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INTRODUCCIN

Antecedentes histricos
El concepto de muerte celular programada fue acuado por Lockshin y Williams en
1964 y describa la muerte de las clulas que ocurra en lugares y momentos
determinados como eventos programados dentro del plan de desarrollo del organismo.
Aos despus, en 1972, los cientficos escoceses Kerr, Wyllie y Currie a partir de una
recopilacin de evidencias morfolgicas, establecieron las diferencias entre dos tipos
de muerte celular. La patolgica que ocurre, por ejemplo, en el centro de una lesin
aguda como trauma o isquemia, est caracterizada por la ruptura celular y recibe el
nombre de necrosis celular, y la fisiolgica, que ocurre durante el desarrollo o la
hemostasis del organismo, que mantiene la integridad de la clula y a la que Kerr y
sus colaboradores llamaron apoptosis. Segn este grupo, la muerte por apoptosis
responda a un programa de muerte intracelular que poda ser activado o inhibido por
una variedad de estmulos, tanto fisiolgicos como patolgicos.
En 1982 tuvo lugar un descubrimiento que abri las puertas al estudio profundo de las
bases moleculares y genticas del proceso de apoptosis. Robert Horvitz, del Instituto
de Massachussets en Cambridge, public los estudios genticos realizados sobre el
nematodo caenorhabditis elegans en los que se describieron los genes encargados del
control y la ejecucin de la apoptosis en este organismo. Gracias a la homologa
existente entre estos genes en c. elegans y organismos superiores, la apoptosis en
este nematodo ha sido tomada como referente del proceso en todos los sistemas y
esto ha podido identificar una parte importante de la red de mecanismos que lo
controlan.

Horvitz y sus colaboradores despus de una paciente observacin de las clulas del
gusano bajo un microscopio (desde la etapa de embrin hasta el animal adulto)
revelaron que, aunque cada gusano generaba 1 090 clulas, el animal adulto consista
de slo 959 clulas. Exactamente 131 clulas del embrin del gusano estaban
programadas para morir, a menudo a los pocos minutos de su nacimiento.

Centrndose en este programa de suicidio, Horvitz identific una va de la muerte,
tres pasos que siguen las clulas condenadas: Primero se mata a la clula, dice
Horvitz en tono dramtico. Despus, y su voz se profundiza, se deshace del cuerpo.
Y en tercer lugar, se destruye la evidencia; describiendo el investigador que distintos
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genes controlan cada uno de estos pasos; alrededor de 15 genes del gusano
desempean una cierta funcin en la apoptosis. Tal descubrimiento lo hizo merecedor
en el ao 2002 del Premio Nobel de Fisiologa y Medicina junto a los cientficos
Sydney Brenner y John Sulston.





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APOPTOSIS (MUERTE CELULAR PROGRAMADA)
OBJETIVO
- Revisar fuentes bibliogrficas actualizadas sobre los mecanismos implicados en la
muerte celular programada (apoptosis) y sus ventajas para el mantenimiento de la
vida.

DESARROLLO
El trmino apoptosis (del griego ptosis: cada) fue originalmente usado por los
botnicos. A principios de la dcada de 1970 Kerr, Wyllie y Currie lo reacuaron para
describir la muerte de las clulas del hgado que, despus de encogerse y
marchitarse, se desprendan de este rgano como hojas en otoo.

La apoptosis es un fenmeno biolgico fundamental, permanente, dinmico e
interactivo. Existen mecanismos pro o anti apoptsicos, regulados genticamente, que
actan en forma activa (pues consumen energa) y equilibrada. Como funcin
necesaria para evitar la sobreproduccin celular era sospechada por los bilogos; pero
es un proceso ordenado y "silencioso" que no produce reaccin tisular y por ello difcil
de captar.

La apoptosis puede estar frenada, en equilibrio o estimulada. Por ejemplo, est
frenada durante el desarrollo de espermatogonias, en las criptas de las glndulas
intestinales (que es un epitelio de crecimiento rpido) y durante la lactancia en su
perodo preparatorio, en que el tejido mamario aumenta su masa celular. Est en
equilibrio respecto de la mitosis en los tejidos adultos sanos. Se ha observado en
epitelios adultos normales del hgado, mama, corteza suprarrenal y tubo digestivo. Es
muy significativo su rol homeosttico en la mdula sea, donde debe destruir en forma
permanente, la mitad de una inmensa cantidad de clulas que solo en leucocitos
significa 5 x 10 elevado a 11, cada 24 Hrs. Est estimulada cuando existen clulas
envejecidas, mutadas neoplsicas o no neoplsicas, alteradas por txicos y las que
estn en proceso de metamorfosis o atresia. Se ha estudiado esta condicin en
neutrfilos envejecidos, en megacariocitos con citoplasma agotado por produccin
excesiva de plaquetas, en la atresia folicular del ovario, en folculos pilosos en
evolucin y en la mama durante la involucin post-lactancia.
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Dos formas de muerte celular son habituales en el organismo: necrosis y apoptosis.
Las caractersticas morfolgicas de ambas, permiten , en la mayora de los tejidos
establecer claras diferencias.

En la necrosis se observan numerosas clulas vecinas sometidas a este proceso,
cubriendo una extensin variable con desintegracin. La destruccin de la membrana
celular permite el escape al exterior de elementos txicos que provocan un proceso
inflamatorio que tendr efecto nocivo en el organismo, segn la extensin del proceso.
El material cromatnico sufre una dispersin irregular. Las causas son agentes txicos,
traumticos e hipxicos; siempre patolgicos.

En la apoptosis el proceso afecta a determinadas clulas, no necesariamente
contiguas y no a todas en un rea tisular. La membrana celular no se destruye, lo que
impide el escape al espacio extracelular de su contenido , resultando un proceso
"silencioso", sin inflamacin. En el citoplasma se produce granulacin fina, con
conservacin de algunos organelos, en especial las mitocondrias que tienen un rol
interactivo importante. A nivel nuclear la cromatina se condensa agrupada en varios
sectores formando cuerpos apoptsicos. La membrana celular se recoge sobre las
eminencias globuliformes que forman los elementos deteriorados del citoplasma y
ncleo. Finalmente, fagocitos captan la clula en su totalidad impidiendo en una accin
impecable, que se produzca alarma en el resto del tejido.

Se ha demostrado, al menos en tejidos epiteliales, que si algo de material apoptsicos
escapa a la accin de los fagocitos, es captado por clulas vecinas. La participacin
de clulas vecinas en este proceso se manifiesta adems por la capacidad de stas de
enviar seales moleculares a la clula que debe morir, como mecanismo
complementario al que desarrolla la clula misma cuando se determina
molecularmente su autodestruccin. El proceso de apoptosis demora entre 30 y 60
minutos en clulas en cultivo. Uno de los ms lentos se produce en clulas hepticas
empleando como promedio 3 horas.

Sistemas sujetos a apoptosis
La muerte celular programada es un mecanismo bsico implicado de forma decisiva
en numerosos procesos. Entre ellos podemos destacar:
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- DESARROLLO EMBRIONARIO:
- Escultura de numerosas estructuras
- Eliminacin de estructuras
- Control de la sobreproduccin de clulas
- Control de clulas defectuosas
- Formacin de clulas diferenciales especiales
- HOMEOSTASIS
- MECANISMOS SELECTIVOS
Desarrollo embrionario
Las primeras observaciones que se realizaron del fenmeno de la muerte celular
programada (MCP) fueron hechas en el contexto del desarrollo. De hecho, como ya se
menciona en un apartado anterior, el termino muerte celular programada se comenz
a utilizar para definir la muerte celular ocurrida en determinado momento y en lugar
determinado como parte del plan de desarrollo de un organismo. La dificultad que se
ha presentado a la hora de estudiar la apoptosis en el desarrollo, es la eficacia en el
proceso de aclaramiento de las clulas apoptticas.
En algunos sistemas de estudio, las clulas apoptticas en gran nmero de ocasiones
eran vistas en el interior de las clulas vecinas encargadas de fagocitarlas. Esto hace
que sea muy difcil calcular hasta donde llega el papel ejercido por la apoptosis en
algunos procesos del desarrollo embrionario, ya que el nmero de clulas apoptticas
que se pueden identificar en determinado momento en un tejido embrionario es
siempre muy bajo, y no se corresponde con la tasa real de apoptosis. Esto hace que
en biologa del desarrollo, la muerte celular programada est an subestimada,
aunque se puede suponer la gran importancia que debe tener a partir de los datos de
experimentos que muestran, que en organismos complejos, la perdida de
funcionalidad del proceso de apoptosis altera el desarrollo de tal forma, que en
muchos casos el animal no es viable.
A pesar de las dificultades se han hecho avances a lo largo de los aos en el estudio
de la apoptosis en este sistema. Se han determinado algunos objetivos que cumple la
apoptosis dentro del desarrollo de un organismo, todos encaminados en ltimo lugar, a
la eliminacin de clulas sin utilidad en ese momento y lugar. Los objetivos son los
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siguientes:

Escultura de distintas estructuras
El ejemplo ms claro de esto es la eliminacin de las membranas interdigitales para la
formacin de los dedos en vertebrados superiores. Otro proceso de formacin de
estructuras en que esta involucrada la apoptosis es en el vaciado de cuerpos slidos
para crear una luz. Por ejemplo, la formacin de la cavidad preamniotica en el embrin
de ratn por la muerte de clulas ectodermales de su interior.
Eliminacin de estructuras
En el proceso de desarrollo a veces se forman estructuras que despus es necesario
suprimir. La razn es que pueden ser restos vestigiales de alguna estructura necesaria
para una especie ancestral pero a la que la evolucin ha hecho perder la utilidad.
Tambin pueden ser formaciones requeridas para determinados estadios del
desarrollo y que despus ya no son de utilidad. Por ltimo, tambin pueden ser
estructuras necesarias para un sexo pero no para el otro. Ejemplos de este objetivo de
la apoptosis durante el desarrollo son los tubos pronefrticos, necesarios en peces y
larvas anfibias pero que han dejado de serlo en mamferos y por eso son eliminados.
Tambin los ductos de Mllerian, que forman el tero y los oviductos en hembras de
mamferos pero que en machos son eliminados por apoptosis.
Control de la sobreproduccin de clulas
En muchos organismos existe, en un principio, una sobreproduccin celular y despus,
el nmero es ajustado a lo necesario mediante apoptosis. Aunque se haba prestado
mayor atencin al control de proliferacin celular como mecanismo de ajuste del
nmero de clulas en determinado tejido, parece que este mecanismo est controlado
principalmente por apoptosis. Un ejemplo es la generacin de neuronas y
oligodendrocitos que se hace en exceso para despus ajustar su nmero en funcin
del nmero de clulas que inervan o de axones que mielinizan respectivamente.

