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Rev Cubana Farm 1998;32(2):106-12

Empresa de Productos Biolgicos "Carlos J. Finlay"
VALIDACIN DE TCNICAS ANALTICAS UTILIZADAS
EN EL CONTROL DE LA CALIDAD
1
Master en Ciencias. Licenciada en Farmacia. Investigadora Agregada.
2
Licenciada en Farmacia. Aspirante a Investigadora.
3
Licenciada en Qumica. Investigadora Agregrada.
4
Licenciada en Qumica. Aspirante a Investigadora.
5
Licenciada en Matemtica.
6
Tcnica en Productos Biolgicos.
7
Tcnica en Qumica Industrial.
8
Tcnica en Metrologa.
La validacin de un mtodo analtico
es el proceso por el cual queda establecido
por estudios experimentales que la capa-
cidad del mtodo satisface los requisitos
para la aplicacin analtica deseada.
1
sta
se fundamenta en la determinacin de di-
versos parmetros que se aplican de
acuerdo con la categora a la que
pertenezcan.
2
Para el desarrollo de un nuevo produc-
to es necesario la utilizacin de mtodos
analticos que permitan cuantificar el pro-
ducto en forma de materia prima o como
principio activo de la formulacin con un
alto grado de confiabilidad.
3
En la actualidad los laboratorios de
control de la calidad de la Industria Mdi-
co-Farmacutica no slo se ocupan de ana-
lizar si un producto cumple o no con sus
requisitos de calidad mediante la utiliza-
Miriam Daz de Armas,
1
Idania Hernndez Oramas,
2
Marcia Martnez de Santelices Cuer-
vo,
3
Ma. Victoria Licea Torns,
4
Lidaila Gmez Baobre,
5
Gloria Louro Gonzlez,
6
Yelina
Morera Fernndez
7
y Esther Gonzlez Hernndez
8
RESUMEN
Se seleccion una metodologa y se elabor un procedimiento normativo operacional para la
validacin de mtodos analticos, utilizados en la evaluacin de las producciones actuales
para los requerimientos de calidad. Se comprob la utilidad de dicho procedimiento median-
te la validacin de los mtodos volumtricos y espectrofotomtricos que intervienen en el
control de la calidad del juego de reactivos para determinacin de hemoglobina en sangre.
Se demostr mediante el diseo experimental y los procedimientos estadsticos empledos
que dichos mtodos son lineales (r
2
>0,98), exactos (F
exp.
< F
tab.
y t
exp.
< t
tab.
), precisos (CV3
%) y especficos (respuesta no significativa), por lo cual son confiables para ser utilizados
en la comprobacin de las especificaciones de calidad del juego de reactivos.
Descriptores DeCS: JUEGO DE REACTIVOS PARA DIAGNOSTICO; HEMOGLOBINA/
anlisis; CONTROL DE CALIDAD.
107
107
cin de mtodos analticos establecidos
para cada uno de ellos, sino tambin se es-
fuerzan para validar cada mtodo analtico
utilizado en el control de la calidad de sus
productos.
Basado en este criterio el laboratorio
de control qumico inici la validacin de
sus mtodos analticos con la que inter-
viene en el control de la calidad de un jue-
go de reactivos que se encuentra en fase
de desarrollo, y posteriormente ser so-
metido a un estudio de estabilidad.
En este trabajo se muestran los resul-
tados obtenidos en la validacin de las tc-
nicas utilizadas en el control de la calidad
del juego de reactivos para la determina-
cin de hemoglobina en sangre, compues-
to por reactivo 1 (solucin de cianuro de
potasio 1g/100 mL) y reactivo 2 (tabletas
de ferricianuro de potasio 200 mg/tab),
4
as como los resultados de la validacin
del mtodo de anlisis de la
cianometaglobulina utilizado en el ensayo
funcional del juego de reactivos.
5
MTODOS
1. Requisitos previos a la validacin. Para
garantizar la confiabilidad de los
resultados se asegur el cumplimien-
to de los requisitos siguientes:
6
- Calificacin del personal en el uso de
los mtodos a validar.
- Calibracin de los instrumentos de
medicin y las medidas de capacidad
de vidrio utilizado.
- Utilizacin de reactivos apropiados y
soluciones de trabajo valoradas.
- Observacin de las medidas de segu-
ridad.
