Clase 9, 13 abril.

Bioqumica
Estudios cinticos. Enzimas 2.
1

GRFICO DE LINEWEAVER-BURK
(Grfico de los dobles recprocos)
A partir de la ecuacin de Michaelis-Menten (inversa) se
obtiene:



El grafico ya no es una curva sino que se convierte en
una recta; y para obtenerlo se hace el mismo tipo de
experimento que para obtener la hiprbola, o sea, se
midieron velocidades para diferentes [S].
Se calcula el reciproco de [S] y [V
0
].
Los puntos que corresponden a [S] altas estn hacia
abajo de la recta y las [S] bajas hacia arriba de la recta;
con las velocidades es lo mismo.
Cuando [S] es infinita estamos hablando de V
MAX,
y el
intercepto lo obtenemos del reciproco.
El otro intercepto siempre va a estar en el lado negativo del grfico y va a corresponder al inverso
K
m
. Con este grfico se obtiene el valor de K
m
ms fcilmente que extrapolar una curva.
Tenemos que: K
m
: constante; V
MAX
: no es constante

Con esta ecuacin uno puede encontrar los interceptos diciendo que:
Si 1/[S] es 0 entonces: 1/V
0
= 1/V
MAX

Si 1/V
0
es 0 entonces: K
m
/V
MAX
= 1/V
MAX

entonces: -K
m
V
MAX
/ V
MAX
entonces: -K
m
(luego se saca reciproco)


Ac tenemos algunos ejemplos de
valores de K
m
. Para la catalasa
(enzima que cataliza la
descomposicin de H
2
O
2
en agua
ms oxgeno), es de 25 mM, lo que
quiere decir que cuando tiene esta
concentracin, la mitad de la
catalasa esta como complejo
enzima-sustrato y la otra mitad
esta como enzima libre. El valor de
K
m
es distinto dependiendo del
sustrato, en el caso de la enzima hexoquinasa (cerebro) necesita sustratos como ATP (0,4 mM), D-
glucosa (0.05 mM), y D-fructosa (1,5 mM); esto quiere decir que, necesita una concentracin
mucho mayor de fructosa para llegar a la mitad de la V
MAX
de la glucosa, indicando que tiene ms
afinidad por glucosa que por fructosa.
Para la quimotripsina (est en el intestino delgado e hidroliza enlaces peptdicos) es ms
conveniente poner pptidos como sustratos, en este caso tenemos gliciltirosinilglicina (108 mM) y
N-benzoiltirosinamida (2,5 mM), siendo ms especfica para el segundo, porque necesita menos
compuesto. O sea que:
El K
m
representa la afinidad de la enzima por su sustrato
Cuanto menor es el K
m
mayor es la afinidad.
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El valor V
MAX
:
V
MAX
= K
CAT
x [E]total K
CAT
: nmero de recambio o constante cataltica de la enzima

El nmero de recambio es el nmero de molculas de sustrato transformadas a producto por
molcula de enzima por unidad de tiempo, cuando la enzima est saturada por sustrato.

V
MAX
no es constante, porque se obtiene cuando la enzima est saturada, todas como complejo
enzima-sustrato; y aunque se aumente la concentracin de sustrato no se formar ms complejo
porque la limitante es la [E], entonces si aumentamos la [E] el doble, se obtiene el doble de V
MAX
.
Tenemos que la V
MAX
depender de la [E] y de K
CAT.


Si imaginamos una sola molcula de enzima que est saturada, o sea, en presencia alta [S], la
enzima esta como complejo enzima-sustrato. Entonces el sustrato en el sitio activo se transforma
en producto, el producto disocia; luego otra molcula de sustrato se convierte en producto y luego
disocia, as sucesivamente entonces hay un recambio de molculas que van pasando de sustrato
a producto. Si uno pudiera contar cuantas molculas son transformadas a producto por esa nica
molcula de enzima, en una unidad de tiempo, es lo que llamamos K
CAT
o nmero de recambio.


