FACULTAD DE CIENCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA Y CIENCIAS AMBIENTALES

INGENIERIA AMBIENTAL
Profesor Coordinador: Dra. Marcela Zahr T/ Prof. Ayudante: Martn Galaz
GUA N 1: MTODOS DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO
PARTE I. MTODOS DE ESTERILIZACIN Y DESINFECCIN
I. DEFINICIONES
- Esterilizacin: eliminacin de toda forma de vida, incluidas las esporas.
- Desinfeccin: proceso de destruir los agentes infecciosos, a travs de la eliminacin de las formas vegetativas, sin
eliminar formas de resistencia (esporas).
- Asepsia: tcnicas empleadas para impedir acceso de microorganismos al campo de trabajo.
- Antimicrobianos: sustancias que matan o inhiben el crecimiento de los microorganismos
- Microbiocidas: sustancias que matan las formas vegetativas, pero no necesariamente las esporas de un
microorganismo (bactericida, fungicida, etc.).
- Microbiostticos: sustancias que inhiben el crecimiento de microorganismos.
- Desinfectantes: se refiere a sustancias empleadas sobre objetos inanimados.
- Agentes teraputicos: antimicrobianos empleados en el tratamiento de infecciones.
II. METODOS FISICOS DE ESTERILIZACIN
1. ALTAS TEMPERATURAS
La alta temperatura combinada con un alto grado de humedad es uno de los mtodos ms efectivos para destruir
microorganismos. El calor hmedo mata los microorganismos, porque coagula sus protenas siendo ms rpido y efectivo
que el calor seco que los destruye al oxidar sus constituyentes qumicos. La accin letal del calor es una relacin de
temperatura y tiempo afectada por muchas condiciones. Por ejemplo, las esporas deClostridium botulinum son destruidas en
4 a 20 minutos a 120 C en calor hmedo, mientras que se necesitan alrededor dedos horas de exposicin al calor seco para
obtener los mismos resultados.
1a. ESTERILIZACION POR CALOR HUMEDO:
Autoclave: El calor en la forma de vapor a saturacin y a presin es el agente ms prctico para esterilizar, ya
que el vapor a presin proporciona temperaturas superiores a las que se obtienen por ebullicin. El autoclave de laboratorio
se emplea generalmente a una presin de vapor de una atmsfera por encima de la presin atmosfrica, lo cual corresponde
a una temperatura de 120 C. El tiempo de exposicin depende del volumen del lquido, de tal manera que para volmenes
pequeos (hasta unos 3 litros) se utilizan 20 minutos a 120 C; si los volmenes son mayores debe alargarse el tiempo de
tratamiento.
Tindalizacin: Se utiliza cuando las sustancias qumicas no pueden calentarse por encima de 100 C sin que resulten
daadas. Consiste en el calentamiento del material entre80- 100 Cpor periodos dehasta una hora con sucesivos tiempos
de incubacin, repitiendo el ciclo durante tres das. Las esporas resistentes germinar durante los perodos de incubacin y
en la siguiente exposicin al calor las clulas vegetativas son destruidas.
Pasteurizacin: Este mtodo se emplea principalmente en alimentos por las mismas razones que en la Tindalizacin, la
diferencia es que no esteriliza. La leche, nata y ciertas bebidas alcohlicas se someten a tratamientos de calor controlado
que slo matan a ciertos tipos de microorganismos, pero no a todos. Por ejemplo, la leche pasteurizada no es estril y se
calienta a 62,8 C, durante 30 minutos.
Ebullicin: Se hierven los objetos a 100C, destruyendo slo las formas vegetativas de las bacterias, no esporas.
Ventajas y desventajas del uso del calor hmedo
Ventajas Desventajas
Rpido calentamiento y alta penetracin de la humedad No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua
Destruccin de bacterias y esporas en corto tiempo
No permite esterilizar soluciones con compuestos orgnicos
termolbiles
Bajo costo Tiene efectos corrosivos sobre ciertos instrumentos metlicos.
No deja residuos txicos
Bajo deterioro del material expuesto
1b. ESTERILIZACION POR CALOR SECO: Se utiliza para materiales slidos estables al calor.