2. Seleccin de los parmetros apropia-
dos de acuerdo con la clasificacin del
mt odo anal t i co y el t i po de
validacin a realizar:
Para validar las tcnicas analticas
utilizadas para la evaluacin de la
concentracin del principio activo
en la solucin de cianuro de potasio
1 % y en las tabletas de ferricianuro
de potasio,
4
y de la tcnica utilizada
para el anlisis de la cianome-
tahemoglobina en el ensayo funcio-
nal del juego de reactivos,
5
se esco-
gieron los parmetros adecuados se-
gn los criterios de validacin que apa-
recen reportados en el Procedimiento
Normativo Operacional 3.09.001.96 de
la Empresa de Productos Biolgicos "
Carlos J Finlay".
Validacin de mtodos volumtricos
Los mtodos de valoracin del cianu-
ro de potasio y el ferricianuro de potasio,
fueron validados mediante la evaluacin de
los parmetros siguientes:
- Linealidad: Se prepararon 6 soluciones
de concentraciones entre 70 y 120 %,
incluyendo el 100 %. Las concentracio-
nes fueron las siguientes: cianuro de
potasio (7,0; 8,0; 9,0; 10,0; 11,0; 12,0
mg/mL); ferricianuro de potasio (4,6;
5,3; 6,0; 6,6; 7,3; 8,0 mg/mL). Se reali-
zaron 3 rplicas de cada una. Se
determin la recta de regresin lineal,
as como los coeficientes r y r
2
. Para el
test de linealidad se consider el co-
eficiente de variacin para el factor de
respuesta f (CV
f
), la desviacin estndar
relativa de la pendiente (Sb
rel
) y la t de
Students prctica (Tp) y la F de Fisher
prctica (F
p
) para p= 0,01.
- Precisin (repetibilidad, reprodu-
cibilidad y robustez)
- Repetibilidad y reproducibilidad: Se
evaluaron las muestras durante 10 d. La
concentracin terica del cianuro de
potasio fue de 1,0 mg/mL y la del
ferricianuro de potasio 6,6 mg/mL. Se
realizaron 4 rplicas por la maana y 4
rplicas por la tarde, y se analizaron
estadsticamente los resultados obteni-
108
-
dos en el da y entre das. Se determin
el coeficiente de variacin (CV) y se aplic
la prueba Anova de clasificacin simple.
Robustez: Se analiz mediante un di-
seo factorial 2
3
,

segn la tabla de
Yourden y Steiner,
6
considerando las
variables: reactivo recin preparado,
reactivo con das de preparado, tem-
peraturas de trabajo diferentes (4 C
y temperatura ambiente) y 2 analistas;
se realiz cada determinacin por tri-
plicado.
- Exactitud: Para el mtodo del
ferricianuro de potasio se realiz un
ensayo de recuperacin, analizando 3
muestras de concentraciones diferen-
tes (5,3; 6,6 y 8,0 mg/mL) por tripli-
cado, preparadas a partir de un placebo.
Se hall la varianza, la G de Cochran y
la t de Student experimental para p = 0,05
en el ensayo de recuperacin.
Para el mtodo del cianuro de potasio
se prepar un patrn de analito al 100 %
de concentracin (1g/100 mL) y una
solucin placebo a la cual se aadi la
cantidad necesaria de analito para obtener
la concentracin al 100 %; ambas solucio-
nes se valoraron utilizando el mismo
mtodo analtico. Se determin la F de
Fisher y la t de Student para p = 0,05.
- Especificidad: Considerando el factor
degradante, previamente selecciona-
do, se evaluaron conjuntamente una
solucin de producto degradado y una
solucin patrn al 100 % de concen-
tracin, utilizando el mismo mtodo
analtico.
Validacin de un mtodo espectrofotomtrico
El mtodo de la cianometahe-
moglobina utilizado en el ensayo funcional
del juego de reactivos para determinacin
de hemoglobina en sangre, se valid de
acuerdo con los criterios establecidos
segn bibliografa consultada.
7
Los parmetros son los siguientes:
- Linealidad: Se evalu la linealidad del
sistema instrumental al estudiar 6 so-
luciones por triplicado en un rango de
concentraciones de 20 a 200 % (4,2;
8,5; 12,6; 16,8; 18,2; 21,0 g/dL). Se
comprob estadsticamente sta y se
evalu la linealidad del mtodo al
analizar 6 soluciones por triplicado en
un rango de concentraciones de 80 a
120 % (6,2; 8,2; 10,2; 12,6; 16,4; 18,2
g/dL). Se determin la recta de
regresin lineal y se calcularon los
coeficientes de r y r
2
. Para el test de
linealidad se hallaron el coeficiente
de variacin (CV
f
) para el factor de
respuesta f; la desviacin estndar
relativa de la pendiente (Sb
rel
) y la F de
Fisher prctica (F
p
) para p = 0,05.
