ue o teste ) reali"ado4 Con@orme mostrado tam*)m na %a*ela 54W+ @oi
reali"ada uma sntese do peptdeo isotopicamente marcado com
.V
9 no resduo 8.1+ e com
,
H5
na cadeia lateral do resduo de #.X para a reali"a<=o dos experimentos de 7M9 em @ase s&lida
Pitem 5454W4.+ p4 ..XQ4
%a*ela 54W4 %a*ela 54W4 %a*ela 54W4 %a*ela 54W4 >e;uncia peptdica do peptdeo H>',+ com o sentido de acoplamento dos
amino$cidos+ com o resduo de amino$cido isotopicamente marcado com
.V
9 representado em
negrito e o resduo de amino$cido isotopicamente marcado com
,
H5 representado su*lin!ado
Peptdeo Sequncia peptdica
HSP2
G I G " I L K N L A K A A G K A A " H A V G E S L
&e$#id' d'
a(')*a+e$#'

# %a*ela 54V mostra as ;uantidades dos demais reagentes utili"ados para cada etapa+ *em
como os resultados de acoplamento e desprote<=o atrav)s dos testes de Zaiser4 Em determinadas
etapas+ @oram necess$rios reacoplamentos devido a resultados insatis@at&rios do teste de Zaiser+
con@orme indicado na %a*ela 54X Pp4 6-Q4 #p&s a conclus=o da sntese+ @oi reali"ada a etapa de
clivagem+ utili"ando0se a solu<=o descrita anteriormente Pp4 WXQ so*re a resina4 Foram o*tidos ,1X
mg do peptdeo *ruto ao @inal da sntese+ consistindo em 2Vc de rendimento4
%a*ela 54V4 %a*ela 54V4 %a*ela 54V4 %a*ela 54V4 Quantidade dos reagentes utili"ada na sntese do peptdeo H>',
#eagente$Suporte Po!im%rico &uantidade
7esina 7inE -+X5 mmol/mg 21+W mg
H(t 51+- mg
DIC 52 j8

# %a*ela 54X apresenta o acompan!amento da sntese manual em todos os seus
acoplamentos4 acompan!amento @e"0se necess$rio para identi@icar rea<Ges incompletas ;ue
s=o detectadas pelo teste de Zaiser4 9este teste a presen<a de grupo amino livre ) caracteri"ada
pela colora<=o a"ulada da resina4 Dessa @orma+ ao @im de cada etapa de acoplamento e de
desprote<=o do grupo amino+ @oram reali"ados testes de Zaiser4
%a*ela 54X %a*ela 54X %a*ela 54X %a*ela 54X4 #compan!amento da sntese de H>',
Ordem do
Acoplamento
Derivado de
Aminocido
Excesso
Tempo de
reao (h)
Teste de Kaiser
Acoplamento Desproteo
1 F+'(-Leu-,H 4 ---- ---
2 F+'(-Se./tBu0-,H 4 1!5 ---- ---
F+'(-G*u/tBu0-,H 4 1!5 ---- ---
4 F+'(-G*1-,H 4 1!5 ---- ---
5 F+'(-A*a-,H 4 1!5 ---- ---
6 F+'(-Se./tBu0-,H 4 1!5 ---- ---
2 F+'(-Hi&/T.#0-,H 4 1!5 ---- ---
3 F+'(-Leu-,H 4 1!5 --- 4
Rea(')*a+e$#' F+'(-Leu-,H 4 2!5 ---- ---
5 F+'(-A*a-,H 4 1!5 ---- ---
10 F+'(-A*a-,H 4 2!5 ---- ---
11 F+'(-L1&/B'(0-,H 4 1!5 --- 4

Rea(')*a+e$#' F+'(-L1&/B'(0-,H 4 2 --- ---

12 F+'(-G*1-,H 4 2 ---- ---
1 F+'(-A*a-,H 4 2 ---- ---
14 F+'(-A*a-,H 4 2 ---- ---
15 F+'(-L1&/B'(0-,H 4 2 ---- ---
16 F+'(-A*a-,H 4 2 ---- ---
12 F+'(-Leu-,H 4 2 ---- ---
13 F+'(-A&$/T.#0-,H 4 2 --- 4
Rea(')*a+e$#' F+'(-A&$/T.#0-,H 4 2!5 --- 4
Rea(')*a+e$#' F+'(-A&$/T.#0-,H 5 ---- ---

15 F+'(-L1&/B'(0-,H 4 2 ---- ---
20 F+'(-Leu-,H 4 2 ---- ---
21 F+'(-I*e-,H 4 2 --- 4
Rea(')*a+e$#' F+'(-I*e-,H 4 2!5 ---- ---
22 F+'(-A&)/tBu0-,H 4 2 ---- ---
2 F+'(-G*1-,H 4 2 ---- ---
24 F+'(-I*e-,H 4 2 --- 4
Rea(')*a+e$#' F+'(-I*e-,H 4 2 ---- ---
25 F+'(-G*1-,H 4 2 ---- ---
d 7esultado positivo+ indicativo da presen<a de grupo amina livre4 0 7esultado negativo+ indicativo da
ausncia de grupo amina livre4 h Desprote<=o n=o reali"ada devido H necessidade de reacoplamento4

# rea<=o de clivagem do peptdeo @oi reali"ada em meio $cido P%F#Q para a clivagem
simultBnea da liga<=o peptidil0resina e remo<=o dos grupos protetores das cadeias laterais4 9o
entanto+ a mistura de clivagem e o tempo de rea<=o s=o dependentes da se;uncia de cada
peptdeo+ uma ve" ;ue di@erentes grupos protetores de cadeias laterais re;uerem di@erentes
tempos e condi<Ges de rea<=o para sua completa remo<=o e ;ue cadeias de amino$cidos mais
susceptveis a rea<Ges com car*oc$tions re;uerem a adi<=o de se;uestradores desses
car*oc$tions4 9este caso+ as condi<Ges de clivagem para o peptdeo H>', est=o apresentadas na
%a*ela 5464
%a*ela 5464 %a*ela 5464 %a*ela 5464 %a*ela 5464 Mistura de clivagem e tempo de rea<=o para o peptdeo H>',
Peptdeo Tempo de !eao(h) "ist#ra de $liva%em
HSP2 2
556TFA! 2!56 78ua!
2!56 TIS

8ogo ap&s a clivagem+ o peptdeo @oi lio@ili"ado e pesado+ correspondendo a um
rendimento *ruto de cerca de 2.c4 Em seguida+ o produto da sntese @oi su*metido H an$lise por
C8#E4 Foi preparada uma solu<=o de concentra<=o . mg/m8 e @oram inCetados ,- 8 da solu<=o
no cromat&gra@o4 gradiente de @ase m&vel utili"ado encontra0se representado na %a*ela 541 Pp4
6,Q4

%a*ela 5414 %a*ela 5414 %a*ela 5414 %a*ela 5414 Gradiente utili"ado P@luxo de .+- m8/minQ para a an$lise do produto o*tido da sntese
do peptdeo H>',
Tempo (min) &%#a '()* TFA (*) Acetonitrila '('+* TFA (*)
0 55 5
10 25 25
0 60 40
5 0 100
40 0 100

# Figura 54V mostra o cromatograma do produto sntese do peptdeo H>',4 9essa @igura+
pode0se o*servar um sinal de alta intensidade a um tempo de reten<=o de .6+. min+
correspondendo a 5,c da solu<=o de acetonitrila -+-1c %F#4 De modo geral+ perce*e0se uma
sntese sem grandes ;uantidades de produtos laterais de nature"a peptdica+ com um produto
principal *em a*undante+ con@orme o*servado no cromatograma4

Figura 54V4 Figura 54V4 Figura 54V4 Figura 54V4 Cromatograma do produto de sntese do peptdeo H>',+ utili"ando0se o gradiente
descrito na %a*ela 541 Pcoluna Microsor* C.1+ solventes H,?%F# -+.c e #cetonitrila?%F#
-+-1cQ4

# Figura 54X Pp4 65Q mostra o espectro de massas o*tido para o produto *ruto da sntese4
9ele+ pode0se o*servar a presen<a de um sinal de m/" aproximadamente ,W.1 g/mol+

correspondente ao peptdeo H>', o sinal a m/" igual a aproximadamente ,XW- g/mol
corresponde ao peptdeo ligado ao grupo Fmoc na extremidade 90terminal4

Figura 54X4 Figura 54X4 Figura 54X4 Figura 54X4 Espectro de massas do produto de sntese do peptdeo H>',4

'.1.'. #ntese da A=-1Be
2
C-)enilseptina .=-1Bes0

# sntese do peptdeo 80'!es @oi @eita de @orma an$loga H de H>',+ sendo ;ue a se;uncia
peptdica deste+ *em como a indica<=o do sentido de acoplamento seguido na sntese+
encontram0se na %a*ela 5424
%a*ela 5424 %a*ela 5424 %a*ela 5424 %a*ela 5424 >e;uncia peptdica do peptdeo 80'!es+ com a ordem de acoplamento dos
amino$cidos+ com o resduo de amino$cido isotopicamente marcado com
.V
9 representado em
negrito e o resduo de amino$cido isotopicamente marcado com
,
H5 representado su*lin!ado
Peptdeo ,e-#.ncia peptdica
L-P9e& F F F " T L K N " A G K V I G A L T
Se$#id' d' a(')*a+e$#'

# sntese de 80'!es ocorreu sem necessidade de reacoplamentos+ con@orme mostrado na
%a*ela 54.-+ mantendo0se durante toda a sntese o excesso de Wh dos reagentes e o tempo de
acoplamento de .+V !+ com exce<=o do primeiro acoplamento+ cuCa dura<=o @oi de 5 !4
%a*ela 54.- %a*ela 54.- %a*ela 54.- %a*ela 54.-4 44 4 #compan!amento da sntese de 80'!es
'rdem do
Acop!amento
(eri)ado de
Aminocido
*+ce,,o
Tempo de
rea-.o
(/)
Te,te de 0ai,er
Acop!amento (e,prote-.o
1 F+'(-T9./tBu0-,H 4 ---- ---
2 F+'(-Leu-,H 4 1!5 ---- ---
F+'(-A*a-,H 4 1!5 ---- ---
4 F+'(-G*1-,H 4 1!5 ---- ---
5 F+'(-I*e-,H 4 1!5 ---- ---
6 F+'(-Va*-,H 4 1!5 ---- ---
2 F+'(-Hi&/T.#0-,H 4 1!5 ---- ---
3 F+'(-L1&/B'(0-,H 4 1!5 --- ---
5 F+'(-G*1-,H 4 1!5 ---- ---
10 F+'(-Leu-,H 4 1!5 ---- ---
11 F+'(-A*a-,H 4 1!5 ---- ---
12 F+'(-L1&/B'(0-,H 4 1!5 ---- ---
1 F+'(-Leu-,H 4 1!5 --- ---

14 F+'(-T9./tBu0-,H 4 1!5 ---- ---
15 F+'(-A&)/tBu0-,H 4 1!5 ---- ---
16 F+'(-A*a-,H 4 1!5 ---- ---
12 F+'(-L1&/B'(0-,H 4 1!5 ---- ---
13 F+'(-A*a-,H 4 1!5 ---- ---
d 7esultado positivo+ indicativo da presen<a de grupo amina livre4 _ 7esultado negativo+ indicativo da ausncia de
grupo amina livre4
# clivagem de 80'!es @oi @eita so* as mesmas condi<Ges reali"adas para a clivagem do
peptdeo H>', P%a*ela 546+ p4 6.Q4
# Figura 546 mostra o per@il cromatogr$@ico do produto o*tido ap&s a sntese+ em ;ue
pode0se o*servar um tempo de reten<=o de .V+5 min+ correspondente ao peptdeo 80'!es4

Figura 5464 Figura 5464 Figura 5464 Figura 5464 Cromatograma do produto de sntese do peptdeo 80'!es+ utili"ando0se o gradiente
descrito na %a*ela 541+ p4 6, Pcoluna Microsor* C.1+ solventes H,?%F# -+.c e #cetonitrila?%F#
-+-1cQ4

3.2. Estudos por Espectroscopia de "icrosmo ircular :"; dos
Peptdeos "istinctina* 9ilaseptina P2 :9SP2; e Fenilseptinas <=
P>es e "=P>es

'.2.1. 5studos por CD da Distinctina
9a primeira etapa+ as con@orma<Ges das Cadeias monom)ricas . e , da distinctina+ assim
como as do pr&prio dmero+ @oram avaliadas+ tanto em solventes ;ue mimeti"am mem*ranas
;uanto na presen<a de vesculas de @os@olipdeos4 En;uanto ;ue+ em solu<=o a;uosa+ as cadeias
polipeptdicas apresentam predominantemente con@orma<Ges randAmicas+ uma propens=o alta H
@orma<=o de !)lice ) o*servada com a adi<=o de %FE PFiguras 541# e (+ p4 66Q4 Esse solvente )
con!ecido por @avorecer a @orma<=o de estruturas 0!elicoidais caso !aCa+ por parte do
polipeptdeo+ uma propens=o em adotar esse tipo de con@orma<=o P>onnic!sen et al4 .22,Q4
Quando a porcentagem de %FE ) aumentada de .-c para ,-c Pv/vQ+ o conteJdo de 0!)lice da
Cadeia . aumenta at) V-c4 #umento de porcentagem de %FE mostra pouco e@eito na
estrutura<=o da cadeia peptdica4 # Cadeia ,+ em contraste+ c!ega a apresentar 66c de sua
estrutura como 0!)lice na presen<a de %FE/$gua X-/W- Pv/vQ PFiguras 541( e 542+ p4 66Q4 #
titula<=o de am*as as cadeias ) caracteri"ada por um ponto iso*)stico+ ;ue ) um indicativo de

;ue as estruturas randAmica e 0!)lice podem ser caracteri"adas por um e;uil*rio entre dois
estados PFiguras 541# e 541(+ p4 66Q4
Deve0se notar ;ue arte@atos advindos do espal!amento da lu" limitam a concentra<=o das
vesculas de lipdeo ;ue podem ser adicionadas H solu<=o peptdica4 *aixo grau de @orma<=o de
0!)lice da Cadeia .+ na presen<a de ''C PFigura 541F+ p4 66Q+ indica+ provavelmente+ ;ue
somente uma pe;uena por<=o de peptdeo est$ associada com os @os@olipdeos "FiteriAnicos4
*serva<Ges similares+ com *ase em valores de constantes de particionamento em mem*ranas+
@oram relatadas para outros peptdeos antimicro*ianos PMatsu"aEi et al4+ .22.+ [enE et al4+ .221+
[ieprec!t et al4+ .222Q4
# Figura 541C Pp4 66Q mostra o espectro de CD de 55 M de Cadeia .+ aumentando0se a
concentra<=o de vesculas ''C/''G P5?.+ mol?molQ4 9a presen<a de .- M de @os@olipdeos+
um mnimo em ,-. nm ) o*servado e a desconvolu<=o dos dados indicam um conteJdo de 0
!)lice de apenas Vc4 Quando a concentra<=o lipdica aumenta gradativamente+ o espectro de CD
passa a adotar @ei<Ges caractersticas de con@orma<Ges !elicoidais+ com um m$ximo em .26 nm e
mnimos em ,-2 nm e ,,5 nm4 # desconvolu<=o dos dados sugere um conteJdo de 0!)lice de
cerca de .6c+ na presen<a de V- M de @os@olipdeos e de aproximadamente ,5c a concentra<Ges
de lipdeo de ,V- M4 Interessantemente+ um ponto iso*)stico somente pode ser de@inido a
concentra<Ges de lipdeo maiores ou iguais a V- M+ indicativo de ;ue transi<Ges estruturais da
solu<=o para o estado associado lipdeo0peptdeo envolvem mais de dois estados
con@ormacionais4
# Figura 541D Pp4 66Q mostra os espectros de CD de 55 M da Cadeia , a ;uantidades
crescentes de vesculas ''C/''G P5?.+ mol?molQ4 En;uanto o espectro ad;uirido a
concentra<Ges de lipdeo de .- M exi*e pouca atividade &tica+ as caractersticas relativas a 0
!)lices aumentam com a adi<=o das vesculas lipdicas+ com as propor<Ges calculadas de .Vc+
.1c+ ,2c e 5.c+ na presen<a de ,- M+ V- M+ .V- M e ,V- M de ''C/''G P5?.+
mol?molQ+ respectivamente4 Esses resultados indicam ;ue a Cadeia , exi*e uma propens=o maior
a estrutura<Ges !elicoidais ;uando comparada H Cadeia .+ a ra"Ges peptdeo0lipdeo similares+ o
;ue provavelmente re@lete seu mel!or particionamento em mem*ranas PveCa tam*)m Figura
541F+ p4 66Q4
# Figura 541E Pp4 66Q mostra os espectros de CD da distinctina a 52 M na presen<a de
;uantidades crescentes de vesculas ''C/''G P5?.+ mol?molQ4 Em contraste com as cadeias

individuais+ um per@il da curva caracterstica de
M de @os@olipdeos PconteJdo de !)lice de ,-cQ4 Quando a concentra<=o de lipdeos )
aumentada ainda mais+ contri*ui<Ges de
e ,V- M de @os@olipdeos4 Final
de vesculas de ''C4 'ode0se notar ;ue o @ormato da curva assemel!a
o*tida na presen<a de ''C/''G P5?.+ mol?molQ P

Figura 5414 Figura 5414 Figura 5414 Figura 5414 Espectros de dicrosmo circular de .-
P;uadrados pretos preenc!idosQ+ .-c %FE PtriBngulos+ em verdeQ+ ,-c %FE Pcrculos va"ados+ em
a"ulQ+ 5-c %FE Pcrculos preenc!idos+ em magentaQ e X-c %FE Pcrculos va"ados+ em marrom
PCQ Espectros ;ue resultaram da titula<=o de vesculas pe;uenas unilamelares ''C?''G P5?.+
mol?molQ H solu<=o da Cadeia .4 # concentra<=o inicial do peptdeo ) de 55
M devido H adi<=o do lipdeo4 PDQ %itula<=o do lipdeo em 51
52 M a 5X M da distinctina4 #s concentra<Ges de lipdeos s=o .-
em pretoQ+ .V- M Pcrculos preenc!idos+ em magentaQ+ ,V-
va"ados+ em marromQ4 PFQ espectros de CD de 6
Cadeia , Pcrculos va"ados+ marromQ+ e ,-
presen<a de 5V- M ''C na @orma de vesculas unilamelares pe;uenas4
individuais+ um per@il da curva caracterstica de 0!)lice pode ser o*servada na presen<a de .-
aumentada ainda mais+ contri*ui<Ges de 0!)lice de cerca de W.c s=o o*servadas na com .V-
M de @os@olipdeos4 Finalmente+ a Figura 541F mostra espectros de CD o*tidos na presen<a
se notar ;ue o @ormato da curva assemel!a0se *astante ao da curva
o*tida na presen<a de ''C/''G P5?.+ mol?molQ PFigura 541EQ4
os de dicrosmo circular de .- M da Cadeia . P#Q e Cadeia , P(Q em $gua
a"ulQ+ 5-c %FE Pcrculos preenc!idos+ em magentaQ e X-c %FE Pcrculos va"ados+ em marrom
mol?molQ H solu<=o da Cadeia .4 # concentra<=o inicial do peptdeo ) de 55
M devido H adi<=o do lipdeo4 PDQ %itula<=o do lipdeo em 51 M a ,6 M de Cadeia ,+ e PEQ em
M da distinctina4 #s concentra<Ges de lipdeos s=o .- M P;uadrados preenc!idos+
M Pcrculos preenc!idos+ em magentaQ+ ,V- M ''C?''G P;uadrados
PFQ espectros de CD de 6 M da Cadeia . PtriBngulos+ em verdeQ+ 6
Cadeia , Pcrculos va"ados+ marromQ+ e ,- M da distincina Pcrculos va"ados+ em a"ulQ na
M ''C na @orma de vesculas unilamelares pe;uenas4
!)lice pode ser o*servada na presen<a de .-
!)lice de cerca de W.c s=o o*servadas na com .V- M
mostra espectros de CD o*tidos na presen<a
se *astante ao da curva
M da Cadeia . P#Q e Cadeia , P(Q em $gua
a"ulQ+ 5-c %FE Pcrculos preenc!idos+ em magentaQ e X-c %FE Pcrculos va"ados+ em marromQ4
mol?molQ H solu<=o da Cadeia .4 # concentra<=o inicial do peptdeo ) de 55 M e diminui a ,2
M de Cadeia ,+ e PEQ em
M P;uadrados preenc!idos+
M ''C?''G P;uadrados
adeia . PtriBngulos+ em verdeQ+ 6 M da
M da distincina Pcrculos va"ados+ em a"ulQ na

conteJdo de 0!)lice como uma @un<=o da concentra<=o de @os@olipdeos ) mostrado
na Figura 54.- Pp4 62Q para am*as as cadeias individuais e para o !eterodmero distinctina4 'ode0
se o*servar ;ue a .V- M ''C/''G Pmol/molQ+ am*as as Cadeias . e , atingiram seu
conteJdo m$ximo de !)lice4 'ara a distinctina+ essa satura<=o ocorre para concentra<Ges de cerca
de ,V- M com o conteJdo de 0!)lice o*servado a XV- M similar ao de ,V- M Pdados n=o
mostradosQ4
En;uanto o grau de @orma<=o de 0!)lices das cadeias individuais em misturas
%FE/$gua aumenta com a concentra<=o de $lcool+ atingindo valores altos e seguindo um
e;uil*rio entre dois estados+ a situa<=o na presen<a de @os@olipdeos ) um tanto mais complexa e
caracteri"ada por e;uil*rios entre v$rios estados4 'rovavelmente o @ormato da curva do espectro
de CD ) a@etado por agrega<=o de vesculas de ''C/''G ;uando a associa<=o de peptdeos
catiAnicos resulta na neutrali"a<=o das cargas negativas dos lipdeos+ ou ;uando os lipdeos
agregam0se entre si4
# adi<=o de 52- M de ''C na @orma de vesculas unilamelares H solu<=o a;uosa das
Cadeias . e , da distinctina+ respectivamente+ causa somente um pe;ueno aumento na
con@orma<=o !elicoidal4 *aixo grau de @orma<=o de 0!)lice pode indicar ;ue somente uma
pe;uena ;uantidade do peptdeo est$ associada aos @os@olipdeos "FiteriAnicos+ con@orme
indicam estudos @eitos com peptdeos antimicro*ianos catiAnicos semel!antes4

Figura 5424 Figura 5424 Figura 5424 Figura 5424 ConteJdo de 0!)lice das Cadeias . e , o*tido por espectroscopia de CD como @un<=o
da porcentagem de %FE em $gua4

Figura 54.-4 Figura 54.-4 Figura 54.-4 Figura 54.-4 ConteJdo de 0!)lice das Cadeias . e , e da distinctina o*tido por espectroscopia de
CD como @un<=o da concentra<=o de lipdeos ''C?''G P5?.+ mol?molQ4

'.2.2. 5studos por CD da 3ilaseptina 12 .3#120

Foram reali"ados experimentos de CD para o peptdeo H>', para veri@icar se+ na
presen<a de @os@olipdios+ o peptdeo adotaria uma estrutura em 0!)lice+ como comumente
ocorre para peptdeos antimicro*ianos P:aslo@@+ ,--,Q4 s experimentos @oram reali"ados
aumentando0se gradativamente a concentra<=o de vesculas unilamelares pe;uenas P>UVsQ+
compostas por ''C e ''G na propor<=o 5?. Pmol?molQ4 # Figura 54.. Pp4 1-Q mostra os
espectros de CD do peptdeo em solu<=o e na presen<a de concentra<=o m$xima de vesculas4
Em solu<=o e sem a presen<a de @os@olipdios+ o peptdeo encontra0se totalmente desestruturado4
Em meios com grande concentra<=o de vesculas+ o peptdeo passa a adotar uma estrutura ;uase
altamente !elicoidal4 Esse comportamento ) esperado uma ve" ;ue a @orma !elicoidal da H>', )
consideravelmente an@ip$tica PFigura .42+ p4 .WQ+ caracterstica @undamental para se dar a
intera<=o do peptdeo com vesculas ou mem*ranas @os@olipdicas4

Figura 54..4 Figura 54..4 Figura 54..4 Figura 54..4 Espectros de CD da H>',+ em solu<=o a pH 6+W contendo tamp=o %ris0HCl a
.--mM Plin!a a"ulQ e em solu<=o+ na presen<a de vesculas de ''C/''G 5?.+ mol?mol Plin!a
vermel!aQ4

3.3. "etermina#&es Estruturais por %esson'ncia 5agntica
?uclear :%5?; em Solu#$o dos Peptdeos "istinctina*
9ilaseptina P2 :9SP2; e Fenilseptinas <=P>es e "=P>es

#s estruturas de todos os peptdeos+ Distinctina+ Hilaseptina0', PH>',Q+ S80'!e
,
T0
Fenilseptina P80'!esQ e SD0'!e
,
T0Fenilseptina PD0'!esQ @oram determinadas por meio da
estrat)gia de assinalamento se;uencial a partir da an$lise dos mapas de contorno de
experimentos *idimensionais de 7M9+ con@orme proposto por [ut!ric! P[ut!ric!+ .21XQ4
Dessa @orma+ o mapa de contornos %C>U @oi utili"ado para identi@icar sinais re@erentes aos
$tomos de !idrognio n=o0l$*eis de cada resduo de amino$cido4 Concomitantemente a essa
atri*ui<=o+ @oram atri*udos tam*)m os sinais de car*ono !idrogenado por meio da an$lise do
mapa de contornos
.
H0
.5
C0H>QC editado4 Esse assinalamento @oi auxiliado pela atri*ui<=o de
correla<Ges se;uenciais do tipo J
NN
(i, i +1)+ J
uN
(i, i +1) e J
[N
(i, i +1) no mapa de contornos
9E>U+ ;ue permitiu identi@icar a posi<=o de cada resduo na estrutura prim$ria de cada
peptdeo4 #p&s essa etapa+ @oram identi@icadas as correla<Ges H m)dia e+ caso existissem+ H longa

distBncia+ *em como as correla<Ges intrarresiduais de cada mol)cula4 Em seguida+ reali"aram0se
os procedimentos de an$lise das listas de restri<Ges+ c$lculo e valida<=o+ con@orme descrito na
Introdu<=o4 'ara am*os os peptdeos+ construram0se as listas com *ase em pseudo$tomos ao
inv)s de serem consideradas atri*ui<Ges esteroespec@icas4 Essa estrat)gia @oi adotada de @orma a
evitar possveis interpreta<Ges incorretas por parte do programa `plor09IH devido a di@eren<as
de nomenclatura em rela<=o ao programa 9M7VieF4 # aproxima<=o por pseudo$tomos+ nesse
caso+ n=o acarreta grande perda de resolu<=o+ uma ve" ;ue+ ao contr$rio de protenas e sistemas
proteicos+ am*os os peptdeos n=o apresentam enovelamento su@iciente para ;ue essa
simpli@ica<=o surta e@eito consider$vel so*re os conCuntos de estruturas calculados4
'.'.1. Determinao 5strutural da Distinctina por RM! em #oluo
# an$lise dos dados de 7M9 em da distinctina solu<=o @oi+ em grande parte+ di@icultada
por so*reposi<Ges e+ em menor escala+ por trocas ;umicas4 # Figura 54., Pp4 1,Q mostra a regi=o
9 do mapa de contornos %C>U+ onde se pode perce*er uma *aixa dispers=o de sinais4
#lgumas dessas so*reposi<Ges puderam ser resolvidas por an$lise do mapa de contornos
.
H0
.5
C0
H>QC PFigura 54.5+ p4 1,Q+ em*ora em alguns resduos+ os sinais relativos aos $tomos das cadeias
principais de am*as Cadeias . e , n=o puderam ser precisamente identi@icados+ como por
exemplo+ os sinais pertencentes aos resduos 8.X+ 7.6+ 75,+ E55+ 851 e ZW. Pnumera<=o mostrada
na %a*ela 54..Q4 9o mapa de contornos 9E>U a so*reposi<=o mostrou0se mais pro*lem$tica+
sendo necess$ria uma an$lise mais criteriosa das principais regiGes estudadas PFigura 54.W+ p4 15Q+
levando0se em conta os sinais atri*udos no mapa de contornos %C>U4
%a*ela 54.. %a*ela 54.. %a*ela 54.. %a*ela 54..4 44 4 >e;uncia de amino$cidos da distinctina+ com suas respectivas numera<Ges
utili"adas durante a an$lise dos experimentos de 7M9 em solu<=o

Figura 54., Figura 54., Figura 54., Figura 54., Mapa de contornos %C>U da distinctina PX-- MH"R %FE
conectividades intrarresiduais dos tipos