Horno Pasteur (horno de esterilizacin): El calor seco se utiliza principalmente para esterilizar material de vidrio y
otros materiales slidos estables al calor. El aparato que se emplea es el horno Pasteur. Para el material de vidrio de
laboratorio se consideran suficientes dos horas de exposicin a 180 C.
Incineracin: La destruccin de los microorganismos por incineracin es una prctica rutinaria en los laboratorios. Las
asas de siembra se calientan a la llama de mecheros Bunsen. La incineracin tambin se utiliza en la eliminacinmasivade
residuos hospitalarios.
Flameado: Sirve para esterilizar las asas de Drigalsky, as comola boca de tubos y matraces.
2. RADIACIONES
2a. RADIACIONES IONIZANTES:
Rayos Gamma: Radiaciones de alta energa emitidas por ciertos istopos radiactivos. Pueden penetrar los materiales
por lo que un producto se puede empaquetar primero y despus esterilizar.
Rayos catdicos: Radiacin con haz de electrones utilizada para esterilizar material quirrgico, medicamentos y otros
materiales. Los materiales se pueden esterilizar despus de empacado (penetran las envolturas) y a temperatura ambiente.
Ambas radiaciones afectan directamente el material gentico del microorganismo y protenas con actividad enzimtica.
2b. RADIACIONES NO IONIZANTES:
Luz ultravioleta: La porcin ultravioleta del espectro incluye todas las radiaciones desde 15 a 390 nm. Las longitudes
de onda alrededor de 265 nm son las que tienen mayor eficacia como bactericidas (200-295 nm). Se usan para reducir la
poblacin microbiana en quirfanos, cuartos de llenado aspticos en la industria farmacutica y para tratar superficies
contaminadas en la industria de alimentos y leche. Tiene poca capacidad para penetrar materiales, por lo que slo los
microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos que se exponen directamente a la accin de la luz UV
son susceptibles de ser destruidos.
Modo de accin: alteracin del material gentico, formando dmeros de Timina.
Ventajas y desventajas del uso del calor seco
Ventajas Desventajas
No es corrosivo para metales e instrumentos Requiere mayor tiempo de esterilizacin que el hmedo
Permite la esterilizacin de sustancias en polvo noacuosas
Permite la esterilizacin de sustancias viscosas no voltiles
No deja residuos txicos
Bajo deterioro del material expuesto
3. FILTRACION
Algunos materiales como suero de animales, soluciones de enzimas, algunas vitaminas y antibiticos son
termolbiles. Otros agentes fsicos como las radiaciones son perjudiciales para estos materiales y poco prcticos para
esterilizarlos, por lo que se recurre a la filtracin. Los microorganismos quedan retenidos en parte por el pequeo tamao de
los poros del filtro y en parte por adsorcin a las paredes del poro durante su paso a travs del filtro debido a la carga
elctrica del filtro y de los microorganismos. Ejemplos:
Filtros de membrana: Los filtros de membranas son discos de ster de celulosa con poros tan pequeos que
previenen el paso de los microorganismos. Existen distintos tipos de filtro dependiendo del tamao de poro. Adems de
utilizarse en la esterilizacin de lquidos se usan en el anlisis microbiolgico de aguas, ya que concentran los
microorganismos existentes en grandes volmenes de agua.
Filtros HEPA: Un filtro HEPA (High Efficiency Particulate Air) est compuesto por pliegues de acetato de celulosa
que retienen las partculas (incluidos los microorganismos) del aire que sale de una campana de flujo laminar.
III. METODOS QUIMICOS DE ESTERILIZACIN
1. OXIDO DE ETILENO: El requerimiento esencial para un agente qumico esterilizante es que sea voltil, as como txico
para los microorganismos, de manera que pueda ser fcilmente eliminado del objeto esterilizado despus del tratamiento. EL
Oxido de etileno se usa en la industria para la esterilizacin de placas Petri, jeringas y otros objetos de plstico que se funden
a temperaturas superiores a los 100 C. Debido a su alto poder de penetracin, estos objetos se empaquetan primero y
despus se esterilizan. El xido de etileno acta inactivando enzimas y otras protenas que contienen grupos sulfidrilos (R-
SH) mediante una reaccin llamada alquilacin.
