Universidad de Chile

Facultad de Cs. Qumicas

y Farmacuticas



Informe Electroforesis
En Geles De Poliacrilamida












Introduccin.

La electroforesis, conocida como PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis), es el
proceso de mover molculas cargadas en solucin, por efecto de la aplicacin de un campo
elctrico a travs de ellas. Se usa como tcnica para la separacin de variadas
molculas segn la movilidad de stas en un campo elctrico, dependiendo de su carga
elctrica , forma y tamao.

La poliacrilamida es un soporte empleado frecuentemente en electroforesis en gel, es
qumicamente inerte, de propiedades uniformes capaz de ser preparado de forma rpida y
reproducible.

Existen dos condiciones principales para realizar electroforesis de protenas en geles de
poliacrilamida: Nativa y Denaturante.

En la Electroforesis Nativa, las protenas se separan de acuerdo a la carga neta que
presentan a un pH determinado, as como tambin de acuerdo a su forma y tamao, a
diferencia de la Electroforesis Denaturante en la que se utiliza un detergente aninico
(SDS) ,con el cual las protenas se denaturan y quedan cargadas negativamente, adems se
usan otros agentes (-mercapto-etanol ) , as eliminando las diferencias de forma y carga ,es
posible separar protenas solo por la diferencia de tamao.

A travs del siguiente informe veremos cmo se calcula el peso molecular de algunas
muestras problemas de protenas en base a la distancia de migracin de la protena con
respecto a la distancia total de la electroforesis. De esta manera se calcula un valor R, dado
por distancia protena/distancia total. Este resultado se calcula para cada estndar de masa
molecular y se realiza una curva estndar del Log de la masa molecular versus los R
respectivos.







OBJETIVOS DEL PRCTICO:
- Comprender el proceso de separacin de protenas mediante SDS-PAGE.
- Determinar experimentalmente la masa molecular de protenas desconocidas.
- Analizar la importancia de la tcnica y su aplicabilidad en casos prcticos.


MATERIALES:
- Unidad de electroforesis con platos, peinetas y espaciadores
- fuente de poder
- micropipetas
- fuentes plsticas con tapa para teir y desteir
- agitador rotatorio



Desarrollo.


Previamente a comenzar a realizar el trabajo practico de Electroforesis
En Geles De Poliacrilamida los docentes a cargo, nos dieron una charla instructiva en la
cual se dieron a conocer una introduccin, en la cual se revisaron y dieron a conocer
conceptos, puntos clave en la realizacin del trabajo y la forma en cmo se iba a
transformar los resultados obtenidos en datos numricos posteriormente.


Se nos hizo entrega de las muestras de protenas ya preparadas, las cuales estaban
contenidas en tubos, de las cuales, cada uno tuvo que sacar con micropipeta 7 L y llevarlo
a la cmara de electroforesis previamente ya montada.

El fundamento del montaje de la cmara de electroforesis se basa que entre dos vidrios se
introducen dos espaciadores de plstico, de modo de que queden en las orillas derecha e
izquierda y alineado con el borde inferior. La funcin de los espaciadores es dar el grosor
deseado al gel de poliacrilamida que se fabricar entre los dos vidrios. Los espaciadores
pueden ser de diferente grosor de acuerdo a la cantidad de muestra que necesite agregarse.
Se coloca en un sistema de sellado de los vidrios , asegurndose que los vidrios y
espaciadores toquen el fondo del sistema. Para asegurarse que no hay filtraciones, se debe
verter agua en el espacio entre los dos vidrios, asegurndose que no escurra fuera del
sistema.
Previamente a ingresar las muestras en la cmara de electroforesis, tuvimos que sacar la
peineta que estaba contenida en el sistema, la cual nos iba a dar origen a los
compartimentos que bamos a utilizar para introducir cada una de las muestras teidas, para
poder visualizarlas en el gel. Es importante que los bolsillos en los que se depositarn las
muestras queden cubiertos con el buffer que lleva los electrolitos, es decir, el buffer de
corrida . Para el TP no contbamos con la muestra N 10 de hemoglobina por lo cual en el
compartimento se puso un blanco, en el compartimento N 5 se introdujo un estndar de
masa molecular, el cual ser nuestro patrn a seguir para calcular los pesos moleculares de
las muestras de protenas problemas . El ltimo paso es conectar la cmara de electroforesis
a la fuente de poder. Revisar que el polo negativo (ctodo) sea el que quede en contacto con
la parte superior del gel (donde estn las muestras) y el positivo (nodo) con la parte
inferior para que as las protenas cargadas negativamente por el SDS (decil sulfato de
sodio).
La electroforesis se realizo a 100V observando el avance del frente de corrida.
Para finalizar el TP de electroforesis al finalizar se retira el gel con mucho cuidado,
ayudado de unas esptulas, se puede apreciar el avance de las protenas a travs del gel,
Una vez retirado el gel, se corta la parte donde estn los espacios formados por la peineta, y
luego es sumergido en una solucin de teido, se deja el gel en sta solucin por un tiempo
necesario y despus de eso ser desteido, para retirar el exceso de teido y lograr as ver el
avance de las protenas problemas, reflejadas en el gel obtenido finalmente.





