Figura 54.54 Figura 54.54 Figura 54.54 Figura 54.54 Mapa de contornos
mostrando conectividades intrarresiduais

Mapa de contornos %C>U da distinctina PX-- MH"R %FE0d,?H,
conectividades intrarresiduais dos tipos J
uN
4
Mapa de contornos
.5
C+
.
H

H>QC da distinctina PX-- MH"R %FE
mostrando conectividades intrarresiduais C
u
- E
u
4
, .?.+ Q mostrando
H>QC da distinctina PX-- MH"R %FE0d,?H, .?.+ v?vQ

Figura 54.W4 Figura 54.W4 Figura 54.W4 Figura 54.W4 Mapas de contornos 9E>U da distinctina
mostrando conectividades inter
J
uN
(i, i +4)R P*Q P*Q P*Q P*Q J
[N
(i, i +1)4
Mapas de contornos 9E>U da distinctina PX-- MH"R %FE
mostrando conectividades inter0residuais dos tipos? PaQ PaQ PaQ PaQ J
uN
(i, i +1)+ J
uN
(i, i

PX-- MH"R %FE0d,?H, .?.+ v?vQ
+2)+ J
uN
(i, i +S) e

#p&s o @inal da atri*ui<=o+ @oi construda uma lista de restri<Ges de distBncia+ contendo
,V1 restri<Ges intrarresiduais+ .,. se;uenciais+ .-5 de m)dio alcance e cinco a longo alcance4 Essa
lista @oi su*metida H an$lise pelo programa QUEE9+ ;ue @orneceu os resultados mostrados na
Figura 54.V Pp42-Q4 Esses resultados mostram ;ue+ dentre todas as restri<Ges+ duas constituem
valores atpicos? H52 HDl/I.5 HD.l PR
1
Q e 8., HD.l/8,V H9 PR
2
Q+ am*as com limites
superiores de distBncia de V+-- ]4 Essas duas restri<Ges apresentaram am*os valores de unicidade
e in@orma<=o m)dia altos4 #l)m disso+ podem ser o*servados dois agrupamentos di@erentes na
Figura 54.Va Pp4 1VQ+ destacados como grupos A e B4 Em A+ encontra0se a maior parte das
restri<Ges+ en;uanto ;ue+ em (+ encontram0se apenas ;uatro restri<Ges+ representadas na %a*ela
54., Pp4 1VQ+ Cuntamente com seus respectivos valores de in@orma<=o m)dia4
Duas considera<Ges merecem ser @eitas a respeito dos dois outliers e do agrupamento B4
'rimeiramente+ os sinais de 9E ;ue originaram as restri<Ges R
1
e R
2
somente puderam ser
atri*udos de um lado da diagonal no mapa de contornos 9E>U+ devido a pro*lemas de lin!a
de *ase ou+ simplesmente+ por;ue s& estavam presentes de um lado da diagonal+ o ;ue l!es
garantiu um valor alto de unicidade4 #l)m disso+ o alto grau de in@orma<=o contida nessas
restri<Ges+ n=o corro*orado por nen!uma outra+ garantiu+ ainda+ a esses dados+ um alto valor de
in@orma<=o m)dia4 8evando em conta o @ato de ;ue os sinais n=o apareceram nos dois lados da
diagonal e os seus respectivos valores de in@orma<=o+ !$ uma pro*a*ilidade consider$vel de ;ue
esses sinais seCam+ na verdade+ arte@atos ou sinais devido H presen<a de mJltiplas con@orma<Ges
presentes na amostra4 s sinais pertencentes ao agrupamento B+ entretanto+ puderam ser
atri*udos em am*os os lados da diagonal+ garantindo a eles valores praticamente nulos de
in@orma<=o Jnica+ mas+ mesmo assim+ o valor relativamente alto de in@orma<=o m)dia mostra
;ue+ em*ora essas restri<Ges seCam consistentes entre si+ elas tm um @orte impacto so*re a
estrutura @inal4 Esses dados a respeito do agrupamento B+ no entanto+ n=o indicam
necessariamente ;ue as restri<Ges ;ue o constituem seCam provenientes de atri*ui<Ges
e;uivocadas ou de arte@atos do espectro4 Essas restri<Ges @oram as Jnicas restri<Ges intercadeias
encontradas e ;ue+ por conse;uncia+ s=o as Jnicas respons$veis pela orienta<=o de uma cadeia
em rela<=o H outra4 Em outras palavras+ essas restri<Ges s=o as Jnicas ;ue de@inem uma estrutura
;uatern$ria+ en;uanto as demais restri<Ges de@inem as estruturas secund$ria e terci$ria de cada
cadeia4 Dessa @orma+ ) totalmente plausvel ;ue essas restri<Ges conten!am um valor alto de
in@orma<=o na estrutura @inal do peptdeo+ uma ve" ;ue est=o ausentes restri<Ges orientacionais
;ue poderiam validar ou n=o os dados do agrupamento B4 >endo assim+ decidiu0se por+ a
princpio+ manter essas restri<Ges nos c$lculos su*se;uentes+ en;uanto ;ue as restri<Ges R
1
e

R
2
@oram retiradas4 Um exemplo do impacto dessas restri<Ges so*re a estrutura @inal do peptdeo
) mostrado na Figura 54.V+ em ;ue as restri<Ges s=o mostradas na @orma de tu*os amarelos+
conectando os $tomos entre os ;uais as distBncias s=o restringidas4 # Figura 54.Xa Pp4 1XQ mostra
todas as restri<Ges+ en;uanto ;ue as Figuras 54.X* e 54.Xc Pp4 1XQ mostram as restri<Ges dos
outliers e do agrupamento B+ respectivamente4

Figura 54. Figura 54. Figura 54. Figura 54.V4 V4 V4 V4 P PP Pa aa aQ QQ Q Gr$@ico de in@orma<=o Jnica por in@orma<=o m)dia da primeira lista de restri<Ges
da distinctina+ mostrando a aglomera<=o dos pontos em dois grupos+ A e B+ e as duas restri<Ges
outliers identi@icadas? H52 HDl/I.5 HD.l e 8., HD.l/8,V H94 P PP P*Q *Q *Q *Q Gr$@ico de unicidade pelo
ndice de cada restri<=o da primeira lista de restri<Ges da distinctina+ mostrando as duas restri<Ges
de maior valor de unicidade4

%a*ela 54., %a*ela 54., %a*ela 54., %a*ela 54.,4 44 4 7ela<=o das restri<Ges pertencentes ao agrupamento B representado na Figura 54.Xa
Pp4 1XQ e seus respectivos valores de in@orma<=o m)dia PI
mcd
Q
Restrio I
mcd
C19 HA/C45 HN 6,61
C45 HN/C19 HA 6,02
C19 HA/C45 HB# 5,46
C45 HB#/C19 HA 5,14

a) b)

Figura 54.X4 Figura 54.X4 Figura 54.X4 Figura 54.X4 7epresenta<=o das restri<Ges de distBncia Ptu
distincitina calculada com essas restri<Ges4 Em
distBncia determinadas+ em P PP P*Q *Q *Q *Q
agrupamento B4

Entretanto+ n=o se pode a@irmar ;uais dessas restri<Ges s=o ou n=o corretas com *ase
apenas nas an$lises de suas in@orma<Ges+ uma ve" ;ue um conteJdo alto de in@orma<=o sugere a
presen<a de restri<Ges incorretas+ mas n=o se pode a@irmar ;ue uma restri<=o ) incorreta com
*Q *Q *Q *Q
cQ cQ cQ cQ
aQ aQ aQ aQ
7epresenta<=o das restri<Ges de distBncia Ptu*os amarelosQ em uma estrutura da
distincitina calculada com essas restri<Ges4 Em P PP PaQ aQ aQ aQ est=o representadas todas as restri<Ges de
*Q *Q *Q *Q est=o representados os outliers e+ em P PP PcQ cQ cQ cQ
pode a@irmar ;uais dessas restri<Ges s=o ou n=o corretas com *ase
*os amarelosQ em uma estrutura da
est=o representadas todas as restri<Ges de
cQ cQ cQ cQ+ as restri<Ges do
pode a@irmar ;uais dessas restri<Ges s=o ou n=o corretas com *ase

*ase somente em seu conteJdo de in@orma<=o Jnica4 Isso torna necess$ria uma avalia<=o mais
detal!ada das restri<Ges e de seus e@eitos so*re o conCunto @inal de estruturas+ levando0se em
conta tam*)m as viola<Ges ocorridas durante o c$lculo das estruturas e parBmetros de ;ualidade
estrutural4 #s viola<Ges presenciadas @oram identi@icadas pelo pr&prio programa `plor09IH e sua
an$lise consistiu em mapear as regiGes com maior nJmero de viola<Ges+ ;ue constituem regiGes
com maior pro*a*ilidade de estarem incorretas4 s parBmetros de ;ualidade estrutural @oram
o*tidos pelo servidor iCing+ utili"ando0se os programas '7CHECZ P8asEoFsEi+ 7ullmannn et
al4+ .22XQ e [H#%IF PVriend+ .22-Q4 # Figura 54.6 Pp4 11Q mostra os resultados para o conCunto
inicial de estruturas+ do ;ual @a" parte o modelo apresentado na Figura 54.X Pp4 1XQ4 9a Figura
54.6a Pp4 11Q est=o as se;uncias das duas cadeias+ com cada resduo de amino$cido representado
pela conven<=o de trs letras e colorido com as cores verde+ laranCa ou vermel!a4 Esse es;uema
de trs cores di" respeito H ;ualidade da regi=o ;ue compreende cada resduo de amino$cido+
sendo ;ue a cor verde indica uma regi=o de *oa ;ualidade+ a cor laranCa indica ;ualidade mediana
ou uma regi=o po*re em in@orma<Ges estruturais e a cor vermel!a+ ;ualidade estrutural ruim ou
estrutura<=o pouco comum4

c)

Figura 54.64 Figura 54.64 Figura 54.64 Figura 54.64 7esultados da an$lise de ;ualidade estrutural e valida<=o dos modelos calculados
para a distinctina utili"ando0se a primeira lista de restri<Ges4 P PP PaQ aQ aQ aQ 7esumo da an$lise para cada
resduo de amino$cido4 #s cores verde+ laranCa e vermel!o representam+ respectivamente+
estrutura de *oa ;ualidade+ estrutura de ;ualidade mediana ou regi=o com pouca in@orma<=o
estrutural e estrutura de ;ualidade *aixa+ ou pouco comum4 P*Q *Q *Q *Q 7esultados do programa
[H#%IF+ relativos H ;ualidade de empacotamento+ :0score do gr$@ico de 7amac!andran e de
Ianin+ e normalidade da cadeia principal e dos rotBmeros4 P PP PcQ cQ cQ cQ Diagrama de 7amac!andran+ o*tido
pelo programa '7CHECZ4 Cada ponto corresponde a um determinado resduo de algum dos
vinte modelos4 s pontos ;ue se encontram em regiGes generosamente @avorecidas e em regiGes
proi*idas s=o representados em vermel!o4

'ode0se notar+ pela an$lise da Figura 54.6a+ ;ue grande parte dos resduos apresenta
estrutura<=o possivelmente incorreta+ salvo uma minoria de segmentos ;ue apresentaram
con@orma<Ges aceit$veis4 # Figura 54.6* mostra em mais detal!es os pro*lemas encontrados nas
estruturas calculadas atrav)s de gr$@icos de algumas grande"as relacionadas com caractersticas
estruturais de peptdeos e protenas4 gr$@ico de ;ualidade de empacotamento mostra se !$
eventuais so*reposi<Ges de grupos e se a vi"in!an<a desses grupos ) condi"ente com sua
*Q *Q *Q *Q
aQ aQ aQ aQ
cQ cQ cQ cQ

caracterstica Pe4g4 polar+ apolar+ arom$tica+ carregada positiva ou negativamente+ etc4Q4 Valores
de ;ualidade de empacotamento menores ;ue 0V apontam erros potenciais na estrutura+ como
o*servado em especial na Cadeia .4 gr$@ico de ;ualidade do gr$@ico de 7amac!andran PFig4
.64*+ p4 11Q mostra a coerncia das distri*ui<Ges de Bngulos de tor<=o em rela<=o Hs distri*ui<Ges
desses Bngulos de tor<=o em v$rias protenas em um *anco de dados4 7egiGes com valores a*aixo
de 0.+, s=o consideradas como merecedoras de uma an$lise mais detal!ada+ e as com valores
a*aixo de 0.+5 podem ser encaradas como possivelmente erradas4 'ela an$lise desse gr$@ico+ pode0
se perce*er ;ue grande parte da Cadeia . est$ potencialmente errada e ;ue aos resduos da
Cadeia , @oram atri*udos valores pr&ximos de 0.+,+ indicando um desvio menor+ por)m
consider$vel em rela<=o Hs distri*ui<Ges de Bngulos diedros normalmente o*servadas nesse tipo
de *iomol)culas4 gr$@ico de normalidade da cadeia principal tam*)m mostra o desvio da
estrutura do peptdeo em rela<=o a um *anco de dados de *iomol)culas proteicas4 Contudo+ na
determina<=o dessa grande"a s=o levados em conta segmentos maiores da cadeia polipeptdica+
possi*ilitando uma avalia<=o mais a*rangente do desvio da normalidade estrutural4 #o analisar
essa grande"a+ consideram0se valores a*aixo de trs como indicativos de desvio grande da
normalidade+ segmentos com valores maiores ;ue trs e menores ;ue .- s=o considerados pouco
comuns e+ portanto+ merecedores de uma an$lise mais criteriosa4 Valores acima de .- s=o
considerados como *ons4 valor m$ximo para essa grande"a ) 1-4 # Cadeia .+ em ;uase sua
totalidade+ apresenta valores de normalidade da cadeia principal pr&ximos a "ero+ H exce<=o de
uma pe;uena regi=o compreendida entre os resduos I.W e 7.6+ ;ue apresentaram valores
maiores ou iguais a .-4 # Cadeia , tam*)m apresentou resultados pouco satis@at&rios+ com a
maior parte dos valores menores ;ue .-4 # normalidade dos rotBmeros e o :0score de Ianin s=o
an$logos H normalidade da cadeia lateral e H ;ualidade do diagrama de 7amac!andran+ por)m
aplicados aos Bngulos diedros das cadeias laterais4 'ara a normalidade dos rotBmeros+
consideram0se valores pro*lem$ticos a;ueles menores ;ue 0-+V e+ para o :0score de Ianin+ os
valores menores ;ue 0-+24 #nalisando0se tam*)m esse gr$@ico+ perce*em0se diversos segmentos
pro*lem$ticos em rela<=o Hs cadeias laterais4
'or @im+ a @igura 54.6c Pp4 11Q mostra a distri*ui<=o dos Bngulos diedros e por resduo
e para cada um dos ,- modelos calculados4 'ode0se o*servar ;ue v$rios pontos se agrupam na
regi=o caracterstica de @ormas 0!)lice+ mas ainda assim encontram0se *astante dispersos+
indicando a presen<a de uma !)lice *astante distorcida4 mais pro*lem$tico+ no entanto+ ) ;ue
apenas uma pe;uena @ra<=o dos pontos encontra0se nas regiGes mais @avorecidas Pcerca de 5WcQ+
en;uanto ;ue a maioria Pcerca de W6cQ encontra0se em regiGes adicionalmente permitidas4 #l)m

de outra grande parcela estar distri*uda em regiGes generosamente permitidas ou totalmente
proi*idas+ indicando con@orma<Ges estericamente improv$veis4
Com *ase nas in@orma<Ges o*tidas por essas an$lises+ @oi construda ent=o uma nova lista+
excluindo0se inicialmente os valores atpicos e @oram reali"adas novas an$lises com o programa
QUEE94 # Figura 54.1a mostra o gr$@ico de in@orma<=o Jnica por in@orma<=o m)dia+ onde se
pode o*servar ;ue as restri<Ges do agrupamento B passaram a ter+ nessa nova lista+ valores de
in@orma<=o m)dia pr&ximos de .-+ o ;ue seria esperado+ uma ve" ;ue essas s=o as Jnicas
restri<Ges ;ue di"em respeito H estrutura ;uatern$ria do peptdeo e ;ue o programa QUEE9 leva
em conta todas as in@orma<Ges de @undo durante a an$lise+ ou seCa+ o conteJdo de in@orma<=o de
cada restri<=o nunca ) considerado de @orma independente em rela<=o Hs demais restri<Ges ou Hs
constri<Ges inerentes H pr&pria estrutura Pcomprimentos e Bngulos de liga<=o+ por exemploQ4
#l)m disso+ perce*e0se com maior clare"a a dispers=o dos dados+ com restri<Ges para am*os os
valores de unicidade e in@orma<=o m)dia relativamente altos Pmaiores ;ue .Q4 Essas restri<Ges+
apresentadas nas Figuras 54.1a e 54.1*+ e listadas na %a*ela 54.5 Pp4 2.Q+ no entanto+ s=o tipos de
restri<=o comumente o*servados em estruturas ricas em 0!)lice+ o ;ue ) o caso da distinctina+
como pode0se in@erir pelo estudo de dicrosmo circular4

Figura 54.14 Figura 54.14 Figura 54.14 Figura 54.14 P PP Pa aa aQ QQ Q Gr$@ico de in@orma<=o Jnica por in@orma<=o m)dia para a segunda lista de
restri<Ges da distinctina+ mostrando os pontos relativos Hs restri<Ges com os maiores valores de
in@orma<Ges Jnica e m)dia+ destacando o agrupamento B presente tam*)m na Figura 54.Xa Pp4
2.Q4 P PP P*Q *Q *Q *Q Gr$@ico de unicidade pelo ndice de cada restri<=o+ mostrando as duas restri<Ges com os
maiores valores de in@orma<=o Jnica4
b)
a)

%a*ela 54.5 %a*ela 54.5 %a*ela 54.5 %a*ela 54.54 4 4 4 7ela<=o das restri<Ges destacadas nas Figuras 54.1a e 54.1*+ relativa H lista de
restri<Ges da distinctina+ com seus respectivos valores de in@orma<=o m)dia PI
mcd
Q+ in@orma<=o
Jnica ou unicidade PI
un
Q e limite superior de distBncia Pl
sup
)
#e,tri-.o (e,cri-.o da #e,tri-.o I
mcd
I
un
l
sup
(1)
R
3
C45 HN:L42 HA 2!21 1!54 5!00
R
4
P6 H";:R HB; 1!20 1!20 2!30
R
5
K13 HA:I21 HN 2!5 1!63 2!30
R
6
H5 HA:L42 HB; 1!30 1!6 2!30
R
7
K13 HN:K14 HA 2!40 1!04 5!00
R
8
L5 HN:A1 HA 2!26 0!52 2!30

# restri<=o R
3
envolve o resduo de amino$cido CWV+ ;ue participa da liga<=o dissul@eto
com o resduo C.2 e a restri<=o R
7
tam*)m envolve um resduo pr&ximo H liga<=o dissul@eto+
Z.14 Essas regiGes pr&ximas aos resduos de cistena nesse peptdeo tm uma tendncia em
apresentar um grau de distor<=o e+ tam*)m de mo*ilidade4 Isso leva a uma menor estrutura<=o
dessa $rea e+ por conse;uncia+ um menor nJmero de correla<Ges 9E4 Isso+ logicamente+ leva a
um menor nJmero de restri<Ges nessas regiGes e+ dessa @orma+ ;ual;uer restri<=o encontrada nas
proximidades da liga<=o dissul@eto ter$ um grau maior de in@orma<=o4 # restri<=o
R
7
em especial+ por si s& C$ carregaria uma in@orma<=o estrutural maior+ uma ve" ;ue ela ) do
tipo oN (i, i +4)+ caracterstica apenas de estruturas do tipo 0!)lice4 Dessa @orma+ para de@inir
mel!or a estrutura do peptdeo seria necess$rio o*ter experimentalmente outras restri<Ges
geom)tricas+ como restri<Ges angulares+ de liga<=o de !idrognio e orientacionais4 # restri<=o 7W
tam*)m di" respeito a uma regi=o potencialmente menos estruturada+ devido H presen<a de dois
resduos de prolina4 >endo assim+ a restri<=o pode tanto ser a Jnica relevante encontrada nessa
regi=o ou o sinal ;ue originou essa restri<=o pode ter sido originado de trocas con@ormacionais+
;ue s=o @re;uentes em regiGes sem estrutura secund$ria de@inida4 Essas restri<Ges+ portanto+
merecem uma an$lise mais detal!ada+ con@orme o proposto adiante4
#s restri<Ges R
5
+ R
6
e R
8
+ por sua ve"+ s=o restri<Ges comumente encontradas em
espectros 9E>U de peptdeos e protenas essencialmente 0!elicoidais+ por)m o valor de limite
superior de distBncia Pl
sup
Q dessas restri<Ges ) demasiado *aixo para estruturas !elicoidais
regulares4 *servando0se+ ainda+ as restri<Ges sim)tricas a essas PcuCas correla<Ges 9E @oram

atri*udas do outro lado da diagonal do mapa de contornosQ+ perce*em0se discrepBncias entre os
valores de l
sup
entre elas4 # restri<=o sim)trica a R
5
tem um valor de l
sup
igual a ,+1- ]+
en;uanto ;ue as sim)tricas a R
6
e R
8
tm valores de l
sup
iguais a V+-- ] Pdados n=o mostradosQ4
Essa di@eren<a entre os limites superiores pode dever0se ao @ato de !aver distor<Ges de lin!a de
*ase ou so*reposi<Ges ao sinal em apenas um dos lados da diagonal+ preCudicando a integra<=o
dos 9Es4
Esses resultados @oram+ durante todo o processo de triagem das restri<Ges+ analisados
Cuntamente com as viola<Ges encontradas e com os dados de sada do iCing4 # lista @inal o*tida
pelas an$lises @oi utili"ada para os c$lculos+ sendo ;ue+ no caso das restri<Ges com limite superior
di@erente dos seus sim)tricos+ @oi considerada em cada lista ou a restri<=o ou a sua sim)trica+ para
veri@icar ;ual seria a mais coerente em rela<=o ao conCunto total de restri<Ges4 Essa estrat)gia
permitiu ;ue se c!egasse a um conCunto de restri<Ges mutuamente coerentes e ;ue @ossem
capa"es de de@inir com resolu<=o relativamente alta um conCunto de estruturas do peptdeo4 #
cada c$lculo+ @oi tam*)m veri@icada a resolu<=o de cada conCunto de estruturas por meio do
7M>D e da variBncia circular4
9a lista utili"ada para o c$lculo @inal @oram consideradas ,V1 correla<Ges intrarresiduais+
15 correla<Ges se;uenciais+ XX correla<Ges H distBncia m)dia e , correla<Ges H distBncia longa4 #s
correla<Ges convencionais Pi4e4 correla<Ges comumente encontradas em estruturas secund$rias
de@inidasQ do tipo se;uencial e H distBncia m)dia para as Cadeias . e , est=o resumidas nas Figuras
54.2a e 54.2* Pp4 25Q+ respectivamente4 %odas as correla<Ges H distBncia longa @oram correla<Ges
intercadeia+ sendo elas as seguintes? CWV H(l/C.2 H# e CWV H9/C.2 H#+ sendo ;ue am*as
resultaram em sinais @racos de 9E+ gerando+ portanto+ restri<Ges com limite superior de
distBncia de V+-- ]4 Foram encontradas as seguintes correla<Ges n=o convencionais envolvendo
os resduos 'X e F2? 'X HDl / F2 H# e F2 H9 / 'X HDl4 #m*as as correla<Ges deram origem a
restri<Ges com limites superiores de distBncia de V+-- ]4

Figura 54.24 Figura 54.24 Figura 54.24 Figura 54.24 %a*ela de 9Es com as restri<Ges caractersticas de estrutura secund$ria
aQ aQ aQ aQ C CC Cadeia . e *Q *Q *Q *Q Cadeia , da distinctina4

# Figura 54,- e a %a*ela 54.
lista utili"ada para o c$lculo @inal do conCunto de estruturas da distinctina4 'ode
as restri<Ges ;ue contm os maiores valores de in@orma<=o Jnica s=o as restri<Ges do tipo
idWQ ;ue+ como @oi dito anteriormente+ s=o restri<Ges caractersticas de
utili"ado no c$lculo nen!um outro tipo de restri<=o ;ue de@ina essa estrutu
esperado ;ue essas restri<Ges conten!am um maior grau de in@orma<=o4

Figura 54,-4 Figura 54,-4 Figura 54,-4 Figura 54,-4 Gr$@ico de unicidade pelo ndice de cada restri<=o na lista utili"ada para o c$lculo
@inal da distinctina+ mostrando as restri<Ges com os maiores v
a)
R9
R11
R9
R11
%a*ela de 9Es com as restri<Ges caractersticas de estrutura secund$ria
Cadeia , da distinctina4
%a*ela 54.W Pp4 2WQ mostram a an$lise de in@orma<=o nas restri<Ges da
lista utili"ada para o c$lculo @inal do conCunto de estruturas da distinctina4 'ode
s ;ue contm os maiores valores de in@orma<=o Jnica s=o as restri<Ges do tipo
dWQ ;ue+ como @oi dito anteriormente+ s=o restri<Ges caractersticas de 0!)lice4 Como n=o @oi
utili"ado no c$lculo nen!um outro tipo de restri<=o ;ue de@ina essa estrutu
esperado ;ue essas restri<Ges conten!am um maior grau de in@orma<=o4
Gr$@ico de unicidade pelo ndice de cada restri<=o na lista utili"ada para o c$lculo
@inal da distinctina+ mostrando as restri<Ges com os maiores valores de in@orma<=o Jnica4
b)
R10
R12
R10
R12
%a*ela de 9Es com as restri<Ges caractersticas de estrutura secund$ria 0!)lice de
mostram a an$lise de in@orma<=o nas restri<Ges da
lista utili"ada para o c$lculo @inal do conCunto de estruturas da distinctina4 'ode0se perce*er ;ue
s ;ue contm os maiores valores de in@orma<=o Jnica s=o as restri<Ges do tipo 9 Pi+
!)lice4 Como n=o @oi
utili"ado no c$lculo nen!um outro tipo de restri<=o ;ue de@ina essa estrutura secund$ria+ )
Gr$@ico de unicidade pelo ndice de cada restri<=o na lista utili"ada para o c$lculo
alores de in@orma<=o Jnica4

%a*ela 54. %a*ela 54. %a*ela 54. %a*ela 54.W WW W4 4 4 4 7ela<=o das restri<Ges destacadas na Figura 54,- Figura 54,- Figura 54,- Figura 54,- com seus respectivos valores de
in@orma<=o Jnica+ ou unicidade+ PI
un
Q+ e limite superior de distBncia Pl
sup
Q
#e,tri-.o (e,cri-.o da #e,tri-.o /
#ni
l
s#p
(1)
R9 A5 HA:I1 HN 1!42 5!00
R10 A44 HN:R40 HA 1!1 5!00
R11 K13 HA:I22 HN 0!50 5!00
R12 C45 HA:L42 HA 0!2 5!00

conCunto das vinte estruturas mais est$veis desse c$lculo est$ representado na Figura
54,.4 #pesar de a lista de restri<Ges ser consistente+ considerando0se os teores de in@orma<=o+ as
restri<Ges de distBncia n=o @oram su@icientes para de@inir uma orienta<=o relativa para as
estruturas contendo as duas cadeias como um todo4 9o entanto+ a so*reposi<=o individual das
cadeias mostra ;ue elas+ ;uando consideradas separadamente+ apresentam0se *em de@inidas+ com
valores 7M>D de -+X6 ] e .+-. ] para as Cadeias . e ,+ respectivamente4 'ara a distinctina como
um todo+ @oram o*servados valores de 7M>D de 5+W1 ]+ valor *astante alto+ devido H pouca
orienta<=o entre as cadeias4

Figura 54,.4 Figura 54,.4 Figura 54,.4 Figura 54,.4 ConCunto das ,- estruturas mais est$veis da distinctina+ com mel!or so*reposi<=o+
calculadas utili"ando a lista @inal+ com o protocolo de arre@ecimento simulado4

#p&s o @im do c$lculo+ o conCunto das vinte estruturas mais est$veis @oi su*metido H
valida<=o pelo servidor iCing+ con@orme mostrado na Figura 54,, Pp4 2XQ4 # Figura 54,,a Pp4 2XQ
mostra ;ue est=o ainda presentes v$rios resduos de amino$cido com estrutura<=o possivelmente
incorreta Pindicados em vermel!oQ e com ;ualidade m)dia Pindicados em laranCaQ4 9o entanto+
nesse conCunto de estruturas+ C$ se pode perce*er maior ;uantidade de resduos com estrutura<=o

