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Forte Potencial anticncer de um Nano-triterpenoide da Phytolacca decandra contra o adenocarcinoma A549 via
apoptose mitocondrial clcio dependente.
(Os terpenos ou terpenides formam uma diversificada classe de substncias naturais, ou metablitos
secundrios de origem vegetal, hidrocarbonetos, encontrados respectivamente nas essncias
de limo (Citrus) e do pinheiro (Pinus). Entretanto, a medida que ligaes duplas presentes nas estruturas
qumicas destas substncias passam a ser funcionalizadas, diversas funes orgnicas podem surgir,
como por exemplo lcool (mentol), cetona (cnfora), aldedo (citral), etc, Suas propriedades qumicas,
fsicas e biolgicas dependero do tamanho de suas estruturas, bem como dos grupos funcionais nelas
presentes, De acordo com o nmero de unidades de isopreno, ou unidades C5 presentes, com
C30: triterpenos;
Triterpenos livres tambm ocorrem em certas resinas e outros possuem atividades biolgicas importantes.
Ainda so precursores de fitoesteris, como o estigmasterol, o - e o-sitosterol. Os fitoesteris possuem
28 ou 29 tomos de carbono, ao contrrio daqueles esterides animais, com 27. Outros triterpenos e
fitoesteris, quando ligados a pequenas cadeias de acar (oses), so denominados saponinas, e possuem
aes biolgicas interessantes, alm da propriedade espumante de alguns. Alguns fitoesteris podem ainda
originar alcalides esteroidais, como aqueles presentes em espcies do gnero Solanum (Solanaceae),
como o tomate e a jurubeba. Triterpenos ainda podem originar heterosdeos cardiotnicos, uma classe
especial de substncia empregada na medicina, como a digoxina, empregada no tratamento
de insuficincia cardaca congestiva. Finalmente, triterpenos em animais ainda podem originar cidos
biliares e vitamina D, alm dos hormnios esteroidais.
Trabalho
- Triterpeno isolado da Phytolacca decandra.
- Nanoencapsulado com um polmero biodegradvel (NdBA)
- potencial anticancer mais forte
- melhor biodisponibilidade e ligao ao alvo.
- Clulas A549 de clulas expostas ao NdBA
- A disfuno mitocondrial (apoptose) foi determinada por exame das mudana na concentrao de
clcio intracelular, acumulo de espcies reativas de oxignio, liberao de citocromo C, protena x associada ao
BLC-2 (BAX) e caspase 3, regulao negativa de linfoma de clula B 2 e despolarizao do potencial de
membrana mitocondrial).
(Bcl-2 refere-se a uma famlia de genes dos mamferos e s protenas a que estes genes do origem. Estas
regulam a permeabilidade da membrana externa da mitocndria e podem ser, quer pr-apoptticos (Bax, Bad,
Bak e Bok, entre outros) quer anti-apoptticos (Bcl-2 propriamente dito, Bcl-xL, e Bcl-w, entre outros). H um
total de 25 genes na famlia Bcl2-2 conhecidos at ao presente. A nome Bcl-2 deriva, do ingls, "B-cell
lymphoma 2", "linfoma de clulas B 2", dado ser o segundo membro de um conjunto de protenas inicialmente
descritas como uma translocao gentica recproca no cromossoma 14 e 18 em linfomas foliculares./
Apoptosis regulator BAX promotes apoptosis by binding to and antagonizing theBcl-2 protein / )

(Caspases so um grupo de proteases baseadas em cistena, enzimas com um resduo de cistena capazes de
clivar outras protenasdepois de um resduo de cido asprtico, uma especifidade incomum entre proteases,
Caspases so essenciais na apoptose celular, um dos principais tipos de morte celular programada durante
o desenvolvimento e em outras fases da vida adulta. Algumas caspases tambm so necessrias no sistema
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imune, para a maturao das citocinas. Falhas na apoptose so uma das contribuies principais para o
desenvolvimento de tumores e doenas auto-imunes; somando-se isto apoptose indesejada que ocorre
na isquemia ou mal de Alzheimer, despertou-se rapidamente interesse nas caspases como alvos teraputicos
desde que foram descobertas em meados da dcada de 90.)
Materiais e Mtodos.