Control de las clulas defectuosas
Durante el desarrollo, se eliminan por apoptosis clulas anormales, con localizacin
errnea, no funcionales o potencialmente peligrosas, de forma que solo completen el
proceso de desarrollo clulas no daadas. Para ilustrar esto existen estudios en los
que irradian hembras de ratn durante la gestacin. La mayora de los embriones
mueren a consecuencia de esto, pero el incremento de anormalidades en los ratones
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que nacen es muy baja lo que indica que existe un mecanismo de proteccin contra el
dao celular en el que interviene la apoptosis.

Formacin de clulas diferenciadas especiales
Existen en los organismos ciertos tipos celulares que son especiales ya que han
perdido su ncleo y orgnulos en el proceso de diferenciacin terminal. Es el caso de
los hemates o los queratinocitos de la piel. Aunque est an sin determinar, existen
indicios de que estos procesos especializados de diferenciacin son en realidad
formas modificadas de apoptosis.
Existen de todas formas en los organismos en desarrollo mucha ms muerte celular de
la que se puede explicar, incluso antes de que las clulas hayan alcanzado el grado de
diferenciacin que las predisponga hacia determinada funcin. Se especula que la
respuesta a esta muerte celular sin justificacin sea un fenmeno de seleccin
continua dentro del proceso del desarrollo.
La muerte de las clulas durante el desarrollo obedece a una serie de seales. Estas
seales pueden proceder de las propias clulas que van a hacer apoptosis en un
proceso de autorregulacin, o del exterior. El ltimo parece ser el mecanismo se
sealizacin utilizado en los sistemas estudiados. La seal externa, que puede ser un
factor soluble asociado a la membrana de otras clulas o a la matriz extracelular,
puede inducir la supervivencia de la clula o bien inducir su apoptosis. Un ejemplo
clsico de induccin de apoptosis mediante una seal de forma sistmica, es la
perdida de la cola durante la metamorfosis de los renacuajos en respuesta al
incremento en sangre de una hormona tiroidea.
En el proceso global de desarrollo es posible que ocurra una combinacin de seales
positivas y negativas para dar lugar a que esta se desarrolle de forma favorable.

Homeostasis
Este es un trmino general que se emplea para designar los mecanismos encargados
de la regulacin de distintos procesos dentro del organismo. Uno de estos
mecanismos de homeostasis, en que la apoptosis juega un papel muy importante, es
el de la regulacin del recambio de clulas en los tejidos. La mayora de los tejidos del
organismo experimentan, en mayor o menor medida, un recambio celular sostenido
por cierto grado de proliferacin de las clulas que lo componen u originan,
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acompaado de muerte y posterior eliminacin de clulas "viejas". Esta muerte tiene
lugar por apoptosis.
El concepto de senectud de las clulas est en parte asociado a la acumulacin de
daos en su material gentico, que las convierte en potencialmente peligrosas. Como
se podr ver a continuacin, estos daos en el ADN desencadenan respuestas
mediadas por quinasas y en ltimo lugar por el factor de transcripcin p53, que pueden
culminar con la apoptosis de la clula si los daos son suficientemente graves. Otra
seal que puede desencadenar la eliminacin por apoptosis de una clula dentro de
determinado tejido, es la prdida de adhesiones con la matriz que lo rodea. Este tipo
de apoptosis por desarraigo se denomina "anoikis" y, adems de eliminar las clulas
que ya han dejado de formar parte del tejido al perder sus conexiones a l, evita que
se puedan unir a matrices en otras localizaciones originando una displasia.

La anoikis se descubri en clulas epiteliales y endoteliales, y se ha documentado in
vivo en un tejido sujeto a un recambio constante como es la piel. En la actualidad se
est investigando el papel de molculas de adhesin como las integrinas, as como de
otros componentes conocidos de las rutas de sealizacin de apoptosis como los
receptores de muerte y las caspasas en la sealizacin de la anoikis.
Papel de la apoptosis en el sistema inmunitario
La muerte celular programada es muy importante para el desarrollo y funcionamiento
del sistema inmunitario, debido a que interviene en los eventos de formacin del
repertorio de clulas T y B, en los mecanismos de tolerancia central y perifrica, en la
eliminacin de clulas autorreactivas, en el establecimiento de la memoria
inmunolgica y en los mecanismos citolticos de clulas asesinas naturales y linfocitos
T citotxicos.
Es conocido que el 95% de los timocitos son eliminados en el timo por mecanismos de
apoptosis, proceso denominado seleccin negativa (delecin clonal), el cual elimina la
existencia de clones T autorreactivos.

Tambin en la mdula sea existe un proceso similar de delecin de clones B,
autorreactivos en el estadio B inmaduro por entrecruzamiento de la inmunoglobulina
de superficie en ausencia de seales coestimulatorias. No obstante, la apoptosis no se
restringe a las clulas inmaduras.
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FIGURA 1: Factores que regulan la ruta de las clulas T activadas, despus del
reencuentro con el Aq.
Tambin los linfocitos T maduros, bajo ciertas condiciones, pueden sufrir apoptosis, lo
que corrobora su papel inmunorregulador. Entre los factores que pueden inducir
apoptosis en clulas maduras estn: los glucocorticoides y las radiaciones gamma, la
estimulacin del complejo TCR/CD3 por anticuerpos monoclonales, Ags nominales y
superantgenos y la estimulacin de los receptores CD2, Fas/Apo-1 y TNF.
Se ha demostrado que la sensibilidad para lograr la apoptosis es ms lenta en clulas
maduras y requiere previa activacin. La ruta que siguen los linfocitos T al ser
estimulados depende de una serie de elementos que determinan si la clula prolifera,
o si muere por apoptosis.
Mecanismos selectivos
Para asegurar el funcionamiento ptimo de algunos de los sistemas fisiolgicos que
componen los organismos superiores, deben existir procesos de seleccin celular.
Estos estn basados en mecanismos de generacin de variedad celular en cuanto a
su funcionalidad, seguidos de una seleccin de los mejores clones, normalmente en
un ambiente de competencia. Estos fenmenos reproducen en el desarrollo del
organismo, los procesos evolutivos que han dado lugar a la especializacin y
optimizacin de las especies. De la misma forma, consiguen una eficacia ptima de
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sus componentes as como una adaptacin individualizada de cada organismo, en la
que la participacin del medio externo tiene gran importancia. Dentro de estros
procesos de seleccin, la apoptosis juega un papel fundamental como herramienta
para hacer desaparecer las clulas que no han sido seleccionadas.

Dos sistemas fisiolgicos donde los fenmenos de seleccin son muy importantes son
el nervioso y el inmune, precisamente sistemas entre cuyos objetivos se encuentran
relacionar al organismo con su entorno y proporcionarle la mejor adaptacin a el.
Debido a la naturaleza de trabajo, el ejemplo de proceso de seleccin que se va a
exponer a continuacin pertenece al sistema inmune.
Seleccin negativa en timo
Este proceso que se lleva a cabo en el timo como etapa final de la maduracin de los
linfocitos T, tiene como objeto la eliminacin, por apoptosis, de los clones de timocitos
que hayan generado un receptor del linfocito T hacia el antgeno (TCR, de T cell
receptor) con especificidad hacia un Ag propio. De esta forma se hace posible la
autotolerancia en los organismos, es decir, la incapacidad de responder a un Ag propio
y por lo tanto, de desencadenar procesos autoinmunes. En el timo tiene lugar la
adquisicin de tolerancia central hacia todos los Ag que puedan ser presentados por
sus clulas, fundamentalmente protenas ubicuas de membrana y suero.

Se diferencia de la tolerancia perifrica adquirida en otras etapas de la ontogenia hacia
Ag propios que solo pueden ser presentados en los tejidos perifricos. La seleccin de
los clones T autorreactivos se lleva a cabo en la etapa de doble positividad de los
timocitos (CD4+, CD8+). Estos se unen con alta afinidad al MHC que contiene
pptidos propios y que es presentado por clulas presentadoras de Ag (APC) del timo.
Esta unin de alta afinidad dispara en el timocito el programa de muerte por apoptosis.
Se conoce poco acerca de los mecanismos moleculares que dirigen este proceso,
pero parece ser muy importante en el, la presencia de las dos molculas CD4 y CD8.
Este proceso de seleccin negativa, junto al de eliminacin de timocitos con
reagrupamientos incorrectos en su TCR, parece ser responsable de la muerte del 95%
de linfocitos T durante los procesos de maduracin en timo (Nossal 1994, revisin del
Cell).


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I CARACTERIZACIN MOLECULAR DE LA APOPTOSIS
MODELO INICIAL: C. ELEGANS
- FAMILIAS DE MOLCULAS IMPLICADAS EN APOPTOSIS
- Receptores de muerte:
> CD95 (APO-1/Fas)
> TNFR1
> DR3
> DR4 y DR5
> Protenas de la familia Bcl-2
Bcl-2
Bcl-Xl
Bax
> Miembros de la subfamilia BH3
- Protenas de la familia de las caspasas
- REGULACIN MOLECULAR DEL PROCESO DE APOPTOSIS
Modelo inicial: C. elegans
Dentro del estudio del proceso de apoptosis que se ha venido realizando a lo largo de
los ltimos aos, result determinante la descripcin de los genes implicados en la
maquinaria de apoptosis del nematodo caenorhabditis elegans (C. elegans) pertenece
a un filo formado por:
"Gusanos de piel lisa, no segmentados, con un cuerpo alargado, cilndrico y forma
afilada en el extremo. Incluye formas libres y parsitas, ambas acuticas y terrestres"

Es un organismo de aproximadamente 1mm de longitud, vive en el suelo sobre
materia vegetal en descomposicin, alimentndose de microorganismos. Su vida se
prolonga a lo largo de 2-3 semanas durante las cuales se reproduce. El estudio de
este nematodo fue iniciado en los aos 60 por Sydney Brenner.
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La ventaja que proporciona c. elegans como sistema experimental es que posee 959
clulas somticas transparentes, que pueden ser estudiadas individualmente mediante
microscopa, y 17800 genes diferentes que forman su mapa gentico secuenciado
ntegramente. Este organismo, a pesar de su simplicidad, desarrolla los procesos que
en organismos superiores son motivo de estudio: embriognesis, desarrollo,
funcionamiento del sistema nervioso, comportamiento y envejecimiento. C. elegans
representa el compromiso perfecto entre la simplicidad en su tratamiento y la
complejidad de las funciones y los mecanismos que posee, regidas por genes que se
han conservado a lo largo de la evolucin hasta los mamferos.
La apoptosis juega un importante papel en el desarrollo embrionario de c. elegans. A
partir de los estudios que Horvitz inici en 1986 (Ellis, Cell 1996 mirar bibliografia
Horvitz), se estableci el nmero y la localizacin de las clulas que moran por
apoptosis durante el desarrollo y mediante el anlisis de mutantes se describieron los
genes implicados en este mecanismo. Estos genes se denominaron ced y se
numeraron desde el -1 al -10. Ced-3. -4 y -9 regulan la fase ejecutora de la apoptosis y
el resto est implicado en los procesos de eliminacin por fagocitosis de la clula
apopttica. Posteriormente se describi el gen EGL-1 que participa tambin en la
regulacin de la MCP (Hengertner, Cell 1998).