*oa Pem verdeQ+ em compara<=o com o primeiro conCunto de estruturas calculadas4 'ode0se
notar+ tam*)m+ ;ue os resduos em vermel!o concentram0se em regiGes espec@icas4 9a Cadeia .+
esses resduos com piores estrutura<Ges est=o presentes pr&ximo H do*ra na cadeia principal+ na
regi=o das prolinas+ in@erida pelos 9Es encontrados nesse segmento+ e tam*)m nas
proximidades da extremidade C0terminal4 9a Cadeia ,+ os resduos presentes em regiGes de
con@orma<Ges consideradas erradas ou improv$veis est=o pr&ximos Hs termina<Ges+ exceto os
resduos G6 e 8,14 s resduos com a cor laranCa podem ser resultado das limita<Ges em serem
o*tidas mais restri<Ges Pde distBncia ou n=oQ devido ao grande nJmero de so*reposi<Ges entre os
sinais nos mapas de contorno4 Em rela<=o aos resultados do [H#%IF+ representados na Figura
54,,* Pp4 2XQ+ pode0se tam*)m perce*er uma mel!ora signi@icativa+ especialmente na
normalidade da cadeia principal+ em*ora se possa o*servar uma ligeira mel!ora tam*)m nos
parBmetros de ;ualidade do diagrama de 7amac!andran e na ;ualidade de empacotamento4
Entretanto+ n=o se pode di"er ;ue !ouve mel!oras no :0score de Ianin4 De @ato+ muitas ve"es os
m)todos de arre@ecimento simulado n=o mostram muita e@icincia na esta*ili"a<=o de
con@orma<Ges de cadeias laterais P>pronE et al4+ ,--WQ4 diagrama de 7amac!andran na Figura
54,,c Pp4 2XQ possi*ilita uma vis=o mel!or do aumento de ;ualidade em rela<=o ao primeiro
conCunto calculado4 9ele+ os pontos encontram0se mais agregados na regi=o de tpica 0!)lice+
sendo ;ue 65+Xc dos pontos encontram0se nas regiGes mais @avorecidas do diagrama+ e apenas
V+.c est=o situados em regiGes generosamente permitidas ou proi*idas4

Figura 54,,4 Figura 54,,4 Figura 54,,4 Figura 54,,4 7esultados da an$lise de ;ualidade estrutural e valida<=o dos modelos calculados
para a distinctina utili"ando0se a Jltima lista de restri<Ges4 P PP PaQ aQ aQ aQ 7esumo da an$lise para cada
resduo de amino$cido4 #s cores verde+ laranCa e vermel!o representam+ respectivamente+
estrutura de *oa ;ualidade+ estrutura de ;ualidade mediana ou regi=o com pouca in@orma<=o
estrutural e estrutura de ;ualidade *aixa+ ou pouco comum4 P PP P*Q *Q *Q *Q 7esultados do programa
[H#%IF+ relativos H ;ualidade de empacotamento+ :0score do gr$@ico de 7amac!andran e de
Ianin+ e normalidade da cadeia principal e dos rotBmeros4 P PP PcQ cQ cQ cQ Diagrama de 7amac!andran+ o*tido
pelo programa '7CHECZ4 Cada ponto corresponde a um determinado resduo de algum dos
vinte modelos4 s pontos ;ue se encontram em regiGes generosamente @avorecidas e em regiGes
proi*idas s=o representados em vermel!o4

Finda a an$lise de valida<=o+ procedeu0se ao re@inamento das ,-- estruturas calculadas4
9ovamente+ escol!eram0se as vinte estruturas mais est$veis para compor o modelo da distinctina
;ue se encontra representado na Figura 54,54 p primeira vista+ C$ se pode perce*er maior varia<=o
con@ormacional+ resultando em uma diminui<=o na precis=o do conCunto de estruturas4 Essa
diminui<=o pode ser o*servada tanto para a distinctina em sua totalidade P;ue passou a ter um
7M>D de 5+65 ]Q+ como para as cadeias separadas Pcom valores de 7M>D de -+66 ] e .+1- ]+ para
Resduos emregies mais favorecidas [A,B,L]
Resduos emregies adicionalmente permitidas [a,b,l,p]
Resduos emregies generosamente permitidas [~a,~b,~l,~p]
Resduos emregies proibidas
Nmero de resduos no-glicina e no-prolina
Nmero de resduos de extremidades (exceto Pro e Gly)
Nmero de resduos glicina (mostrados como tringulos)
Nmero de resduos prolina
Nmero total de resduos
Estatsticas do Diagrama
(graus)

(
g
r
a
u
s
)
dtn-modelo2-final (20 modelos)
Diagrama de Ramachandran
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q
cQ cQ cQ cQ

as Cadeias . e ,+ respectivamenteQ4 # diminui<=o da precis=o dos conCuntos de estruturas
considerando0se as cadeias individuais pode dever0se ao @ato de as @ormas em 0!)lice presentes
nos modelos serem an@ip$ticas+ o ;ue di@iculta sua esta*ili"a<=o em meios puramente a;uosos+ ao
contr$rio do ;ue ocorreria em meios ricos em %FE ou em @os@olipdeos4 >endo assim+ um
re@inamento em $gua poderia causar uma desesta*ili"a<=o de estruturas desse tipo+
especialmente em regiGes pouco de@inidas por restri<Ges derivadas de dados de 7M9+ ;ue est=o
mais suscetveis a caractersticas do campo de @or<a aplicado durante o c$lculo4 Em contrapartida+
apesar de ser muitas ve"es tido como n=o deseC$vel pela literatura de 7M9+ o aumento dos
valores de 7M>D pode ser tam*)m interpretado como uma caracterstica positiva+ uma ve" ;ue
a amostragem con@ormacional da mol)cula no espa<o tam*)m aumenta4 Isso ) particularmente
importante+ uma ve" ;ue muitas estruturas com valores de 7M>D *aixos superestimam a
precis=o do experimento+ su*estimando a caracterstica dinBmica da mol)cula no sistema
estudado4

Figura 54,54 Figura 54,54 Figura 54,54 Figura 54,54 Vis=o estereoespacial do conCunto das ,- estruturas mais est$veis da distinctina+ com
mel!or so*reposi<=o+ calculadas utili"ando a lista @inal+ com o protocolo de arre@ecimento
simulado4

'or)m+ o resultado mais signi@icativo+ @oi a ;ualidade estrutural da mol)cula do peptdeo+
como mostra a Figura 54,W Pp4 22Q4 'erce*eu0se uma mel!ora consider$vel na ;ualidade total da
mol)cula+ caracteri"ado por mais resduos de amino$cido representados em verde na Figura
54,Wa Pp4 22Q4 # ;ualidade de empacotamento e a do diagrama de 7amac!andran apresentaram
mel!oras consider$veis+ *em como a normalidade da cadeia principal e as distri*ui<Ges dos
Bngulos diedros de cadeias laterais PFigura 54,W*+ p4 22Q4 # mel!ora da ;ualidade da estrutura<=o
da cadeia principal+ no entanto+ ) mel!or perce*ida pelo diagrama de 7amac!andran da Figura

54,Wc Pp4 22Q4 *serva0se uma distri*ui<=o angular *em mais coerente com a @orma !elicoidal
in@erida pelos experimentos de CD+ com os pontos *em mais aglomerados na regi=o
caracterstica de 0!)lice4 #l)m disso+ perce*e0se uma popula<=o maior em regiGes mais
@avorecidas P1-+.cQ em compara<=o com os resultados de valida<=o o*tidos anteriormente4 #l)m
de o re@inamento ter aumentado a popula<=o de pontos nas regiGes mais @avorecidas do diagrama
de 7amac!andran+ perce*eu0se o comportamento inverso para as regiGes generosamente
@avorecidas e proi*idas+ ;ue+ neste caso+ possuem Cuntas apenas 5+6c do total de pontos4
Desconsiderando0se as extremidades e as proximidades dos resduos de prolina+ tem0se 25+6c de
pontos em regiGes mais @avor$veis e apenas .+,c dos pontos em regiGes des@avor$veis+ valores
caractersticos de modelos de alta ;ualidade estrutural4

Figura 54,W4 Figura 54,W4 Figura 54,W4 Figura 54,W4 7esultados da an$lise de ;ualidade estrutural e valida<=o dos modelos calculados
para a distinctina utili"ando0se a Jltima lista de restri<Ges e posteriormente re@inados em $gua4 P PP PaQ aQ aQ aQ
7esumo da an$lise para cada resduo de amino$cido4 #s cores verde+ laranCa e vermel!o
representam+ respectivamente+ estrutura de *oa ;ualidade+ estrutura de ;ualidade mediana ou
regi=o com pouca in@orma<=o estrutural e estrutura de ;ualidade *aixa+ ou pouco comum4 P PP P*Q *Q *Q *Q
7esultados do programa [H#%IF+ relativos H ;ualidade de empacotamento+ :0score do gr$@ico
de 7amac!andran e de Ianin+ e normalidade da cadeia principal e dos rotBmeros4 P PP PcQ cQ cQ cQ Diagrama de
7amac!andran+ o*tido pelo programa '7CHECZ4 Cada ponto corresponde a um determinado
resduo de algum dos vinte modelos4 s pontos ;ue se encontram em regiGes generosamente
@avorecidas e em regiGes proi*idas s=o representados em vermel!o4
Esse resultado permite apontar as regiGes tidas como pro*lem$ticas pelas t)cnicas de
valida<=o4 #s extremidades das cadeias peptdicas em geral apresentam maior grau de li*erdade
em rela<=o aos segmentos mais estruturados dos peptdeos4 Como nessas regiGes normalmente
s=o encontrados poucos dados ;ue levem a restri<Ges geom)tricas+ o protocolo de arre@ecimento
simulado muitas ve"es encontra mnimos de energia ;ue n=o s=o necessariamente realistas+ uma
Anlise Baseada nos Resduos de Aminocido
Cadeia 1
Cadeia 2
aQ aQ aQ aQ
Resduos emregies mais favorecidas [A,B,L]
Resduos emregies adicionalmente permitidas [a,b,l,p]
Resduos emregies generosamente permitidas [~a,~b,~l,~p]
Resduos emregies proibidas
Nmero de resduos no-glicina e no-prolina
Nmero de resduos de extremidades (exceto Pro e Gly)
Nmero de resduos glicina (mostrados como tringulos)
Nmero de resduos prolina
Nmero total de resduos
Estatsticas do Diagrama
(graus)

(
g
r
a
u
s
)
dtn-modelo2-final-ref (20 modelos)
Diagrama de Ramachandran
*Q *Q *Q *Q
cQ cQ cQ cQ

ve" ;ue+ devido Hs *aixas restri<Ges experimentais+ as con@orma<Ges desses segmentos dependem
muito mais do campo de @or<a aplicado durante o c$lculo+ em compara<=o Hs demais regiGes4
%anto a regi=o pr&xima ao resduo de prolina+ onde se locali"a uma do*ra acentuada na cadeia
principal+ ;uanto as vi"in!as H liga<=o dissul@eto apresentam+ tam*)m+ um grau de li*erdade
relativamente alto4 9o entanto+ esses segmentos s=o+ al)m disso+ pouco comuns+ o ;ue l!es
con@ere uma pro*lem$tica maior na etapa de valida<=o estrutural4 @ato de se tratarem de
estruturas pouco convencionais permite ;ue estes segmentos seCam muitas ve"es classi@icados
como incorretos em ve" de simplesmente incomuns4 Isso ocorre por;ue a maior parte dos
m)todos de valida<=o leva *astante em conta *ancos de dados com diversas estruturas em
resolu<=o alta de protenas4 #s con@orma<Ges presentes nessas estruturas proteicas dos *ancos de
dados s=o consideradas corretas+ en;uanto ;ue con@orma<Ges locais di@erentes das o*servadas
nessas estruturas s=o consideradas incorretas4 >endo assim+ n=o se pode a@irmar ;ue as estruturas
dessas regiGes esteCam corretas com *ase somente na a@irma<=o de ;ue se tratam de
con@orma<Ges pouco usuais+ mas tam*)m n=o se devem descartar as evidncias desse tipo de
estrutura<=o o*servadas nos experimentos de 7M94
Em*ora o modelo @inal calculado n=o possa ainda representar de modo @iel a mol)cula do
peptdeo estudado+ pode0se certamente a@irmar ;ue uma *oa parcela da estrutura do peptdeo C$
@oi elucidada4 Entretanto+ @uturos experimentos s=o necess$rios+ principalmente para determinar
a orienta<=o relativa entre as duas cadeias4 'ara tal+ deve0se pes;uisar um meio ;ue diminua a
varia<=o con@ormacional do peptdeo4 Isso pode ser conseguindo tanto variando0se parBmetros
como temperatura+ pH e nature"a do tamp=o+ por exemplo+ como introdu"indo0se *icelas para
@or<ar uma certa orienta<=o no peptdeo+ possi*ilitando+ assim+ a a;uisi<=o de dados de
acoplamento dipolar residual+ ;ue podem ser convertidos em restri<Ges orientacionais4 #l)m
disso+ seria interessante reali"ar experimentos ;ue @orne<am outros tipos de restri<=o+ como
experimentos !eteronucleares de mel!or resolu<=o+ para ;ue se possam o*ter com maior
precis=o os valores de deslocamento ;umico para serem convertidos em restri<Ges angulares+ ou
experimentos de C>U0DQF ou '!ase >ensitive C>U+ ;ue tam*)m podem @ornecer valores de
restri<Ges angulares e experimentos ;ue possi*ilitem o c$lculo de restri<Ges de liga<=o de
!idrognio4

'.'.2. Determinao 5strutur
# atri*ui<=o dos sinais nos mapas de contorno relativos ao peptdeo H>', deu
seguindo a estrat)gia de atri*ui<=o se;uencial proposta por [ut!ric!
@orma+ primeiramente+ @oram identi@icados os padrGes de
contornos %C>U4 # Figura 54,V mostra a regi=o em ;ue se o*servam correla<Ges dos
!idrognios al@a e de cadeias laterais com os !idrognios amidcos de cada amino$cido4 Como a
trans@erncia de magneti"a<=o ;ue d$ origem ao
entre $tomos de car*ono !idrogenados+ as correla<Ges o*servadas nesse experimento s=o apenas
intrarresidual+ ou seCa+ cada sistema de spin o*servado na regi=o ;ue a Figura 54,V compreende
re@ere0se apenas a um resduo
pertencente H liga<=o peptdica4 >endo assim+ ) possvel identi@icar claramente sistemas de
atri*u0los a certos amino$cidos4

Figura 54,V4 Figura 54,V4 Figura 54,V4 Figura 54,V4 >istemas de spins caractersticos na re
peptdeo H>',+ em ;ue se encontram as correla<Ges intraresiduais de !idrognios
cadeias laterais com !idrognios amdicos das liga<Ges peptdicas
solu<=o W-c de %FE0d, em H,Q

'.'.2. Determinao 5strutural da 3ilasptina 12 .3#120
# atri*ui<=o dos sinais nos mapas de contorno relativos ao peptdeo H>', deu
seguindo a estrat)gia de atri*ui<=o se;uencial proposta por [ut!ric! P[at!ric!+ .21XQ
@orma+ primeiramente+ @oram identi@icados os padrGes de spin caractersticos no mapa de
e de cadeias laterais com os !idrognios amidcos de cada amino$cido4 Como a
trans@erncia de magneti"a<=o ;ue d$ origem ao mapa de contornos %C>U ocorre somente
se apenas a um resduo de amino$cido+ pois entre cada resduo !$ uma car*onila+
pertencente H liga<=o peptdica4 >endo assim+ ) possvel identi@icar claramente sistemas de
los a certos amino$cidos4
>istemas de spins caractersticos na regi=o do mapa de contornos %C>U do
peptdeo H>',+ em ;ue se encontram as correla<Ges intraresiduais de !idrognios
cadeias laterais com !idrognios amdicos das liga<Ges peptdicas PX-- MH"R W mM de H>', em
Q4

# atri*ui<=o dos sinais nos mapas de contorno relativos ao peptdeo H>', deu0se
P[at!ric!+ .21XQ4 Dessa
caractersticos no mapa de
e de cadeias laterais com os !idrognios amidcos de cada amino$cido4 Como a
mapa de contornos %C>U ocorre somente
de amino$cido+ pois entre cada resduo !$ uma car*onila+
pertencente H liga<=o peptdica4 >endo assim+ ) possvel identi@icar claramente sistemas de spin e
gi=o do mapa de contornos %C>U do
peptdeo H>',+ em ;ue se encontram as correla<Ges intraresiduais de !idrognios al@a e de
PX-- MH"R W mM de H>', em

Con@orme mostrado na Figura 54,V Pp4 .-.Q+ alguns sistemas de spin caractersticos
podem ser prontamente identi@icados no mapa de contornos %C>U4 s trs sistemas de spin do
tipo #` correspondem aos trs resduos de glicina PG5+ G.W e G,,Q+ sendo ;ue ) esperado ;ue
correla<Ges re@erentes ao resduo 90terminal PG.Q n=o apare<am no mapa de contornos %C>U+
devido H alta mo*ilidade normalmente apresentada por resduos nas extremidades de cadeias
polipeptdicas4 Dois sistemas de spin do tipo #5` tam*)m podem ser @acilmente identi@icados e
corresponderiam a dois resduos de alanina4 Entretanto+ devido H grande ;uantidade desse tipo
de resduo na se;uncia polipeptdica Pseis resduos de alanina no totalQ+ n=o ) possvel
determinar a ;ual deles correspondem os sistemas de spin identi@icados4
Um sistema do tipo #5(5M` ) veri@icado nas correla<Ges envolvendo o !idrognio
amdico relativo ao deslocamento ;umico 1+.X ppm+ e ) *astante caracterstico de resduos de
valina4 9o caso+ esse sistema corresponderia ao resduo V,.4 Correla<Ges envolvendo o
!idrognio amdico com deslocamento ;umico em 6+V- ppm poderia apresentar tam*)m um
sistema de spin do tipo #5(5M`4 por)m+ devido ao @ato de uma das correla<Ges corresponder a
um sinal de intensidade menor ;ue os demais Pcorrela<=o do !idrognio amdico com o
!idrognio de deslocamento ;umico .+.1 ppmQ+ ) possvel ;ue se trate de um sistema de spin do
tipo #5M'%P(5Q`+ caracterstico de resduos de isoleucina+ podendo corresponder+ a priori+ tanto
ao resduo I, ;uanto ao IV4 @ato de o sistema de spin re@erente ao !idrognio com
deslocamento ;umico 1+.X ppm estar muito *em de@inido+ corro*ora a !ip&tese de ;ue o outro
sistema de spin seCa re@erente a um resduo de isoleucina4
%rs sistemas de spin do tipo #M` podem ser @acilmente identi@icados+ con@orme
mostrado na Figura 54,V Pp4 .-.Q+ correspondendo aos resduos DW+ 91+ H.2+ ou >,W4 'or @im+ um
sistema de spin do tipo #5(5M` relativo a correla<Ges envolvendo o !idrognio amdico de
deslocamento ;umico 6+2X ppm ) veri@icado nessa regi=o do mapa de contornos4 >istemas de
spin desse tipo s=o caractersticos de resduos de glutamina+ $cido glutBmico e metionina4 Como
existe apenas um resduo de $cido glutBmico na se;uncia de H>',+ esse sistema de spin
corresponde ao resduo E,54
#l)m da an$lise dos padrGes %C>U descrita acima+ a identi@ica<=o dos sistemas de spin
@oi @eita considerando0se tam*)m os deslocamentos ;umicos tendo como *ase as an$lises
estatsticas apresentadas no *anco de dados (M7( P(iological Magnetic 7esonance Data (anE+
!ttp?//FFF4*mr*4Fisc4eduQ4

# identi@ica<=o dos resduos pode ser @eita por meio das correla<Ges o*servadas no mapa
de contornos 9E>U+ em especial as correla<Ges do tipo se;uencial+ do tipo J
NN
(i, i +1)+
J
uN
(i, i +1) e J
[N
(i, i +1)4 #l)m disso+ como se sa*e ;ue o peptdeo adota uma estrutura
secund$ria do tipo 0!)lice+ ) possvel utili"ar correla<Ges 9E caractersticas desse tipo de
con@orma<=o+ tais como J
NN
(i, i +2)+ J
uN
(i, i +2)+ J
uN
(i, i +S)+ J
uN
(i, i +4) e J
u[
(i, i +S)+
como @orma de identi@ica<=o de determinados resduos4 #s regiGes do mapa de contornos
9E>U em ;ue se encontram estas correla<Ges est=o mostradas na Figura 54,X Pp4 .-W+ regi=o
;ue compreende correla<Ges do tipo J
NN
Q+ Figura 54,6 Pp4 .-V+ correla<Ges do tipo J
uN
e J
[N
Q e
Figura 54,1 Pp4 .-X+ correla<Ges do tipo J
u[
Q4 Dessa maneira+ o resduo E,5 identi@icado no mapa
de contornos %C>U apresenta uma correla<=o 9E se;uencial do tipo J
NN
(i, i +1) PFig4 54,X+
p4 .-WQ com o resduo de sistema de spin #` Pcaracterstico de resduos de glicinaQ com
deslocamento ;umico do !idrognio amdico de 1+,V ppm+ sendo+ portanto+ possvel identi@icar
o resduo G,,4
resduo G,,+ por sua ve"+ apresenta uma correla<=o do tipo J
[N
(i, i +1) PFig4 54,6+ p4
.-VQ com o resduo de sistema de spin #5(5M`+ identi@icado como V,.+ con@irmando+ assim+ a
atri*ui<=o previamente proposta4 L possvel ainda+ identi@icar uma correla<=o do tipo J
uN
com o
resduo de sistema de spin do tipo #M` com deslocamento ;umico de !idrognio amdico de
1+., ppm+ caracteri"ando0se+ assim+ uma correla<=o 9E J
uN
(i, i +S)+ e propiciando a
identi@ica<=o do resduo H.24

Figura 54,X Figura 54,X Figura 54,X Figura 54,X4 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de H>',

Correla<Ges do tipo J
possvel a identi@ica<=o do deslocamento ;umico do !idrognio amdico do resduo #,-4
deslocamento ;umico do !idrognio
correla<=o J
u[
(i, i +S) envolvendo os sinais relativos
resduo 8.1 pAde ser identi@icado pelas correla<Ges do tipo
J
NN
(i, i +1) PFig4 54,XQ com os !idrognios da H.2 e
da V,. PFig4 54,1+ p4 .-XQ4
4 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de H>', PX-- MH"R W mM de H>', em
Q mostrando conectividades inter0residuais dos tipo
J
[N
(i, i +1) envolvendo os !idrognios *eta
deslocamento ;umico do !idrognio al@a desse resduo pAde ser identi@icado por meio da
envolvendo os sinais relativos ao resduo E,5 PFig4 54,1+ p4 .
resduo 8.1 pAde ser identi@icado pelas correla<Ges do tipo J
[N
(i, i +1) PFig4 54,6+ p4
com os !idrognios da H.2 e J
u[
(i, i +S) com os $tomos de !idrognio
residuais dos tipo J
NN
4
*eta de H.2 tornaram
desse resduo pAde ser identi@icado por meio da
ao resduo E,5 PFig4 54,1+ p4 .-XQ4
PFig4 54,6+ p4 .-VQ e
com os $tomos de !idrognio

Em*ora seCa possvel atri*uir o !idrognio
a H.2 PFig4 54,1+ p4 .-XQ+ as regiGes em ;ue se encontram as correla<Ges relativas aos resduos de
amino$cidos Z.V+ #.X e #.6 apresentam mu
a atri*ui<=o desses resduos de amino$cido4 9o entanto+ ) possvel identi@icar uma correla<=o do
tipo J
uN
entre a 8.1 e o resduo de amino$cido com sistema de
apresenta deslocamento ;umico de 1+., ppm PFig4 54,6+ p4 ..-Q4 Esta correla<=o apresenta
intensidade relativamente *aixa+ o ;ue ) *astante comum em 9Es do tipo
J
uN
(i, i +4) em estruturas 0!elicoidais4 #nalisando
pode0se atri*uir esse sistema de
como sendo do tipo J
uN
(i, i +4

Figura 54,64 Figura 54,64 Figura 54,64 Figura 54,64 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de H>',

Em*ora seCa possvel atri*uir o !idrognio al@a da #.X+ pela correla<=o
Q+ as regiGes em ;ue se encontram as correla<Ges relativas aos resduos de
amino$cidos Z.V+ #.X e #.6 apresentam muitas so*reposi<Ges de sinais+ preCudicando+ portanto+
entre a 8.1 e o resduo de amino$cido com sistema de spin #` cuCo !idrognio amdico
enta deslocamento ;umico de 1+., ppm PFig4 54,6+ p4 ..-Q4 Esta correla<=o apresenta
intensidade relativamente *aixa+ o ;ue ) *astante comum em 9Es do tipo
!elicoidais4 #nalisando0se a se;uncia de amino$cidos de H>',+
se atri*uir esse sistema de spin #` ao resduo G.W e con@irmar a correla<=o em ;uest=o
4)4
7egi=o do mapa de contornos 9E>U de H>', PX-- MH"R W mM de H>', em
da #.X+ pela correla<=o J
u[
(i, i +S) com
Q+ as regiGes em ;ue se encontram as correla<Ges relativas aos resduos de
itas so*reposi<Ges de sinais+ preCudicando+ portanto+
#` cuCo !idrognio amdico
enta deslocamento ;umico de 1+., ppm PFig4 54,6+ p4 ..-Q4 Esta correla<=o apresenta
intensidade relativamente *aixa+ o ;ue ) *astante comum em 9Es do tipo J
uN
(i, i +2)+
amino$cidos de H>',+
#` ao resduo G.W e con@irmar a correla<=o em ;uest=o
uN
e J
[N
4

!idrognio amdico do resduo G.W+ por sua ve"+ apresenta correla<=o do tipo
J
NN
(i, i +1) com o !idrognio amdico Pde deslocamento ;umico 1+W1 ppmQ p
sistema de spin do tipo #5`+ caracterstico de resduos de alanina+ sendo possvel+ portanto
a@irmar ;ue este sistema de spin corresponde ao resduo #.54 #inda levando
correla<Ges com a G.W+ ) possvel identi@icar uma correla
por sua ve"+ apresenta uma correla<=o do tipo
atri*ui<=o do !idrognio amdico deste Jltimo4 # #.6 pAde ser identi@icada a partir da correla<=o
entre seus !idrognios *eta e
J
u[
(i, i +S)4 s !idrognios amdico e
de contornos %C>U+ atrav)s da identi@ica<=o do sistema de
!idrognio amdico do res
J
NN
(i, i +1) com o !idrognio amdico da #., e
atri*ui<=o da Z.. ) con@irmada pela presen<a de uma correla<=o do tipo
PFig4 54,6+ p4 .-VQ4 Este tipo de correla<=o tam*)m ) identi@icada entre os resduos Z.. e #.-+
permitindo a atri*ui<=o deste Jltimo+ ;ue ) con@irmada por outras correla<Ges envolvendo o
resduo #.-+ como J
NN
(i, i +1
54,6+ p4 .-VQ4