- Precisin (repetibilidad, reproduci-
bilidad y robustez).
- Repetibilidad y reproducibilidad: Se
consideraron muestras de concen-
traci ones al t as ( 18, 0 g/ dL) ,
medias (12,0 g/dL) y bajas (4,8 g/
dL) de hemolizados de produccin
nacional y se estudiaron por el mtodo
propuesto durante 10 d, maana y
tarde, realizando 4 repeticiones en
cada sesin. Se determin el coefi-
ciente de variacin (CV) y se aplic
la prueba Anova de clasificacin
simple.
- Robustez: Se analiz mediante un di-
seo factorial 2
3
segn la tabla de
Yourden y Steiner,
6
considerando las
variables: 2 tiempos de incubacin de
la reaccin (15 y 40 min), 2 tempera-
turas de trabajo (temperatura ambiente
y 37 C) y 2 analistas; se realiz cada
determinacin por triplicado.
- Exactitud: Se compar el juego de
reactivos diseado con un juego de
reactivos de la firma comercial
Wiener, en un total de 100 muestras
de pacientes en paralelo y por
duplicado. Los resultados obtenidos
por ambos mtodos se compararon
mediante un anlisis de regresin lineal.
109
109
- Sensibilidad: Los lmites de detec-
cin y cuantificacin se calcularon
tericamente utilizando el valor de la
ordenada en el origen obtenida para la
recta de calibracin en el ensayo de
linealidad. Los lmites calculados se
comprobaron experimentalmente me-
diante el anlisis repetitivo de 10
muestras de 2 soluciones preparadas
a las concentraciones obtenidas y los
resultados fueron evaluados por un
Anova de clasificacin simple.
RESULTADOS
En la tabla 1 se presentan los resulta-
dos obtenidos en la validacin de 2 mto-
dos volumtricos. Como se puede obser-
var en esta tabla, las tcnicas analticas em-
pleadas en la cuantificacin de los princi-
pios activos cianuro de potasio y
ferricianuro de potasio, cumplen con los
rangos de aceptacin de acuerdo con el
estudio estadstico realizado para los
parmetros estudiados (linealidad, preci-
sin, exactitud y especificidad), en las con-
centraciones seleccionadas y las condicio-
nes de trabajo establecidas.
En la tabla 2 se observan los valores
obtenidos para el ensayo funcional del jue-
go de reactivos desarrollado, consideran-
do para su evaluacin los parmetros de
linealidad, precisin a concentraciones ba-
jas, medias y altas del analito (como se re-
comienda en la bibliografa consultada);
adems de exactitud y sensibilidad del m-
todo, los cuales se encuentran dentro de
los rangos de aceptacin establecidos.
TABLA 1. Resultados de la validacin de mtodos volumtricos
Procesamiento Valoracin del Valoracin del ferri- Criterios de
Parmetro estadstico cianuro de potasio cianuro de potasio aceptacin
Linealidad . Coeficientes de r
2
= 0,9989 r
2
= 0,9925 r
2
,98
correlacin y r = 0,9994 r = 0,9962 r 0,99
determinacin
. Test de linealidad CV
f
= 0,63 % CV
f
= 1,89 % CV
f
5 %
Sb
rel
= 0,84 % Sb
rel
= 1,98 % Sb
rel
2 %
t
exp
= 118,50 t
exp
= 46,05 t
exp
t
(16; 0,01)
=2,92
F
exp
= 14092,62 F
exp
= 2120,78 F
exp
F
(1; 16; 0,01)
= 8,53
FA
exp
= 2,64 FA
exp
= 4,17 FA
exp
FA
(4; 12; 0,01)
=5,41
. Test de proporcio-
nalidad a = -0,15 a = -0,18 a 0
IC
(a)
= (-0,32; 0,10) IC
(a)
= (-0,17; 0,29) IC
(a)
incluye el 0
t
exp
= 1,95 t
exp
= 1,27 t
exp
< t
(16; 0,05)
= 2,12
Precisin . Coeficientes de CV
repet
=0,40 % CV
Repet
= 0,28 % CV
Repet
3 %
. Repetibilidad y
variacin CV
Reprod
= 1,83 % CV
Reprod
= 1,60 % CV
Reprod
3 %
Reproducibilidad CV
Reprod
< 2 CV
Repet
. Test de Anova Diferencias no sig- Diferencias no sig- Diferencias no sig-
de clasificacin nificativas nificativas nificativas
simple F
exp
=1,43 F
exp
= 1,31 F
exp
< F
(9; 70; 0,01)
= 2,82