El complejo ejecutor formado por ced-3, -4 y -9 representa la imagen ms simplificada
del programa apopttico que se puede encontrar en clulas de mamferos. Cada una
de las protenas expresadas a partir de ellos son equivalentes a las que, en
organismos superiores, constituyen los pilares que soportan la red de sealizacin de
la apoptosis. CED-3 es una proteasa equivalente a las caspasas de mamferos,
protenas ejecutoras de la apoptosis que desmontan la maquinaria celular degradando
un grupo seleccionado de protenas. CED-3 se activa por homodimerizacin y para
hacerlo posible, existe otra protena CED-4 capaz de interaccionar con ella y tambin
consigo misma.
La unin de CED-3 a CED-4 y la posterior homodimerizacin de esta, traera consigo
la activacin de CED-3. CED-4 tiene tambin su homologo en mamferos, Apaf-1, que
se une a procaspasa-9 y facilita su activacin. La tercera protena de esta maquinaria
es CED-9, la pieza reguladora, que se une a CED-4 y la inhabilita para mediar la
activacin de CED-3, al impedir su homodimerizacin (28). Su interaccin con una
protena pro-apopttica como es EGL-1 en c. elegans, la separa de CED-4 dejndola
realizar su funcin activadora de la apoptosis (Hengertner, Cell 1998). En mamferos,
13

esta protena es equivalente a toda una familia con miembros tanto pro-apoptticos
como anti-apoptticos que regulan el proceso de muerte celular. Las molculas
equivalentes entre los sistemas que se han mencionado anteriormente, presentan tal
homologa de secuencias que muestran que este sistema se ha mantenido totalmente
conservado a lo largo de la evolucin. Los componentes del sistema que parece que
han sido de adquisicin ms recientes son los receptores de muertes, ya que ningn
equivalente de ellos ha sido encontrado an en c. elegans.

De esta forma, el estudio del nematodo c. elegans estableci las bases para la
caracterizacin, que hoy da an es incompleta, de la compleja red de procesos que
culminan con la apoptosis celular y que a continuacin se resumen.

Familias de molculas implicadas en el proceso de apoptosis
Receptores de muerte
Las molculas relacionadas con el proceso de apoptosis que se han mantenido a lo
largo de la evolucin, desde organismos como el c. elegans hasta los mamferos,
llevan a cabo un programa de apoptosis iniciado por seales que provienen del interior
celular. Estas seales responden a eventos que comprometen el buen funcionamiento
de la clula dentro del entorno donde est situada: perdida de contacto con las clulas
que la rodean, estrs celular o seales contradictorias y simultneas en cuanto a la
puesta en marcha o no, de su ciclo de divisin. Ante esta situacin, en que la clula es
potencialmente peligrosa para el sistema donde se encuentra integrada, se pone en
marcha la maquinaria de apoptosis y es eliminada.

Este sistema sealizador no puede sostener el tipo de apoptosis llamado "instructivo"
en el cual a una clula que no ha sufrido ninguno de los daos mencionados
anteriormente, se le dirige activamente hacia la apoptosis ya que su eliminacin es
necesaria para llevar a cabo determinado proceso fisiolgico. Los mamferos han
desarrollado mecanismos para llevar a cabo esta forma de apoptosis que es
especialmente importante dentro del sistema inmune. En la apoptosis "instructiva"
tienen un papel fundamental los llamados receptores de muerte, situados en la
superficie de la clula, y que reciben la seal de ligandos de muerte especficos para
cada uno de ellos. Los receptores pueden dar la seal directamente a las caspasas en
pocos segundos disparando as el programa de apoptosis.
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Los receptores de muerte pertenecen a la superfamilia del receptor de TNF (TNFR)
cuyos miembros tienen en comn un dominio extracelular rico en cisteina. Otro rasgo
comn a todas estas molculas sealizadoras de apoptosis es la presencia de una
secuencia situada en su dominio intracitoplasmtico y que servira para acoplar al
receptor con el resto de la maquinara apopttica. Los receptores de muerte mejor
caracterizados son los siguientes:
CD95 (APO-1/Fas)
Esta protena fue identificada inicialmente mediante un Ac dirigido contra ella y que
define un Ag presente en la superficie de clulas como linfocitos humanos B y T
activados, algunas lneas tumorales de origen linfoide y otros tipos celulares como son
los hepatocitos. El Ac contra CD95 se une a las clulas que lo expresan
provocndoles apoptosis in vitro. Por otra parte, inyectando in vivo Ac anti-CD95 a
ratones nu/nu con xenotransplantes de tumores humanos, eliminaban estos por
apoptosis de sus clulas (Trauth, Science 1994). El gen que codifica para la protena
CD95 en humano se encuentra en la localizacin 10q23 (cromosoma 10) y consiste en
una serie de 9 exones interrumpidos por 8 intrones. El dominio extracelular de la
protena est formado por tres subdominios ricos en cisteinas, codificados por los
exones 2, 3 y 4, mientras que la zona intracitoplasmtica, incluida la regin reguladora
llamada "death domain", se encuentra en el exn 9.
El ligando fisiolgico de CD95 se denomina CD95L y es una protena perteneciente a
la familia del TNF (tumor necrosis factor). CD95 se expresa de forma bastante general
en los distintos tejidos. La protena ha podido ser detectada en clulas epiteliales,
fibroblastos, osteoblastos y ciertos tipos de endoteliales, adems en ratn, el ARNm
de la protena se ha detectado abundantemente en timo, corazn hgado y ovario. Por
otra parte, CD95L se expresa predominantemente en clulas T y NK activadas, as
como de forma constitutiva en los tejidos que gozan de "privilegio inmune". Este patrn
de expresin de ambas molculas demuestra que deben tener implicacin en una
serie importante de procesos fisiolgicos relacionados con el sistema inmune.

Resulta importante a la hora de determinar el papel jugado por algunas molculas,
estudiar el efecto que tiene su prdida de funcin en ratones "knockout". En el caso
del par CD95/CD95L, existen ratones que portan las mutaciones homocigticas lpr
(lymphoproliferation) o gld (general lymphoproliferation disease), que se traducen por
una perdida de funcin de los genes CD95 y CD95L respectivamente. Estos ratones
presentan una serie de alteraciones como son linfoadenopatas y esplenomegalia por
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acumulacin de clulas de origen T CD4- CD8-, niveles elevados de autoAc y
desordenes de carcter autoinmune e inflamatorios. En el caso de las molculas
CD95/CD95L, existe tambin un referente humano de la perdida de su funcin, ya que
se ha descrito en una serie de nios una mutacin con carcter heterocigtico en el
gen que codifica CD95. Esta mutacin da lugar a un fenotipo similar al de los ratones
lpr y gld, incluyendo linfoadenopatas, esplenomegalia, hipergammaglobulinemia y, de
forma variable, una serie de alteraciones autoinmunes (Fisher, Cell 1995). Estos datos,
tanto en ratn como en humano, han resultado de ayuda a la hora de establecer una
serie de procesos fisiolgicos en los que la implicacin de la apoptosis mediada por la
pareja de molculas CD95/CD95L est perfectamente demostrada. Estos procesos
son:

Modulacin negativa de la respuesta inmune mediante la muerte por apoptosis de las
clulas T activadas una vez realizada su funcin (Naga, Science 1995). De esta forma
se evita su acumulacin. Tambin parece estar implicada en la deleccin de clones
autorreactivos de linfocitos B.

Mecanismo efector de citotoxicidad por parte de linfocitos T y clulas NK. Se ha
demostrado un papel importante de la apoptosis va CD95 en la citotoxicidad mediada
por clulas T y NK. Este mecanismo ocurre en unin al clsico, mediado por perforina
/granzima B.

Existen rganos, como el ojo o testculos; cuya estructura no podra soportar los
efectos de una respuesta inmune y su proceso inflamatorio asociado. Estos tejidos
estn aislados a estos procesos y se conocen como "sitios de privilegio inmune". Se
pensaba que este "privilegio" se mantena evitando la entrada de clulas activadas en
ellos. Recientemente, se ha propuesto otro mecanismo de conservacin del privilegio
inmune. Las clulas activadas pueden entrar en estos tejidos pero, una vez all, son
eliminadas por apoptosis va CD95 (Griffith, Science 1995). Esto se confirm con el
hallazgo de una expresin constitutiva de CD95L en el epitelio y endotelio de la cornea
y el iris, en las clulas ciliares del ojo, as como en las clulas de Sertoli en el testculo,
y con la observacin de que, en ratones gld, se produce una inflamacin masiva en la
retina tras la infeccin con virus de herpes simple a diferencia de los ratones wild-type
que no presentan apenas clulas inflamatorias.
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TNFR1
El receptor 1 de TNF es una protena de aproximadamente 55 kDa y se expresa en la
mayora de los tipos celulares. Esta protena da nombre a la familia en que est
integrada, por tanto comparte con CD95 los tres subdominios ricos en cisteinas
situados en la zona extracelular. El ligando de TNFR1 es TNF, una citoquina producida
principalmente por macrfagos activados y clulas T en respuesta a infeccin. A
diferencia de la pareja formada por CD95/ CD95L, el par TNFR1/TNF es capaz de
trasmitir a la clula dos tipos de seales muy distintas entre s. Por una parte, la unin
de TNF a su receptor TNFR1 activa a los factores de transcripcin NFkB y AP-1 dando
lugar a la induccin de genes de carcter proinflamatorio e inmunomodulador. Por otra
parte, esta unin puede dar lugar tambin a una seal de apoptosis. La sealizacin
de apoptosis por medio de TNFR1 es mucho ms limitada que la mediada por CD95.
En el caso de TNFR1, la unin de su ligando solo sealiza apoptosis en algunos tipos
celulares y solo cuando la sntesis de protenas ha sido bloqueada. De este hecho se
deduce que debe existir en las clulas algn factor que bloquee las seales de
apoptosis derivadas de TNFR1. La expresin de este factor estar probablemente
controlada a travs de NFkB y JNK/AP-1.
DR3
El receptor DR3 (death receptor 3) es muy parecido en cuanto a su secuencia, a
TNFR1. Cuando se une a su ligando Apo3L, da lugar tambin a una doble seal que
puede llevar a la activacin de NFkB o a la muerte por apoptosis de la clula. Las
molculas que median ambas vas de la sealizacin son tambin las mismas que en
el caso de TNFR. En el nico aspecto en que existen diferencias entre ambas rutas de
sealizacin es la expresin, tanto de receptores como de ligandos. El mensajero de
Apo3L se encuentra expresado de forma constitutiva en muchos tejidos, mientras que
DR3 se encuentra presente principalmente en bazo, timo y sangre perifrica y se
induce por la activacin en linfocitos T. De forma inversa, es el receptor de TNF el que
se encuentra expresado de forma ubicua mientras que el ligando se expresa solo en
linfocitos y macrfagos activados. Esta diferencia sugiere distintas funciones biolgicas
para ambas vas sealizadoras.
DR4 y DR5
DR4 y DR5 son receptores de muerte cuyo ligando llamado TRAIL o Apo2L es el que
muestra mas similitud con CD95L aunque, a diferencia de estas molcula, su ARN
17

mensajero se encuentra expresado de forma constitutiva en gran cantidad de tejidos y
la expresin se eleva en linfocitos T se sangre perifrica cuando estos son
estimulados. La seal a travs de Apo2L produce apoptosis en una gran variedad de
lneas tumorales. Se ha descrito tambin en una subpoblacin de clulas T maduras,
un aumento de la apoptosis mediada por Apo2L al tratar estas con IL-2. Esto puede
sugerir un posible papel de estos receptores en la deleccin perifrica de los linfocitos
T (Martnez Lorenzo, Eur. J. Immunol. in press). Otro posible papel de la apoptosis
mediada por Apo2L es la eliminacin de clulas infectadas por virus (Jeramias, Eur. J.
Immunol. 1998).