Figura 54,14 Figura 54,14 Figura 54,14 Figura 54,14 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de H>', PX-- MH"R W mM de H>', em
com o !idrognio amdico Pde deslocamento ;umico 1+W1 ppmQ p
`+ caracterstico de resduos de alanina+ sendo possvel+ portanto
a@irmar ;ue este sistema de spin corresponde ao resduo #.54 #inda levando
correla<Ges com a G.W+ ) possvel identi@icar uma correla<=o do tipo J
uN
(i, i +
por sua ve"+ apresenta uma correla<=o do tipo J
[N
(i, i +1) com a #.X+ possi*ilitando a
e os !idrognios al@a da G.W+ caracteri"ando um 9E do tipo
4 s !idrognios amdico e al@a da #.6 podem ser @acilmente atri*udos pelo mapa
de contornos %C>U+ atrav)s da identi@ica<=o do sistema de spin #5`4
!idrognio amdico do resduo #.5+ por sua ve"+ apresenta correla<Ges do tipo
com o !idrognio amdico da #., e J
NN
(i, i +2) com a Z.. PFig4 54,X+ p4 .-
atri*ui<=o da Z.. ) con@irmada pela presen<a de uma correla<=o do tipo J
[
Q4 Este tipo de correla<=o tam*)m ) identi@icada entre os resduos Z.. e #.-+
1) com Z.. P@ig4 54,X+ p4 .-WQ e J
uN
(i, i +S) com o resduo #.5 P@ig4
apa de contornos 9E>U de H>', PX-- MH"R W mM de H>', em
com o !idrognio amdico Pde deslocamento ;umico 1+W1 ppmQ pertencente a um
`+ caracterstico de resduos de alanina+ sendo possvel+ portanto
a@irmar ;ue este sistema de spin corresponde ao resduo #.54 #inda levando0se em conta as
+1) com a Z.V ;ue+
com a #.X+ possi*ilitando a
da G.W+ caracteri"ando um 9E do tipo
da #.6 podem ser @acilmente atri*udos pelo mapa
duo #.5+ por sua ve"+ apresenta correla<Ges do tipo
com a Z.. PFig4 54,X+ p4 .-WQ4 #
[N
(i, i +1) com #.,
Q4 Este tipo de correla<=o tam*)m ) identi@icada entre os resduos Z.. e #.-+
com o resduo #.5 P@ig4
apa de contornos 9E>U de H>', PX-- MH"R W mM de H>', em
u[
4

resduo 82 @oi identi@icado com *ase nas correla<Ges do tipo J
NN
(i, i +1)+ J
uN
(i, i +1)
e J
[N
(i, i +1) com o resduo #.- PFigs4 54,X+ p4 .-W+ e 54,6+ p4 .-V+ respectivamenteQ e o resduo
91+ atrav)s dos 9Es com os resduos 82 PJ
NN
(i, i +1)+ J
uN
(i, i +1) e J[N(i, i +1)Q+ #.-
PJ
NN
(i, i +2)+ J
uN
(i, i +2)Q+ #.. PJ
uN
(i, i +S) e J
u[
(i, i +S)Q e #., PJ
uN
(i, i +4)Q+ al)m do
pr&prio sistema de spin do tipo #M`+ condi"ente com o resduo de asparagina4 Devido ao @ato de
n=o !aver so*reposi<=o de sinais com as correla<Ges envolvendo 91+ @oi possvel atri*uir diversas
correla<Ges com outros resduos+ possi*ilitando a identi@ica<=o destes4 Essas correla<Ges s=o?
J
NN
(i, i +1) com a Z6 PFig4 54,X+ p4 .-WQ+ J
uN
(i, i +1) e J
uN
(i, i +S) com Z6 e IV+
respectivamente PFig4 54,6+ p4 .-VQ+ J
u[
(i, i +S) com IV PFig4 54,1+ p4 .-XQ e J
[N
(i, i +1) com Z6
PFig4 54,6+ p4 .-VQ4 resduo IX pAde ser atri*udo com *ase nos 9Es J
NN
(i, i +1) com Z6 e IV
PFig4 54,X+ p4 .-WQ+ J
uN
(i, i +1) e J
uN
(i, i +S) com IV e 82+ respectivamente+ e J
[N
(i, i +1) com
IV4
Correla<Ges envolvendo o resduo IV tam*)m permitiram a identi@ica<=o de diversos
outros sinais e+ por conse;uncia+ de outros resduos de amino$cidos4 #s correla<Ges envolvendo
IV @oram? J
NN
(i, i +1) e J
NN
(i, i +2)+ com DW e G5+ respectivamente PFig4 54,X+ p4 .-WQ+
J
uN
(i, i +1) e J
uN
(i, i +S) com DW e IV+ respectivamente PFig4 54,6+ p4 .-VQ+ J
u[
(i, i +S) com I,
PFig4 54,1+ p4 ...Q e J
[N
(i, i +1) com DW PFig4 54,6+ p4 .-WQ4 #s atri*ui<Ges relativas a DW puderam
ser con@irmadas pelo sistema de spin #M` apresentado PFig4 54,V+ p4 .-X+ deslocamento ;umico
do !idrognio amdico de 6+X1 ppmQ e com correla<Ges do tipo J
NN
(i, i +1) com G5 PFig4 54,X+ p4
.-WQ e J
uN
(i, i +1) e J
uN
(i, i +2) com G5 e I,+ respectivamente PFig4 54,6+ p4 .-WQ4
#s atri*ui<Ges relativas a G5 e I, @oram con@irmadas pelos 9Es entre esses dois
resduos+ sendo0os+ especi@icamente+ J
uN
(i, i +1) e J
[N
(i, i +1) PFig4 54,6+ p4 .-VQ4 9o mapa de
contornos 9E>U apenas+ o*servou0se uma correla<=o de um resduo de sistema de spin #`
com o !idrognio amdico de I,4 #tri*uram0se estes sinais ao resduo G.+ dada a correla<=o
J
uN
(i, i +1) PFig4 54,6+ p4 .-VQ e o sistema de spin caracterstico de resduos de glicina4
resduo 8,V pAde ser identi@icado pelas correla<Ges J
u[
(i, i +S) com G,, PFig4 54,1+ p4
.-XQ e d99Pi+ id.Q com dois $tomos de !idrognio de deslocamentos ;umicos X+1V ppm e 6+.X
ppm+ ;ue @oram identi@icados como sendo a;ueles pertencentes H car*oxamida terminal4 #l)m
disso+ 8,V ainda apresenta correla<Ges do tipo J
uN
(i, i +1) e J
[N
(i, i +1) PFig4 54,6+ p4 .-VQ com
um resduo de amino$cido cuCo sistema de spin ) do tipo #M`4 #l)m disso+ os valores de
deslocamento ;umico de seus !idrognios *eta s=o relativamente altos+ se comparados com os
valores usualmente encontrados em outros resduos de amino$cido Pos valores o*tidos @oram

5+26 ppm e 5+21 ppmQ4 Esses altos valores de deslocamento ;umico de !idrognios pertencentes
a um grupo metileno s=o caractersticos de resduos de serina4 Dessa maneira+ o resduo >,W pAde
ser+ por @im+ atri*udo4
%odos os resduos puderam+ assim+ ser atri*udos com *ase nessa an$lise+ como se
o*serva na Figura 54,2+ ;ue representa a regi=o relativa Hs correla<Ges intrarresiduais de
!idrognios amdicos com os demais !idrognios de cada resduo de amino$cido do mapa de
contornos %C>U4 resumo das correla<Ges 9E se;uenciais e caractersticas de estruturas
!)lice+ ;ue @oram utili"adas para a determina<=o da estrutura tridimensional de H>',+ )
apresentado na Figura 545-+ p4 .-2

Figura 54,2 Figura 54,2 Figura 54,2 Figura 54,24 7egi=o do mapa de contornos %C>U de H>', PX-- MH"R
solu<=o W-c de %FE0d, em
$tomos de !idrognio amdicos4

sduos puderam+ assim+ ser atri*udos com *ase nessa an$lise+ como se
os %C>U4 resumo das correla<Ges 9E se;uenciais e caractersticas de estruturas
.-24
4 7egi=o do mapa de contornos %C>U de H>', PX-- MH"R W mM de H>', em
em H,Q mostrando conectividades intrarresiduais envolvendo os
$tomos de !idrognio amdicos4
sduos puderam+ assim+ ser atri*udos com *ase nessa an$lise+ como se
os %C>U4 resumo das correla<Ges 9E se;uenciais e caractersticas de estruturas 0
W mM de H>', em
ndo conectividades intrarresiduais envolvendo os

Figura 545-4 Figura 545-4 Figura 545-4 Figura 545-4 7esumo das correla<Ges 9E se;uenciais e caractersticas de estruturas 0!elicoidais
encontrados no mapa de contornos 9E>U para H>', PX-- MH"R W mM de H>', em solu<=o
W-c de %FE0d, em H,Q4 #s correla<Ges se;uenciais encontram0se representadas pelos
retBngulos c!eios e as correla<Ges de m)dio alcance s=o representadas por lin!as4 #s espessuras
desses elementos s=o proporcionais H intensidade dos sinais 9Es a ;ue correspondem4
#nalisando o conCunto de correla<Ges 9E mostrado na Figura 545-+ pode0se perce*er
;ue !$ uma grande ;uantidade de 9Es caractersticos de estruturas 0!)lice+ em especial
correla<Ges do tipo J
uN
(i, i +S)+ J
uN
(i, i +4) e J
u[
(i, i +S)+ indicando a presen<a dessa
estrutura secund$ria em praticamente toda a extens=o da cadeia polipeptdica de H>',4
'.'.'. Determinao 5strutural da A=-1Be
2
C-)enilseptina .=-1Bes0 e da
AD-1Be
2
C-)enilseptina .D-1Bes0 por RM! em #oluo
#s atri*ui<Ges dos sinais relativos aos peptdeos 80'!es e D0'!es @oram @eitas
conCuntamente+ em D'C PW mM do peptdeo em W- mM de D'C0d51Q e *aseadas nas atri*ui<Ges
reali"adas por Magal!=es a partir de espectros da 80'!es e D0'!es em %FE+ descritas em sua tese
de doutorado Pde Magal!=es+ ,-..Q4 # compara<=o com os espectros previamente o*tidos @oi
essencial devido ao @ato de os mapas de contorno %C>U ad;uiridos para os peptdeos em D'C
n=o apresentarem *oa rela<=o sinal/rudo dos sinais4 Entretanto+ algumas in@orma<Ges a respeito
do sistema de spin dos deslocamentos ;umicos de alguns resduos de amino$cido puderam ser
o*tidas4
Dessa maneira+ a atri*ui<=o @oi reali"ada com *ase principalmente nos mapas de
contorno 9E>U e H>QC editado4 s sinais relativos a cada resduo de amino$cido e Hs
intera<Ges dipolares entre os nJcleos
.
H @oram identi@icados por meio da metodologia de

assinalamento se;uencial+ de @orma an$loga H expla
H>',4 #s atri*ui<Ges das correla<Ges intrarresiduais encontram

Figura 545.4 Figura 545.4 Figura 545.4 Figura 545.4 7egiGes do mapa de contornos %C>U relativas Hs correla<Ges intrarresiduais
envolvendo os $tomos de !idrognios amdicos de cada resduo de amino$cido para
P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es P1-- MH"R , mM do
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q
assinalamento se;uencial+ de @orma an$loga H explanada na se<=o 5454, Pp4 .-
H>',4 #s atri*ui<Ges das correla<Ges intrarresiduais encontram0se apresentadas na Figura 545.
7egiGes do mapa de contornos %C>U relativas Hs correla<Ges intrarresiduais
volvendo os $tomos de !idrognios amdicos de cada resduo de amino$cido para
do peptdeo em W- mM de D'C0d51Q4
nada na se<=o 5454, Pp4 .--Q+ para o peptdeo
se apresentadas na Figura 545.4
7egiGes do mapa de contornos %C>U relativas Hs correla<Ges intrarresiduais
volvendo os $tomos de !idrognios amdicos de cada resduo de amino$cido para P PP PaQ aQ aQ aQ 80'!es e

# an$lise simultBnea dos dois espectros mostrou
assinalamentos+ uma ve" ;ue os deslocamentos ;umicos o*servados para os !idrognios de
resduos mais distantes da extremidade
@ato de os deslocamentos ;umicos de $tomos dos !idrognio
distantes do resduo F, terem sido mais conservados em compara<=o com os deslocamentos
;umicos de $tomos de !idrognios amdicos+ grande parte da atri*ui<=o de sinais @oi *aseada
principalmente na an$lise comparativa dos mapas de contorno
resduos F, puderam ser @acilmente assinalados devido H maior varia<=o dos deslocamentos
;umicos dos !idrognios al@a e amdicos P
b W+,W ppm e
b 6+1- ppm+ par

e
.5
C de 80'!es e D0'!es s=o mostrados no #nexo #4

Figura 545,4 Figura 545,4 Figura 545,4 Figura 545,4 Mapas de contorno
P1-- MH"R , mM do peptdeo em W- mM
#s Figuras 5455 Pp4 ..,Q+ 545W Pp4 ..
caractersticas de correla<Ges do tipo
am*os os peptdeos4

aQ
# an$lise simultBnea dos dois espectros mostrou0se de grande auxlio para os
e os deslocamentos ;umicos o*servados para os !idrognios de
resduos mais distantes da extremidade 90terminal variaram pouco PFig4 545.+ p4 ..
@ato de os deslocamentos ;umicos de $tomos dos !idrognio al@a e de
.5
s do resduo F, terem sido mais conservados em compara<=o com os deslocamentos
principalmente na an$lise comparativa dos mapas de contorno
.
H+
.5
C0H>QC PFig4 545,Q4
e amdicos P
b W+WW ppm e
b 2+W5 ppm para a 8

b 6+1- ppm+ para a D0'!esQ4 Demais deslocamentos ;umicos de nJcleos de
'!es s=o mostrados no #nexo #4
Mapas de contorno
.
H+
.5
C0H>QC editados dos peptdeos P PP PaQ aQ aQ aQ 8
peptdeo em W- mM de D'C0d51Q
Q+ 545W Pp4 ..5Q e 545V Pp4 ..WQ mostram+ respectivamente+ as regiGes
caractersticas de correla<Ges do tipo J
NN
+ J
uN
e J
[N
+ e J
u[
dos mapas de contorno 9E>U de
*Q
se de grande auxlio para os
e os deslocamentos ;umicos o*servados para os !idrognios de
terminal variaram pouco PFig4 545.+ p4 ..-Q4 Devido ao
.5
C de resduos mais
s do resduo F, terem sido mais conservados em compara<=o com os deslocamentos
H>QC PFig4 545,Q4 s
b 2+W5 ppm para a 80'!es+ e

Demais deslocamentos ;umicos de nJcleos de
.
H
80'!es e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es
Q mostram+ respectivamente+ as regiGes
dos mapas de contorno 9E>U de

Figura 54554 Figura 54554 Figura 54554 Figura 54554 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de
do peptdeo em W- mM de D'C
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q
7egi=o do mapa de contornos 9E>U de P PP PaQ aQ aQ aQ 80'!es+ e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es
D'C0d51Q mostrando correla<Ges inter0residuais do tipo
'!es P1-- MH"R , mM
residuais do tipo J
NN
4

Figura 545W4 Figura 545W4 Figura 545W4 Figura 545W4 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de
J
[N
4
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q
7egi=o do mapa de contornos 9E>U de P PP PaQ aQ aQ aQ 80'Hes e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es
D'C0d51Q mostrando conectividades inter0residuais dos tipos
'!es P1-- MH"R , mM
residuais dos tipos J
uN
e

Figura 545V Figura 545V Figura 545V Figura 545V4 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de

# Figura 545X Pp4 ..V
caractersticas de estruturas 0
peptdeos 80'!es e D0'!es4

aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q
4 7egi=o do mapa de contornos 9E>U de P PP PaQ aQ aQ aQ 80'!es e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es P1-- MH"R
D'C0d51Q mostrando conectividades inter0residuais do tipo
# Figura 545X Pp4 ..VQ apresenta o resumo das correla<Ges 9E se;uenciais e
0!elicoidais encontradas nos mapas de contorno 9E>U+ para os
'!es P1-- MH"R , mM
residuais do tipo J
u[
4
o resumo das correla<Ges 9E se;uenciais e
!elicoidais encontradas nos mapas de contorno 9E>U+ para os

Figura 545X Figura 545X Figura 545X Figura 545X4 7esumo das correla<Ges 9E se;uenciais e caractersticas de estruturas 0!elicoidais
encontradas no mapa de contornos 9E>U P1-- MH"R , mM peptdeo em W- mM D'C0d51Q para
P PP PaQ aQ aQ aQ 80'!es e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es4 #s correla<Ges se;uenciais encontram0se representadas pelos retBngulos
c!eios e as correla<Ges de m)dio alcance s=o representadas por lin!as4 #s espessuras desses
elementos s=o proporcionais H intensidade dos sinais 9Es a ;ue correspondem4

'ela an$lise dos conCuntos de correla<Ges relativas a 80'!es e D0'!es+ uma grande
;uantidade de 9Es caractersticos de 0!)lices+ evidenciando a presen<a dessa estrutura
secund$ria em grande parte de am*as as cadeias peptdicas+ em*ora a maior ;uantidade de 9Es
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q

presentes na regi=o pr&xima H extremidade 90terminal da D0'!es indica uma maior estrutura<=o
deste peptdeo em rela<=o a 80'!es4

'.'.+. C8lculo e 4alidao 5strutural a partir dos Dados de RM! em
#oluo
s c$lculos @oram reali"ados utili"ando restri<Ges semi;uantitativas+ de acordo com a
intensidade dos 9Es o*servados entre pares de nJcleos de
.
H+ cuCas distBncias interatAmicas
s=o de@inidas por estas restri<Ges durante o c$lculo dos modelos das estruturas peptdicas4 'ara os
peptdeos 80'!es e D0'!es+ @oram utili"adas tam*)m restri<Ges de Bngulos diedros derivadas de
valores de deslocamento ;umico de $tomos da cadeia principal+ calculadas pelo programa
%#8>d P>!ai et al4+ ,--2Q4 #s listas de restri<=o o*tidas @oram su*metidas ao programa QUEE9
para valida<=o em rela<=o a seus respectivos conteJdos de in@orma<=o estrutural e+ por @im+
su*metidas ao c$lculo4
c$lculo @oi reali"ado utili"ando0se o protocolo de arre@ecimento simulado Psimulated
annealingQ+ *aseado em dinBmica de Bngulos de tor<=o P7ice et al+ .22WR >tein et al4+ .22XQ4 'ara o
re@inamento da H>',+ apenas+ n=o @oram utili"ados valores de deslocamentos ;umicos de
.5
C
para a de@ini<=o dos potenciais de @or<a m)dia+ *aseados nos *ancos de dados do `plor09IH+
devido ao @ato de !aver apenas resultados de 7M9 relativos a nJcleos de
.
H para este peptdeo4

'.'.+.1. C8lculo e 4alidao 5strutural da 3ilaseptina 12 .3#120
# lista utili"ada para o c$lculo dos modelos para H>', constituiu0se de .1, restri<Ges de
distBncia+ sendo 12 restri<Ges do tipo intrarresidual+ VW do tipo se;uencial e 52 restri<Ges de
alcance m)dio4 # an$lise por conteJdo de in@orma<=o reali"ada pelo programa QUEE9 )
mostrada na Figura 5456 Pp4 ..6Q4 'ode0se perce*er ;ue as restri<Ges de maior conteJdo de
in@orma<=o P.V4H#/.24H9+ .54H#/.64H9+ 24H#+ .54H9Q re@erem0se a restri<Ges ;ue tm maior
peso na de@ini<=o de uma estrutura 0!elicoidal+ durante o c$lculo do modelo+ ou seCa+ s=o as
restri<Ges derivadas de correla<Ges 9E ;ue s=o *astante caractersticas desse tipo de estrutura
secund$ria4 Como n=o @oram utili"adas restri<Ges de Bngulos diedros ou de liga<Ges de
!idrognio+ ) esperado ;ue este tipo de restri<=o ten!a um conteJdo de in@orma<=o maior ;ue as
demais4 Como este peptdeo estrutura0se em meio mim)tico de mem*rana na @orma 0

!elicoidal+ ) coerente n=o considerar esse tipo de restri<=o como incorreta+ apesar do alto valor
de unicidade dada pelo programa QUEE94

Figura 54564 Figura 54564 Figura 54564 Figura 54564 Diagrama de unicidade por ndice das restri<Ges utili"adas no c$lculo de
determina<=o estrutural dos modelos para o peptdeo H>',4

#s vinte estruturas de menores energias est=o mostradas na Figura 5451 e pode0se
perce*er claramente ;ue a @orma 0!elicoidal ) adotada em praticamente toda a extens=o da
cadeia polipeptdica4 #l)m do mais+ ) *astante evidente o car$ter an@ip$tico desta !)lice+ ;ue est$
de acordo com o ;ue ) comumente o*servado em peptdeos antimicro*ianos !elicoidais4

Figura 545 Figura 545 Figura 545 Figura 54514 14 14 14 ConCunto das vinte estruturas de menor energia do peptdeo H>',+ visuali"ado aQ aQ aQ aQ
lateralmente+ e *Q *Q *Q *Q @rontalmente+ com as cadeias laterais !idro@licas representadas em a"ul+ e as
!idro@&*icas em verde4

aQ
*Q

conCunto das estruturas apresentou um 7M>D de -+W. ] para a so*reposi<=o de
estruturas na regi=o compreendida entre os resduos VV e 8,V e a valida<=o mostrou ;ualidade
estrutural elevada+ con@orme o mostrado na Figura 5452+ de acordo com a classi@ica<=o 7G P7ed
range GreenQ adotada pelo iCing4 %odos os resduos de amino$cido @oram classi@icados com a
cor verde Psigni@icando alta ;ualidade estruturalQ+ com exce<=o do resduo V,V+ ;ue @oi
representado pela cor vermel!a+ indicando ;ualidade estrutural *aixa PFigura 5452Q4 # ra"=o disso
@oi devido H distri*ui<=o dos valores dos Bngulos diedros da cadeia lateral+ de acordo com as
com*ina<Ges angulares de@inidas no diagrama de Ianin4 motivo dessa distri*ui<=o angular
insatis@at&ria possivelmente deve0se ao @ato de n=o !aver restri<Ges de distBncia su@icientes para
de@inir uma determinada estrutura<=o da cadeia lateral de V,V durante o c$lculo estrutural4 9os
casos em ;ue n=o !$ restri<Ges geom)tricas+ a ;ualidade do modelo depende somente do campo
de @or<a utili"ado para o c$lculo4 #pesar de esse campo de @or<a contemplar *em algumas
caractersticas eletrAnicas+ eletrost$ticas e est)ricas+ ;uando utili"adas restri<Ges geom)tricas+ ele
) muito realista ;uando n=o est=o presentes tais restri<Ges+ mesmo com o re@inamento+ ;ue se
*aseia em minimi"a<Ges energ)ticas mais e@icientes e campos de @or<a mais completos4 Dessa
@orma+ a ;ualidade *aixa devido H con@orma<=o adotada pela cadeia lateral de um resduo
terminal+ ;ue normalmente tem maior varia*ilidade estrutural+ n=o compromete o modelo
calculado+ uma ve" ;ue as restri<Ges o*tidas a partir de dados experimentais s=o mutuamente
coerentes e convergem para uma estrutura do tipo 0!)lice4

Figura 54524 Figura 54524 Figura 54524 Figura 54524 Classi@ica<=o por resduos do peptdeo H>',+ de acordo com suas respectivas
;ualidades estruturais+ de pelo crit)rio 7G adotado pela inter@ace iCing+ em ;ue verde indica
*oa ;ualidade estrutural e vermel!o indica ;ualidade insatis@at&ria4

# Figura 54W- Pp4 ..2Q mostra a distri*ui<=o de Bngulos e dos resduos de amino$cido
no diagrama de 7amac!andran+ mostrando 22c dos resduos com com*ina<Ges dos valores
desses Bngulos pertencentes a regiGes mais @avorecidas+ sendo os demais .c distri*udos em
regiGes permitidas+ evidenciando+ mais uma ve" a ;ualidade estrutural elevada das estruturas
o*tidas4

Figura 54W-4 Figura 54W-4 Figura 54W-4 Figura 54W-4 Diagrama de 7amac!andran das vinte estruturas de menores energias para o
peptdeo H>',4 # regi=o mais @avorecida ) representada em vermel!o+ a adicionalmente
permitida+ em amarelo+ a generosamente permitida+ em amarelo claro+ e a regi=o proi*ida+ em
*ranco4 22c dos resduos apresentaram com*ina<Ges angulares pertencentes H regi=o mais
@avorecida+ -+Vc+ a regiGes adicionalmente permitidas e -+Vc+ a regiGes generosamente
permitidas4

'.'.+.2. C8lculo e 4alidao 5strutural da A=-1Be
2
C-)enilseptina .=-1Bes0
'ara a determina<=o estrutural de 80'!es+ @oram utili"adas ,56 restri<Ges de distBncia
Pdentre as ;uais ..2 s=o do tipo intrarresidual+ X. do tipo se;uencial e V6 s=o restri<Ges de alcance
m)dioQ e 5, restri<Ges angulares+ derivadas de valores de deslocamento ;umico de
.
H e de
.5
C
de $tomos da cadeia principal do peptdeo4 Mais uma ve"+ restri<Ges derivadas de correla<Ges
9E *astante caractersticas de estruturas 0!)lice apresentaram altos ndices de unicidade
P64H9/54H#+ V4H9/,4H#+ .,4H9/14H#+ .64H(l/.W4H# e 14H9/W4H#+ Figura 54W.+ p4 .,-Q+ ;ue
poderiam ser ainda mel!or em*asadas utili"ando0se restri<Ges advindas de dados experimentais
relativos a liga<Ges de !idrognio ou acoplamentos dipolares residuais+ por exemplo4

Figura 54W.4 Figura 54W.4 Figura 54W.4 Figura 54W.4 Diagrama de unicidade por ndice das restri<Ges utili"adas no c$lculo de
determina<=o estrutural dos modelos para o peptdeo 80'!es4

conCunto das vinte estruturas de menor energia ) mostrado na Figura 54W,+ sendo
evidente o conteJdo elevado de estrutura secund$ria do tipo 0!)lice4 'erce*e0se+ ainda+ uma
grande convergncia geom)trica entre as estruturas+ re@letida+ tam*)m+ no 7M>D o*tido+ de -+5X
] para um alin!amento da cadeia principal+ entre os resduos DW e %.14

Figura 54W,4 Figura 54W,4 Figura 54W,4 Figura 54W,4 ConCunto das ,- estruturas de menor energia do peptdeo 80'!es+ visuali"ado aQ aQ aQ aQ

# classi@ica<=o de cada resduo pelo crit)rio 7G do iCing ) mostrada na Figura 54W5 Pp4
.,.Q4 s resduos DW+ 82 e %.1 @oram classi@icados como laranCa+ indicativo de uma possvel
;ualidade estrutural *aixa4 9ovamente+ a possvel de@icincia estrutural ) apontada na
aQ
*Q

distri*ui<=o angular das cadeias laterais desses resduos+ sendo a possvel causa o *aixo nJmero
de restri<Ges envolvendo $tomos dessas cadeias laterais4

Figura 54W54 Figura 54W54 Figura 54W54 Figura 54W54 Classi@ica<=o por resduos do peptdeo 80'!es+ de acordo com suas respectivas
;ualidades estruturais+ pelo crit)rio 7G adotado pela inter@ace iCing+ em ;ue verde indica *oa
;ualidade estrutural e laranCa indica ;ualidade estrutural mediana4

# Figura 54WW mostra o diagrama de 7amac!andran da 80'!es+ em ;ue .--c dos resduos
possuem com*ina<Ges dos Bngulos e dentro da $rea de@inida como mais @avor$vel Pregi=o
em vermel!oQ4

Figura 54WW4 Figura 54WW4 Figura 54WW4 Figura 54WW4 Diagrama de 7amac!andran das vinte estruturas de menor energia para a 80'!es4 #
regi=o mais @avorecida ) apresentada em vermel!o+ a adicionalmente permitida+ em amarelo+ a
generosamente permitida+ em amarelo claro+ e a regi=o proi*ida+ em *ranco4 .--c dos resduos
apresentaram com*ina<Ges angulares pertencentes H regi=o mais @avorecida4

'.'.+.'. C8lculo e 4alidao 5strutural da AD-1Be
2
C-)enilseptina .D-1Bes0
# determina<=o estrutural da D0'!es @oi reali"ada utili"ando0se um conCunto de ,.V
restri<Ges de distBncia P.,, do tipo intrarresidual+ V. do tipo se;uencial e W, de alcance m)dioQ e
,X restri<Ges angulares4 >imilarmente aos peptdeos 80'!es e H>',+ os c$lculos de unicidade do
QUEE9 mostraram apenas restri<Ges caractersticas de 0!)lice como respons$veis pelo maior
nJmero de in@orma<Ges estruturais PFigura 54WVQ4

Figura 54WV4 Figura 54WV4 Figura 54WV4 Figura 54WV4 Diagrama de unicidade por ndice das restri<Ges utili"adas no c$lculo de
determina<=o estrutural dos modelos para o peptdeo D0'!es4

#s ,- estruturas de menor energia+ ;ue compGem o modelo para a D0'!es s=o mostradas
na Figura 54WX4 L tam*)m evidente o alto grau de so*reposi<=o da cadeia principal desse
conCunto de estruturas Ptam*)m alin!adas na regi=o compreendida entre os resduos DW e %.1Q+
;ue ) re@letido no 7M>D calculado+ cuCo valor ) de -+W5 ]4

Figura 54WX4 Figura 54WX4 Figura 54WX4 Figura 54WX4 ConCunto das ,- estruturas de menor energia do peptdeo D0'!es+ visuali"ado aQ aQ aQ aQ
aQ
*Q