Ac tenemos una tabla con
algunos ejemplos de K
CAT
. Vemos
que son nmeros muy altos
medido por segundos.
La catalasa transforma 40
millones de molculas de H
2
O
2
a
oxigeno ms agua por segundo,
o sea, es una enzima rpida en
realizar el proceso de catlisis.

La importancia de K
CAT
/Km
Este cociente es lo que ms informacin entrega.

Si [S] << Km: ([S] es mucho menor que K
m
)
V= (V
MAX
/K
m
) x [S] ; remplazando por V
MAX
= K
CAT
x [E
T
] tenemos
V= (K
CAT
x [E
T
]/K
m
) x [S]
V= (K
CAT
/K
m
) x [E
T
] x [S]

K
CAT
/K
m
mide la eficiencia cataltica y la especificidad.

No es una reaccin de primer orden, sino que es un proceso bimolecular donde el sustrato va a
interaccionar con la enzima.
La enzima trasformar ms rpido a producto a el sustrato que tiene mayor K
CAT
/K
m
.
Por qu es un cociente? Porque la reaccin es ms rpida cuando K
CAT
es ms alta.
Adems, el 1/K
m
tiene que ver con que cuando el K
m
es pequeo, la afinidad es mayor, y se une
ms sustrato al sitio activo.




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Esta tabla muestra diferentes enzimas en las cuales el cociente K
CAT
/K
m
es cercano al lmite que
surge por el control difusional (10
8
a 10
9
M
-1
S
-1
). Ac estamos hablando de un proceso bimolecular
donde la enzima debe encontrarse con su sustrato; esto ocurre por difusin en solucin acuosa a
temperatura ambiente donde la reaccin es instantnea, lo que limita la velocidad es la difusin.
Estas son enzimas que poseen una alta eficiencia cataltica.


Ejemplo para la especificidad de quimotripsina:
Se propone usar 3 diferentes
sustratos: A,B,C; y en laboratorio
uno de estos es el ms adecuado.
Midieron para cada uno la K
CAT
y el
K
m
; y luego calcul el K
CAT
/K
m
.

Lo destacado en rojo muestra la
diferencia con la molcula anterior.

Entre los sustratos A y B tenemos
vemos que en B el valor K
CAT

aumento con respecto a A, en
cambio el K
m
disminuy. As que en
todo sentido uno dice que el sustrato B es mejor que el A. En el sustrato C tenemos un mayor K
CAT

pero un mayor K
m
con respecto a B, entonces el sustrato C es menos eficiente que B.
Solo con estos datos podemos calcular el K
CAT
/K
m
de cada sustrato y ver cul es ms eficiente de
los tres, en este caso sera el sustrato C.

Todo lo visto hasta ac tiene que ver con [S], ahora veremos lo relacionado con [E].

EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE ENZIMA
Cuanto mayor es [E], mayor es la formacin de complejo E-S siempre que la E este saturada.
V
MAX
es directamente proporcional a [E]. Cuando uno varia una variable, todo lo dems debe
mantenerse constante. Para calcular V
MAX
se mantiene constante la [S] que debe ser alta para
obtener altas velocidades.
Para [E] = 0 V = 0
Luego: el grfico de V
MAX
en funcin de [E] es una recta que pasa por el origen.
Se mide V
MAX
(o una velocidad cercana a V
MAX
) para determinar [E].

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Definicin: Una unidad de actividad cataltica (U) es la cantidad de enzima que cataliza la
transformacin de 1 mol de S a P por minuto, en condiciones ptimas, estandarizadas.

Se mide la velocidad y se deduce la cantidad de E que hay. Esto es muy importante porque uno
puede usar cualquier muestra donde haya una variedad de protenas, enzimas, etc. pero uno mide
especficamente de la E para la cual se hace el ensayo de actividad cataltica.