La seal de apoptosis mediada por estos receptores puede ser regulada mediante una
familia de receptores "decoy" (seuelos), DcRs, que protegen a la clula de la
apoptosis provocada por la unin de TRAIL. Uno de los miembros de esta familia es
DcR1 (TRID, TRAIL-R3 LIT), una protena ligada a la superficie celular por una unin
glicosil fosfatidil-inositol (GFI), que se asemeja a la porcin extracelular de DR4 pero
sin poseer ningn dominio intracitoplasmtico. DcR1 es capaz de unirse a TRAIL y su
transfeccin en clulas sensibles a esta va de sealizacin reduce notablemente la
apoptosis mediada por esta seal. DcR2 (TRAIL-R4 TRUNDD) es tambin un
receptor homologo a DR4 y DR5 con el dominio intracitoplasmtico truncado. Se ha
demostrado que la transfeccin con DcR2 inhibe la apoptosis mediada por TRAIL de
forma no activa, ya que la eliminacin de su dominio interno no influye en su actividad
inhibidora. Todos estos datos indican que, tanto DcR1 como DcR2 compiten con DR4
y DR5 por la unin de TRAIL, dificultando as que la seal de apoptosis sea
transmitida a travs de estos receptores.
Protenas de la familia Bcl-2
Un proceso como la apoptosis, que culmina con la muerte de las clulas y que se
cuenta con casi la totalidad de la maquinaria para llevarse a cabo ya sintetizada, a
falta solo de la seal que la ponga en marcha, necesita de mecanismos de regulacin
de gran exactitud y seguridad. Una de las vas de regulacin de la apoptosis ms
importantes es llevada a cabo por una familia de protenas que cuenta en la actualidad
con al menos 15 miembros en mamferos y otros tantos en virus, y que tiene como
caracterstica, la homologa de todos sus miembros con Bcl-2 que fue la primera que
se describi. Las molculas de esta familia tienen su equivalente en el sistema de c.
elegans. Una de sus protenas encargadas de llevar a cabo el programa de apoptosis,
18

CED-9, muestra gran similitud tanto estructural como funcional con Bcl-2 impidiendo la
activacin de CED-3, efectora de la apoptosis, por CED-4.
La descripcin del primer miembro conocido de la familia, Bcl-2, se realiz al estudiar
el punto de corte en la translocacin t(14:18), presente en el 85% de los linfomas
foliculares de clulas B humanas. Esta translocacin trasladaba un protoconcogen, al
que se denomin bcl-2, desde su posicin normal en 18q21 hasta el locus de la
cadena pesada de la inmunologa en 14q32. Esto colocaba a bcl-2 bajo las rdenes
del promotor de la cadena pesada de inmunoglobulina, desregulando su trascripcin y
dando como resultado la sobreexpresin de Bcl-2 en las clulas de linfoma.

A partir de la descripcin de esta protena, tuvieron lugar otras muchas descripciones
de molculas que guardaban homologa con esta y que tenan carcter anti o pro-
apopttico. Lo que identifica a todas estas protenas como miembros de una sola
familia es la presencia en su estructura de al menos una de cuatro secuencias
consecutivas descritas y que se numeran desde BH1 a BH4. De estos dominios
parece que BH3 est directamente relacionado con una funcin pro-apopttica y el
resto de ellos con una funcin anti-apopttica. La estructura que presentan est
tambin condicionada a la presencia de estos dominios. BH1, BH2 y BH3 forman una
a-hlice cada uno de ellos y cuando estn presentes en la misma molculas, por
ejemplo Bcl-x, pueden formar una hendidura hidrofbica, en la cual podra encajar la a-
hlice formada por el dominio BH3 si se encontrara en otra molcula de la familia
orientado hacia el exterior.
Este dato estructural explica el importante papel que tiene en el funcionamiento de
estas molculas las homo y heterodimerizaciones, que tienen lugar ente ellas y que
pueden dar lugar a su activacin o inactivacin. De esta forma, se creara un equilibrio
entre ellas en el que sera de vital importancia sus cantidades relativas. La
heterodimerizacin no es necesaria para la actividad de los miembros anti-apoptticos
de la familia y para los pro-apoptticos del grupo Bax. Sin embargo, es muy importante
para los miembros pro-apoptticos del grupo BH3 que basan gran parte de su
funcionamiento en la unin a las protenas anti-apoptticas alterando su actividad. Los
miembros ms estudiados y que poseen una relacin con el sistema inmune mejor
establecida son los que se exponen a continuacin:
Bcl-2
Es la protena prototipo de esta familia. Pesa 26 KDa y posee los cuatro dominios que
la definen (BH1-BH4). Bcl-2 es una protena integral de membrana y se encuentra en
19

la cara citoplasmtica de la membrana externa de la mitocondria, el retculo
endoplsmico y la envuelta nuclear. Es en esas membranas, gracias a que puede
formar una estructura similar a un poro, donde se desarrolla una de sus posibles
funciones: modificar el flujo de molculas o pequeas protenas a travs de ellas,
interviniendo en la estabilidad de orgnulos como la mitocondria ante la existencia de
posibles daos. Su sobreexpresin puede evitar o al menos retrasar varias formas de
muerte celular programada como las inducidas por retirada de factores de crecimiento,
irradiacin g, glucocorticoides y mltiples drogas quimioterpicas.
En contraste, parece no influir en otros mecanismos de apoptosis como, por ejemplo,
la sealizacin va CD95 en la mayora de los tipos celulares. A la hora de establecer
el papel fisiolgico realizado por Bcl-2, debe estudiarse el fenotipo que presenta el
ratn knockout para el gen que lo codifica. El animal se desarrolla normalmente pero
termina mostrando una exagerada apoptosis de linfocitos y melanocitos, as como
lesiones neuronales e intestinales y una enfermedad renal terminal. Esto lleva a
pensar que Bcl-2 no tiene un papel muy importante, o al menos tiene un papel
redundante, en el desarrollo embrionario pero, ya despus, interviene en la regulacin
de la apoptosis en linfocitos, neuronas y el resto de clulas y tejidos mencionados
anteriormente.

Bcl-xL
Bcl-xL es una de las protenas ms estrechamente relacionada con Bcl-2, tanto en su
estructura como en su funcin. Posee los cuatro dominios BH y su peso molecular es
de 30 KDa. Su sobreexpresin puede mediar una resistencia significativa a la muerte
celular por apoptosis dependiente de deprivacin de factor de crecimiento. Se ha
estudiado la expresin del ARNm de esta molcula y parece encontrarse en una gran
variedad de tejidos entre los que destaca algunas poblaciones del sistema
hematopoytico y el sistema nervioso central. Esta distribucin preferencial puede
sugerir algunos de los papeles fisiolgicos que puede jugar la expresin de esta
protena.

La expresin del mensajero de esta molcula en tejido neural adulto es alta y
constitutiva y esto puede estar relacionado con la capacidad de este tejido de
mantener la viabilidad celular postmittica durante largos periodos de tiempo. Un dato
que hace importante a la molcula Bcl-xL en el contexto de este trabajo es que, dentro
de la ontogenia de los linfocitos B, Bcl-xL se expresa en dos momentos muy
concretos: uno es el estadio pre-B y otro es durante la estancia de las clulas en los
20

CG, justo al mismo tiempo en que se produce una "downregulation" de Bcl-2. Estos
datos acompaados de experimentos en que se estudia el efecto de la sobreexpresin
de Bcl-xL sobre la respuesta inmune a nivel de rganos linfoides secundarios revelan
un importante papel de la protena Bcl-xL en estos territorios aunque no se ha podido
establecer an su mecanismo de accin. El ratn knockout para este gen es inviable lo
que demuestra su enorme importancia tambin el desarrollo embrionario.

Bax
Esta protena es uno de los miembros pro-apoptticos ms importantes de la familia.
Le da nombre a la subfamilia Bax, su peso molecular es de 21 KDa y posee los
dominios BH1, BH2 y BH3 aunque son BH1 y BH2 los que guardan una estrecha
homologa con Bcl-2. Bax est ampliamente expresado en los distintos tejidos y su
sobreexpresin acelera la muerte en respuesta a distintas seales. Lo que ha hecho
recientemente a Bax objeto de estudio es su implicacin en los fenmenos
mitocondriales de la apoptosis y su capacidad de llevar a cabo una forma de muerte
celular programada independiente de muchos de los mecanismos de regulacin y
ejecucin de este proceso. Esto parece estar relacionado con su capacidad para
interaccionar con los canales que controlan la permeabilidad y el flujo ionico en dicho
orgnulo.

Miembros de la subfamilia BH3
Esta subfamilia est compuesta solo por miembros proapoptticos que, excepto por el
dominio BH3, no muestran homologa con Bcl-2. Para ejercer su actividad, estas
protenas pueden formar heterodmeros con miembros antiapoptticos de la familia.
Para ello, el dominio BH3 de los miembros de este grupo puede introducirse en el
hueco hidrofbico formado por la asociacin de las regiones BH1, BH2 y BH3 de los
miembros antiapoptticos. Un ejemplo de la accin de esta familia de proteina es la
ejercen dos de sus miembros Bid y Bik sobre la mitocondria, donde inducen la
liberacin de citocromo c y posterior apoptosis (Shimizu, PNAS, 2000).

Protenas de la familia de las caspasas
Dentro de la maquinaria que lleva a cabo el programa de apoptosis, los miembros
ejecutores son una serie de proteasas englobadas bajo el nombre de caspasas. Este
sistema ejecutor se ha mantenido a lo largo de la evolucin y, tras su descripcin en c.
elegans, se encontr el equivalente en mamferos gracias a la homologa que
21

presentaban ambas molculas. Esta primera proteasa encontrada en mamfero se
denomin ICE (interleukin-1b-converting enzime) o caspasa-1 (cisteina-aspartasa-1) y
es precisamente uno de los pocos miembros de la familia al que no se le ha podido
hallar relacin directa con el proceso de apoptosis, sino ms bien con el de la
inflamacin.