Em rela<=o ao modelo estrutural da 80'!es PFigura 54W,+ p4 .,-Q+ pode0se averiguar ;ue o
conCunto de estruturas para a D0'!es apresenta um car$ter an@ip$tico ainda mais acentuado ;ue
seu !om&logo+ comparando0se as visGes @rontais de am*os os peptdeos PFigura 54W,*+ p4 .,-+ e
Figura 54WX*+ p4 .,,+ para 80'!es e D0'!es+ respectivamenteQ+ com os resduos de amino$cido F.
e F, mais concentrados na @ace !idro@&*ica da !)lice4 #l)m disso+ perce*e0se uma menor
varia*ilidade con@ormacional das cadeias laterais desses resduos de amino$cido na D0'!es em
rela<=o H 80'!es+ acentuando0se+ dessa maneira+ o car$ter an@ip$tico da primeira4
# Figura 54W6 mostra a classi@ica<=o por resduo da D0'!es pela inter@ace iCing+ indicando
*oa ;ualidade estrutural+ indicando apenas ;ualidade mediana para os resduos I.W+ #.X e 8.64
desvio apontado em rela<=o Hs rela<Ges angulares comumente o*servadas em cadeias
polipeptdicas locali"a0se na cadeia principal e provavelmente ) devido H distor<=o da !)lice na
regi=o pr&xima H extremidade C0terminal+ con@orme o*servado na Figura 54WXa Pp4 .,,Q4 #pesar
de a estrutura secund$ria em ;uest=o apresentar um leve desvio em rela<=o a sua @orma ideal+ as
com*ina<Ges angulares o*servadas n=o violam as condi<Ges est)ricas em ;ue se @undamenta o
diagrama de 7amac!andran4 Dessa @orma+ essa distor<=o @oi considerada como uma
caracterstica estrutural+ pois esta ) @undamentada em resultados experimentais de 7M9 em
solu<=o4

Figura 54W64 Figura 54W64 Figura 54W64 Figura 54W64 Classi@ica<=o por resduos do peptdeo D0'!es+ de acordo com suas respectivas
;ualidades estruturais+ pelo crit)rio 7G adotado pela inter@ace iCing+ em ;ue verde indica *oa
;ualidade estrutural e laranCa indica ;ualidade estrutural mediana4

diagrama de 7amac!andran para a D0'!es ) apresentado na Figura 54W1 Pp4 .,WQ+
mostrando grande parte das com*ina<Ges angulares relativas H cadeia principal na regi=o mais
@avorecida+ em*ora em duas das ,- estruturas o resduo F, apresenta com*ina<Ges de e ;ue
se encontram na regi=o proi*ida do diagrama4 Isso n=o necessariamente indica erro estrutural+
uma ve" ;ue o resduo F, trata0se do estereoisAmero D da @enilalanina e o diagrama de
7amac!andran @oi construdo tendo como *ase nos estereoisAmeros 8 de amino$cidos4 >endo
assim+ ) esperado ;ue outliers como estes seCam o*servados no caso de D0amino$cidos4

Figura 54W14 Figura 54W14 Figura 54W14 Figura 54W14 Diagrama de 7amac!andran das ,- estruturas de menor energia para a D0'!es4 #
regi=o mais @avorecida ) representada em vermel!o+ a adicionalmente permitida+ em amarelo+ a
generosamente permitida+ em amarelo claro+ e a regi=o proi*ida+ em *ranco4 21+2c dos resduos
apresentaram com*ina<Ges angulares pertencentes H regi=o mais @avorecida+ -+Wc a regiGes
adicionalmente permitidas e -+6c H regi=o proi*ida4

'.'.5. 5studos *opol(gicos da /nterao 1eptdeo-Dicamada
)os%olipdica por Ressonncia Magntica !uclear .RM!0 em )ase
#(lida

'.'.5.1. 5studo da 3ilaseptina 12 .3#120 por RM! em )ase #(lida
'ara o estudo de 7M9 em @ase s&lida de H>',+ @oram utili"ados peptdeos
isotopicamente marcados com
.V
9 no resduo de leucina na posi<=o .1 P8.1Q e com
,
H5 na metila
do resduo de alanina na posi<=o .X P#.XQ4
espectro de 7M9 de
5.
' desacoplado de
.
H PFigura 54W2+ p4 .,VQ mostra um sinal em
um maior valor de deslocamento ;umico de intensidade muito maior ;ue os demais sinais+
indicando uma *oa orienta<=o da *icamada lipdica4

Figura 54W24 Figura 54W24 Figura 54W24 Figura 54W24 Espectro de 7M9 de
5.
' desacoplado de
.
H de amostra contendo o peptdeo H>',
reconstitudo em *icamadas mecanicamente orientadas de ''C P.+Vc em mol de H>', em
''CQ a 25c de umidade relativa P.X.+2 MH"Q4
# Figura 54V- mostra o espectro de 7M9 de
.V
9 desacoplado de
.
H para a H>',4
espectro apresenta apenas um sinal de alta intensidade+ indicando a ;ue a maior parte das
mol)culas de peptdeo encontra0se alin!ada paralelamente H super@cie da *icamada+ em uma
orienta<=o principal4 deslocamento ;umico o*servado @oi de 6W ppm4 # presen<a de apenas
um sinal maCorit$rio ) indcio de ;ue o peptdeo segue pre@erencialmente uma orienta<=o
;uando interage com a *icamada @os@olipdica4

Figura 54V-4 Figura 54V-4 Figura 54V-4 Figura 54V-4 Espectro de 7M9 de
.V
9 desacoplado de
.
H de amostra contendo o peptdeos H>',
em *icamadas mecanicamente orientadas de ''C P.+Vc em mol de H>', em ''CQ a 25c de
umidade relativa PW-+XMH"Q44

espectro de 7M9 de
desdo*ramento ;uadrupolar de deut)rio o*servado ) de ,6 EH"+ mostrando+ tam*)m+ evidncia
de ;ue o peptdeo possui uma orienta<=o pre@erencial ao interagir com a *icamada4

Figura 54V.4 Figura 54V.4 Figura 54V.4 Figura 54V.4 Espectro de 7M9 de
mecanicamente orientadas de ''C
relativa PX.+W MH"Q4

# partir dos valores de deslocamento ;umico de
deut)rio+ prosseguiu0se com a determina<=o das possveis orienta<Ges do peptdeo na *icamada4
#s rela<Ges angulares ;ue de@inem essa orienta<=o encontram

Figura 54V,4 Figura 54V,4 Figura 54V,4 Figura 54V,4 #lin!amentos possveis do peptdeo H>', em *icamada de ''C
H>', em ''CQ+ apresentados em @un<=o do Bngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o
interna4 s pontos em a"ul representam orienta<Ges ;ue concorda
;uadrupolar de
,
H e os pontos em vermel!o representam as orienta<Ges em concordBncia com o
deslocamento ;umico experimental de
romanos+ mostram orienta<Ges ;ue concordam simultan
portanto+ representam as possveis orienta<Ges do peptdeo nas *icamadas lipdicas4
espectro de 7M9 de
,
H de H>', ) apresentado na Figura 54V.
orienta<=o pre@erencial ao interagir com a *icamada4
Espectro de 7M9 de
,
H de amostra contendo o peptdeo H>', em *icamadas
mecanicamente orientadas de ''C P.+Vc em mol de H>', em ''CQ a 25c de umidade
dos valores de deslocamento ;umico de
.V
9 e desdo*ramento ;uadrupolar de
se com a determina<=o das possveis orienta<Ges do peptdeo na *icamada4
#s rela<Ges angulares ;ue de@inem essa orienta<=o encontram0se representadas na Figura 5
#lin!amentos possveis do peptdeo H>', em *icamada de ''C
+ apresentados em @un<=o do Bngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o
interna4 s pontos em a"ul representam orienta<Ges ;ue concordam com o desdo*ramento
deslocamento ;umico experimental de
.V
94 s pontos de interse<=o+ indicados por algarismos
romanos+ mostram orienta<Ges ;ue concordam simultaneamente com os dois parBmetros e+
', ) apresentado na Figura 54V.4 valor de
orienta<=o pre@erencial ao interagir com a *icamada4
H de amostra contendo o peptdeo H>', em *icamadas
P.+Vc em mol de H>', em ''CQ a 25c de umidade
se com a determina<=o das possveis orienta<Ges do peptdeo na *icamada4
se representadas na Figura 54V,4
#lin!amentos possveis do peptdeo H>', em *icamada de ''C P.+Vc em mol de
+ apresentados em @un<=o do Bngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o
m com o desdo*ramento
94 s pontos de interse<=o+ indicados por algarismos
eamente com os dois parBmetros e+

4

Figura 54V54 Figura 54V54 Figura 54V54 Figura 54V54 7epresenta<=o dos possveis alin!amentos
H>',+ com estruturas vistas P PP PaQ aQ aQ aQ
em verde e os resduos polares+ em a"ul4 # *icamada lipdica encontra
em a"ul claro4

9a Figura 54V5+ pela intera<=o da @ace !idro@&*ica com o interior ali@$tic
pode0se considerar ;ue a orienta<=o VI+ com o eixo da !)lice paralelo H super@cie da estrutura
@os@olipdica+ ) a mais prov$vel4 Entretanto+ perce*e
inser<=o dos resduos polares E,5 e >,W no meio !idro@
de a estrutura utili"ada para a determina<=o das orienta<Ges derivar de resultados de 7M9 com o
peptdeo dissolvido em %FE+ meio ;ue normalmente indu" estruturas
de uma estrutura ad;uirida com o peptdeo em contato com @os@olipdeos poderia @ornecer
resultados mais precisos acerca da orienta<=o pre@erencial4 utro ponto ;ue merece ser
levantado ) ;ue essa determina<=o topol&gica n=o leva em conta ;uestGes dinBmicas do peptdeo
e+ como esses resduos de amino$cido encontram
possvel ;ue ;uestGes dinBmicas ten!am in@luncia signi@icativa so*re esses resduos e ;ue essa
regi=o n=o se encontra necessariamente em contato com o interior !idro@&*ico dura
tempo ;ue ocorre a intera<=o peptdeo

aQ aQ aQ aQ
7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V, Pp4 .,X
aQ aQ aQ aQ de lado e P PP P*Q *Q *Q *Q de @rente4 s resduos apolares est=o representados
em verde e os resduos polares+ em a"ul4 # *icamada lipdica encontra0se representada pela $rea
9a Figura 54V5+ pela intera<=o da @ace !idro@&*ica com o interior ali@$tic
se considerar ;ue a orienta<=o VI+ com o eixo da !)lice paralelo H super@cie da estrutura
@os@olipdica+ ) a mais prov$vel4 Entretanto+ perce*e0se ;ue+ nessa topologia !$ ainda uma
inser<=o dos resduos polares E,5 e >,W no meio !idro@&*ico4 Isso pode ser conse;uncia do @ato
peptdeo dissolvido em %FE+ meio ;ue normalmente indu" estruturas 0!elicoidais4 # utili"a<=o
da com o peptdeo em contato com @os@olipdeos poderia @ornecer
es resduos de amino$cido encontram0se em uma regi=o pr&xima H
regi=o n=o se encontra necessariamente em contato com o interior !idro@&*ico dura
tempo ;ue ocorre a intera<=o peptdeo0mem*rana4
*Q *Q *Q *Q
indicados na Figura 54V, Pp4 .,XQ+ para
de @rente4 s resduos apolares est=o representados
se representada pela $rea
9a Figura 54V5+ pela intera<=o da @ace !idro@&*ica com o interior ali@$tico da *icamada+
se considerar ;ue a orienta<=o VI+ com o eixo da !)lice paralelo H super@cie da estrutura
se ;ue+ nessa topologia !$ ainda uma
&*ico4 Isso pode ser conse;uncia do @ato
!elicoidais4 # utili"a<=o
da com o peptdeo em contato com @os@olipdeos poderia @ornecer
se em uma regi=o pr&xima H C0termina<=o+ )
regi=o n=o se encontra necessariamente em contato com o interior !idro@&*ico durante todo o

'.'.5.2. 5studo da A=-1Be
2
C-)enilseptina .=-1Bes0 e AD-1Be
2
C-)enilseptina .D-
1Bes0 por RM! em )ase #(lida

'rimeiramente+ @oram reali"ados experimentos de 7M9 de
5.
' desacoplados de
.
H4 s
espectros tanto de 80'!es ;uanto de D0'!es mostram sinais com maior valor de deslocamento
;umico de intensidade muito maior ;ue os demais sinais PFig4 54VWQ+ indicando uma *oa
orienta<=o da *icamada lipdica4 espectro de 80'!es PFig4 54VWaQ mostra um terceiro sinal
imediatamente ao lado do sinal principal+ ;ue indica degrada<=o da *icamada lipdica+ em*ora+
devido H sua intensidade+ pode0se concluir ;ue a degrada<=o ) mnima e n=o in@luencia
signi@icativamente os resultados dos demais experimentos reali"ados4

Figura 54VW4 Figura 54VW4 Figura 54VW4 Figura 54VW4 Espectros de 7M9 de
5.
' desacoplados de
.
H+ de amostras contendo os peptdeos P PP PaQ aQ aQ aQ
80'!es e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es+ em *icamadas mecanicamente orientadas de ''C P5c em mol dos
peptdeos em ''CQ a 25c de umidade relativa P.X.+2 MH"Q4
# Figura 54VV mostra os espectros de 7M9 de
.V
9 desacoplados de
.
H para a 80'!es PFig4
54VVa+ p4 .,2Q e D0'!es PFig4 54VV*+ p4 .,2Q4 s deslocamentos ;umicos o*servados para am*as as
amostras @oram *astante pr&ximos entre si P6X ppm para 80'!es e 6W ppm para D0'!esQ+ o ;ue
indica orienta<Ges das respectivas !)lices similares entre si4
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q

Figura 54VV4 Figura 54VV4 Figura 54VV4 Figura 54VV4 Espectros de 7M9 de
.V
9 desacoplados de
.
H de amostras contendo os peptdeos P PP PaQ aQ aQ aQ
80'!es e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es em *icamadas mecanicamente orientadas de ''C P5c em mol dos
peptdeos em ''CQ a 25c de umidade relativa PW-+X MH"Q4
s espectros de
,
H de am*as as @enilseptinas encontram0se na Figura 54VX4 s valores de
desdo*ramento ;uadrupolar de deut)rio o*servados s=o *astante di@erentes P5X EH" para a 80
'!es+ Fig4 54VXa+ e ,6 EH" para a D0'!es+ Fig4 54VX*+ indicando uma di@eren<a signi@icativa entre
os Bngulos a"imutais de rota<=o+ o ;ue indica ;ue as maneiras com ;ue cada peptdeo ancora0se H
mem*rana se di@erenciam signi@icativamente entre si4

Figura 54VX4 Figura 54VX4 Figura 54VX4 Figura 54VX4 Espectros de 7M9 de
,
H de amostras contendo os peptdeos P PP PaQ aQ aQ aQ 80'!es e P PP P*Q *Q *Q *Q D0'!es
em *icamadas mecanicamente orientadas de ''C P5c em mol dos peptdeos em ''CQ a 25c
de umidade relativa PX.+W MH"Q4

Com os valores de deslocamento ;umico de
.V
deut)rio+ @oi possvel reali"ar o c$lculo de orienta<Ges possveis do peptdeo na mem*rana4 #s
rela<Ges angulares ;ue de@inem essa orienta<=o para a 80'!es encontram0se representadas na
*Q *Q *Q *Q
aQ aQ aQ aQ
aQ aQ aQ aQ
*Q *Q *Q *Q

Figura 54V6 e+ para a D0'!es+ na F
estruturas dos peptdeos encontram
80'!es e D0'!es+ respectivamente4 #s estruturas utili"adas para a determina<=o das topologias
orientacionais mais prov$veis @oram os modelos de menor energia cuCas geometrias @oram
determinadas com *ase nos resultados de 7M9 em solu<=o+ na presen<a de D'C4 #s estruturas
@oram primeiramente alin!adas em rela<=o ao eixo "+ levando em conta o eixo principal da
!)lice compreendida entre os resduos DW e 8.64 alin!amento @oi reali"ado utili"ando
programa G7M#C> W4W PVan Der >poel
N -E da amida pertencente H liga<=o peptdica entre os resduos 91 e

Figura 54V64 Figura 54V64 Figura 54V64 Figura 54V64 #lin!amentos possveis do peptdeo 8
em @un<=o do Bngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o interna4 #s curvas em a"ul
representam orienta<Ges ;ue concordam com o desdo*ramento ;uad
em vermel!o representam as orienta<Ges em concordBncia com o deslocamento ;umico
experimental de 7M9 de
.V
94 s pontos de interse<=o+ indicados por algarismos romanos+
mostram orienta<Ges ;ue concordam simultaneamente com os dois
representam as possveis orienta<Ges do peptdeo nas *icamadas lipdicas4

'!es+ na Figura 54V2 Pp4 .5.Q4 #s aplica<Ges dessas orienta<Ges so*re as
estruturas dos peptdeos encontram0se representada nas Figuras 54V1 Pp4 .5.Q e 54X- Pp4
'!es+ respectivamente4 #s estruturas utili"adas para a determina<=o das topologias
ais prov$veis @oram os modelos de menor energia cuCas geometrias @oram
@oram primeiramente alin!adas em rela<=o ao eixo "+ levando em conta o eixo principal da
!)lice compreendida entre os resduos DW e 8.64 alin!amento @oi reali"ado utili"ando
PVan Der >poel et al4+ ,--VQ+ pelo vetor paralelo ao sentido da liga<=o
da amida pertencente H liga<=o peptdica entre os resduos 91 e 824
#lin!amentos possveis do peptdeo 80'!es em *icamada de ''C+ apresentados
representam orienta<Ges ;ue concordam com o desdo*ramento ;uadrupolar de
mostram orienta<Ges ;ue concordam simultaneamente com os dois parBmetros e+ portanto+
Q4 #s aplica<Ges dessas orienta<Ges so*re as
Q e 54X- Pp4 .5,Q para a
'!es+ respectivamente4 #s estruturas utili"adas para a determina<=o das topologias
ais prov$veis @oram os modelos de menor energia cuCas geometrias @oram
@oram primeiramente alin!adas em rela<=o ao eixo "+ levando em conta o eixo principal da 0
!)lice compreendida entre os resduos DW e 8.64 alin!amento @oi reali"ado utili"ando0se o
+ pelo vetor paralelo ao sentido da liga<=o
'!es em *icamada de ''C+ apresentados
rupolar de
,
H e as curvas
parBmetros e+ portanto+

Figura 54V14 Figura 54V14 Figura 54V14 Figura 54V14 7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V6+ para 8
com estruturas vistas aQ aQ aQ aQ de lado e
e os resduos polares+ em a"ul4 # *icamada lipdica ) representada pela $rea em a"ul claro4

Figura 54V24 Figura 54V24 Figura 54V24 Figura 54V24 #lin!amentos possveis do peptdeo D
em @un<=o do Bngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o interna4 s pontos em a"ul
experimental de 7M9 de
.V

aQ aQ aQ aQ
7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V6+ para 8
de lado e *Q *Q *Q *Q de @rente4 s resduos apolares est=o representados em verde
#lin!amentos possveis do peptdeo D0'!es em *icamada de ''C+ apresentados
ngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o interna4 s pontos em a"ul
*Q *Q *Q *Q
7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V6+ para 80'!es+
s resduos apolares est=o representados em verde
'!es em *icamada de ''C+ apresentados
ngulo de inclina<=o e do Bngulo polar de rota<=o interna4 s pontos em a"ul
,
H e as curvas

Figur Figur Figur Figura 54X-4 a 54X-4 a 54X-4 a 54X-4 7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V2+ para D
com estruturas vistas P PP PaQ aQ aQ aQ lateral e
os resduos polares+ em a"ul4 # *icamada lipdica encontra
claro4

#nalisando0se a Figura 54V1 Pp4 .5.
;ue+ para o peptdeo 80'!es+ as orienta<Ges mais @avorecidas s=o as IV e V+ devido ao @ato de
grande parte dos resduos apolares est
sugerindo intera<Ges menos energ)ticas do peptdeo com o meio mim)tico de mem*rana4
Entretanto+ devido ao @ato de a orienta<=o IV promover uma mel!or inser<=o dos resduos de
@enilalanina P!idro@&*icosQ e menor inser<=o da extremidade
resduo !idro@lico treonina P%.1Q no interior !idro@&*ico da *icamada @os@olipdica+ pode
considerar esta como sendo a orienta<=o mais prov$vel4 Com *ase nos mesmos crit)rios+ pela
an$lise da Figura 54X-+ pode0se concluir ;ue a orienta<=o mais prov$vel para D
orienta<=o II+ pois trata0se da Jnica em ;ue as cadeias laterais de resduos polares n=o se
encontram inseridas no interior da *icamada4 #penas as cadeias laterais de res
encontram0se parcialmente inseridas no meio !idro@&*ico na
sugere ;ue a cadeia lateral desse resduo interage com a inter@ace da *icamada+ ;ue ) polar4 #l)m
disso+ os resduos de @enilalanina encontram
sugerindo um ancoramento ;ue @acilitaria a intera<=o do entre o peptdeo e os @os@olipdeos4
L interessante comparar os dois peptdeos epim)ricos em rela<=o H suas respectivas
orienta<Ges mais prov$veis4 'rimeirame
resduos de @enilalanina PF.+ F, e F5Q no meio @os@olipdico se d$ de maneira mais e@etiva do ;ue
para a 80'!es+ em ;ue o resduo F.
54X-+ p4 .5,+ para a 80'!es e D
aQ
7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V2+ para D
lateral e P PP P*Q *Q *Q *Q @rontal4 s resduos apolares est=o representados em verde e
os resduos polares+ em a"ul4 # *icamada lipdica encontra0se representada pela $rea em a"ul
se a Figura 54V1 Pp4 .5.Q pela an@ipaticidade das estruturas+ pode
'!es+ as orienta<Ges mais @avorecidas s=o as IV e V+ devido ao @ato de
grande parte dos resduos apolares estarem em contato direto com a *icamada @os@olipdica+
e menor inser<=o da extremidade C0terminal+ em ;ue se encontra o
resduo !idro@lico treonina P%.1Q no interior !idro@&*ico da *icamada @os@olipdica+ pode
se concluir ;ue a orienta<=o mais prov$vel para D
se da Jnica em ;ue as cadeias laterais de resduos polares n=o se
encontram inseridas no interior da *icamada4 #penas as cadeias laterais de res
se parcialmente inseridas no meio !idro@&*ico na representa<=o da Figura 54X-4
disso+ os resduos de @enilalanina encontram0se ;uase totalmente inseridos na *icamada+
orienta<Ges mais prov$veis4 'rimeiramente+ o*serva0se ;ue+ para a D0'!es+ a inser<=o dos
'!es+ em ;ue o resduo F. Pconsiderando as orienta<Ges IV+ Fig4 54V1+
'!es e D0'!es+ respectivamenteQ n=o estaria se;uer em contato com a
*Q
7epresenta<=o dos possveis alin!amentos indicados na Figura 54V2+ para D0'!es+
@rontal4 s resduos apolares est=o representados em verde e
sentada pela $rea em a"ul
Q pela an@ipaticidade das estruturas+ pode0se concluir
'!es+ as orienta<Ges mais @avorecidas s=o as IV e V+ devido ao @ato de
arem em contato direto com a *icamada @os@olipdica+
terminal+ em ;ue se encontra o
resduo !idro@lico treonina P%.1Q no interior !idro@&*ico da *icamada @os@olipdica+ pode0se
se concluir ;ue a orienta<=o mais prov$vel para D0'!es seria a
se da Jnica em ;ue as cadeias laterais de resduos polares n=o se
encontram inseridas no interior da *icamada4 #penas as cadeias laterais de resduos como lisina
representa<=o da Figura 54X-4 Isso
e ;uase totalmente inseridos na *icamada+
'!es+ a inser<=o dos
Pconsiderando as orienta<Ges IV+ Fig4 54V1+ p4 .5. e II+ Fig4
n=o estaria se;uer em contato com a

regi=o !idro@&*ica da *icamada+ considerando a estrutura est$tica utili"ada para a simula<=o
orientacional4 Esses resultados sugerem um mel!or ancoramento na *icamada por parte da D0
'!es em compara<=o com a 80'!es4 Essa intera<=o di@erencial da D0'!es com o meio mim)tico
de mem*rana muito possivelmente deve0se ao estereoisAmero D do resduo F,+ ;ue indu"iria
uma con@orma<=o da extremidade 90terminal mais propensa a se inserir de @orma mais e@etiva no
interior !idro@&*ico de agrupamentos @os@olipdicos4 #ncoramentos como esse s=o normalmente
*astante importantes para o exerccio da atividade *iol&gica de peptdeos antimicro*ianos+ uma
ve" ;ue eles promovem uma intera<=o mais @orte com a mem*rana *acteriana4 De @ato+ esses
resultados s=o coerentes com os testes antimicro*ianos reali"ados com am*os os peptdeos Pde
Magal!=es+ ,-.,Q+ em ;ue se o*serva uma atividade *actericida maior por parte da D0'!es em
rela<=o H 80'!es4 Esse ancoramento mais e@etivo teria um papel importante nessa di@eren<a de
atividade4
9o entanto+ a con@igura<=o do C
u
do resduo de F, na D0'!es n=o teria uma in@luncia na
extremidade 90terminal apenas+ mas tam*)m na pr&pria orienta<=o da !)lice4 Isso ) evidente
tanto pelas imagens relativas Hs orienta<Ges mais prov$veis ;uanto pelo pr&prio espectro de
,
H4
En;uanto os resultados dos experimentos de 7M9 de
.V
9 indicam Bngulos de inclina<=o
relativamente pr&ximos entre os peptdeos+ a di@eren<a dos valores de desdo*ramento
;uadrupolar de deut)rio aponta ;ue os peptdeos adotam Bngulos polares de rota<=o interna
signi@icativamente di@erentes ;uando da intera<=o deles com a *icamada @os@olipdica4 Uma
an$lise das Figuras 54V1 Pp4 .5.Q e 54X- Pp4 .5,Q realmente mostra ;ue a intera<=o da regi=o
!elicoidal da D0'!es com o meio mim)tico de mem*rana se d$ de @orma mais e@etiva em
compara<=o com a mesma regi=o do peptdeo 80'!es4 'or @im+ uma outra caracterstica
geom)trica interessante ) a ligeira distor<=o da !)lice apresentada nas estruturas da D0'!es4 Essa
distor<=o aparentemente promove uma maior inser<=o da cadeia lateral da 8.6 na *icamada+
@a"endo+ ao mesmo tempo+ com ;ue o resduo %.1 @i;ue em contato com a inter@ace a;uosa+ e
n=o com o interior !idro@&*ico4 9os modelos para a 80'!es+ em ;ue tal distor<=o n=o )
encontrada+ o resduo %.1 encontra0se inserido no meio apolar da *icamada4 Essa caracterstica
possivelmente in@luencia a mel!or intera<=o da D0'!es em rela<=o a seu !om&logo4
#l)m disso+ analisando as larguras de lin!a dos sinais nos respectivos espectros de 7M9
de
,
H de 80'!es e de D0'!es+ veri@ica0se ;ue elas s=o di@erentes+ se apresentando maior para o
primeiro peptdeo4 Isso pode ser devido a di@eren<as de mo*ilidade de cada peptdeo no meio
utili"ado4 >endo assim+ poder0se0ia in@erir ;ue+ en;uanto D0'!es apresentaria *asicamente uma
orienta<=o maCorit$ria+ devido H menor largura de lin!a dos sinais PFig4 54VX*+ p4 .,2Q+ 80'!es

interagiria com a *icamada em grande parte seguindo a orienta<=o calculada+ mas !averia uma
popula<=o consider$vel de mol)culas interagindo com a *icamada seguindo outras orienta<Ges4
Essa in@erncia est$ em concordBncia com os dados de ensaios *iol&gicos Pde Magal!=es et al4+
,-.,Q+ ;ue mostram maior atividade antimicro*iana para a D0'!es+ uma ve" ;ue intera<Ges
peptdeo0mem*rana mais @ortes re@letem a ado<=o de uma orienta<=o pre@erencial das mol)culas
do peptdeo em rela<=o H *icamada @ops@olipdica4 'or outro lado+ a maior mo*ilidade de 80'!es+
revelada pelos sinais de 7M9 mais largos+ devidos H maior popula<=o de orienta<Ges
moleculares+ resulta em intera<Ges peptdeo0mem*ranas mais @racas+ sendo condi"ente com a
menor atividade *iol&gica veri@icada para este epmero4
3.4. aracteri2a#$o 7ermodin'mica do Processo de 0ntera#$o
Peptdeo65embrana por alorimetria de 7itula#$o 0sotrmica
9este tra*al!o+ o processo de intera<=o dos peptdeos H>', com mem*ranas mim)ticas
de ''C?''G Pmodelo de mem*rana *acterianaQ @oi estudado por calorimetria de titula<=o
isot)rmica+ com o o*Cetivo de determinar os parBmetros termodinBmicos PA E+ A S+ A 0 e K
p
Q+ o
grau de intera<=o
b
e o coe@iciente este;uiom)trico da intera<=o PnQ4
'.+.1 Determinao da entalpia de interao peptdeo-membrana
#s curvas mostradas na Figura 54X. P# e (Q+ p4 .5V+ representam o tipo de titula<=o
descrito na introdu<=o+ com *aixas ra"Ges '?8 para o peptdeo H>', e lipossomas de
''C/''G4