2. GLUTARALDEHIDO: Una solucin acuosa al 2% presenta una amplia actividad microbiana. Es efectivo frente a virus,
clulas vegetativas y esporas de bacterias y hongos. Se usa en medicina para esterilizar instrumentos urolgicos y pticos.
Es el nico esterilizante efectivo fro.
3. FORMALDEHIDO: Se utilizan pastillas de paraformaldehdo, las cuales pueden disponerse en el fondo de una caja
envuelta en gasa o algodn, que despus puede ser expuesta al calor para una rpida esterilizacin (gas formaldehdo).
Tambin pueden ser usadas en estufas de formol, que son cajas de doble fondo, en donde se colocan las pastillas y se
calienta hasta 60 C, esterilizando materiales de ltex, goma, plstico.
IV. DESINFECTANTES y ANTISEPTICOS
1. INORGANICOS:
Metales: Los ms efectivos son el mercurio (no utilizado actualmente), plata, cobre y zinc. Actan inactivando las
protenas celulares al combinarse con ellas.
- Mercurio (antisptico para heridas superficiales de la piel y mucosas): mercurocromo (mercromina) y el mertiolato.
- Plata (antispticos): nitrato de plata (AgNO3)
- Cobre (antifungico): Sulfato de cobre (CuSO4) mezcla Bordolesa para plantas
- Zinc: fungicidas (ej, tratamiento del pi de atleta).
cidos y Bases: Actan alterando la permeabilidad y coagulando las protenas. En general los cidos son ms eficaces
que los lcalis. Dentro de estos compuestos se encuentran el sulfrico (H2SO4), ntrico (HNO3), hidrxido de sodio (NaOH) e
hidrxido de potasio (KOH).
Compuestos inorgnicos oxidantes: Actan oxidando los componentes de la membrana y enzimas. El agua
oxigenada (H2O2) al 6% (20 volmenes, en forma comercial) se utiliza como antisptico en pequeas heridas de la piel.
Halgenos: Los halgenos son agentes fuertemente oxidantes por lo que son altamente reactivos y destructivos para
los componentes vitales de las clulas microbianas.
- Cloro: La muerte de los microorganismos por accin cloro se debe en parte a la combinacin directa del cloro
con las protenas de las membranas celulares y las enzimas. Asimismo, en presencia de agua desprende oxgeno naciente
(O) que oxida la material orgnica.
El gas cloro licuificado se utiliza en la desinfeccin del agua de bebida y piscinas. El hipoclorito sdico (leja) al 1% se
puede utilizar como desinfectante domstico.
- Yodo: Adems de la oxidacin, la habilidad que tiene el yodo para combinarse con el aminocido tirosina resulta
en la inactivacin de enzimas y otras protenas. El yodo se puede utilizar como antisptico bajo dos formas:
i) tintura de yodo, es una solucin alcohlica (tintura) de yodo (I2) ms ioduro potsico (KI) o ioduro sdico (NaI).
ii) iodforos, son mezclas de yodo (I2) con compuestos que actan como agentes transportadores y solubilizadores del
iodo. Por ejemplo, la povidona iodada (Betadine) es un complejo de iodo y polivinil pirrolidona (PVP). Los iodforos tienen la
ventaja de que no tien la piel. Las preparaciones de iodo se utilizan principalmente para desinfectar la piel, as como en la
desinfeccin de pequeas cantidades de agua. Los vapores de iodo se utilizan a veces para desinfectar el aire.
2. ORGANICOS:
Alcoholes: Hay un aumento en el poder bactericida a medida que aumenta la longitud de la cadena carbonada;
pero como los alcoholes con peso molecular superior al del proplico (3C) no se mezclan en todas las proporciones con el
agua, no se suelen utilizar como desinfectantes. Los alcoholes actan desnaturalizando las protenas, disolviendo las capas
lipdicas y como agentes deshidratantes. El etanol al 96% se usa como antisptico de la piel y como desinfectante en los
termmetros clnicos orales y algunos instrumentos quirrgicos y de laboratorio.