La familia de las caspasas en humanos est formada hasta el momento por 11
miembros descritos, y todos ellos tienen en comn que se encuentran en forma de
zimgeno o proenzima con una estructura bien definida: a) el dominio N-terminal es
muy variable tanto en su secuencia como en su longitud y tiene funciones de
regulacin y activacin, b) la regin cataltica est formada por dos dominios, uno
grande ("20 KDa) y otro pequeo ("10 KDa), que darn lugar a las dos subunidades
del enzima una vez activada. Las caspasas se dividen en dos grupos segn la longitud
de su regin reguladora N-terminal o prodominio. Las caspasas con prodominio largo
como son la -1,-2, -4, -5, -8, y -10 parecen estar involucradas en funciones de
regulacin de la activacin de la cascada.
Ejemplos bien conocidos de este grupo son las procaspasas -8 y -10 que contienen en
sus largos prodominios repeticiones de una secuencia de interaccin proteina-proteina
llamada dominio efector de muerte o DED (death effector domain) y las procaspasas -
1, -2, -4, -5 y -9, que contienen dominios de reclutamiento de caspasas o CARDs
(caspase recruitment domains). La presencia en su estructura de estas secuencias
unido a su localizacin cercana a la membrana plasmtica hacen posible su
reclutamiento hacia el complejo formado en torno a receptores de superficie
sealizadores de apoptosis como CD95 y TNF, activndose all y dando lugar al
comienzo de la cascada de proteolisis. Por esta situacin dentro del proceso se las
conoce como caspasas iniciadoras. El otro grupo est compuesto por las caspasas
con prodominio corto como son las caspasas -3, -6 y -7. Estas parecen estar situadas
"downstream" en la cadena y se ha demostrado in vitro que son activadas por alguna
de las caspasas iniciadoras. Los estudios realizados sugieren que estas caspasas
llamadas efectoras son las que actan al final de la cascada sobre los componentes
celulares, proteolizndolos.
Las caspasas realizan su funcin enzimtica de forma especfica y eficaz. Cortan una
cisteina precedida por un asprtico, cuando existe en el sustrato una secuencia de
reconocimiento compuesta de cuatro aminocidos y que vara significativamente entre
las diferentes caspasas. Adems, es necesario que la protena sustrato posea tambin
una estructura terciaria que le permita ser reconocida por las caspasas. A la hora de
22

estudiar el papel de las caspasas en los distintos sistemas, se utilizan pptidos
inhibidores sintticos, que compiten con los sustratos fisiolgicos por el sitio activo del
enzima. Estos pptidos pueden ser especficos para bloquear la accin de una o
varias caspasas o generales. Tambin existe variabilidad en cuanto a la reversibilidad
de su efecto.
El mecanismo de accin de las caspasas tiene importancia a la hora de explicar tanto
su papel dentro de la apoptosis como su activacin. Todas las caspasas se activan por
proteolisis y cumplen todas las condiciones para que esta activacin sea llevada a
cabo por otras caspasas.
Una de estas molculas activa a la otra cortando entre sus dominios. De esta forma, el
prodominio se pierde y la enzima activa queda formada por un heterodmero
compuesto por la subunidad grande y la subunidad pequea. Ambas subunidades
aportan al sitio activo residuos encargados tanto del reconocimiento de sustrato como
de la catlisis. A la hora de actuar, las caspasas lo hacen en forma de tetrmero, dos
unidades enzimticas que se unen entre s manteniendo ambos sitios activos
independientes (55/5 o 6). Este proceso de activacin puede permitir a las caspasas
realizar su funcin con un efecto cascada que se va amplificando a si mismo desde
que se da la seal de inicio. En cuanto a esto, se ha especulado mucho sobre como
tiene lugar la seal que determina la primera autocatlisis activadora que disparar el
sistema. Este sera adems uno de los puntos donde podra establecerse una
regulacin del sistema.
Existe una hiptesis basada en la observacin de que la sobreexpresin de
determinadas procaspasas en la clula hace que estas se agrupen y se autoactiven.
Esto sugiere que las caspasas iniciadoras podran encontrarse como monmeros a
bajas concentraciones y que la molcula adaptadora unida al receptor de muerte
servira para unirlas propiciando su autocatlisis. Existe tambin un modelo llamado
"de autocatlisis facilitada" que postula que las caspasas se encuentran en la clula
formando complejos o con una conformacin tal, que previene su autocatlisis. Un
cofactor actuara facilitando la activacin, bien cambiando la conformacin de las
misma, o bien liberando un inhibidor del complejo formado, de forma que se permitiese
la autocatlisis de la protena y el comienzo de la seal apopttica.

En cuanto a los sustratos celulares sobre los que actan las caspasas, estos son un
nmero determinado de protenas que son cortadas de manera coordinada con la
finalidad de hacerles perder su funcin o modificrsela, de tal manera, que la
23

organizacin celular resulte desmantelada. La ruptura de sustratos por parte de las
caspasas produce estos efectos en el proceso general:
- Llevan a cabo una degradacin de molculas implicadas en proteger a la clula del
proceso de apoptosis como es el caso de ICAD/DFF45, la molcula que mantiene
inhibida a CAD, la nucleasa responsable de la degradacin del DNA durante la
apoptosis. Otras molculas protectoras de la clula y que son degradadas por
caspasas son alguno de los miembros anti-apoptticos de la familia Bcl-2. En el caso
de estas protenas, la proteolisis libera un fragmento que tiene poder pro-apopttico
por si mismo. De esta forma, las caspasas realizan una alimentacin positiva de su
propio efecto.
- Degradan tambin molculas implicadas directamente en la estructura celular como
son la quinasa de adhesin focal o FAK (focal adhesion kinase) y la quinasa 2 activada
por p21, modificando su actividad. En otras ocasiones, como en el caso de la
gelsolina, la rotura por caspasa le hace perder la regin reguladora pasando a
expresarse de forma constitutiva.
- Otras protenas degradadas por las caspasas son algunas de las relacionadas con la
reparacin en el ADN y con los procesos de replicacin y transcripcin del ADN (DNA-
PKCS) o la poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP). En este ltimo caso, no est an
claro que objetivo persigue la ruptura de estos sustratos dentro del programa general
de apoptosis.
Ante el gran nmero de caspasas que existen, aparentemente con funciones
intercambiables, se plantea la cuestin de si existe una funcin redundante te todas
ellas o si lo que ocurre, es que su actividad es especfica de cada tejido. Experimentos
con ratones knockout para varios miembros de las caspasas proporcionan una
respuesta a esta pregunta, adems de ilustrar sobre el papel fisiolgico de estas
proteasas. Estos estudios concluyen que existe una activacin de las caspasas
dependiente tanto del tejido como del estmulo desencadenante de la apoptosis.

Por ltimo, la actividad de las caspasas va acompaada de la accin de sus
inhibidores al igual que ocurre con otros sistemas proteolticos. Se han identificado
varios de estos inhibidores en virus. Los mejor estudiados son CrmA y p35. CrmA
(cytokine response modifier A) es una molcula producida por el virus cowpox. Inhibe
potencialmente las caspasas -1 y -8, y bloquea la apoptosis causada por TNF, CD95,
la provocada por retirada de suero u otros factores de crecimiento, as como la que se
origina tras romper las uniones de la clulas con la matriz extracelular. p35 es una
24

protena de baculovirus que bloquea principalmente la apoptosis producida por
infeccin viral. Aunque estos inhibidores han sido encontrados solo en varios virus,
existe una familia de protenas inhibidoras de apoptosis (IAPs), alguno de cuyos
componentes se han descrito ya en humanos. Se ha descrito in vitro una potente
activacin selectiva de caspasa-3 y-7 por parte de IAP, aunque el mecanismo de esta
inhibicin continua sin aclararse.

Regulacin molecular del proceso de apoptosis
Hasta este momento se ha podido ver la descripcin de los componentes ms
importantes de la maquinaria de apoptosis en mamfero, as como un pequeo esbozo
de su funcin dentro del sistema. Dentro del proceso de apoptosis, todos estos
elementos se encuentran coordinados entre s, tanto fsica como funcionalmente y
aportan al sistema global una gran variedad tanto de rutas de iniciacin en respuesta a
muy diferentes estmulos, como de puntos de regulacin. En la va sealizadora de
apoptosis que, ms que una forma lineal, presenta una estructura reticular muy
ramificada en sus inicios y que despus va confluyendo hacia rutas comunes para
terminar en una o unas pocas, tienen especial importancia esos puntos de regulacin.

Existen sobre todo algunos, situados al final dentro de la red, donde se deciden
acciones tan drsticas para la integridad celular que constituyen autnticos puntos de
no retorno.
A la hora de entender la interaccin existente entre la seal de apoptosis y la puesta
en marcha de la cascada de proteolisis mediada por caspasa, es necesario conocer la
existencia de una serie de protenas, los adaptadores. Entre estos adaptadores se
encuentran FADD, TRADD y Apaf-1. FADD (Mort-1), es una protena que sirve de
puente entre CD95 y la procaspasa-8. Para ello posee dos regiones de unin que son
las que distinguen a las molculas adaptadoras. Por una parte, un dominio DD (death
domain) por el cual se une a una regin homologa presente en la regin
intracitoplasmtica de CD95, y por la otra, un dominio DED (death effectot domain),
ejemplo partculas del dominio CARD (caspase recruitment domain) de unin
homotpica que poseen tanto las molculas adaptadoras como las caspasas de
prodominio largo y, que en este caso, le sirve para unirse a procaspasa-8. La perdida
de FADD, estudiada mediante ratones knockout, es letal en la etapa embrionaria, lo
que muestra que FADD debe tener otras funciones de sealizacin crticas, adems
de servir de puente entre CD95 y procaspasa-8. TRADD es el adaptador que se une
25