# ## #
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 0,014
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
-10
-5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120
Tempo (min)
c
a
l
/
s
Razo molar
k
c
a
l
/
m
o
l

(
p
e
p
t
d
e
o

i
n
j
e
t
a
d
o
)

( (( (
0,0000 0,0004 0,0008 0,0012 0,0016 0,0020
1,2
1,6
2,0
2,4
2,8
3,2
3,6
4,0
4,4
0,0
0,2
0,4
0,6
0 10 20 30 40 50
Tempo (min)
c
a
l
/
s
Razo Molar
k
c
a
l
/
m
o
l

p
e
p
t
d
e
o

i
n
j
e
t
a
d
o

Figura 54X.4 Figura 54X.4 Figura 54X.4 Figura 54X.4 Curvas da titula<=o calorim)tricas do lipossoma de ''C?''G P5?.+
mol?molQ P5V mMQ com o peptdeo H>',4 # ## #? inCe<=o de .X 8 do peptdeo H>', na
concentra<=o , mM4 ( (( (? inCe<=o de ,6 8 H>', na concentra<=o 5W- M4

%anto na Figura 54X.# ;uanto na Figura 54X.( a concentra<=o do lipdeo na c)lula era 5V
mM com volume a igual a .+W,WW m8 Pvolume e@etivoQ4 Entretanto+ o*serva0se ;ue a intera<=o
depende da concentra<=o de H>',4
9a Figura 54X.# em ;ue a concentra<=o de H>', era , mM e o volume inCetado .X 8+ a
ra"=o '?8 variou de .?.+VW1 Pprimeira inCe<=oQ a .?61 PJltima inCe<=oQ com a entalpia de intera<=o
exot)rmica4 9a Figura 54X.(+ esta mesma ra"=o variou de .?V+515 a .?VVX+ com a concentra<=o
do peptdeo de 5W- M e inCe<Ges de ,6 8 e entalpia de intera<=o endot)rmica4 9a %a*ela 54.V
Pp4 .5XQ s=o mostrados os valores da varia<=o de entalpia de intera<=o o*tidos4
valor positivo para a varia<=o da entalpia+ ;uando a concentra<=o do peptdeo ) 5W-
M pode ser Custi@icada pela *aixa ra"=o '?84 # energia envolvida na dessolvata<=o do peptdeo )
maior do ;ue a energia de intera<=o e inser<=o do peptdeo na mem*rana+ n=o sendo+ neste caso+
entalpicamente @avor$vel P%a*ela 54.VQ4 processo endot)rmico ;ue se o*serva sugere um
processo de agrega<=o do peptdeo na super@cie da mem*rana4

%a*ela 54. %a*ela 54. %a*ela 54. %a*ela 54.V VV V4 44 4 Entalpia de intera<=o de H>', com ''C?''G 5?.Pmol?molQ
'eptdeo/carga 'eptdeo/carga 'eptdeo/carga 'eptdeo/carga Concentra<=o do peptdeo Concentra<=o do peptdeo Concentra<=o do peptdeo Concentra<=o do peptdeo
A
HPZ PZ PZ PZI II I/mol de peptdeoQ /mol de peptdeoQ /mol de peptdeoQ /mol de peptdeoQ
''C?''G P5?.Q ''C?''G P5?.Q ''C?''G P5?.Q ''C?''G P5?.Q
HSP2:-1 2 +< -52!14
HSP2:-1 40 < -12!2
De acordo com a %a*ela 54.V+ os valores das entalpias o*tidas indicam uma intera<=o
peptdeo/lipdeo entalpicamente @avor$vel4 9uma primeira aproxima<=o+ estes valores
representam a intera<=o eletrost$tica entre o peptdeo e o lipdeo negativo da mem*rana e tm a
magnitude dependente da carga do peptdeo H>',4
#s curvas de titula<=o o*tidas das experincias em ;ue o peptdeo est$ na c)lula e )
titulado com lipdeo s=o mostradas nas Figuras 54X,# e X,0(4
# ## #
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
-4
-2
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130
Tempo (min)
c
a
l
/
s
Razo molar
k
c
a
l
/
m
o
l

d
e

l
i
p
d
e
o

i
n
j
e
t
a
d
o

( (( (
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0
-2,0
-1,5
-1,0
-0,5
0,0
0,5
1,0
-10
-5
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100110120130
Tempo (min)
c
a
l
/
s
Razo molar
k
c
a
l
/
m
o
l

d
e

l
i
p
d
e
o

i
n
j
e
t
a
d
o

Figura 54X,4 Figura 54X,4 Figura 54X,4 Figura 54X,4 Curvas calorim)tricas da titula<=o do peptdeo H>', 1V- M com com
inCe<Ges de X 8 de lipossomas de ''C?''G P5?.+ mol?molQ P5V mMQ4 # ## #? %b ,V CR
( (( (? %b 5V C4
9os experimentos de titula<=o mostrados nas Figuras 54X, # e (+ a ra"=o '?8 variou de
.?-+, Pincio da titula<=oQ a .?X45 P@inal da titula<=oQ4 # ra"=o peptdeo/lipdeo ) *aixa ao longo de

toda a titula<=o+ veri@icando0se+ neste caso+ a satura<=o do lipossoma inCetado na c)lula de
titula<=o4 # este;uiometria da rea<=o PnQ+ calculada a partir da ra"=o molar no ponto de in@lex=o
da curva de titula<=o+ ) aproximadamente ,+V+ indicando ;ue cada mol)cula de peptdeo est$
envolvida por ,+V mol)culas de lipdeo no lipossoma4 L de se notar a in@luncia da temperatura
na intera<=o peptdeo0mem*rana4 %anto a ,V C PFigura 54X,a+ p4 .5XQ ;uanto a 5V ^C PFigura
54X,(+ p4 .5XQ+ a satura<=o ocorre com o mesmo nJmero de inCe<Ges+ C$ ;ue a concentra<=o do
peptdeo utili"ada em am*as as titula<Ges ) a mesma4 9o entanto+ o*serva0se uma mel!or
intera<=o na titula<=o e@etuada a 5V ^C tanto pelo @ormato da curva de titula<=o+ ;uanto pela
;uantidade de calor li*erada+ a ;ual @oi maior na titula<=o a 5V ^C4 Esta o*serva<=o pode ser
explicada pela maior @lexi*ilidade das ca*e<as e mo*ilidade das cadeias car*onadas na
temperatura de 5V ^C+ @acilitando a intera<=o e inser<=o do peptdeo na mem*rana4
valor da entalpia experimental A
cxp
E
0
+ ;ue neste caso representa a entalpia do
processo de intera<=o Pparti<=oQ+ ) o*tido pelo somat&rio dos calores q
+ de cada inCe<=o Pap&s

descontada a contri*ui<=o da dilui<=o no processo+ ;ue neste caso @oi o*tida como o valor m)dio
dos q
dos Jltimos picos+ tomados ;uando o valor de q
+ esta*ili"a num valor positivoQ dividido

pelo nJmero de mols de peptdeo total na c)lula (n
pcp
)+ de acordo com a E;ua<=o 54.+
apresentada a seguir?
AE
o
=
_ q
k=1
n
pcp

PE;454.Q PE;454.Q PE;454.Q PE;454.Q
# partir do c$lculo da varia<=o de entalpia pela e;ua<=o 545 e com o conCunto de
e;ua<Ges 54V e 54X PQuadro 54.+ p4 .52Q calcula0se a constante de parti<=o K
p
Pap&s a corre<=o dos
e@eitos eletrost$ticos+ ;ue a@etam a concentra<=o de peptdeo na mem*ranaQ4 Com o valor de
K
p
calculado @oram o*tidos os valores da varia<=o da energia livre PA0
0
Q e da varia<=o de
entropia AS
0
4 s valores destes parBmetros+ o*tidos para o peptdeo H>', s=o mostrados na
%a*ela 54.X Pp4 .W5Q4
processo de intera<=o do peptdeo H>', em lipossomas de ''C?''G @oi avaliado
considerando0se o e@eito glo*al Pcontri*ui<=o dos e@eitos !idro@&*icos e eletrost$ticos em
simultBneoQ re@letido no calor li*erado por inCe<=o Pprocesso de parti<=o simplesQ+ C$ ;ue tanto o
peptdeo ;uanto os lipossomas tm cargas4

# distri*ui<=o do peptdeo entre a @ase a;uosa e a @ase lipdica ) governada pela energia
de trans@erncia+ isto )+ pela varia<=o de energia de Gi**s PA0
0
Q na passagem de uma @ase para a
outra4 P[!ite \ [imleD+ .222R [ieprec!t \ >eelig+ ,--,R >eelig+ ,--WQ4 # exata locali"a<=o do
peptdeo na mem*rana ) in@luenciada @undamentalmente pela nature"a das interac<Ges
electrost$ticas+ polares e apolares ;ue se esta*elecem4
# varia<=o de energia de Gi**s PE;4 54,Q de todo o processo pode ser o*tida atrav)s do
coe@iciente de parti<=o+ K
p
?
A0 = A0
0
+RlnK
p

PE;4 54, PE;4 54, PE;4 54, PE;4 54,Q
9uma situa<=o de e;uil*rio+ onde A0 = uR tem0se a E;ua<=o 545 ent=o?
A0
0
= RlnK
p
ou A0
0
= RlnSSSK
p

PE;4 545 E;4 545 E;4 545 E;4 545Q
9a E;ua<=o 545 pode0se incluir o @actor VV4V ;ue representa a contri*ui<=o translacional
Pentr&picaQ das mol)culas de $gua para a energia livre do processo de parti<=o PHo@@man+ .26WR
Holt"er+ .22VQ4
# partir dos valores de A0+ o*t)m0se os valores de A S
0
+ pela E;ua<=o 54W?
A0
0
= AE
0
AS
0

PE;4 54W E;4 54W E;4 54W E;4 54WQ
# varia<=o da entalpia AE
0
+ relacionada com o processo de parti<=o+ pode ser calculada de acordo
com a E;ua<=o 54.+ a partir dos dados experimentais o*tidos por I%C P>eelig+ .226R [ieprec!t et
al4+ .222Q+

pcp
=
n
pcp
n
pcp

P54VQ P54VQ P54VQ P54VQ
pcp
= q
AE
0
n
pcp
/
k=1

P54XQ P54XQ P54XQ P54XQ
C
pcp,u
=
dI

n
pcp
I
ccI
(1
pcp
) P546Q P546Q P546Q P546Q
dI
=
I
ccI
(I
ccI
+iI
n]
)
P541Q P541Q P541Q P541Q
n
Ip
= I
n]
C
Ip
P542Q P542Q P542Q P542Q
b
=
n
pcp
n
Ip
P54.-Q P54.-Q P54.-Q P54.-Q
b
= K
p
C
pcp,u
P54..Q P54..Q P54..Q P54..Q

Quadro 54.4 Quadro 54.4 Quadro 54.4 Quadro 54.4 ConCunto de e;ua<Ges usadas no c$lculo de K
p
a partir dos dados experimentais de
titula<=o calorim)trica isot)rmica+ em ;ue q
) o calor envolvido em cada inCe<=o PC$ su*trado

do calor de dilui<=oQ e n
pcp
) o nJmero total de mols de peptdeo na c)lula do calormetro4
9o decurso da titula<=o+ a @ra<=o de peptdeo ligado+ H mem*rana+
pcp
) dada pela
E;ua<=o 54V do Quadro #+ onde n
pcp
) a ;uantidade+ em mols+ de peptdeo ligado ap&s a i

i

inCe<=o4 >e em cada inCe<=o temos uma ;uantidade de calor trocada+ q
+ pode0se com*inar as
E;ua<Ges 54.4 e 54V e expressar a @ra<=o ligada em @un<=o da entalpia do processo de intera<=o+
con@orme a e;ua<=o 54X4
# partir do valor de
pcp
pode0se estimar a ;uantidade de peptdeo ;ue permanece livre

na solu<=o a;uosa+ ap&s o e;uil*rio de parti<=o a ;ual pode ser calculada pela E;ua<=o 5464
# concentra<=o C
pcp,u
deve ser corrigida por um @actor de dilui<=o

dI
PE;ua<=o 541Q no
caso de se usar o V'0I%C+ por;ue o volume e@etivo da c)lula P.4W,WW m8Q mant)m0se+ mas !$
uma dilui<=o do peptdeo pela ;uantidade inCetada Pvolume esse ;ue ) expulso da c)lulaQ4
volume e@etivo da c)lula calorim)trica ) I
ccI
+ i ) o nJmero da inCe<=o e I
n]
) o volume inCetado4

p medida em ;ue a titula<=o prossegue+ a ;uantidade de lipdeo inCetada na c)lula
calorim)trica aumenta4 # ;uantidade de lipdeo+ n
Ip
+ presente na c)lula+ e a concentra<=o C

Ip
+
em mol+ do lipdeo na seringa na inCe<=o i s=o conta*ili"ados de acordo com a e;ua<=o 5424
'ode0se calcular a @ra<=o de parti<=o peptdeo/lipdeo+
b
+ da E;ua<=o 54.-+ pela ra"=o
entre a ;uantidade+ em mol+ de peptdeo ligado n
pcp
e a ;uantidade+ em mol+ de lipdeo n

Ip
+
ap&s cada inCe<=o4
>e a intera<=o do peptdeo com a mem*rana corresponder a um processo de parti<=o
simples Pem ;ue se considera ;ue o pepttdeo+ ou est$ na solu<=o+ ou est$ na mem*rana lipdicaQ+
a curva da @ra<=o de parti<=o
b
em @un<=o da concentra<=o do peptdeo em solu<=o a;uosa
C
pcp,u
deve ser linear e o declive desta curva @ornece o valor da constante de parti<=o+ K
p
+
con@orme a E;ua<=o 54.. P(reuEinE et al4+ ,---Q4 9este caso+ os e@eitos de carga Peletrost$ticosQ e
!idro@&*icos s=o considerados em conCunto4
# representa<=o gr$@ica da @ra<=o de peptdeo H>', ligada (
b
) H mem*rana mim)tica de
''C?''G em @un<=o da concentra<=o do peptdeo livre na @ase a;uosa+ (C
pcp,u
) )
apresentada nas Figuras 54X5 P# e (+ p4 .W,Q4 # Figura 54X5 # Pp4 .W,Q representa os dados o*tidos
na titula<=o calorim)trica isot)rmica a ,VgC e a Figura 54X5 ( Pp4 .W,Q representa os mesmos
dados+ o*tidos a 5VgC4 9a %a*ela 54.X Pp4 .W5Q est=o mostrados os valores dos parBmetros
termodinBmicos da intera<=o peptdeo/mem*rana+ o*tidos por I%C4
*serva0se uma rela<=o linear entre
b
e C
pcp,u
com um *om coe@iciente de correla<=o
nos dois casos4 s valores de K
p
P%a*ela 54.X+ p4 .W5Q o*tidos atrav)s das inclina<Ges das retas
tem valores semel!antes para o mesmo peptdeo+ tanto a ,VgC+ ;uanto a 5VgC4 Este resultado
sugere ;ue+ no processo de parti<=o !$ uma signi@icativa contri*ui<=o do e@eito !idro@&*ico e
;ue a intera<=o electrost$tica n=o ) dominante4 De @ato+ a carga nominal do peptdeo H>', ) d.
e este petdeo tem uma con@orma<=o *astante an@ip$tica PFiguras .42+ p4 .V e 54WX+ p4 .,6Q+ o ;ue
@acilita a sua inser<=o na mem*rana lipdica4
9os valores negativos encontrados para o AE
0
P%a*ela 54.X+ p4 .W5Q est=o somadas as
intera<Ges eletrost$sticas e !idro@&*icas do peptdeo H>', com os lipdeos da mem*rana4 Estes
valores tam*)m conta*ili"am as liga<Ges de H intramoleculares da estrutura em !)lice do
peptdeo @ormada no momento da intera<=o com a mem*rana4 # magnitude desta intera<=o @oi
in@luenciada pela temperatura+ C$ ;ue o maior valor AE
0
@oi o*tido a 5VgC4 Como descrito

anteriormente+ o aumento da temperatura aumenta a mo*ilidade das ca*e<as e das cadeias
car*onadas do lipdeo+ @acilitando a inser<=o do peptdeo4
Em rela<=o aos valores de S
0
o*serva0se na %a*ela 54.X+ p4 .W5+ ;ue os valores s=o
positivos+ indicando a contri*ui<=o da componente entr&pica no processo de parti<=o do
peptdeo para a mem*rana4 Esta o*serva<=o est$ de acordo com o processo de intera<=o e
inser<=o do peptdeo na mem*rana ;ue envolve algumas etapas? inicialmente o peptdeo )
atrado para a super@cie da mem*rana por e@eito eletrost$tico e esta intera<=o ) geralmente
dirigida pela entalpia4 Em seguida+ o peptdeo ;ue se encontrava desestruturado+ na @ase a;uosa+
estrutura0se em 0!)lice ou @ol!a0 Peste processo )+ geralmente+ entalpicamente @avor$velQ4

# ## #
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12
0
2000
4000
6000

X
b

/

m
M
.
m
o
l
-
1
C
pep,aq
/ mM

( (( (
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14
0
2000
4000
6000
8000
10000

X
b

/

m
M
.
m
o
l
-
1
C
pep, aq
/ mM

Figura 54X54 Figura 54X54 Figura 54X54 Figura 54X54 7epresenta<=o gr$@ica da @ra<=o ligada do peptdeo em @un<=o da
concentra<=o do peptdeo livre em @ase a;uosa para o H>', a 1V- M em mem*ranas
lipdicas de ''C?''G P5?.Q 5V mM4 # ## #? titula<=o a ,V gC R valor de 7
,
b -+22254 (? (? (? (? #?
titula<=o a 5V gC R valor de 7
,
b -+22124 s valores de K
p

@oram o*tidos a partir das
inclina<Ges das curvas4

%a*ela %a*ela %a*ela %a*ela 54.X 54.X 54.X 54.X4 44 4 Valores dos parBmetros termodinBmicos experimentais o*tidos por I%C para H>',
'eptdeo
Concentra<=o
do peptdeo
PMQ
Zp
AE
0

PEI/mol de
peptdeoQ
AS
0

PEI/mol de
peptdeoQ
A0
0

PEI/mol de
peptdeoQ
P'?8Q
H>', ,V C
1V-
P.?-+,0.?V+,Q
X+11x.-
W
0X+6X 5-+1- 056+VX
H>', 5V C
1V-
P.?-+,0.?V+,Q
X+2Wx.-
W
0.5+XW ,V+,- 051+XW

'or Jltimo+ o peptdeo insere0se no nJcleo !idro@&*ico da mem*rana e esta inser<=o pode
ser entalpicamente dirigida pelas liga<Ges de H e as interac<Ges de van der [aals @ormadas+ mas
tam*)m pode ser governada entropicamente por e@eito !idro@&*ico P>eelig+ .226R >eelig+ ,--WQ4 #
entropia do processo inclui a mudan<a con@ormacional do peptdeo e a perda de $gua da camada
de solvata<=o Paumento dos graus de li*erdade rotacional e translacional das mol)culas de $guaQ
durante a inser<=o4 Desta maneira o *alan<o entalpico e entr&pico do processo de intera<=o
peptdeo/mem*rana pode @avorecer a entropia4
# maior componente entr&pica (S
0
) na intera<=o com a mem*rana @oi veri@icada H
temperatura de ,V gC4 # di@eren<a encontrada ) Custi@icada pelo menor valor da entalpia+ em
rela<=o H temperatura de 5V gC4
s valores negativos da energia de Gi**s (0
0
) con@irmam ;ue o processo parti<=o )
energeticamente @avor$vel+ indicando ;ue o peptdeo particiona espontaneamente para a
mem*rana4

$. %oncluso
9o tra*al!o apresentado nesta tese+ @oram reali"ados experimentos de nature"as distintas
e complementares para elucidar aspectos estruturais e termodinBmicos de trs peptdeos
antimicro*ianos PDistinctina+ Hilaseptina ',+ a*reviada como H>',+ S80'!e
,
T0Fenilseptina e SD0
'!e
,
T0Fenilseptina+ a*reviados como 80'!es e D0'!es+ respectivamenteQ4 #s metodologias
empregadas @oram Dicrosmo Circular PCDQ+ 7M9 em solu<=o+ 7M9 em @ase s&lida e
Calorimetria de %itula<=o Isot)rmica PI%CQ e todas @orneceram in@orma<Ges valiosas e
complementares entre si para se entender de @orma mais completa as propriedades dessas
su*stBncias ;ue possi*ilitam o exerccio de suas atividades *iol&gicas ;ue+ no caso+ s=o atividades
antimicro*ianas4

4.1. Distinctina e Cadeias 1 e 2

Em rela<=o H distinctina+ os estudos de CD mostraram ;ue am*os os monAmeros
PCadeias . e ,Q estruturam0se em meios mim)ticos de mem*rana+ em*ora nen!uma estrutura<=o
signi@icativa possa ser identi@icada em $gua4 7esultado semel!ante @oi o*tido para o !eterodmero
distinctina+ ;ue se estrutura consideravelmente *em em meio vesicular4 Entretanto+ di@eren<as
@oram o*servadas ;uando se comparou o conteJdo de estruturas 0!)lice o*tido em
experimentos em ,+,+,0tri@luoretanol P%FEQ4 %ais resultados podem indicar ;ue a intera<=o do
!eterodmero com meios mim)ticos de mem*rana Pno caso+ vesculas @os@olipdicasQ em solu<=o
pode ser mel!or descrita como um e;uil*rio envolvendo mais de uma esp)cie termodinBmica+
devido H ausncia de um ponto isos*)sticos Pou isodicr&icoQ4 Em*ora os resultados de 7M9 em
@ase s&lida descritos em Magal!=es e cola*oradores em ,--2 mostrem ;ue a distinctina interage
com *icamadas @os@olipdicas com as cadeias orientadas ;uasi0paralelamente entre si+ esse estudo
n=o leva em conta o e;uil*rio termodinBmico dessa intera<=o e esse car$ter est$ re@letido nos
resultados o*tidos por CD4 conCunto de modelos o*tido a partir de dados de 7M9 em solu<=o
da distinctina em %FE re@lete de certa maneira esse dinamismo estrutural+ mostrando grande
varia*ilidade da orienta<=o de uma cadeia em rela<=o H outra4 #l)m disso+ n=o @oram o*servadas
correla<Ges 9E de longo alcance entre as duas cadeias4 Em*ora a ausncia dessas correla<Ges
n=o impli;ue necessariamente ;ue o peptdeo adote uma con@orma<=o com as cadeias

monom)ricas orientadas paralelamente entre si+ esses resultados evidenciam ;ue n=o !$
intera<Ges intercadeia su@icientemente @ortes para esta*ili"ar uma estrutura ;uatern$ria tal ;ual a
o*servada para a distinctina em $gua P7aimondo et al4+ ,--VQ4 Comportamento semel!ante @oi
o*servado para o peptdeo !omodim)rico Homotarsinina PVerlD+ ,-.-Q+ em ;ue espectros
o*tidos com a su*stBncia em $gua mostram correla<Ges intercadeia *em de@inidas ;ue re@letem
uma estrutura<=o do tipo coiled coil+ ou super0!)lice+ mas espectros deste peptdeo em D'C n=o
mostram tais 9Es intercadeia+ levando a um modelo cuCa orienta<=o das unidades
monom)ricas n=o ) *em de@inida4
'or @im+ os resultados de 7M9 em solu<=o da distinctina mostram ;ue a mel!or
estrat)gia a ser tomada para o estudo deste peptdeo em solu<=o seria utili"ar meios ;ue indu"am
a uma ordena<=o da sua mol)cula+ como+ por exemplo+ *icelas4 Dessa @orma+ seria possvel o*ter
valores de orienta<=o entre as cadeias levando em conta+ ainda+ o aspecto dinBmico da
con@orma<=o molecular ;uando em solu<=o4 Esses resultados aCudariam na descri<=o da
intera<=o peptdeo0mem*rana *acteriana+ especialmente se aliados aos dados estruturais pr)0
existentes4 9o momento da reda<=o deste tra*al!o+ est=o+ ainda+ em curso+ estudos
termodinBmicos por I%C da distinctina e de suas cadeias monom)ricas ;uando interagem com
lipossomas4 Estes estudos podem n=o s& @ornecer in@orma<Ges extremamente relevantes das
intera<Ges em si+ mas tam*)m da termodinBmica envolvida na mudan<a con@ormacional dos
peptdeos ;uando passam de um meio totalmente a;uoso para outro meio rico em @os@olipdeos4
#l)m disso+ seria possvel estudar o papel da liga<=o dissul@eto so*re a atividade antimicro*iana+
*em como a possvel sinergia entre as Cadeias . e , da distinctina no ;ue di" respeito H sua
atividade *actericida4
%odas estas o*serva<Ges mostram ;ue+ em*ora se ten!a in@orma<Ges de@inidas a respeito
das estrutura<Ges da distinctina e das Cadeias . e , em meios mim)ticos aos ;uais elas exercem
suas atividades *iol&gicas+ a elucida<=o do mecanismo relativo Hs suas propriedades
antimicro*ianas ainda necessita de diversos outros estudos+ e ) de importBncia signi@icativa para a
compreens=o da nature"a dessa nova classe de anti*i&ticos H ;ual pertencem os peptdeos
antimicro*ianos isolados da pele de anuros4

4.2. Hilseptina P2 (HSP2)

'ara este peptdeo+ os experimentos de CD mostraram ;ue+ em*ora o peptdeo seCa
maCoritariamente desestruturado em meio totalmente a;uoso+ ele apresenta conteJdo elevado
de 0!)lice ;uando se encontra em meio @os@olipdico4 Este tipo de comportamento+ como C$
comentado+ ) *astante comum em peptdeos antimicro*ianos+ especialmente com de !)lices
an@ip$ticas+ ;ue propiciam intera<Ges mais e@etivas com mem*ranas *acterianas4 De @ato+ os
resultados o*tidos por 7M9 na presen<a de %FE mostram ;ue o peptdeo tem maior propens=o
em adotar a @orma 0!elicoidal e ;ue esta estrutura ) *astante an@ip$tica+ o ;ue ) coerente tanto
com os resultados de CD ;uanto com as caractersticas estruturais de outros peptdeos
antimicro*ianos isolados da pele de anuros4 s estudos de 7M9 em @ase s&lida permitiram
determina<=o da orienta<=o mais prov$vel Porienta<=o VI+ Fig 54V5+ p4 .5,Q desse peptdeo no
meio de *icamada @os@olipdica e mostraram ;ue a estrutura<=o adotada por H>', tem papel
importante na intera<=o entre este peptdeo e @os@olipdeos4
s estudos por I%C @orneceram in@orma<Ges complementares a respeito da intera<=o
entre H>', e lipossomas+ podendo0se extrair conclusGes a respeito da este;uimetria dessa
intera<=o+ *em como os parBmetros termodinBmicos envolvidos4 Interessantemente+ os
resultados mostraram ;ue a e@ic$cia dessa intera<=o depende *astante da concentra<=o do
peptdeo+ ou mel!or+ da ra"=o peptdeo?lipdeo4 Em situa<Ges em ;ue essa ra"=o ) *aixa+ a
intera<=o n=o ) entalpicamente @avorecida e a an$lise desses dados parece sugerir ;ue a
capacidade de agrega<=o da H>', tem um papel signi@icativo no exerccio de sua atividade
*iol&gica4 utro dado interessante ;ue pAde ser extrado ) a respeito da nature"a dessa intera<=o
;ue ) maCoritariamente de nature"a !idro@&*ica+ considerando a an@ipaticidade da !)lice+ em*ora
intera<Ges de nature"a eletrost$ticas ten!am papel importante em uma intera<=o preliminar
entre a H>', e o lipossoma+ respons$vel pela aproxima<=o inicial do peptdeo ao meio
@os@olipdico4
#grupando0se os resultados o*tidos para a H>',+ pode0se c!egar a uma imagem mais
geral a respeito da maneira pela ;ual o peptdeo interage com a mem*rana4 # presen<a de
resduos carregados positivamente em meio @isiol&gico+ como a lisina+ na se;uncia de
amino$cidos de H>', teria papel @undamental na aproxima<=o inicial do peptdeo com a
mem*rana *acteriana+ por)m+ ap&s essa aproxima<=o inicial+ a intera<=o seria mantida por
@atores relativos H !idro@o*icidade e relacionados diretamente H @ace !idro@&*ica da !)lice4 Essas

o*serva<Ges s=o *astante coerentes tanto com os resultados de 7M9 em solu<=o+ ;ue mostrou
uma estrutura<=o em 0!)lice an@ip$tica+ ;uanto com a topologia da orienta<=o determinada por
7M9 em @ase s&lida+ ;ue mostra ;ue o modelo o*tido experimentalmente pode ser utili"ado
com sucesso para descrever a rela<=o estrutura0atividade dessa su*stBncia4
#pesar de algumas caractersticas ;ue podem levar H atividade antimicro*iana de H>',
terem sido elucidadas por estes experimentos+ o estudo do mecanismo pelo ;ual se d$ essa
atividade ainda est$ no incio4 'rimeiramente+ deve0se levar em conta ;ue os experimentos de
7M9 em solu<=o @oram reali"ados com o peptdeo na presen<a de %FE4 Em*ora os resultados
o*tidos nesse meio possam ser a princpio utili"ados para explicar estrutura<Ges em mem*ranas+
a utili"a<=o de resultados o*tidos com o peptdeo na presen<a de micelas de D'C pode @ornecer
modelos mais precisos para serem su*metidos Hs restri<Ges orientacionais o*tidas por estudos de
7M9 em @ase s&lida e+ por @im construir0se uma imagem mais completa da intera<=o do peptdeo
com a mem*rana4 # utili"a<=o de meios ;ue n=o seCam o %FE ) importante pelo @ato de se ter
uma mel!or no<=o da presen<a ou ausncia de uma estrutura<=o de@inida nas extremidades da
cadeia polipeptdica+ *em como da nature"a dessa estrutura+ uma ve" ;ue este solvente pode de
certa maneira @or<ar a estrutura<=o em 0!)lice dessas extremidades ;uando+ em meio
@isiol&gico+ elas n=o possuam tal con@orma<=o4 # determina<=o mais precisa da geometria dessas
termina<Ges ) importante devido ao @ato de elas muitas ve"es interagirem com o interior
!idro@&*ico das mem*ranas+ agindo como se @ossem NBncorasO e potenciali"ando a capacidade de
intera<=o do peptdeo4 9o entanto+ pode0se considerar ;ue os resultados o*tidos em %FE
@ornecem in@orma<Ges extremamente relevantes a respeito do papel da estrutura secund$ria em
;uest=o P;ue @oi o*servada nos experimentos de CDQ na atividade *iol&gica da H>',4 9o
momento da escrita dessa conclus=o+ os experimentos em D'C C$ !aviam sido reali"ados+ mas
ainda n=o analisados e atri*udos4