* Clulas de cncer de pulmo humano A549 (5x10
5
clulas/mL)
* TM Phytolacca decandra - evaporada 60
o
- rendimento cerca 52% - isolado por cromatografia em slica gel.
* encapsulao em nanopartculas.
* Ensaio de proliferao celular (aps exposio ao NdBA).
* absorbncia 595nm (Thermo-Scientific, Multiskan ELISA, Waltham, USA)
* Estudo de morfologia de superfcie da A 549
* Fotografas por AFM (Veeco di CP-11)
* Medio do contedo de clcio intracelular
* avaliado por indicador corante fluorescente "Fura 2-AM" - anlise por fluormetro e microscpio
fluorescente.
* Determinao de potencial de membrana mitocondrial
* Determinado por prova fluorescente, Rhodamine 123 - o potencial de membrana avaliado por citometria
e microscopia fluorescente.
* Avaliao relao ATP/ADP e atividade da ATPase.
* Calculada utilizando kit Enzylight relao ADP/ATP bioluminescencia teste (ELDT 100Q9) - anlise por
luminmetro.
* Atividade da ATPase - vermelho fenol.
* Anlise microscpica de espcies reativas de oxignio (ROS) intracelular.
* anlise fluorescncia (DCFH-DA)- a intensidade da fluorescncia DCF proporcional ao perxido produzido
na clula.
* Colorao de amarelo de acridina para apoptose.
* Identificao das estruturas condensadas de cromatina - fluorescncia examinada por microscpio de
fluorescncia.
* Estimativa de porcentagem de apoptose por citometria de fluxo
* avaliar apoptose e necrose, externalizao da fosfatidilserina - observada por anexina V-FITC /iodeto de
propdio (marcador) - avaliao por intensidade da fluorescncia em 10.000 eventos.
IMMUNOBLOT
* Ensaio imunoenzimtico
* Preparao da frao citoslica
- Amostras lavadas com tampo fosfato gelado.
- Re-suspendida em "tampo A" e lisada por homogeneizao, aps centrifugada (1000xg / 10 minutos - 4
o
C)
- Sobrenadante centrifugado (10000xg / 15 minutos) para formar pellet de mitocndria.
- A frao citoslica sobrenadante obtida por centrifugao (12000xg / 1hora - 4
o
C)
* Isolamento da mitrocndria e separao da frao mitoncondrial
- a mitocndria foi isolada por separao em clulas A549 com tripsina/EDTA, centrifugada a 300xg /5
minutos, lavadas com tampo fosfato e re-suspendida em tampo A.
- As clulas foram lisadas com um homogeinizador (40 cursos)e a suspensao centrifugada a 2500 xg - 10
minutos - 4
o
C)
- O pellet resultante foi lavado e re-suspendido com tampo B.
A anlise por immunoblot das fraes mitocondriais e citoslicas foi conduzida utilizando anticorpos
anticitocromo C e caspase 3, anticorpos fosfatase alcalina conjugada.
Para anlise quantitativa de cada banda, foi determinada a intensidade da banda usando o software Total
Lab.
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* Extrao do RNA e Anlise da transcriptase reversa.
- RNA extrado usando o reagente trizol
- cRNA foi transcrito reverso por uma transcriptase reversa e o cDNA utilizado como modelo para reao
PCR (para auxiliar a amplificao).
- utilizao de um primer oligonucleotdeo para RT-PCR.
* Avaliao in vivo da absoro relativa dos nanoencapsulados em vrios tecidos
- administrao oral em camundongos - 10mg/kg
- Anlise do tecido de crebro, pulmo, fgado e rins - anlise do homogenato final por espectofotmetro uv-
visvel em comprimento de onda 479nm.
* RESULTADOS
* Espectofotometria de massa do extrato alcolico de phytolacca decandra.
- identificao do grupo triterpenide (provavelmente derivado de cido betulnico).
* Caracterzao de nanopartculas de NdBA
- (figura 1B e C) - microscpio de fora atmica
- superfcie esfrica, superfcie lisa, sem "pinholes" ou rachaduras.
* Teste de citotoxicidade
- para avaliar dose.
* Morfologia das clulas A549
- As clulas tratadas apresentaram diferentes frequncias de apoptose como as bolhas celulares, retrao e
separao do citoplasma e flutuao, distoro e condensao nuclear.