mediante un dominio DD a la regin intracitoplasmtica de los receptores de superficie
TNFR1 y DR3, y acta como plataforma de emisin de varias seales, mediante su
unin con otros adaptadores.
La unin de TRADD con FADD, tambin por la regin DD, media la activacin de
procaspasa-8 como se vi anteriormente. Poe otra parte, TRADD puede unirse
tambin al complejo ofrmado por RIP (que posee tambin dominio DD) y TRAF2,
dirigiendo la seal hacia la activacin de NF-kb. Por ltimo, la protena Apaf-1,
homologa de la protena de c. elegans.CED-4, actua como molcula adaptadora a
nivel de mitocondria, uniendose a procaspasa-9 a travs de un dominio CARD que
posee en su extremo N-terminal. Apaf-1 tiene la capacidad de homodimerizarse,
facilitando la agregacin de la procaspasa como se vera a continuacin. El papel de
Apaf-1 es muy importante, como se demuestra en el efecto que su ausencia tiene en
el ratn knockout, que muere durante la embriognesis con graves alteraciones
craneofaciales, sobrecrecimiento del cerebro y malformaciones en el ojo. El inicio de la
seal de apoptosis puede encontrarse tanto fuera de la clula, en los receptores de
superficie, como dentro de ella respondiendo a estmulos de estrs celular a nivel de
mitocondria o a disfunciones dentro del ciclo celular.
Los receptores en la superficie de la clula como CD95 y TNFR1 dan comienzo a la
seal de apoptosis realizando un reclutamiento de procaspasa-8. Para ello, interviene
la molcula adaptadora FADD que en el caso de CD95 se une de forma directa y en el
de TNFR1 lo hace a travs de la molcula intermedia TRADD (TNFR-associated death
domain). La protena FADD contiene un dominio DED que recluta varia subunidades
de procaspasa-8. TNFR1 puede dar lugar tambin a la activacin de otras
procaspasas mediante la unin de otras molculas adaptadoras como son RAIDD y
RIP2 que contienen regiones CARD, el otro dominio de interaccin proteina-proteina
que sirve para el reclutamiento de procaspasas. A partir de esta activacin se
desencadena el proceso. Otro punto de inicio de la seal de apoptosis es la
mitocondria. Existe una molcula, Apaf-1, homologa en mamferos de la protena CED-
4 de c. elegans, que puede unir procaspasa-9 mediante la interaccin de sus regiones
CARDs. Apaf-1 posee adems otra regin capaz de mediar su homodimerizacin y por
tanto la unin de las procaspasas-9, lo que lleva a su autocatlisis y posterior
activacin. En todos estos sistemas, el complejo formado por los receptores, los
adaptadores y la procaspasa se denomina apoptosoma, y es la formacin de este
complejo lo que da lugar a la activacin de la procaspasa.
26

En el caso de Aaf-1, para llevar a cabo el proceso de formacin de este apoptosoma
es necesaria la presencia de ATP y de citocromo c, una molcula de pequeo tamao
liberada por la mitocondria. De esta forma, la liberacin de citocromo c por parte de la
mitocondria puede mediar la activacin de la procaspasa-9. Esta seal de activacin
puede venir de la mitocondria en si misma como respuesta a distintas formas de estrs
celular o tambin, puede formar parte de un bucle de amplificacin de la seal
mediada por receptores de superficie en la que interviene la mitocondria. En este bucle
de amplificacin interviene una protena pro-apopttica de la familia Bcl-2, Bid, que es
procesada por caspasa-8 dividindose en dos fragmentos. Uno de ellos, el C-terminal,
acta sobre la mitocondria hacindole liberar al exterior citocromo c, que activa el
apoptosoma formado por Apaf-1 y procaspasa-9 llevndole a su procesamiento. De
esta forma, en apoptosis mediada por receptor de muerte en las que existen pocos
precursores de caspasa-8, la seal se amplifica mediante este sistema. Este punto de
la red de sealizacin es susceptible a regulacin por miembros anti-apoptticos de la
familia Bcl-2, que actuaran inhibiendo el transporte de citocromo c al exterior y
estabilizando la membrana mitocondrial.
Por eso la apoptosis mediada por receptor no se afecta por protenas de la familia Bcl-
2 excepto en los casos en que en esta ruta tiene gran peso la amplificacin llevada a
cabo por Bid en la mitocondria.
En cuanto a la seal de muerte que parte exclusivamente de la mitocondria, puede
responder a una gran variedad de estmulos que impliquen estrs celular como son
algunas drogas, radiaciones, agentes oxidantes, sobrecarga de Ca++, etc. Algunos de
estos estmulos actan directamente sobre la mitocondria y otros lo hacen a travs de
molculas mediadoras como son las ceramidas, segundos mensajeros en la
sealizacin de apoptosis y Bax, un miembro pro-apopttico de la familia Bcl-2 muy
importante en la apoptosis mediada por mitocondria.
Los efectos de estas seales en la mitocondria se traducen en una serie de
alteraciones en el buen funcionamiento del orgnulo. Se produce una liberacin de
citocromo c, ruptura de la cadena de transporte de electrones, liberacin de iones
superoxido y una hiperpolarizacin de la membrana interna que puede terminar con
una expansin de la matriz y ruptura de la membrana externa de la mitocondria. Otros
efectos sobre la mitocondria son la induccin del poro mitocondrial que quedara
permanentemente abierto, permitiendo la entrada de agua y solutos en la matriz con el
consiguiente choque osmtico, y la liberacin del factor inductor de apoptosis (AIF),
que se ha demostrado que procesa procaspasa-3 in vitro. Tambin la activacin de
27

Bax que puede formar, como otros miembros de la familia Bcl-2, un canal en la
membrana de la mitocondria que en su caso, en lugar de estabilizarla como ocurre con
los miembros anti-apoptticos de la familia, hara lo contrario.
Por ltimo, existen seales de apoptosis que tienen su inicio en el ncleo y esto es
debido a que, en el contexto de un organismo pluricelular, una clula que ha adquirido
por daos en el ADN un carcter neoplsico debe ser eliminada por apoptosis, ya que
la desaparicin de una clula no supone ningn perjuicio al organismo y en cambio su
transformacin si. Existen en la clula mecanismos capaces de detectar daos en el
ADN y discriminar entre las dos posibles respuestas celulares a estos daos. La
reparacin, que puede ser til en el caso de clulas que se van a diferenciar de forma
inminente perdiendo su capacidad mittica (ej: clulas epiteliales), la apoptosis o la
detencin de la clula en los estadios G1 y G2 del ciclo, lo cual es una forma de
muerte ya que la clula queda genticamente inhabilitada de manera irreversible. Las
respuestas celulares a daos genticos estn mediadas por quinasas, de las que cabe
destacar dos: ATM y la quinasa dependiente de ADN, DNA-PK. Ambas dirigen una
serie de respuestas entre las que se encuentran activacin del ciclo, detencin del
crecimiento celular, reparacin y apoptosis. ATM y posiblemente DNA-PK actan
sobre el factor de transcripcin p53. Este factor se encuentra normalmente a bajos
niveles ya que es degradado por la protena Mdm-2. El dao en el ADN induce
fosforilacin de p53 o Mdm-2, en el caso de Mdm-2 posiblemente por DNA-PK. La
fosforilacin inhibe la interaccin de ambas protenas y por tanto p53 se estabiliza,
incrementando su expresin y activndose.
La activacin de p53 puede dar lugar a dos respuestas:
Detencin en el ciclo celular de forma irreversible mediante la induccin de p21, un
inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina (Cdk).
Apoptosis mediante un mecanismo que aun permanece sin determinar pero en el que
parece que influye la activacin de genes como el de Bax y otras molculas. Se han
podido comprobar tambin otros mecanismos como transrepresin de genes anti-
apoptticos y otros mecanismos no transcripcionales.
Esta es la visin general de la red de eventos que rigen la apoptosis. Existen dentro de
toda esta compleja red numerosos procesos an por determinar, relaciones por
establecer y mecanismos por entender dentro de un programa encaminado por igual a
asegurar la vida de la clula y a procurar su muerte rpida y efectiva.

28

I EVENTOS CELULARES DEL PROCESO DE APOPTOSIS
CAMBIOS EN LA MEMBRANA PLASMTICA
- CAMBIOS EN LA MITOCONDRIA
- CAMBIOS NUCLEARES
- ELIMINACIN DE LA CLULA APOPTTICA

Cambios en la membrana plasmtica
La membrana plasmtica de la clula es uno de los lugares donde se hacen ms
evidentes los efectos de toda la serie de modificaciones bioqumicas que constituyen
la apoptosis. Esto hace que la clula adquiera un aspecto tpicamente apopttico
caracterizado por la disminucin de tamao, el aislamiento respecto de las clulas que
la limitan (en el caso en que sea adherente) y el redondeamiento de su forma. Se
generan tambin unas estructuras a modo de pequeas evaginaciones esfricas
surgidas a partir de la membrana, que se denominan blebs y que confieren a la clula
un aspecto "boiling" (hirviente) al inicio del proceso y "pop-corn like" (forma de
palomita de maz) en los ltimos estadios, cuando a los blebs se les han unido los
cuerpos apoptticos de tamao mucho mayor y con contenido nuclear.

En las clulas apoptticas se producen tambin cambios en la simetra de los
fosfolpidos de membrana. Esto no se puede apreciar con la simple observacin de la
clula al microscopio, pero se puede detectar mediante tcnicas de fluorescencia y, de
hecho, resultan muy tiles a la hora de identificar poblaciones de clulas apoptticas.
La bicapa lipdica que forma la membrana plasmtica de la clula tiene una
composicin y orientacin muy determinada. Su distribucin asimtrica se describi
por primera vez hace 20 aos (Bretcher, Nature 1972) y parece que este concepto se
ha hecho extensivo a todos los tipos celulares de organismos eucariotas. De los
fosfolpidos que forman la bicapa, los que contienen colina, esfingomielina y
fosfatidilcolina, estn orientados al exterior, mientras que la mayora de los
aminofosfolpidos, fosfatidilserina y fosfatidiletanolamina, estn orientados hacia el
interior. Esta orientacin de la membrana no es un hecho esttico, sino que es fruto de
una dinmica en la que continuamente los fosfolpidos se mueven cruzando la
membrana en ambas direcciones hasta conseguir el equilibrio que garantice la
correcta arquitectura. En la estabilidad de esta intervienen interacciones lpido-lpido,
29

lpido-protena y protena-protena, as como la accin de tres enzimas: flipasa, flopasa
y scramblasa, que median los movimientos de los fosfolpidos en una forma ATP y
Calcio dependiente (234). La enzima flipasa transporta rpidamente los
aminofosfolpidos (PS y PE) desde la membrana externa hacia la interna de una forma
dependiente de ATP. La flopasa, otra enzima dependiente de ATP, transporta
lentamente y de forma no especifica fosfolpidos de la membrana interna a la externa.
Por ltimo, la scramblasa se activa con un incremento del calcio intracelular y, de
forma muy rpida, induce una aleatorizacin de la distribucin de fosfolpidos.

Durante la apoptosis, ocurre una perdida de la asimetra de la membrana y por tanto
una externalizacin de PS como uno de los eventos ms precoces. Existe muy poca
informacin sobre el mecanismo de esta alteracin aunque puede que, por una parte,
el aumento intracelular de Ca++ y, por otra, las alteraciones en los niveles de PIP2 que
se dan durante la apoptosis ocasione un desacople de las enzimas encargadas de
mantener la asimetra. Este evento es muy importante para el proceso general de la
apoptosis ya que "marca" a las clulas para su posterior fagocitosis como se ver a
continuacin.
La otra alteracin de la membrana asociada a apoptosis que es la formacin de blebs,
presenta tambin una gran cantidad de incgnitas en lo que se refiere a su mecanismo
de formacin. Es bien conocido que durante la apoptosis se produce una
reorganizacin del citoesqueleto por la proteolisis de muchos de sus componentes y
esto puede dar lugar a la formacin de estas estructuras, de cuyo posible papel
fisiolgico trata parte de este trabajo.