4.3. [L-Phe
2
]-Fenilseptina (L-Phes) e [D-Phe
2
]-Fenilseptina (D-
Phes)

s resultados o*tidos para as @enilseptinas permitiram n=o s& c!egar a conclusGes a
respeito de alguns aspectos envolvidos em seus mecanismos de a<=o+ mas tam*)m analisar a
in@luncia de uma epimeri"a<=o perto de uma das extremidades da cadeia peptdica so*re a

estrutura e intera<=o com @os@olipdeos4 7esultados o*tidos por 7M9 em solu<=o mostraram ;ue
am*os os peptdeos adotam estruturas ricas em 0!)lice+ mas exceto por uma estrutura<=o
ligeiramente maior da D0'!es+ n=o @oram o*servadas di@eren<as signi@icativas entre os modelos
para cada peptdeo4 s resultados de 7M9 em @ase s&lida+ no entanto+ mostram ;ue !$ di@eren<a
consider$vel na orienta<=o desses peptdeos ;uando de suas intera<Ges com *icamadas
@os@olipdicas4 #plicando0se as restri<Ges orientacionais so*re os modelos o*tidos por 7M9 em
solu<=o na presen<a de micelas de D'C+ pAde0se o*servar ;ue+ em*ora am*as as estruturas
satis@a<am o crit)rio de ;ue a @ace !idro@&*ica de suas !)lices an@ip$ticas interaCa com o interior
ali@$tico da *icamada+ a inser<=o da extremidade 90terminal da D0'!es+ ;ue apresenta o motivo
'!e0'!e0'!e caracterstico das @enilseptinas+ ) maior+ sugerindo um mel!or ancoramento do
peptdeo na *icamada lipdica4 Esse mel!or ancoramento seria devido ao @ato de o segundo
resduo de '!e ser o estereoisAmero D e ) *astante coerente com o @ato de a D0'!es apresentar
maior atividade antimicro*iana ;ue seu epmero+ a 80'!es+ sugerindo tam*)m+ um mel!or
empil!amento arom$tico na D0'!es ;ue na 80'!es
Futuramente+ seria interessante desco*rir aspectos adicionais relativos a essa intera<=o
di@erenciada a partir de experimentos como I%C e simula<Ges de DinBmica Molecular+ ;ue
podem @ornecer in@orma<Ges complementares em rela<=o H termodinBmica da intera<=o e
tam*)m detal!es a nvel atAmico e a varia<=o temporal de certas propriedades4 Entretanto+ os
resultados de 7M9 puderam com sucesso conciliar as caractersticas estruturais de am*os os
peptdeos com os dados de atividade *iol&gica existentes4

4.4. Consideraes Finais

Com *ase no arsenal de m)todos existentes para o estudo estrutural e termodinBmico dos
peptdeos+ @oi possvel elucidar alguns aspectos a respeito da estrutura<=o e atividade *iol&gica
dessas su*stBncias4 # determina<=o geom)trica de peptdeos antimicro*ianos tem se mostrado
*astante importante no entendimento de suas respectivas atividades *iol&gicas4 Entretanto+ )
cada ve" mais necess$rio o uso de outras t)cnicas para se construir um mel!or modelo de
mecanismo de atividade para as su*stBncias ;ue apresentem grande potencial de aplica<=o
@armacol&gica4 # utili"a<=o de 7M9 no estado s&lido de amostras orientadas+ em especial+ pode
@ornecer resultados extremamente importantes em rela<=o H maneira pela ;ual essa intera<=o

ocorre e ;ue di@icilmente poderia ser o*tida experimentalmente por outra t)cnica4 Em*ora ainda
!aCa certas limita<Ges no ;ue tange a 7M9+ sua utili"a<=o tem0se mostrado @undamental para a
compreens=o de diversos aspectos relativos a peptdeos e protenas no geral4 Essa capacidade da
7M9 ) ainda mais potenciali"ada ;uando utili"ada em conCunto com outras t)cnicas como I%C+
;ue @ornece in@orma<Ges termodinBmicas+ as ;uais aliadas Hs in@orma<Ges estruturais permitem a
constru<=o de modelos mais precisos e completos so*re a atividade *iol&gica dessas su*stBncias4

&. Re'er(ncias )ibliogr'icas

#isen*reD+ C4 \ (4 (ec!inger P,--WQ4 q%ilt and rotational pitc! angle o@ mem*rane0inserted
polDpeptides @rom com*ined .V9 and ,H solid0state 9M7 spectroscopD4q (ioc!emistrD W5 W5 W5 W5P5,Q?
.-V-,0.-V.,4
#isen*reD+ C4+ '4 (ertani+ et al4 P,-.-Q4 q>olid0state 9M7 investigations o@ mem*rane0associated
antimicro*ial peptides4q Met!ods Mol (iol X.1 X.1 X.1 X.1? ,-20,554
#rseniev+ #4 >4+ V4 I4 ZondaEov+ et al4 P.21WQ4 q9M7 solution spatial structure o@ rs!ortr scorpion
insectotoxin IV#4q FE(> 8ett .XV .XV .XV .XV4
(atista+ C4 V4+ 84 74 da >ilva+ et al4 P.222Q4 q#ntimicro*ial peptides @rom t!e (ra"ilian @rog
'!Dllomedusa distincta4q 'eptides ,- ,- ,- ,-PXQ? X620X1X4
(atista+ C4 V4+ #4 >caloni+ et al4 P,--.Q4 q# novel !eterodimeric antimicro*ial peptide @rom t!e
tree0@rog '!Dllomedusa distincta4q FE(> 8ett W2W W2W W2W W2WP.0,Q? 1V0124
(ec!inger+ (4 P.22XQ4 q%oFards mem*rane protein design? pH0sensitive topologD o@ !istidine0
containing polDpeptides4q I Mol (iol ,X5 ,X5 ,X5 ,X5PVQ? 6X1066V4
(ec!inger+ (4 P.222Q4 q%!e structure+ dDnamics and orientation o@ antimicro*ial peptides in
mem*ranes *D multidimensional solid0state 9M7 spectroscopD4q (ioc!im (iop!Ds #cta .WX, .WX, .WX, .WX,P.0
,Q? .V60.154
(ec!inger+ (4+ 74 Zinder+ et al4 P.222Q4 q'eptide structural analDsis *D solid0state 9M7
spectroscopD4q (iopolDmers V. V. V. V.P5Q? .6W0.2-4
(ec!inger+ (4 \ I4 >eelig P.22.Q4 qCon@ormational c!anges o@ t!e p!osp!atidDlc!oline !eadgroup
due to mem*rane de!Ddration4 # ,H09M7 studD4q C!em '!Ds 8ipids V1 V1 V1 V1P.0,Q? .0V4
(evins+ C4 84 \ M4 :aslo@@ P.22-Q4 q'eptides @rom @rog sEin4q #nnu 7ev (ioc!em V2 V2 V2 V2? 52V0W.W4
(ier*raum+ G4 \ H40G4 >a!l P.21VQ4 qInduction o@ autolDsis o@ >tap!Dlocci *D t!e *asic peptide
anti*iotic pepV and nisin and t!eir in@luence on t!e activitD o@ autolDtic en"Dmes4q #rc!
Micro*iol .W. .W. .W. .W.4
(loc! Ir4+ (4 P,-..Q %ransmiss=o oral4

(oman+ H4 G4 P.22VQ4 q'eptide anti*iotics and t!eir role in innate immunitD4q #nnu 7ev
Immunol .5 .5 .5 .5? X.02,4
(raun+ [4+ C4 (osc!+ et al4 P.21.Q4 qCom*ined use o@ proton0proton ver!auser en!ancements
and a distance geometrD algorit!m @or determination o@ polDpeptide con@ormations4 #pplication
to micelle0*ound glucagon4q (ioc!im (iop!Ds #cta XX6 XX6 XX6 XX6P,Q? 566052X4
(raun+ [4 \ 94 Go P.21VQ4 qCalculation o@ protein con@ormations *D proton0proton distance
constraints4 # neF e@@icient algorit!m4q I Mol (iol .1X .1X .1X .1XP5Q? X..0X,X4
(reuEinE+ E4+ '4 Gan"+ et al4 P,---Q4 q(inding o@ nisin : to *ilaDer vesicles as determined Fit!
isot!ermal titration calorimetrD4q (ioc!emistrD 52 52 52 52P55Q? .-,W60.-,VW4
(runger+ #4 %4+ '4 D4 #dams+ et al4 P.226Q4 q9eF applications o@ simulated annealing in `0raD
crDstallograp!D and solution 9M74q >tructure V VV VP5Q? 5,V055X4
(runger+ #4 %4+ #4 ZruEoFsEi+ et al4 P.22-Q4 q>loF0cooling protocols @or crDstallograp!ic
re@inement *D simulated annealing4q #cta CrDstallogr # WX P 't 6Q WX P 't 6Q WX P 't 6Q WX P 't 6Q? V1V0V254
Cantor+ C4 74 %4+ >494 P.21,Q4 ptical >pectroscopD o@ 'roteins4 %!e 'roteins4 H4 94 74 H4
Editors4 9eF UorE+ #cademic 'ress4 V? V? V? V? .WV05-X4
Cavanag!+ I4+ [4 I4 Fair*ort!er+ et al4 P,--XQ4 'rotein 9M7 >pectroscopD? 'rinciples and 'ractice4
x@ord+ Elsevier #cademic 'ress4
Cavanag!+ I4+ [4 I4 Fair*rot!er+ et al4 P,--XQ4 'rotein 9M7 >pectroscopD+ >econd Edition?
'rinciples and 'ractice4 9eF UorE+ #cademic 'ress4
C!an+ [4 C4 \ '4 D4 [!ite P,---Q4 Fmoc >olid '!ase 'eptide >Dnt!esis4 # 'ractical #pproac!4
x@ord+ x@ord UniversitD 'ress4
C!an+ [4 C4 [4+ '4D4 P,---Q4 Fmoc solid p!ase peptide sDnt!esis? a practical approac!4 x@ord+
UZ+ x@ord UniversitD 'ress4
Clore+ G4 M4 \ #4 M4 Gronen*orn P.22.Q4 q%Fo0+ t!ree0+ and @our0dimensional 9M7 met!ods
@or o*taining larger and more precise t!ree0dimensional structures o@ proteins in solution4q #nnu
7ev (iop!Ds (iop!Ds C!em ,- ,- ,- ,-? ,20X54

Clore+ G4 M4+ M4 9ilges+ et al4 P.21XQ4 q%!e t!ree0dimensional structure o@ alp!a.0purot!ionin in
solution? com*ined use o@ nuclear magnetic resonance+ distance geometrD and restrained
molecular dDnamics4q EM( I V VV VP.-Q? ,6,20,65V4
Clore+ G4 M4+ M4 74 >taric!+ et al4 P.222Q4 qImpact o@ 7esidual Dipolar Couplings on t!e #ccuracD
o@ 9M7 >tructures Determined @rom a Minimal 9um*er o@ 9E 7estraints4q I #m C!em >oc
.,. .,. .,. .,.4
Cordier+ F4 \ >4 Gr"esieE P.222Q4 qDirect o*servation o@ !Ddrogen *onds in proteins *D
interresidue 5!I9Cr scalar couplings4q I #m C!em >oc .,. .,. .,. .,.? .X-.0.X-,4
Cordier+ F4+ M4 7ogoFsEi+ et al4 P.222Q4 q*servation o@ t!roug!0!Ddrogen0*ond ,!IHCr in a
perdeuterated protein4q I Magn 7eson .W- .W- .W- .W-P,Q? V.-0V.,4
Cornilescu+ G4+ F4 Delaglio+ et al4 P.222Q4 q'rotein *acE*one angle restraints @rom searc!ing a
data*ase @or c!emical s!i@t and se;uence !omologD4q I (iomol 9M7 .5 .5 .5 .5P5Q? ,1205-,4
Cross+ %4 #4 P.226Q4 q>olid0state nuclear magnetic resonance c!aracteri"ation o@ gramicidin
c!annel structure4q Met!ods En"Dmol ,12 ,12 ,12 ,12? X6,0X2X4
Csordas+ #4 \ H4 Mic!l P.26-Q4 q%!e isolation o@ *om*inin4q Monats!e@te @ar C!emie .-. .-. .-. .-.4
de Magal!=es+ M4 %4 Q4 '4+ M4V4R VerlD+ 74M4R Mun!o"+ V4H44R (ar*osa+ E4#4R >ilva+ 84'4R de
#rauCo+ I4E4R (loc! Ir+ C4 P,-.,Q4 q'!enDlseptin? 'eptides Fit! structural diversitD and neF
*iological insig!ts4q #rtigo su*metido4
Delaglio+ F4+ >4 Gr"esieE+ et al4 P.22VQ4 q9M7'ipe? a multidimensional spectral processing sDstem
*ased on U9I` pipes4q I (iomol 9M7 X XX XP5Q? ,660,254
Delaglio+ F4+ :4 [u+ et al4 P,--.Q4 qMeasurement o@ !omonuclear proton couplings @rom regular
,D C>U spectra4q I Magn 7eson .W2 .W2 .W2 .W2P,Q? ,6X0,1.4
Duer+ M4 I4 P,--WQ4 Introduction ro >olid0>tate 9M7 >pectroscopD4 x@ord+ UZ+ (lacEFell
'u*lis!ing 8td4
Fletc!er+ D4 M4+ D4 94 M4 Iones+ et al4 P.22XQ4 q%reatement o@ 9E constraints involving
e;uivalent or nonstereoassigned protons in calculations o@ *iomolecular structures4q I (iomol
9M7 1 11 1? ,2,05.-4

Gil+ V4 M4 >4 G4+ C4F4G4C4 P.216Q4 7essonBncia Magn)tica 9uclear 0 Fundamentos+ M)todos e
#plica<Ges4 Coim*ra+ 'ortugal+ Funda<=o Calouste Gul*enEian4
Griesinger+ C4+ 4 [4 >orensen+ et al4 P.21VQ4 q%Fo0dimensional correlation o@ connected 9M7
transitions4q I #m C!em >oc .-6 .-6 .-6 .-64
Guntert+ '4 P.221Q4 q>tructure calculation o@ *iological macromolecules @rom 9M7 data4q Q 7ev
(iop!Ds 5. 5. 5. 5.P,Q? .WV0,564
Gantert+ '4 P.221Q4 q>tructure calculation o@ *iological macromolecules @rom 9M7 data4q
QuarterlD 7evieFs o@ (iop!Dsics 5. 5. 5. 5.? .WV0,564
Guntert+ '4+ [4 (raun+ et al4 P.22.Q4 qE@@icient computation o@ t!ree0dimensional protein
structures in solution @rom nuclear magnetic resonance data using t!e program DI#9# and t!e
supporting programs C#8I(#+ H#(#> and G8M>#4q I Mol (iol ,.6 ,.6 ,.6 ,.6P5Q? V.60V5-4
Havel+ %4 F4 \ Z4 [at!ric! P.21WQ4 q# distance geometrD program @or determining t!e structures
o@ small proteins and ot!er macromolecules @rom nuclear magnetic resonance measurements o@
intramolecular
.
H0
.
H proximities in solution4q (ull Mat! (iol WX WX WX WX4
Ho@@man+ #4 >4 P.26WQ4 q'rinciples governing *iomolecule interactions at @oreign inter@aces4q
Iournal o@ (iomedical Materials 7esearc! 1 11 1P5Q? 660154
Ho@@mann+ [4+ Z4 7ic!ter+ et al4 P.215Q4 q# novel peptide designated 'U8a and its precursor as
predicted @rom cloned m79# o@ `enopus laevis sEin4q EM( I , ,, ,PVQ? 6..06.W4
Holt"er+ #4 P.22VQ4 q%!e cratic correction and related @allacies4q (iopolDmers 5V 5V 5V 5VPXQ? V2V0X-,4
Hoo@t+ 74 [4+ C4 >ander+ et al4 P.226Q4 q*CectivelD Cudging t!e ;ualitD o@ a protein structure @rom
a 7amac!andran plot4q Comput #ppl (iosci .5 .5 .5 .5PWQ? W,V0W5-4
Huang+ H4 [4 P,---Q4 q#ction o@ antimicro*ial peptides? tFo0state model4q (ioc!emistrD 52 52 52 52?
15W6_15V,4
Is!i*as!i+ 94 Z4+ %4R C!ino+ M4R FuEui+ H4R >!inoda+ I4R ZiEuc!i+ E4R Eai+ H4R FuEui+ >4 P.211Q4
q7ole o@ t!e HDdrop!o*ic #mino #cid 7esidue in t!e (itterness o@ 'eptides4q #gricultural and
(iological C!emistrD V, V, V, V,P.Q? 2.02W4
Iaco*son+ (4+ [4 #4 #nderson+ et al4 P.2VWQ4 q# 'roton Magnetic 7esonance >tudD o@ t!e
HDdration o@ DeoxDri*onucleic #cid4q 9ature .65 .65 .65 .654

Io!nson+ (4 #4 (4+ 74#4 P.22WQ4 q9M7 VieF? # computer program @or t!e visuali"ation and
analDsis o@ 9M7 data q I (iomol 9M7 W WW W? X-50X.W4
Zaiser+ E4+ 74 84 Colescott+ et al4 P.26-Q4 qColor test @or detection o@ @ree terminal amino groups in
t!e solid0p!ase sDnt!esis o@ peptides4q #nal (ioc!em 5W 5W 5W 5WP,Q? V2V0V214
Zarplus+ M4 P.2V2Q4 qContact Electron0>pin Coupling o@ 9uclear Magnetic Moments4q I C!em
'!Ds 5- 5- 5- 5-? ..0.V4
Zetc!em+ 74 74+ [4 Hu+ et al4 P.22WQ4 q>tructure and dDnamics @rom solid state 9M7
spectroscopD4q >tructure , ,, ,P1Q? X2206-.4
Zim+ H4 4 840C4+ E4C4 P,--XQ4 qQuantitative >tructure#ctivitD 7elations!ip >tudD o@ (itter
'eptides4q I #gric Food C!em VW VW VW VW? .-.-,0.-...4
Zline+ #4 D4+ [4 (raun+ et al4 P.21XQ4 q>tudies *D .H nuclear magnetic resonance and distance
geometrD o@ t!e solution con@ormation o@ t!e alp!a0amDlase in!i*itor tendamistat4q I Mol (iol
.12 .12 .12 .12P,Q? 566051,4
Zonrat+ 74+ M4 %ollinger+ et al4 P.222Q4 q9M7 tec!ni;ues to studD !Ddrogen *onding in a;ueous
solution4q Monats!e@te @ar C!emie .5- .5- .5- .5-4
Zoradi+ 74+ M4 (illeter+ et al4 P.22XQ4 qM8M8? a program @or displaD and analDsis o@
macromolecular structures4q I Mol Grap! .W .W .W .WP.Q? V.0VV+ ,205,4
Zragol+ G4+ >4 8ovas+ et al4 P,--.Q4 q%!e anti*acterial peptide pDrr!ocoricin in!i*its t!e #%'ase
actions o@ DnaZ and prevents c!aperone0assisted protein @olding4q (ioc!emistrD W- W- W- W-P.-Q? 5-.X0
5-,X4
8asEoFsEi+ 74 #4+ I4 #4 7ullmannn+ et al4 P.22XQ4 q#QU# and '7CHECZ09M7? programs @or
c!ecEing t!e ;ualitD o@ protein structures solved *D 9M74q I (iomol 9M7 1 11 1PWQ? W660W1X4
8aFs+ D4 D4+ H4 M4 (itter+ et al4 P,--,Q4 q>olid0state 9M7 spectroscopic met!ods in c!emistrD4q
#ngeF C!em Int Ed Engl W. W. W. W.P.6Q? 5-2X05.,24
8elC+ F4 %4+ %4R %emussi+ '4#4R %oniolo+ C4R P.21-Q4 qInteraction o@ alp!a080aspartDl0D0
p!enDlalanine met!Dl ester Fit! t!e receptor site o@ t!e *itter taste4q Farmaco >ci4 5V 5V 5V 5V? 211022X4
8inge+ I4 '4+ M4 Ha*ecE+ et al4 P,--5Q4 q#7I#? automated 9E assignment and 9M7 structure
calculation4q (ioin@ormatics .2 .2 .2 .2P,Q? 5.V05.X4

8inge+ I4 '4+ M4 #4 [illiams+ et al4 P,--5Q4 q7e@inement o@ protein structures in explicit solvent4q
'roteins V- V- V- V-P5Q? W2X0V-X4
8ipsit"+ 74 >4 \ 94 %Candra P,--WQ4 q7esidual dipolar couplings in 9M7 structure analDsis4q #nnu
7ev (iop!Ds (iomol >truct 55 55 55 55? 5160W.54
Mac#rt!ur+ M4 [4 \ I4 M4 %!ornton P.22XQ4 qDeviations @rom planaritD o@ t!e peptide *ond in
peptides and proteins4q I Mol (iol ,XW ,XW ,XW ,XWPVQ? ..1-0..2V4
Mae!as!i+ Z4 H4+ 84 P,--2Q4 q(itter peptides and *itter taste receptors q Cell Mol 8i@e >ci XX XX XX XX? .XX.0
.X6.4
MarEleD+ I4 84+ #4 (ax+ et al4 P.221Q4 q7ecommendations @or t!e presentation o@ 9M7 structures o@
proteins and nucleic acids4 IU'#C0IU(M(0IU'#( Inter0Union %asE Group on t!e
>tandardi"ation o@ Data (ases o@ 'rotein and 9ucleic #cid >tructures Determined *D 9M7
>pectroscopD4q I (iomol 9M7 ., ., ., .,P.Q? .0,54
Matsu"aEi+ Z4 P.222Q4 q[!D and !oF are peptide0lipid interactions utili"ed @or sel@0de@enses
Magainins and tac!Dplesins as arc!etDpes4q (ioc!im4 (iop!Ds4 #cta .WX, .WX, .WX, .WX,? .0.-4
Matsu"aEi+ Z4 P.222Q4 q[!D and !oF are peptide0lipid interactions utili"ed @or sel@0de@enses
Magainins and tac!Dplesins as arc!etDpes4q (ioc!im (iop!Ds #cta .WX, .WX, .WX, .WX,P.0,Q? .0.-4
Moraes+ C4 M4 \ (4 (ec!inger P,--WQ4 q'eptide0related alterations o@ mem*rane0associated Fater?
deuterium solid0state 9M7 investigations o@ p!osp!atidDlc!oline mem*ranes at di@@erent
!Ddration levels4q Magn 7eson C!em W, W, W, W,P,Q? .VV0.X.4
Morris+ #4 84+ M4 [4 Mac#rt!ur+ et al4 P.22,Q4 q>tereoc!emical ;ualitD o@ protein structure
coordinates4q 'roteins ., ., ., .,PWQ? 5WV05XW4
MuCee*+ #4+ 94 (4 UlDanov+ et al4+ Eds4 P.222Q4 Con@ormational Ensem*le Calculatios? #nalDsis o@
'rotein and 9ucleic #cid 9M7 Data4 (iological Magnetic 7esonance4 9eF UorE+ ZluFer
#cademics/'lenum 'u*lis!ers4
Munster+ C4+ #4 >paar+ et al4 P,--,Q4 qMagainin , in p!osp!olipid *ilaDers? peptide orientation and
lipid c!ain ordering studied *D `0raD di@@raction4q (ioc!im (iop!Ds #cta .VX, .VX, .VX, .VX,P.0,Q? 560WW4
9a*uurs+ >4 (4+ E4 Zrieger+ et al4 P,--VQ4 qDe@inition o@ a neF in@ormation0*ased per0residue
;ualitD parameter4q I (iomol 9M7 55 55 55 55P,Q? .,50.5W4

9a*uurs+ >4 (4+ C4 #4 >pronE+ et al4 P,--5Q4 qQuantitative evaluation o@ experimental 9M7
restraints4q I #m C!em >oc .,V .,V .,V .,VP52Q? .,-,X0.,-5W4
9a*uurs+ >4 (4+ C4 #4 >pronE+ et al4 P,--WQ4 qConcepts and tools @or 9M7 restraint analDsis and
validation4q Concepts in Magnetic 7esonance ,,# ,,# ,,# ,,#P,Q? 2-0.-V4
9eF+ 74 74 C4 P.22-Q4 8iposomes? # practical approac!4 9eF UorE+ x@ord UniversitD 'ress4
9ilges+ M4+ Ed4 P,--.Q4 #pplications o@ Molecular Modeling in 9M7 >tructure Determination4
Computational (ioc!emistrD and (iop!Dsics4 9eF UorE+ M4 DeEEer+ Inc4
9ilges+ M4+ G4 M4 Clore+ et al4 P.211Q4 qDetermination o@ t!ree0dimensional structures o@ proteins
@rom interproton distance data *D dDnamical simulated annealing @rom a random arraD o@ atoms4
Circumventing pro*lems associated Fit! @olding4q FE(> 8ett ,52 ,52 ,52 ,52P.Q? .,20.5X4
tagiri+ Z4 94+ U4R >!inoda+ I4R FuEui+ H4R Eai+ H4 P.21VQ4 q>tudies on a model o@ *itter peptides
including arginine+ proline and p!enDlalanine residues4 I4 (itter taste o@ di0 and tripeptides+ and
*itterness increase o@ t!e model peptides *D extension o@ t!e peptide c!ain4q #gricultural and
(iological C!emistrD W2 W2 W2 W2? .-.20.-,X4
'apo+ 94 >4+ U4 P,--VQ4 qHost de@ense peptides as neF Feapons in cancer treatment4q Cell4 Mol4
8i@e >ci X, X, X, X,? 61W062-4
'ere"+ C4 #4 H4+ 84R 7ong+ M4R Zo"aE+ I4#4R 'reuss+ #4Z4R :!ang+ H4R Max+ M4R MargolsEee+ 74F4
P,--,Q4 q# transient receptor potential c!annel expressed in taste receptor cells4q 9ature
9euroscience V VV V? ..X20..6X4
'@lugrat!+ I4 [4+ G4 [iegand+ et al4 P.21XQ4 qCrDstal structure determination+ re@inement and t!e
molecular model o@ t!e alp!a0amDlase in!i*itor Hoe0WX6#4q I Mol (iol .12 .12 .12 .12P,Q? 515051X4
7aimondo+ D4+ G4 #ndreotti+ et al4 P,--VQ4 q# @olding0dependent mec!anism o@ antimicro*ial
peptide resistance to degradation unveiled *D solution structure o@ distinctin4q 'roc 9atl #cad >ci
U > # .-, .-, .-, .-,P.1Q? X5-20X5.W4
7amac!andran+ G4 94+ C4 7amaEris!nan+ et al4 P.2X5Q4 q>tereoc!emistrD o@ polDpeptide c!ain
con@igurations4q I Mol (iol 6 66 6? 2V0224