Obs.: Se usan variantes de la definicin para algunas enzimas, si es necesario o conveniente. Va
relacionado a las unidades trabajadas.


EFECTO DEL pH
Ejemplo: Pepsina (proteasa gstrica)
Se mide el efecto de pH sobre velocidad.

Ponemos log V porque es mejor comprimir los datos que
son muy grandes y diversas.

El grafico muestra que a pH bajos hay mayor velocidad.

Para cada enzima hay un pH ptimo, que es un pH al cual
se obtiene la mayor velocidad si se hacen mediciones a
diferente pH. Es caracterstico para cada E al igual que K
m
.

En este ejemplo, la pepsina tiene un pH ptimo bajo 2. Es
adecuado al pH del medio al cual acta in vivo por el jugo
gstrico que contiene el estmago.


Ejemplo: Glucosa-6-fosfatasa heptica

Se muestra una curva de pH bastante clsica, y es lo que
se espera tener. Se llama curva acampanada, en donde
primeramente la velocidad aumenta con el aumento de
pH, luego hay un mximo que no es pronunciado, y
finalmente la velocidad disminuye cuando el pH se hace
bsico.

Esta E tiene un pH ptimo cercano a 8. Tiene que ver con
el pH del citosol de los hepatocitos. Se ve que el pH
ptimo de la E no es idntico al pH del medio, pero es
parecido.

A qu se debe que la velocidad aumente en la zona donde el pH es ms alcalino? Porque lo que
ocurre ah es la catlisis acido-base. Cuando ocurre catlisis acida el sustrato debe estar
protonado, en la catlisis bsica debe estar sin el protn para recibir un protn del sustrato y
favorecer la reaccin. En caso del ejemplo, el grupo debe estar desprotonado.


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EFECTO DE LA TEMPERATURA
La velocidad de reaccin aumenta con la temperatura, porque las molculas tiene una mayor
energa promedio entonces hay un nmero mayor que puede vencer esa barrera energtica de
activacin.
Un aumento de 10C aproximadamente dobla la V.
A mayor temperatura aumenta la desnaturacin.
Los dos efectos se contraponen: a partir de cierta temperatura, la velocidad baja con la
temperatura.
Las enzimas no presentan una temperatura ptima, porque depende de cmo uno mida la
velocidad de reaccin.

Existen algunas E que son ms termolbiles que otras, otras donde a altas temperaturas no se
desnaturan tanto porque son ms termoresistentes.


Los ensayos de actividad enzimtica

Se prepara un medio de reaccin que contiene todo, menos la enzima; adems de agua
destilada debe tener los sustratos correspondientes, tampn que genere el pH optimo, algunas E
tambin necesitan un cofactor que puede ser una coenzima o un ion inorgnico que no est unido
a la E, condiciones adecuadas para este cofactor, ya que, se une reversiblemente a la E entonces
hay una curva de saturacin donde cada E tenga su cofactor.

Se tempera, con un bao termoregulado o algn espectrofotmetro con termorregulacin. La
ms usada es 30C. Debe ser sobre la T ambiente porque es ms fcil calentar que enfriar.

Se agrega la enzima para el inicio de reaccin.

En un ensayo de tiempo fijo se para la reaccin despus de cierto tiempo (corto). Por
ejemplo, si uno se presupuesta un tiempo de reaccin de 5 minutos, debe agregar algo cuando
se cumpla el tiempo para detener la reaccin. Este algo puede ser un inhibidor especifico de la
enzima o un poco de cido fuerte para denaturar a la enzima y as parar su accin.

Se determina la *P+, o, la [S] que queda an. Pero generalmente interesa calcular la [P] que
depender de la caracterstica que tenga; lo ms propio es que absorba luz entonces se mide su
absorbancia (que el reactante no absorbe).
Hay sustratos artificiales que son muy parecidos al natural, y si la enzima no es muy especfica
tambin lo cataliza sintetizndose sustratos artificiales que son cromognicos lo cual es til, ya
que, al trasformarse a producto aparece color.