Fenol y compuestos fenlicos: Una solucin acuosa al 5% de fenol mata rpidamente a las clulas vegetativas de
los microorganismos. Sin embargo, las esporas son mucho ms resistentes al fenol. Debido a que el fenol es txico y tiene un
olor desagradable, ya casi no se usa como desinfectante o antisptico, siendo reemplazado por compuestos fenlicos que
son sustancias derivadas del fenol menos txicas y ms activas frente a los microorganismos. Lysol es una mezcla de
compuestos fenlicos que se utiliza para desinfectar objetos inanimados como los suelos, paredes y superficies. El fenol y
compuestos fenlicos actan alterando la permeabilidad de la membrana citoplasmtica, as como desnaturalizando las
protenas.
PARTE II: MEDIOS DE CULTIVO
MEDIOS DE CULTIVO.
Se denomina medio de cultivo al material nutritivo preparado en el laboratorio para el crecimiento de los
microorganismos. Algunas bacterias pueden crecer normalmente en cualquier medio de cultivo, otras necesitan medios
especiales y hay algunas que no son capaces de crecer en ningn medio de cultivo hasta ahora desarrollado. Los
microorganismos que crecen y se multiplican en los medios de cultivos se denominan cultivo.
Entre los criterios considerados en un medio de cultivo artificial para lograr el desarrollo de un microorganismo se
encuentran la presencia y disponibilidad de nutrientes, elementos traza, factores de crecimiento, suplementos, etc. El medio
deber ser estril y presentar un pH adecuado para los microorganismos, y adems deber ser incubado bajo condiciones
de temperaturas adecuadas para su crecimiento.
Factores orgnicos de crecimiento y suplementos.
Si un medio que contiene todos los componentes qumicos necesarios, no soporta el crecimiento de un
microorganismo, ello puede deberse a la falta de un factor orgnico de crecimiento. Estos factores son compuestos orgnicos
especficos, requeridos en muy pequeas cantidades y que no pueden ser sintetizados por la clula.
Algunos microorganismos pueden no requerirlos, otros necesitar slo de uno, y algunos pueden utilizarlostodos. Las
sustancias que sirven como factores orgnicos de crecimiento son: vitaminas (biotina, cido nicotnico), aminocidos,
purinas y pirimidinas.
Ciertos microorganismos presentan mayores dificultades al cultivarlos, ya sea por su lentitud de crecimiento o por la
baja biomasa que alcanzan. En este caso se puede agregar al medio de cultivo suplementos, los cuales no siendo vitales
para su desarrollo, los favorecen de manera significativa. Entre lossuplementos podemos encontrar: extractos de levadura y
carne, infusiones de cerebro y corazn, peptonas, suero y sangre.
Agentes solidificantes
Segn el uso que se les desee dar, los medios de cultivo pueden tener distinta consistencia, distinguindose los
medios lquidos (sin agentes solidificantes), semislidos (0.8% agente solidificante) y medios slidos (1.52%).
Agar-agar: Es el agente solidificante mas utilizado debido a que la mayor parte de las bacterias son incapaces de
degradarlo. Es un polisacrido complejo extrado de un alga del gnero Gelidium sp. Tiene la posibilidad de absorber 500
veces su peso en agua, solidifica a los 45C y licua por sobre los 100C. Es capaz de mantener un pH neutro y es
transparente.
Otros agentes solidificantes utilizados son las albminas animales, carragenatos vegetales y slica gel (gel
inorgnico).
CLASIFICACIN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO:
a) Segn la fuente de nutrientes:
1- Natural ej. La leche.
2- Artificial ej. Mezcla de productos qumicos.
b) Segn su composicin:
b.1 - Medios sintticos o definidos: Se conoce su composicin qumica exacta. Se usan para microorganismos a
los que se les conoce sus requerimientos nutricionales, como por ejemplo los quimiolitotrofos. Generalmente contienen
fuentes de carbono como la glucosa, de nitrgeno, usualmente de cloruro, sulfato o fosfato de amonio, y varias sales
inorgnicas incluidas trazas de metales. Ejemplo: agar-almidn.
b.2 - Medios complejos o no definidos: Es aquel que tiene ingredientes de composicin qumica desconocida o
slo parcialmente conocida. Se usan para hacer crecer microorganismos de difcil cultivo. Ejemplos: agar sangre, agar yema
de huevo, caldo lactosado, agar marino, agar nutritivo, caldo nutritivo (Extracto de carne 3 gr.; Peptona 5 gr.; Agua Destilada
1lt).