Experimento.

Masas moleculares estndar preteido.



Se procedi a cargar 7 L de cada protena, y 15 L de muestra estndar.
- Primer compartimento: Casena.
- Segundo compartimento: Mioglobina.
- Tercer compartimento: Mezcla de enzimas.
- Cuarto compartimento: Anticuerpo.
- Quinto compartimento: St Masa Molecular.
- Sexto compartimento: Proteinato de Zapallo.
- Sptimo compartimento : Ovoalbmina.
- Octavo compartimento: Plasma.
- Noveno compartimento: Citosol de papas.
- Decimo compartimento: Blanco.



Foto del trabajo prctico de electroforesis de otro grupo.


Foto electroforesis de nuestro grupo:
Nosotros escogimos estas tres bandas de protenas, pues eran ms legibles que las dems.




Se realizaron los siguientes pasos para obtener el peso molecular de cada protena,
deacuerdo a las bandas mostradas en la imagen.


Ecuaciones para obtener los datos:







Lo primero que hacemos es la curva de calibracin
Los Rf de esta curva los sacamos con el standard, haciendo una relacin de la distancia en
que migra la protena con la total, fijndonos en los parmetros de pesos moleculares del
standard.












La distancia total es de 15.2 cm
Distancia
(cm)
kDa Rf log MM
0,8 175 0,05263158 2,243038049
2,7 80 0,17763158 1,903089987
4,5 58 0,29605263 1,763427994
6,1 46 0,40131579 1,662757832
7,6 30 0,5 1,477121255
9,8 25 0,64473684 1,397940009
13,1 17 0,86184211 1,230448921
14,6 7 0,96052632 0,84509804

Mediante regresin lineal es posible aproximar una recta que relacione el PM con el Rf,
obteniendo:
Luego de obtener la curva de calibracin sacamos los Rf de las protenas escogidas, para
relacionarlos con los PM (pesos moleculares) de la curva de calibracin.

P1= Rf1 = 7,5/15,2= 0,493421052
P2= Rf2= 14,8/15,2= 0,97368421
P3= Rf3= 11,5/15,2= 0,756578947

Mediante regresin lineal de la curva de calibracion es posible aproximar una recta que
relacione el Rf con el PM, dando como resultado la siguente ecuacion de la recta, en donde
el eje (x) seria los Rf y el eje (y) los log PM
logPM = -1,3081RF + 2.2022
luego interpolamos y obtenemos los Rf moleculares de las tres proteinas escogidas, para
sacar sus respectivos PM (pesos moleculares).

N de protena distancia de migracin
(cm)
Rf log PM PM
1 7,5 0,493421052 1,556755922 36,03761
3 8,1 0,532894737 1,505120395 31,99782
2 14,8 0,97368421 0,928523685 8,482496


La protena N 1 representada por el bolsillo tercero con la mezcla de enzimas nos dio un
peso molecular equivalente a 36,03761.
La protena N2 representada por el bolsillo sptimo que contena ovoalbmina nos dio un
peso molecular de 31,9978.
La protena N3 representada por el bolsillo octavo que contena citosol de papas nos dio
un peso molecular de 8,482496.
Grfica:


0
0.5
1
1.5
2
2.5
0 0.5 1 1.5
l
o
g

M
M

Rf
Grfico log MM v/s Rf

Series1
Linear (Series1)