Se calculan los moles de P, si es que se quiere pasar a unidades de P.

Se calculan el nmero de U y la concentracin de la enzima en la muestra (U/ml).

Se puede calcular la actividad especfica, A.E. (U/mg). Refleja la pureza de una enzima.




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Tabla de purificacin de una enzima hipottica
Se siguieron 5 etapas:

Primero se prepar un
extracto celular crudo
(sobrenadante donde
estn las protenas
solubles); el volumen
obtenido fue de 1,4 litros.
Se midieron protenas
totales con un test
especfico obtenindose
10 mil mg.; tambin se
calcul que tiene 100 mil
unidades de actividad cataltica.

Luego precipitaron con sulfato de amonio (llamado salazn), la cual a altas concentraciones de la
sal precipita las protenas; esto redujo el volumen, ya que, solo se ocupa el precipitado, a 280 ml.;
luego se calcul el total de protenas que fue de 3 mil mg.; la actividad cataltica se redujo en un
4% conservndose gran parte de las enzimas.

Se realiz una cromatografa de intercambio inico donde el volumen se redujo a 90 ml. y el total
de protenas se redujo a 400 mg., porque de entre todas las fracciones de la cromatografa se
eligi el que tiene la actividad cataltica; y las unidades se redujeron a 80 mil enzimas.

Luego se realiz una cromatografa de exclusin molecular, donde las protenas salen por orden de
tamao (primero las ms grandes y luego las pequeas); el volumen quedo casi igual, las protinas
se redujeron a 100 mg. perdiendo un poco de actividad.

Finalmente se hizo una cromatografa de afinidad (mtodo ptimo) donde el volumen se redujo
bastante, a 6 ml.; las protenas totales a 3 mg. y actividad cataltica a 45 mil unidades.
Esto sera lo corresponde a la enzima pura. El rendimiento de este proceso fue de un 45%.
Tericamente, en el extracto celular crudo, debera haber habido entre 6 a 7 mg. aprox., pero solo
se obtuvieron 3 mg.

Si se quiere hacer un anlisis para ver si realmente esta puro, debe realizarse una electroforesis.
La actividad especfica mide la pureza de la muestra de enzima.
Para cada etapa puede calcularse la actividad especfica dividiendo unidades/mg, y puede
observarse en la tabla que va fuertemente en aumento, deducindose que la etapa ms exitosa es
la ltima, ya que, pasa de 600 a 15 mil.

La actividad especfica es un cierto valor constante para cada E. Si uno tiene su E y la guarda,
debera controlar si cambia su actividad especfica, porque si cambia puede desnaturarse con el
tiempo.





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Ensayos de actividad enzimtica:
Ensayo de actividad de FBPasa, de tiempo fijo.
Ensayo de actividad de FBPasa, cintico, usando reacciones acopladas.

Determinacin de actividades enzimticas en el suero de sangre
Muchos estados patolgicos afectan la concentracin de enzimas en el plasma.

Por ejemplo, cuando una persona tiene hepatitis, los hepatocitos se irritan y se rompen,
liberndose enzimas que estn en los hepatocitos llegan a la sangre. Entonces se determina
concentracin de una enzima que es tpica de los hepatocitos en la sangre, ya que, est a una
concentracin mayor a lo normal, indicando hepatitis.

Enzimas de importancia en el diagnstico
- Fosfatasa alcalina (enfermedad heptica u sea)
- Fosfatasa cida (carcinoma de prstata)
- Alanina-aminotransferasa (lesin heptica)

Las constantes cinticas son K
m
, K
CAT
y tambin est el pH ptimo, por lo tanto, la fosfatasa alcalina
tiene un pH ptimo alcalino y la fosfatasa acida tiene un pH ptimo cido.