. Robustez . Factorizacin Diferencias no sig- Diferencias no signi- Diferencias no sig-
nificativas para ficativas para nificativas
cada factor cada factor
Exactitud . Test de Fisher F
exp
= 1,35 F
exp
< F
(9; 9; 0,05)
= 3,18
. Test de Student t
exp
= 0,51 t
exp
< t
(18; 0,05)
= 2,10
. Test de Cochran G
exp
= 0,30 G
exp
< G
(3; 3; 0,05)
= 0,87
. Test de Student t
exp
= 0,13 t
exp
< t
(8; 0,05)
= 2,30
Especificidad - No significativa No hay respuesta Respuesta no
significativa
110
TABLA 2. Resultados de la validacin del mtodo espectrofotomtrico
Parmetro Procesamiento estadstico Resultados Criterios de aceptacin
Sistema instrumental Mtodo r
2
0,98
Linealidad Coeficientes de r
2
= 0,9990 r
2
=0,9997 r 0,99
correlacin y r = 0,9995 r = 0,9998
determinacin
Test de linea- CV
f
= 0,61 % CV
f
= 0,45 % CV
f
5 %
lidad Sb
rel
= 0,25 % Sb
rel
= 0,41 % Sb
rel
2 %
t
exp
= 399,86 t
exp
= 242,64 t
exp
t
(16; 0,01)
= 2,92
F
exp
= 159887,55 F
exp
= 58876,97 F
exp
F
(1;16; 0,01)
= 8,53
FA
exp
= 3,68 FA
exp
= 4,98 FA
exp
FA
(4;12; 0,01)
= 5,41
Test de propor- - a = 0,15 a 0
cionalidad IC
(a)
= (-0,20; 0,50) IC
(a)
incluye el 0
t
exp
= 0,009 t
exp
< t
(16; 0,05)
= 2,12
Precisin C onc. bajas Conc. medias Conc. Altas
Repetibilidad y Coeficientes de CV
Repet
= 0,43 % 0,16 % 0,14 % CV
Repet
3 %
Reproducibilidad variacin CV
Reprod
= 0,11 % 0,22 % 0,02 % CV
Reprod
3 %
CV
Reprod
< 2 CV
Repet
Test de Anova Diferencias no significativas Diferencias no significativas
de clasificacin F
exp
= 0,31 1,21 0,68 F
exp
< F
(9; 70; 0,01)
= 2,82
simple
Robustez Factorizacin Diferencias no significativas Diferencias no significativas
para cada factor
Exactitud Anlisis de re- r
2
= 0,9960 r
2
>0, 98
gresin lineal F
exp
= 8856,66 F
exp
> F
(1;98;0,01)
= 6,85
IC
(b)
= (0,96; 1,01) IC
(b)
incluye el 1
IC
(a)
= (-0,09; 0,43) IC
(a)
incluye el 0
b = 0,9859 b 1
Sensibilidad Coeficiente de a = 0,15 3 a
variacin b = 2,88 LD =
b
LD = 0,16 g/dL CV = 0,52 %
CV 3 %
LC = 0,52 g/dL CV = 0,62 %
10 a
LC =
b
DISCUSIN
Al evaluar estadsticamente la
linealidad de los mtodos analticos vali-
dados y del sistema instrumental para el
mtodo espectrofotomtrico, se
obtuvieron coeficientes de correlacin (r)
y de determinacin (r
2
) que demuestran
que existe regresin entre las variables
concentraciones y las respuestas medidas.
Para confirmar que dicha regresin era
lineal se aplicaron diferentes test de
linealidad, considerando el anlisis de la
varianza (FA
exp
) el tests ms riguroso que
corrobor la linealidad de los mtodos y
del sistema instrumental. De igual forma
se comprob que se cumple la condicin
de proporcionalidad y el error sistemtico
de cada mtodo es despreciable.
Por otra parte, el estudio de precisin
mostr una buena repetibilidad y
reproducibilidad de los resultados de
acuerdo con los criterios de aceptacin,
mientras que los factores estudiados para
cada mtodo en el ensayo de robustez no
influyeron significativamente en los
111
111
resultados, por lo cual podemos conside-
rar que dichos mtodos son precisos.
Para evaluar la exactitud se aplicaron
diferentes procedimientos experimentales
y estadsticos que responden a las
caractersticas propias del mtodo anal-
tico validado. En el caso del mtodo de va-
loracin del ferricianuro de potasio se
comprob que el rango de concentracio-
nes estudiado no influye en la variabilidad
de los resultados, ya que se cumpli con
el criterio del test de Cochran (G
exp
),
adems no se obtuvieron diferencias sig-
nificativas entre la recuperacin media y
el 100 % al aplicar el test de Student (t
exp
),
confirmando la buena exactitud del
mtodo.