Cambios en la mitocondria
Como se ha mostrado en apartados anteriores, la mitocondria juega un papel muy
importante dentro del proceso de apoptosis. Su funcin amplificadora de la seal,
iniciada por las caspasas, asegura la culminacin del proceso incluso ante la
existencia de un reducido nmero de molculas de proenzima actuando como
unidades iniciadoras. As mismo aporta a la ruta ejecutora de la apoptosis un sitio de
regulacin mediante las protenas de la familia Bcl-2. Finalmente, en ausencia de
caspasas, como se ha demostrado en sistemas tratados con inhibidores de estas, es
capaz de mediar por si sola una forma de muerte celular mucho mas lenta y de
caractersticas atpicas cuya relevancia fisiolgica se est estudiando.
30


Debido a esta fuerte implicacin en el proceso, la mitocondria es uno de los orgnulos
celulares que sufren numerosos cambios en su funcionamiento a lo largo de este.
Estos cambios en su funcin no se corresponden con cambios morfolgicos ya que la
mitocondria mantiene su apariencia intacta durante prcticamente todo el proceso, a
diferencia de lo que ocurre en la necrosis.

A nivel molecular, en la mitocondria se disparan mecanismos propios del programa de
apoptosis, adems de darse una serie de disfunciones en los procesos bioqumicos
llevados a cabo en este orgnulo que pueden, por si mismos a largo plazo, conducir a
la clula a la muerte. Estos mecanismos y disfunciones son:
- Se produce un desacople en la cadena de transporte de electrones as como
una detencin del metabolismo energtico. Esta alteracin se ha observado en
apoptosis de timocitos producida por radiacin g y en la apoptosis va CD95. La
ceramida, un segundo mensajero implicado en la sealizacin de apoptosis, provoca
la detencin de la cadena en un punto determinado, segn se ha podido comprobar
tanto en clulas como en mitocondria aislada. Como consecuencia de esto, se
produce una cada en la produccin de ATP, pero esto ocurre a largo plazo y no
parece estar implicado en la induccin de apoptosis.

- Produccin de especies reactivas de oxigeno. Dentro de la cadena de transporte
electrnico se estima que entre un 1 y un 5% de los electrones se pierden participando
principalmente en la formacin de iones superoxido O2-. Al perder eficiencia la cadena
de transporte durante la apoptosis, se incrementa la formacin de estos radicales
libres. Aunque la tarda formacin de estas especies y el normal desarrollo de la
muerte celular en condiciones de anaerobiosis cuestionan su necesidad dentro del
proceso, no existen an bases suficientemente consolidadas como para excluirlos de
l.

- Liberacin de citocromo c. Una gran variedad de agentes pro-apoptticos inducen
en la mitocondria la liberacin de citocromo c. Esta molcula, cuya liberacin es
independiente de caspasas en la mayora de los sistemas estudiados (hay que hacer
la excepcin de la liberacin inducida por CD95) es una pieza imprescindible en el
apoptosoma formado por Apaf-1 y procaspasa-9, y le lleva a su procesamiento hasta
31

dar lugar a caspasa-9 activa. La liberacin de citocromo c en respuesta a estmulos
pro-apoptticos se inhibe por la presencia de Bcl-2.

- Fallo en el mantenimiento del potencial transmembrana. El potencial mitocondrial
transmembrana proporciona una distribucin asimtrica de protones y otros iones en
ambas caras de la membrana interna de la mitocondria, dando lugar a un gradiente
tanto qumico como elctrico. Durante la apoptosis se ha observado una ruptura de
este potencial como rasgo muy temprano. La causa de esta reduccin del potencial
transmembrana se produce por la apertura de un gran canal llamado poro de
transicin de permeabilidad (PT) mitocondrial. Este poro est formado por protenas de
la membrana interna, como el translocador de nucletido adenina (ANT) y de la
membrana externa, como la porina o canal aninico voltaje dependiente (VDAC). Los
componentes de ambas membranas se acoplan entre s constituyendo un punto de
contacto entre ambas membranas a travs del cual pueden pasar molculas de peso =
1,5 KDa. Su funcin fisiolgica, segn est en estudio, es permitir la liberacin de
Calcio al citoplasma y la entrada de protenas importantes para mantener el potencial
transmembrana hacia la matriz mitocondrial, todo esto mediante breves pulsos de
apertura. El hecho de que algunos estmulos inhibidores de apoptosis actan sobre el
poro, impidiendo su apertura, hace pensar que pueda tener un papel en el proceso de
apoptosis. El lugar del poro PT dentro del programa de ejecucin de la apoptosis
parece estar "downstream", tanto de la liberacin de citocromo c como de la activacin
de las caspasas. En cambio, tanto las caspasas como la protena Bax si parecen
facilitar su apertura permanente, lo que inducira una nueva liberacin de citocromo c y
de un factor pro-apopttico mitocondrial (AIF) que a su vez induciran activacin de
caspasas. Esto sita al poro PT como lugar de amplificacin de la seal de apoptosis.
Independientemente de estos efectos, la apertura del poro PT puede dar lugar a una
desregulacin del volumen de la mitocondria por hiperosmolaridad en la matriz. Esto la
llevara a expandirse hasta romper la membrana externa con la consiguiente liberacin
del contenido del espacio intermembrana al citosol.
- Formacin de poros por las protenas de la familia Bcl-2. Como se expuso en el
apartado anterior, la mayora de los mecanismos apoptticos que tienen lugar en la
mitocondria estn regulados por el equilibrio entre los miembros de la familia Bcl-2.
Uno de los mecanismos de regulacin de esta familia se basa en la formacin de
poros en la membrana. Por eso, a todas las alteraciones adquiridas por la mitocondria
enumeradas hasta ahora, hay que aadir la accin reguladora de estas protenas.
32


Cambios nucleares
El aspecto del ncleo de una clula apopttica se convierte en lo ms caracterstico de
esta. Aunque existen variaciones entre los distintos tipos celulares, en general se
produce un aumento en la densidad de la cromatina que comienza formando parches
alrededor de la envuelta nuclear y terminan dando lugar a una o varias esferas densas
en las ltimas etapas. Los cambios iniciales se acompaan de una reduccin del
ncleo. Esta alteracin en la cromatina es fruto de la ruptura de la lmina nuclear,
estructura que se encuentra bajo la envuelta nuclear, y que participa en su estabilidad.
Adems de estos cambios morfolgicos, en el ncleo celular se produce durante la
apoptosis, la fragmentacin del ADN en una escalera de subunidades regulares que
resultan del corte al azar entre los nucleosomas, Llegan a sumarse hasta un milln de
cortes dando como consecuencia una situacin en la que la transcripcin se para, ya
que no existe forma de ser reparada. Se conoce muy poco sobre el papel que este
fenmeno puede jugar dentro del proceso global de la apoptosis.

La ruptura del ADN es llevada a cabo por una endonucleasa que se activa va
caspasas. Esta endonucleasa fue primero descrita en ratn y se la denomin CAD
(caspase-activated dexyribonuclease). Esta enzima se encuentra normalmente en el
citoplasma de forma inactiva, por efecto del inhibidor ICAD que posee sitios de corte
por caspasa-3. Durante el proceso de apoptosis, ICAD es degradado por la caspasa-3
y esto libera y permite la activacin de la nucleasa CAD, que realiza su funcin sobre
el ncleo de la clula. En humano existe un sistema homlogo al descrito en ratn.
Existe una protena humana, DFF45 (DNA fragmentation factor 45), que presenta una
secuencia significativamente similar a la de ICAD y que media tambin fragmentacin
del ADN en ncleos cuando se produce activacin de la caspasa-3. De esta forma, se
supone que DFF45 acta en humanos sobre una nucleasa similar a CAD inhibindola
igual que ocurre en ratn. Aunque los efectos de la endonucleasa sobre el ADN celular
sean tan drsticos, estudios realizados induciendo apoptosis en clulas con un
inhibidor ICAD mutante resistente a caspasas, demuestran que la clula muere por
apoptosis en ausencia de fragmentacin del ADN. Esta muerte se traduce en ruptura
de sustratos en el citoplasma, alteraciones tpicas en la membrana plasmtica, en la
integridad de la mitocondria etc. Todo esto conduce a la muerte de la clula que
mantiene su ADN integro, aunque la cromatina si presenta las alteraciones tpicas de
apoptosis, probablemente por la accin de caspasas sobre protenas nucleares como
son poli (ADP-ribosa) polimerasa (PARP) o lmina nuclear. Este hecho permite
33

replantear la degradacin del ADN en el proceso de apoptosis, no como medio de
destruccin de la clula (que llega a morir igualmente en ausencia de fragmentacin
del ADN) sino como parte del proceso de limpieza de las clulas muertas, facilitando
su fagocitosis o previniendo que el ADN integro pueda transformar a la clula
fagoctica.

Eliminacin de la clula apopttica
En el proceso de apoptosis, tan importante es que la muerte sea rpida, efectiva y
sometida a buenos procesos de regulacin como que, una vez muerta, la clula sea
convenientemente retirada. De esta manera se evita su ruptura y el vertido de su
contenido al medio, lo que dara lugar a una respuesta inflamatoria indeseable.
Estudios realizados en c. elegans describen la existencia de 7 genes implicados en el
aclaramiento de las clulas apoptticas, lo que demuestra la importancia que este
proceso tiene en la apoptosis.

En general, existen dos estrategias para este proceso: a) en tejidos con bajos ndices
de apoptosis, la fagocitosis es ejercida por clulas vecinas; b) en ciertos tejidos con
altas tasas de apoptosis, existen clulas "profesionales" (generalmente macrfagos)
que hacen esta funcin. Uno de los puntos ms importantes en el estudio de este tema
es la descripcin de los mecanismos de reconocimiento de la clula apopttica por
parte de los fagocitos o las clulas vecinas encargadas de su eliminacin. Existen ya
varios de estos mecanismos identificados. Estos incluyen tanto sistemas de
reconocimiento por parte de los fagocitos, como sistemas de sealizacin de su
estado por parte de las clulas apoptticas. El primer mecanismo descrito implica a
uno de los sistemas de interaccin clula-clula ms familiares: los carbohidratos de
superficie de una clula se unen a las lectinas de otra clula.