c) Segn su uso:
c.1 - Medios Selectivos: Son medios que favorecen el crecimiento de determinados microorganismos. El medio ha
sido modificado para incluir uno o ms agentes inhibitorios, restringiendo el crecimiento de cierto tipo de organismos. Las
sustancias inhibitorias usadas pueden ser antibiticos, colorantes, sales biliares (para enriquecer enterobacterias), cristal
violeta (que inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas y permite el crecimiento de las Gram negativas), medio salino
(3% NaCl para enriquecer bacterias halfilas) etc.
Ejemplos: Brillant green bile broth y McConkey para coliformes, Chapman para Staphylococcus, Agar TCBS para
Vibrio sp. y Bile blood agar paraStreptococcus faecalis
c.2 - Medios de diagnstico diferencial o determinativo: Contienen reactivos que diferencian entre los distintos
tipos de bacterias, sirven para una identificacin presuntiva o preliminar, adems de determinar propiedades fisiolgicas y
bioqumicas puntuales de los microorganismos.
Ejemplos: Agar sangre, Agar citrato Simmons, Agar leche, Agar gelatina, Agar DNAasa, Agar yema de huevo, Medio
de Hugh Leifson (O/F), Agar almidn.
c.3 - Medios de crecimiento o mantencin: Tienen como objetivo preservar un stock de cultivo, para mantener en
el laboratorio una cantidad de microorganismos viables disponibles para su eventual uso.
Ejemplos: Agar nutritivo, Caldo peptonado, Medios de congelacin (se baja a la mitad los componentes nutritivos del
medio y se agrega glicerol para impedir la formacin de cristales).
PREPARACIN DE UN MEDIO DE CULTIVO
En forma comercial los medios se presentan deshidratados y con todos sus componente ya incluidos, siendo
necesaria solo la adicin de agua y la posterior esterilizacin para su uso.
1. Preparacin de medio slido en placas de Petri:
a. Pesar la cantidad de medio deshidratado y disolver en agua destilada segn las indicaciones del fabricante.
b. Agitar con una varilla de vidrio calentando sobre la llama del mechero hasta que hierva y se disuelva completamente la
mezcla.
c. Tapar el matraz con algodn hidrfobo y cubrir la boca del matraz con papel aluminio.
d. Autoclavar a 120 C x 20 minutos.
e. Una vez que la temperatura y presin descienden, abrir la autoclave y retirar el matraz. Luego, trabajando cerca de la
llama del mechero y flameando la boca del matraz, depositar aprox.. 20 ml del medio an lquido en cada una de las
cpsulas de Petri (previamente esterilizadas en horno Pasteur).
f. Una vez solidificado el medio, almacenar las placas en posicin invertida y refrigeradas (4C).
2. Preparacin de medio slido, semislido o lquido en tubos.
a. Repetir los puntos a y b del tem anterior. (En caso de preparar medio lquido no es necesario hervir).
b. Depositar aprox. 5 ml de la solucin en cada tubo de ensayo, tapando la boca de cada uno de ellos con algodn
hidrfobo.
c. Poner los tubos en una gradilla autoclavable, y cubrir la boca de todos ellos con una hoja de papel aluminio. Autoclavar
a 120C x 20 minutos.
d. Una vez retirados de la autoclave, si se desea obtener tubos con agar inclinado, posicionar los tubos (con el medio an
lquido) de forma horizontal sobre el mesn, dejndolos levemente inclinados (al apoyar la boca del tubo sobre una
pipeta de vidrio).
e. Una vez solidificado el medio almacenar los tubos en la gradilla en posicin vertical a 4 C.
OBJETIVOS.
- Conocer las diferentes metodologas de desinfeccin y esterilizacin utilizadas en el laboratorio de microbiologa
para la preparacin del material a utilizar.
- Conocer el equipamiento bsico del laboratorio de microbiologa y el uso de los equipos disponibles
- Aprender a preparar los medios de cultivos para el crecimiento de los microorganismos.
MICROBIOLOGIA- 2014/ UNIVERSIDAD DE VALPARAISO