Se determin igualmente que el m-
todo de valoracin del cianuro de potasio
es exacto, ya que no existen diferencias
significativas entre los resultados, ni por
su varianza (test de Fisher) ni por la dife-
rencia de medias (test de Student); mien-
tras que para el mtodo de determinacin
de la cianometahemoglobina se obtuvo un
98 % de equivalencia con el mtodo de re-
ferencia de la firma comercial Wiener y
una recta de regresin lineal: y=0,9859 x
+ 0,1754, que garantiza la exactitud del
mtodo.
Adems, se comprob que ambos m-
todos volumtricos son especficos, ya que
los productos de degradacin en un caso
no interfieren en la valoracin, mientras
que en el otro la respuesta es insigni-
ficante.
Los lmites de deteccin (LD) y
cuantificacin (LC) calculados para el
mt odo de det ermi naci n de l a
cianometahemoglobina, fueron corrobora-
dos experimentalmente. El mtodo es sen-
sible, ya que no se encontraron diferencias
significativas entre los resultados obteni-
dos para cada lmite y los coeficientes de
variacin para cada uno de ellos fueron
menores que el coeficiente de variacin
permitido para el mtodo.
Todos los resultados obtenidos en la
validacin de los mtodos volumtricos y
espectrofotomtrico permiten asegurar
que son confiables, ya que cumplen los cri-
terios de validacin reportados por Castro
y otros en 1989 y por Aguilar y otros en
1992. Adems ambos mtodos pueden ser
utilizados tanto en el control de la calidad
como en el estudio del juego de reactivos
para determinacin de hemoglobina en san-
gre.
De esta manera se comprob experi-
mentalmente la utilidad del procedimiento
establecido para la validacin de mtodos
analticos; y queda abierto el camino a la
validacin de todos los mtodos analti-
cos en el control de la calidad.
AGRADECIMIENTOS
Agradecemos a la licenciada Yaim Farias
Domnguez por su desinteresada colaboracin y
sus sabios consejos en la interpretacin estadsti-
ca de los resultados.
SUMMARY
A methodology was selected and a normative operative procedure was prepared for the
validation of analytical methods used in the evaluation of the present productions for quality
requirements. The usefulness of this procedure was proved by the validation of the volumetric
and spectrophotometric methods taking part in the quality control of the reagent kits for
determining haemoglobin in blood. It was demostrated by the experimental design and the
statistical procedures used that such methods are lineal (r
2
> 0.98), exact (F
exp
< F
tab
and T
exp
< t
tab
),
precise (CV 3 %) and specific (no significative response). Therefore, they are reliable and
may be used in the checking of the quality specifications of the reagent kits.
Subject headings: REAGENT KITS, DIAGNOSTIC; HEMOGLOBINS/analysis; QUALITY
CONTROL.
112
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Aguilar G, Alcntara A, Chrvel A, Garca JL, Garzn A, Guerrero ME, et al. Validacin de mtodos analticos.
Comit de Elaboracin de Guas Oficiales de Validacin de la Direccin General de Control de Insumos para la
Salud, SSA. Colegio Nacional de Qumicos Farmacuticos Biolgicos. Mxico AC, 1992.
2. United States Pharmacopoeial Convention. USP XXII. United States Pharmacopoeia. 22 ed. Easton: Mark
Printing; 1990:1225,1710.
3. Rampazoo P. Standardisation and Validation of Analytical Methods in the Pharmaceutical Industry. II Farmaco
1990;45:807-15.
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5. Beal PJ, Cook LP, Lovric VA. Hemoglobin. Pathology 1974;6:251-4.
6. Castro M, Gascn S, Pujol M, Sans JM, Vicente L. Validacin de mtodos analticos. Asociacin Espaola de
Farmacuticos de la Industria. Monografa AEFI. Seccin Catalana. Comisin de Normas de Buena Fabricacin
y Control de la Calidad. Edicin Hewlett Packard, 1989.
7. Calpena AC, Escribano E, Fernndez C. Validacin de los mtodos analticos. Farm Clin 1991;7(9):749-58.
Recibido: 24 de noviembre de 1997. Aprobado: 31 de enero de 1998.
Lic. Miriam Daz de Armas. Empresa de Productos Biolgicos "Carlos J. Finlay". Infanta No. 1162, municipio
Centro Habana, Ciudad de La Habana, Cuba.