7esende+ I4 M4+ C4 M4 Moraes+ et al4 P,--2Q4 qMem*rane structure and con@ormational c!anges o@
t!e anti*iotic !eterodimeric peptide distinctin *D solid0state 9M7 spectroscopD4q 'roc 9atl #cad
>ci U > # .-X .-X .-X .-XP52Q? .XX520.XXWW4
7ice+ 84 M4 \ #4 %4 (runger P.22WQ4 q%orsion angle dDnamics? reduced varia*le con@ormational
sampling en!ances crDstallograp!ic structure re@inement4q 'roteins .2 .2 .2 .2PWQ? ,660,2-4
7ossler+ '4 Z4+ C4R Freitag+ I4R 9oe+ I4R (reer+ H4 P.221Q4 qIdenti@ication o@ a p!osp!olipase C *eta
su*tDpe in rat taste cells4q Eur I Cell (iol 66 66 66 66? ,V50,X.4
>aunders+ M4+ #4 [is!na+ et al4 P.2V6Q4 q%!e 9uclear Magnetic 7esonance o@ 7i*onuclease .4q I
#m C!em >oc 62 62 62 624
>c!Fieters+ C4 D4+ I4 I4 Zus"eFsEi+ et al4 P,--5Q4 q%!e `plor09IH 9M7 molecular structure
determination pacEage4q I Magn 7eson .X- .X- .X- .X-P.Q? XV0654
>eelig+ I4 P.266Q4 qDeuterium magnetic resonance? t!eorD and application to lipid mem*ranes4q Q
7ev (iop!Ds .- .- .- .-P5Q? 5V50W.14
>eelig+ I4 P.226Q4 q%itration calorimetrD o@ lipid0peptide interactions4q (ioc!im (iop!Ds #cta
.55. .55. .55. .55.P.Q? .-50..X4
>eelig+ I4 P.226Q4 q%itration calorimetrD o@ lipid_peptide interactions q (ioc!imica et (iop!Dsica
#cta P((#Q 0 7evieFs on (iomem*ranes .55. .55. .55. .55.P.Q? .-50..X
>eelig+ I4 P,--WQ4 q%!ermodDnamics o@ lipid0peptide interactions4q (ioc!imica et (iop!Dsica #cta
P((#Q 0 (iomem*ranes .XXX .XXX .XXX .XXXP.0,Q? W-0V-4
>eelig+ I4 P,--WQ4 q%!ermodDnamics o@ lipid_peptide interactions4q (ioc!imica et (iop!Dsica #cta
P((#Q 0 (iomem*ranes .XXX .XXX .XXX .XXXP.0,Q? W-0V-4
>!ai+ U4 P.222Q4 qMec!anism o@ t!e *inding+ insertion and desta*ili"ation o@ p!osp!olipid *ilaDer
mem*ranes *D alp!a0!elical antimicro*ial and cell non0selective mem*rane0lDtic peptides4q
(ioc!im4 (iop!Ds4 #cta .WX, .WX, .WX, .WX,? VV06-4
>!ai+ U4 P.222Q4 qMec!anism o@ t!e *inding+ insertion and desta*ili"ation o@ p!osp!olipid *ilaDer
mem*ranes *D alp!a0!elical antimicro*ial and cell non0selective mem*rane0lDtic peptides4q
(ioc!im (iop!Ds #cta .WX, .WX, .WX, .WX,P.0,Q? VV06-4

>!annon+ C4 E4 P.2W1Q4 q# mat!ematical t!eorD o@ communication4q %!e (ell >Dstem %ec!nical
Iournal ,6 ,6 ,6 ,6? 5620W,54
>!en+ U4+ F4 Delaglio+ et al4 P,--2Q4 q%#8>d? a !D*rid met!od @or predicting protein *acE*one
torsion angles @rom 9M7 c!emical s!i@ts4q I (iomol 9M7 WW WW WW WWPWQ? ,.50,,54
>pronE+ C4 #4+ >4 (4 9a*uurs+ et al4 P,--5Q4 q%!e precision o@ 9M7 structure ensem*les revisited4q
I (iomol 9M7 ,V ,V ,V ,VP5Q? ,,V0,5W4
>pronE+ C4 #4 E4 M4+ >4 (4 9a*uurs+ et al4 P,--WQ4 qValidation o@ protein structures derived *D
9M7 spectroscopD4q 'rogress 9uc Mag 7es >pec WV WV WV WV? 5.V05564
>reerama+ 94 \ 74 [4 [oodD P,--WQ4 qComputation and analDsis o@ protein circular dic!roism
spectra4q Met!ods En"Dmol 515 515 515 515? 5.105V.4
>reerama+ 94 [4+ 74[4 P,---Q4 qEstimation o@ 'rotein >econdarD >tructure @rom Circular
Dic!roism >pectra? Comparison o@ C9%I9+ >E8C9+ and CD>>%7 Met!ods Fit! an
Expanded 7e@erence >et4q #nal (ioc!e+ .V .V .V .VP,Q? ,V,0,X-4
>tein+ E4 G4+ 84 M4 7ice+ et al4 P.226Q4 q%orsion0angle molecular dDnamics as a neF e@@icient tool
@or 9M7 structure calculation4q I Magn 7eson .,W .,W .,W .,WP.Q? .VW0.XW4
%Candra+ 94 \ #4 (ax P.226Q4 qDirect measurement o@ distances and angles in *iomolecules *D
9M7 in a dilute li;uid crDstalline medium4q >cience ,61 ,61 ,61 ,61PV5W-Q? ....0...W4
%roll+ [4 \ 74 Z4 Cannan P.2V5Q4 q# modi@ied p!otometric nin!Ddrin met!od @or t!e analDsis o@
amino and imino acids4q I (iol C!em ,-- ,-- ,-- ,--P,Q? 1-501..4
%sai+ C4 >4 P,--,Q4 #n Introduction to Computational (ioc!emistrD4 9eF UorE+ [ileD08iss4
Van Der >poel+ D4+ E4 8inda!l+ et al4 P,--VQ4 qG7M#C>? @ast+ @lexi*le+ and @ree4q I Comput
C!em ,X ,X ,X ,XP.XQ? .6-.0.6.14
Van Gunsteren+ [4 F4 P.221Q4 qValidation o@ molecular dDnamics simulation4q I C!em '!Ds .-1 .-1 .-1 .-14
VerlD+ 74 M4+ C4 M4 de Moraes+ et al4 P,--2Q4 q>tructure and mem*rane interactions o@ t!e
anti*iotic peptide dermadistinctin Z *D multidimensional solution and oriented .V9 and 5.'
solid0state 9M7 spectroscopD4q (iop!Ds I 2X 2X 2X 2XPXQ? ,.2W0,,-54

Vogt+ %4 (4+ (4 (ec!inger+ et al4 P.222Q4 q'eptide structural analDsis *D solid0state 9M7
spectroscopD4q (iopolDmers V. V. V. V.4
VolEe+ F4+ >4 Eisen*latter+ et al4 P.22WQ4 qDDnamic properties o@ Fater at p!osp!atidDlc!oline
lipid0*ilaDer sur@aces as seen *D deuterium and pulsed @ield gradient proton 9M74q C!em '!Ds
8ipids 6- 6- 6- 6-P,Q? .,.0.5.4
VranEen+ [4 F4 \ [4 7ieping P,--2Q4 q7elations!ip *etFeen c!emical s!i@t value and accessi*le
sur@ace area @or all amino acid atoms4q (MC >truct (iol 2 22 2? ,-4
Vriend+ G4 P.22-Q4 q[H#% IF? # molecular modeling and drug design program4q I Mol Grap!
1 11 1PV,0VXQ4
[agner+ G4 \ Z4 [ut!ric! P.21,Q4 q#mide protein exc!ange and sur@ace con@ormation o@ t!e
*asic pancreatic trDpsin in!i*itor in solution4 >tudies Fit! tFo0dimensional nuclear magnetic
resonance4q I Mol (iol .X- .X- .X- .X-P,Q? 5W505X.4
[eiss+ M4 >4+ #4 Ia*s+ et al4 P.221Q4 q'eptide *onds revisited4q 9at >truct (iol V VV VP1Q? X6X4
[ester!o@@+ H4 V4+ D4 Iuretic+ et al4 P.212Q4 qMagainins and t!e disruption o@ mem*rane0linEed
@ree0energD transduction4q 'roc 9atl #cad >ci U > # 1X 1X 1X 1XP.6Q? XV260XX-.4
[!ite+ >4 H4 \ [4 C4 [imleD P.222Q4 qMem*rane protein @olding and sta*ilitD? p!Dsical
principles4q #nnual 7evieF o@ (iop!Dsics and (iomolecular >tructure ,1 ,1 ,1 ,1P.Q? 5.205XV4
[!ite+ >4 H4+ [4 C4 [imleD+ et al4 P.221Q4 q'rotein @olding in mem*ranes? determining
energetics o@ peptide0*ilaDer interactions4q Met!ods En"Dmol ,2V ,2V ,2V ,2V? X,0164
[ieprec!t+ %4+ M4 (eDermann+ et al4 P.222Q4 q(inding o@ #nti*acterial Magainin 'eptides to
ElectricallD 9eutral Mem*ranes? %!ermodDnamics and >tructuret4q (ioc!emistrD 51 51 51 51P5,Q? .-5660
.-5164
[ieprec!t+ %4 \ I4 >eelig P,--,Q4 Isot!ermal titration calorimetrD @or studDing interactions
*etFeen peptides and lipid mem*ranes4 'eptide0lipid interactions4 >4 #4 >imon \ %4 I4 McIntos!4
>an Diego0U>#+ #cademic 'ress4 V,? V,? V,? V,? 5.0VX4
[illiamson+ M4 '4+ %4 F4 Havel+ et al4 P.21VQ4 q>olution con@ormation o@ proteinase in!i*itor II#
@rom *ull seminal plasma *D .H nuclear magnetic resonance and distance geometrD4q I Mol (iol
.1, .1, .1, .1,P,Q? ,2V05.V4

[ilson+ Z4 >4+ >4 (utterFort!+ et al4 P.221Q4 q[!o c!ecEs t!e c!ecEerss Four validation tools
applied to eig!t atomic resolution structures4 EU 50D Validation 9etForE4q I Mol (iol ,6X ,6X ,6X ,6X? W.60
W5X4
[is!art+ D4 >4+ (4 D4 >DEes+ et al4 P.22,Q4 q%!e c!emical s!i@t index? a @ast and simple met!od @or
t!e assignment o@ protein secondarD structure t!roug! 9M7 spectroscopD4q (ioc!emistrD 5. 5. 5. 5.PXQ?
.XW60.XV.4
[rig!t+ '4 E4 P.212Q4 q[!at can tFo0dimensional 9M7 tell us a*out proteinssq %rends (ioc!em
>ci .W .W .W .WP6Q? ,VV0,X-4
[at!ric!+ Z4 P.21XQ4 9M7 o@ 'roteins and 9ucleic #cids4 9eF UorE+ [ileD0Interscience4
[at!ric!+ Z4 P.212Q4 q%!e development o@ nuclear magnetic resonance spectroscopD as a
tec!ni;ue @or protein structure determination4q #cc C!em 7es ,, ,, ,, ,,4
Uang+ 84+ %4 M4 [eiss+ et al4 P,---Q4 qCrDstalli"ation o@ antimicro*ial pores in mem*ranes?
magainin and protegrin4q (iop!Ds I 62 62 62 62PWQ? ,--,0,--24
Uang+ 84 [4+ %4M4R 8e!rer+ 74I4R Huang+ H4[4 P,---Q4 qCrDstalli"ation o@ antimicro*ial pores in
mem*ranes? magainin and protegrin4q (iop!Ds4 I 62 62 62 62? ,--,0,--24
:aslo@@+ M4 P,--,Q4 q#ntimicro*ial peptides o@ multicellular organisms4q 9ature W.V W.V W.V W.VPX16-Q? 5120
52V4
:uiderFeg+ E4 74 '4+ M4 (illeter+ et al4 P.21WQ4 q>patial arrangement o@ t!e t!ree alp!a0!elices in
solution structure in solution structure o@ E4 coli lac repressor D9#0*inding domain4q FE(> 8ett
.6W .6W .6W .6W4

Ane*o A
7abelas de "eslocamento ,umico de <=P>es e "=P>es

#.

%a*ela #.4 %a*ela #.4 %a*ela #.4 %a*ela #.4 Valores de deslocamento ;umico de nJcleos pertencentes H cadeia principal e H
posi<=o [ H car*onila para cada resduo de amino$cido de 80'!es

7esduo de 7esduo de 7esduo de 7esduo de
Ytomo Ytomo Ytomo Ytomo
Deslocamento Deslocamento Deslocamento Deslocamento
Qumico PppmQ Qumico PppmQ Qumico PppmQ Qumico PppmQ
F.
H9

C# V6+X,2
H# W+WV5
C( 52+5V,
H(. 5+,5W
H(, 5+-X5
P80QF,
H9 2+W,1
C# X.+.-X
H# W+W,6
C( 52+,22
H(. 5+VW-
H(, 5+,,2
F5
H9 1+1-V
C# X.+.16
H# W+.,W
C( 51+X12
H(. 5+.WV
H(, 5+-1X
DW
H9 6+2.1
C# V6+,12
H# W+5.W
C( W-+,WW
H(. ,+651
H(, ,+1-W
%V
H9 6+2-.
C# XX+,1.
H# 5+21-
C( X1+WXV
H( W+,-1
8X
H9 1+-,,
C# V1+.V1
H# 5+2.-
C( W.+W6V
H(. .+V15
H(, .+V5V
Z6
H9 1+.V-
C# X-+VX5
H# 5+6V.
C( 5,+.V-
Z6
H(. .+1,1
H(, .+6W2
91
H9 6+215
C# VX+-1W
H# W+W66
C( 51+V,W
H(. ,+2X,
H(, ,+1XW
82
H9 1+,V1
C# V1+-.V
H# W+-16
C( W,+--X
H(. .+1V6
H(, .+X,V
#.-
H9 1+X.5
C# VV+V1,
H# 5+2,V
C( .1+..,
H(l .+WX2
G..
H9 1+,,V
C# W6+W5-
H#. W+-1V
H#, 5+616
Z.,
H9 6+1-.
C# V1+122
H# W+,-W
C( 5,+W1W
H(. ,+..V
H(, .+2.5
V.5
H9 1+-XV
C# XX+65W
H# 5+XXW
C( 5.+66W
H( ,+,X1
I.W
H9 1+WV6
C# XV+.W6
H# 5+X12
C( 56+6V1
H( .+2W1
G.V H9 1+,11
G.V
C# WX+21V
H#. 5+25X
H#, 5+15X
#.X
H9 6+6X,
C# VW+.X-

#,

H# W+,65
C( .1+6-6
H(l .+VV.
8.6
H9 6+1V1
C# VX+WWW
H# W+,X,
C( W5+.12
H(. .+126
H(, .+X.2
%.1
H9 6+6X6
C# X,+,1X
H# W+5,-
C( 6-+5-.
H( W+5VV

#5

%a*ela #,4 %a*ela #,4 %a*ela #,4 %a*ela #,4 Valores de deslocamento ;umico de nJcleos pertencentes H cadeia principal e H
posi<=o [ H car*onila para cada resduo de amino$cido de D0'!es
7e 7e 7e 7esduo de sduo de sduo de sduo de
Ytomo Ytomo Ytomo Ytomo
Deslocamento Deslocamento Deslocamento Deslocamento
Qumico PppmQ Qumico PppmQ Qumico PppmQ Qumico PppmQ
F.
H9

C# VX+1VW
H# W+,W,
C( 52+X51
H(. 5+56V
H(, 5+.X,
PD0QF,
H9 6+621
C# V+-.,
H#

C( W.+V.X
H(. ,+VXW
H(, ,+512
F5
H9 2+,W1
C# X.+VWX
H# 5+1X,
C( 51+W1-
H(. 5+-.V
H(, ,+2..
DW
H9 1+112
C# VX+2,V
H# W+.WW
C( 51+5X1
H(. ,+6X5
H(, ,+XV1
%V
H9 6+X62
C# XX+-VW
H# 5+26W
C( X1+2.V
H( W+-WW
8X
H9 6+V.W
C# V6+25-
H# 5+2X6
C(

H(. .+1W-
H(, .+61-
Z6
H9 1+,1-
C# X-+WV2
H# 5+,-5
C( 5,+.X1
H(. .+1V,
H(, .+65V
91
H9 1+.-2
C# VV+2W1
91
H# W+5-5
C( 51+522
H(. ,+261
H(, ,+16W
82
H9 1+,W-
C# V1+-5.
H# W+-2,
C( W,+-2.
H(. .+1XW
H(, .+6-W
#.-
H9 1+V65
C# VV+X-V
H# 5+255
C( .1+,X1
H(l .+W22
G..
H9 1+,,-
C# W6+W5,
H#. 5+62W
H#, W+-1X
Z.,
H9 1+,2-
C# V1+6V,
H# W+,,,
C( 5,+X16
H(. ,+.,1
H(, .+2,.
V.5
H9 1+-2V
C# XX+6WW
H# 5+XV5
C(

H( ,+,6,
I.W
H9 1+W2.
C# XV+-6V
H# 5+X12
C( 56+621
H( .+2V6
G.V
H9 1+,2-
C# W6+-V6
H#. 5+2W6
H#, 5+1W.
#.X
H9 6+611
C# VW+.1,
H# W+,1.
C( .1+112
H(l .+VV6
8.6 H9 6+11.

#W

8.6
C# VX+5-,
H# W+,X1
C( W5+.W6
H(. .+2-.
H(, .+X5-
%.1
H9 6+61,
C#

H# W+5W.
C(

H(

Ane*o )
Apresenta#&es de 7rabal>os em ongressos

(.

1. RESENDE, J. M., MUNHOZ, V. H. O., AISENBERY, C., MORAES, C. M., VERLY, R. M,
BERTANI, P., FERREIRA, A. C., PIL-VELOSO, D., BECHINGER, B.
Membrane Structure and Conformational Changes During Bilayer-Association of the Antibiotic
Heterodimeric Peptide Distinctin by Oriented Solid-State NMR Spectroscopy 12th NMR USERS
MEETING-3rd IBEROAMERICAN NMR MEETING, 2009, Angra dos Reis.
EXTENDED ABSTRACT BOOK. Rio de Janeiro: AUREMN, 2009. v.12. p.97 - 98
Keywords: Phyllomedusa distincta, Antimicrobial Peptide, Nuclear Magnetic Resonance
Knowledge areas : Proteins,Spectroscopy,Structure, Conformation and Stereochemistry
Additional references : Brasil/English.

2. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, RESENDE, J. M., ALMEIDA, F. C. L., PIL-VELOSO, D.
Structural Determination by NMR of the Antimicrobial Peptide Distinctin In: 12th NMR USERS
MEETING-3rd IBEROAMERICAN NMR MEETING, Angra dos Reis.
EXTENDED ABSTRACT BOOK. Rio de Janeiro: Auremn, 2009. v.12. p.169 - 170
Additional references : Brasil/English.

3. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Pil-Veloso, D., Alcntara, A. F. C.
Structural Determination by NMR Spectroscopy and Conformational Analysis of Chain 2 of
Distinctin, an Antimicrobial Peptide from Phyllomedusa distinct Anurans In: EUROMAR
Magnetic Resonance Conference, 2008, So Petersburgo.
Book Of Abstracts. So Petersburgo: St. Petersburg State University, 2008. v.1. p.28 - 28
Keywords: Nuclear Magnetic Resonance, Antimicrobial Peptide, Phyllomedusa distincta
Knowledge areas : Structure, Conformation and Stereochemistry,Spectroscopy,Proteins
Additional references : Rssia/English. Meio de divulgao: Impresso

Structural Determination by NMR Spectroscopy and Conformational Analysis of Chain 1 of
Distinctin, an Antimicrobial Peptide from Phyllomedusa distinct Anurans In: EUROMAR
Magnetic Resonance Conference, 2008, So Petersburgo.
Book Of Abstracts. So Petersburgo: St. Petersburg State University, 2008. v.1. p.27 - 27
Additional references : Rssia/English. Meio de divulgao: Impresso

Presentations in Events

1. MUNHOZ, V. H. O., DE PAULA, S. F. C., RESENDE, J. M., PIL-VELOSO, D.,
BECHINGER, B.
Structural and Orientational Determination of the Antimicrobial Peptide Hylaseptin P2 in
Membrane-Mimicking Environment, 2011. (Presentation,Presentations in Events)
Keywords: Antimicrobial Peptide, Solid State NMR Spectroscopy
Additional references : Brasil/Portuguese. Meio de divulgao: Impresso; Local: Hotel do Frade; Cidade: Angra dos
Reis; Evento: 13th Nuclear Magnetic Resonance Users Meeting; Inst.promotora/financiadora: AUREMN

2. MUNHOZ, V. H. O., MAGALHAES, M. T. Q., VERLY, R. M, DE PAULA, S. F. C.,
AISENBERY, C., RESENDE, J. M., BECHINGER, B., PIL-VELOSO, D., BLOCH JR, C.
Structural and Orientational Determination of the Antimicrobial Peptide Phenylseptin in
Membrane-Mimicking Environment, 2011. (Congress,Presentations in Events)
Keywords: Antimicrobial Peptide, Nuclear Magnetic Resonance, Solid State NMR Spectroscopy
Knowledge areas : Proteins,Structure, Conformation and Stereochemistry
Additional references : Brasil/Portuguese; Local: Hotel do Frade; Cidade: Angra dos Reis; Evento: 13th Nuclear
Magnetic Resonance Users Meeting; Inst.promotora/financiadora: AUREMN

3. MUNHOZ, V. H. O., MAGALHAES, M. T. Q., VERLY, R. M, DE PAULA, S. F. C., RESENDE,
J. M., AISENBERY, C., PIL-VELOSO, D., BLOCH JR, C., BECHINGER, B.
Structural and Orientational Study of Peptide Phenylseptin in Micellar Environment, 2011.
(Presentation,Presentations in Events)
Additional references : China/English; Cidade: Beijing; Evento: 12th International Congress on Amino Acids, Peptides
and Proteins; Inst.promotora/financiadora: Amino Acids

4. MUNHOZ, V. H. O., ASSUNCAO, B. A., DE PAULA, S. F. C., RESENDE, J. M., PIL-
VELOSO, D., BECHINGER, B.
Topological Determination of the Antimicrobial Peptide Hylaseptin P2 in Oriented

(,

Bilayers, 2011. (Presentation,Presentations in Events)
Additional references : China/English. Meio de divulgao: Impresso; Cidade: Beijing; Evento: 12th International
Congress on Amino Acids, Peptides and Proteins; Inst.promotora/financiadora: Amino Acids

5. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, RESENDE, J. M., ALMEIDA, F. C. L., PIL-VELOSO, D.
Structural Determination by NMR of the Antimicrobial Peptide Distinctin, 2009.
(Congress,Presentations in Events)
Additional references : Brasil/English; Local: Hotel do Frade; Cidade: Angra dos Reis, RJ; Evento: 12th NMR USERS
MEETING-3rd IBEROAMERICAN NMR MEETING; Inst.promotora/financiadora: AUREMN

6. MUNHOZ, V. H. O., VERLY, R. M, Bemquerer, M. P., Pil-Veloso, D.
Sntese em fase slida e caracterizao da Distinctina, peptdeo antimicrobiano isolado
de Phyllomedusa distincta, 2008. (Congress,Presentations in Events)
Keywords: Sntese de Peptdeos em Fase slida, Peptdeos Antimicrobianos, Phyllomedusa distincta
Knowledge areas : Organic Synthesis,Cromatografia
Additional references : Brasil/Portuguese. Meio de divulgao: Impresso; Local: Hotel Monte Real Resort; Cidade:
guas de Lindia; Evento: XXXI Reunio Anual da SBQ; Inst.promotora/financiadora: Sociedade Brasileira de Qumica

STRUCTURAL DETERMINATION BY NMR SPECTROSCOPY AND CONFORMATIONAL
ANALYSIS OF CHAIN 2 OF PHYLLOMEDUSA DISTINCTA AN ANTIMICROBIAL PEPTIDE
FROM PHYLLOMEDUSA DISTINCTA ANURANS, 2008. (Congress,Presentations in Events)
Additional references : Rssia/English. Meio de divulgao: Impresso; Local: St. Petersburg State University; Cidade:
So Petersburgo; Evento: EUROMAR Magnetic Resonance Conference; Inst.promotora/financiadora: EUROMAR

STRUCTURAL DETERMINATION BY NMR SPECTROSCOPY AND CONFORMATIONAL
ANPHYLLOMEDUSA DISTINCTA ANURANS.ALYSIS OF CHAIN 1 OF DISTINCTIN, AN
ANTIMICROBIAL PEPTIDE FROM PHYLLOMEDUSA DISTINCTA ANURANS, 2008.
(Congress,Presentations in Events)
Keywords: Nuclear Magnetic Resonance, Antimicrobial Peptide, Conformational Analysis
Knowledge areas : Structure, Conformation and Stereochemistry,Proteins,Spectroscopy
Additional references : Brasil/Portuguese. Meio de divulgao: Impresso; Local: St. Petersburg State University; Cidade:
So Petersburgo; Evento: EUROMAR Magnetic Resonance Conference; Inst.promotora/financiadora: AMPERE,

Ane*o %
Artigos Publicados e Submetidos

C.

Artigos Publicados

Georgescu+ I4R Mun!o"+ V4 H4 4+ (ec!inger+ (4 9M7 >tructures o@ t!e Histidine07ic! 'eptide
8#HW in Micellar Environments? Mem*rane Insertion+ pH0Dependent Mode o@ #ntimicro*ial
#ction+ and D9# %rans@ection4 (iop!Ds4 I4 P,-.-Q 22+ ,V-60,V.V
7esende+ I4 M4+ Moraes+ C4 M4+ Mun!o"+ V4 H4 4+ #isen*reD+ C4+ VerlD+ 74 M4+ (ertani+ '4+ Cesar+
#4+ 'il&0Veloso+ D4+ (ec!inger+ (4 Mem*rane structure and con@ormational c!anges o@ t!e
anti*iotic !eterodimeric peptide distinctin *D solid0state 9M7 spectroscopD4 'roc4 9atl4 #c4 >ci4
P,--2Q+ .-X+ .XX520.XXWW4

Artigos Submetidos

de Magal!=es+ M4 %+ VerlD+ 74 M4+ Mun!o"+ V4 H4 4+ 'rates+ M4 V4+ de #raJCo+ I4 E4+ (loc! Ir4+ C4
'!enDlseptins? D0 and 80amino acid Containing 'eptides t!at Com*ine #versive GustatorD
'roperties Fit! #ntimicro*ial #ctivities Isolated @rom t!e >Ein >ecretion o@ HipsD*oas punctatus4
Partigo su*metidoQ4

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Universidade Federal de Minas Gerais

Instituto de Cincias Exatas

+ E;4.4WQ de uma Jnica restri<=o experimental r pode ser

restri<Ges de distBncia e para todos os

P PP PFigura .4,.*Q *Q *Q *Q4 De@inindo0se

4 'ara am*as as orienta<Ges do peptdeo s=o mostradas+ H direita+ os

+ con@orme mostrado na E;ua<=o .4..+

+ 9+ H9 e CK+ em rela<=o a um *anco de dados de deslocamentos ;umicos desses

b 6+1- ppm+ par

b 2+W5 ppm para a 8

+ de cada inCe<=o Pap&s

dos Jltimos picos+ tomados ;uando o valor de q

+ esta*ili"a num valor positivoQ dividido

) P546Q P546Q P546Q P546Q

P542Q P542Q P542Q P542Q

P54.-Q P54.-Q P54.-Q P54.-Q

P54..Q P54..Q P54..Q P54..Q

) o calor envolvido em cada inCe<=o PC$ su*trado

) a ;uantidade+ em mols+ de peptdeo ligado ap&s a i

pode0se estimar a ;uantidade de peptdeo ;ue permanece livre

deve ser corrigida por um @actor de dilui<=o

+ presente na c)lula+ e a concentra<=o C

e a ;uantidade+ em mol+ de lipdeo n

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P PP PFigura .4,.Q Q Q Q4 De@inindo0se