* Contedo intracelular de clcio
- verificar se sinalizao de clcio est ligada aos caminho de apoptose.
- corante para clcio - Fura 2-AM - para verificar se NdBA induziu clcio na clula A549.
- Aumento na intensidade de fluorescncia aps exposio a 50mcg/mL e 100mcg/mL de NdBA e dBA.
* Mudana no potencial de membrana mitocondrial.
- as clulas tratadas apresentaram diminuio na intensidade de fluorescncia com Rhodamine123, que
aumentou aps 24 horas de incubao. Essa mudana tambm foi verificada com citometria de fluxo.
- figura 3B

* relao ATP/ADP e atividade da ATPase.
- a relao ATP/ADP diminuiu nas clulas A549 com doses aumentadas dos nanoencapsulados. (figura 3C)
- Aumento significante nos nveis de atividade da ATPase nas clulas tratadas.
* Gerao de ROS
- a gerao de ROS foi menor nas clulas controle (fig 3E)
* Fluorescncia por laranja de acridina.
- Clulas controle - fluorescncia verde, indicando que so viveis.
- Clulas tratadas - fluorescncia vermelha com cromatina condensada, indicando que estavam passando por
apoptose. (fig. 4A)
* Estimativa de % de apoptose.
- Dados demonstraram que os nanoencapsulados estimularam a apoptose ou necrose de modo dose
dependente, comparados com o controle. (figura 4B, a - e).

*Immunoblot e PCR-RT
- Immunoblot - anlise de expresso de protenas.
- PCR-RT - graus de expresso mRNA.
- Expresso de citocromo c na frao mitocondrial - "down regulated" nas clulas tratadas, dose
dependente.
- Nvel de citocromo c na frao citoslica - "up regulated" nas clulas tratadas, dose dependente.
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- Expresso RNAm (BAX) - up regulated, dose dependente, e expresso Bcl2 - down regulated, nas clulas
tratadas.
- Expresso de caspase 3 - up regulated com aumento das doses de tratamento.

* Distribuio tecidual de nanopartculas PLGA
- maior parte das partculas detectadas no fgado, seguida pelo rim, pulmo e crebro.
* DISCUSSO
- dBA e NdBA - diminuiu a viabilidade das clulas A549 de modo dose dependente.
- Ambas induziram a apoptose via stress ER e Clcio associado mitocondria.
- Primeiro - tentativa de identificar os mecanismos moleculares envolvidos pela apoptose induzida pelos
nanoencapsulados.
- Foco principal - entender alteraes na homeostasia de clcio induzida pelos nanoencapsulados.
- Diminuio de viabilidade de clulas A549 de modo dose dependente.
( conhecido que o processo de apoptose precedida pela colapso do potencial mitocondrial, o que pode
ser desencadeada por vrios estmulos, como mudanas na Ca2, oxignio radicais, inchao da matriz e ruptura da
membrana exterior com consequentes alteraes na permeabilidade da membrana mitocondrial externa, e
liberao de fatores apoptognicas)
- a concentrao de clcio LIC ([Ca2] i) aumentou aps a administrao de dBA e NdBA. (Pr-tratamento
com EGTA (Ca2 quelante) no evitou o aumento de [Ca2] i, o que indicou que o clcio foi de uma depsito
intracelular e no a partir do LEC. Ca2 liberado do ER conhecido por ser apoptognica, o que acaba por conduzir
perda da homeostase de [Ca2] e associado com mecanismo de apoptose e morte celular.
- perda de Ca do ER - papel na nos efeitos citotxicos de dBA e NdBA, por induo
ER estresse agudo. O tratamentos tambm causou quebra do sistema de fosforilao oxidativa por ATP /
esgotamento relao ADP e dissipao de DJM e elevao de ROS, indicando dBA que poderia alvejar mitocndrias.
- Rompimento de DJM leva a permeabilizao mitocondrial que geralmente companha ou precede o
lanamento do citocromo c para dentro do citoplasma, que conduz formao
de um complexo apoptossomo ativa e da ativao de cascata caspase, que ento ativa o carrasco caspase3 para
orquestrar a apoptose.