Este sistema fue considerado a partir de la observacin de que al aadir un azcar,
reconocida por determinada lectina de la superficie celular, como es N acetil
glucosamina, se reduce en un 50% respecto al control, la unin de macrfagos
peritoneales de ratn a timocitos apoptticos, sin afectar su unin basal a timocitos no
apoptticos. Esta accin se demostr que era especfica de determinadas lectinas, ya
que solo algunos azucares tenan propiedades inhibidoras. A partir de estos datos se
estableci que la apoptosis provocaba cambios en los carbohidratos de la superficie
celular que lo hacan reconocibles por algunas lectinas. Para confirmar esta hiptesis,
34

experimentos de microelectroforesis celular demostraron que exista una perdida en la
superficie celular de cargas negativas y todos estos datos en conjunto permitieron
confeccionar el siguiente modelo:
La perdida de residuos terminales de cido silico de las cadenas laterales de las
glicoprotenas por parte de las clulas apoptticas, expone residuos normalmente
enmascarados por ellas, que interaccionan con las lectinas de la superficie de
macrfagos.

El segundo mecanismo se describi a partir de estudios de inhibicin dependiente de
carga elctrica, del reconocimiento de clulas apoptticas. Estos hicieron suponer la
presencia de una estructura en la superficie de estas clulas, capaz de interaccionar
con los fagocitos. Esta estructura no presentaba carcter proteico, ya que su accin no
se inhiba por proteasas ni por inhibidores de su sntesis. A partir de los estudios de
inhibicin, se identific tambin un posible receptor presente en los fagocitos, la
integrina a4b3 a la que se atribuan previamente solo funciones de adhesin a matriz.
Trabajos posteriores confirmaron el papel de esta molcula en diferentes sistemas
experimentales. En la interaccin de esta protena con la clula apopttica interviene
una molcula puente, la trombospondina, que es secretada y sintetizada por los
macrfagos y sirve de puente al unirse al complejo formado por a4b3 y CD36 en el
fagocito y a una estructura an por determinar en la clula apopttica.

El tercer mecanismo de reconocimiento responde al evento que ocurre en la
membrana plasmtica de las clulas apoptticas, y que ha sido descrito en un
apartado anterior: La perdida de la asimetra de fosfolpidos. Esta provoca la
exposicin al exterior de la fosfatidilserina (PS). La inhibicin de reconocimiento en
ciertos sistemas mediante la adicin de liposomas que contenan PS en su superficie
sugiri una posible interaccin de la PS en la superficie de la clula apopttica con un
receptor en el macrfagos. Esto ha sido confirmado por estudios posteriores.
Todos estos mecanismos intervienen en el aclaramiento de clulas apoptticas. El
funcionamiento de uno u otro depende de la especie y de la naturaleza, tanto de la
clula apopttica como del fagocito. En al caso de fagocitos "profesionales", existe
adems el interrogante de que estmulos quimiotcticos intervienen para atraer a dicha
clula hacia el foco donde tiene lugar la apoptosis.
35




La apoptosis es una funcin biolgica muy importante en la patogenia de varias
enfermedades estudiadas hasta el momento. Podemos destacar el cncer,
malformaciones, trastornos metablicos, neuropatas, lesiones miocrdicas y
trastornos del sistema inmunitario.
Respecto del cncer, el factor biolgico ms importante antineoplsico parece ser la
protena 53 sintetizada por el gen humano p53. Es una fosfoprotena proapoptsica
que se activa ente la presencia de mutaciones del ADN, actuando en la fase G1 del
ciclo celular. Controla la reparacin de lesiones del ADN efectuado por polimerasas
especficas, (contribuye a frenar el ciclo en tales circunstancias) y es capaz de detectar
clulas neoplsicas agresivas frenando su capacidad de producir angiognesis para
facilitar las metstasis. La p53 se agota rpidamente por lo que debe ser sintetizada
en forma constante. Su rol es frenar el ciclo destruyendo clulas mediante la apoptosis
antes de llegar a la etapa de sntesis a fin de impedir que se repliquen mutaciones
carcinogenticas, que producirn nuevas cepas tumorales cada vez ms agresivas.

Otro aspecto de importancia clnica es la relacin entre apoptosis y neuropatas. En el
desarrollo del sistema nervioso, las neuronas se generan a partir de clulas
precursoras que una vez diferenciadas no se dividen ms. Antes de emitir dendritas y
axones, las neuronas inmaduras o las precursoras emigran desde el lugar de
36

nacimiento en busca de la localizacin definitiva usando como camino el sistema glial.
Esta migracin tiene, adems, como objetivo lograr las conexiones interneuronales
correctas. Si ello no se efecta la neurona no recibe la accin de factores de
crecimiento secretados por la clula receptora a que pertenece el axn conectado y la
clula que hizo la conexin equivocada muere por apoptosis. Cualitativamente, en
estudios realizados en la formacin de la va ptica en la rata, por oligodendrocitos que
milienizan axones, mueren por apoptosis alrededor del 50% de ellos debido a
conexiones errneas. De esta manera contribuye la apoptosis en el desarrollo correcto
del sistema nervioso.
Otro hecho de importancia observado recientemente es el rol que juegan la isquemia e
hipoxia. En zonas perifricas de infartos cerebrales se han observado clulas en
apoptosis con fragmentacin de la cromatina y sobreexpresin de caspasas.

En enfermedades neurodegenerativas se ha observado apoptosis en biopsias de
pacientes con Alzheimer, Huntington y Parkinson, fallecidos por otra causa. La
apoptosis en la Enfermedad de Alzheimer no es sistematizada, sino difusa, que
coincide con el polmorfismo de la lesin. Cotman en 1998 ha detectado que el
Alzheimer muestra mayor nmero de clulas apoptsicas, especialmente en neuronas
del hipocampo. Se ha postulado que estas lesiones puedan deberse a un descontrol
gentico de la apoptosis. El bloqueo de caspasas para frenar la apoptosis abre nuevos
campos teraputicos en enfermedades neurodegenerativas.

En cardiopatas, James en 1998 ha planteado que la apoptosis es importante en la
destruccin exagerada de clulas durante el desarrollo del sistema excitoconductor
produciendo trastornos como la bradicardia sinusal, arritmias graves y sndrome Q-T
prolongado, en nios. Trastornos de oxigenacin producen adems de necrosis, cierta
cantidad de apoptosis en partes perifricas de la zona daada.

En infartos recientes se ha encontrado sobre expresin de Bcl 2. En infartos antiguos,
con clulas en apoptosis, se ha detectado presencia de Bax (que ya vimos, es una
protena proapoptsica de la familia del Bcl 2 fosforilada). Dos autores sugieren que la
insuficiencia cardaca postinfarto sea debida en gran medida a la prdida de
cardiocitos por apoptosis.

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CONCLUSIONES

- En todo organismo multicelular adulto debe existir un equilibrio entre la generacin o
proliferacin y la desaparicin o muerte de las clulas que lo componen, con el fin de
mantener un tamao constante.
- La alteracin de este equilibrio conduce a situaciones patolgicas como el cncer,
cuando la proliferacin se encuentra aumentada, o las enfermedades degenerativas,
cuando los procesos de muerte celular estn incrementados.
- Es por ello que la apoptosis resulta esencial para toda forma de vida. Es un proceso
clave para el desarrollo y es una medida de seguridad en la edad adulta. A medida
que un organismo se desarrolla, enfrenta una serie de desafos que surgen de su
complejidad y de su entorno: debe producir muchos tipos de clulas diferentes a partir
de una sola clula y debe coordinar las actividades de estas clulas diferentes
permitindoles comunicarse entre s. Cada clula debe trabajar para el bien comn.
- Existen ocasiones, en que esto ltimo significa que una clula debe suicidarse. Tales
sacrificios ocurren en una forma ordenada. Las clulas que sufren lesiones mueren de
forma desordenada: se hinchan, estallan, derraman su contenido sobre sus vecinas y
producen inflamacin; las que cometen suicidio mueren prolijamente y desaparecen.
Sus muertes son tiles pues ayudan a esculpir el cuerpo y a mantener el correcto
funcionamiento de otras clulas.




38

BIBLIOGRAFA

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Universidad Catlica de Chile.
http://escuela.med.puc.cl/publ/PatologiaGeneral/Patol_033.html
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3. Arango, Mara del Carmen y col. TEMA DE REVISIN. La apoptosis: sus
caractersticas y su papel en la transformacin maligna de la clula. Instituto de
Oncologa de Cuba. 1997.http://www.bvs.sld.cu/revista/onc/vol13_2_97/onc11297.htm
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presentada en sesin del 2 de junio de 1999. Universidad de Chile.
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http://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html
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consecuencias fatales En: www.cecs.cl/web/cecs_ index.php?area=educacion...
10. NASA. Cell Apoptosis. http://205.149.4.69/spacebio.net/modules/gs_resource/
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11. Pines, Maya. Ventajas de suicidio celular. Como la apoptosis es saludable. Howard
Hughes Medical Institute. 2005. En: http://www.hhmi.org/genesweshare-esp/c110.html
12. Seales de la apoptosis. En: sonhouse.hunter.cuny.edu/ foster/350-Syl-2003.htm

39

ANEXOS
La mitocondria
Considerada como la central de energa celular, la mitocondria es el organelo en la
clula donde se lleva a cabo la respiracin celular. Se sabe tambin que tiene un papel
central en la apoptosis o muerte celular. Hay un inters creciente en oncologa para
entender como opera este vnculo mitocondrial con la apoptosis que, en condiciones
normales, impide el desarrollo de tumores.


En la figura, mitocondrias en un tejido muscular. La mitocondria dispone de la energa
mediante la sntesis de ATP, una verdadera moneda energtica celular, porque
participa en todas las transacciones de energa.
En: La mitocondria. www.cecs.cl/web/cecs_ index.php?area=educacion...

Apoptosis celular
La clula que est muriendo mediante apoptosis, o suicidio celular, sufre cambios
notables. Primero se encoge y se separa de sus vecinas (parte superior derecha).
Entonces aparecen burbujas o ampollitas (esferas rosadas) en su superficie (dndole
apariencia de que bulle) y la cromatina (porcin negra de la clula interior mayor), que
es el ADN nuclear en complejos con protenas, se condensa en los bordes del ncleo.
Pronto el ncleo, y a continuacin la propia clula, se rompe y los fragmentos celulares
son rpidamente ingeridos por otras clulas en los alrededores.
En: NASA http://205.149.4.69/spacebio.net/modules/gs_resource/Apoptosis.jpeg

40



Apoptosis network



41



En: bio.ifom-firc.it/.../ doc/doc/maps/apoptosis.html

Los mecanismos de la apoptosis


42




En: John W. Kimball's Apoptosis Page
ttp://www.ultranet.com/~jkimball/BiologyPages/A/Apoptosis.html


Apoptosis (muerte celular programada): Una va verstil para el desarrollo
teraputico

43



Las mutaciones que ocurren en las clulas cancerosas frecuentemente hacen
inefectivas las diversas vas apoptticas con que cuenta el organismo y que estn
diseadas para eliminar clulas malignas. Por esto, las terapias que puedan inducir la
apoptosis en clulas cancerosas tienen gran potencial en el tratamiento de diversos
tipos de cncer.