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INSTI TUTO DE TECNOLOG A ORT

MI CROBI OLOG A GENERAL


GU A DE TRABAJOS PRCTI COS










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Trabajo Prctico N 1
Microscopa



Objetivos
Describir cada una de las partes del microscopio y comenzar a relacionarse con el mismo.
Adquirir entrenamiento en la tcnica de enfoque con en el microscopio ptico de distintos tipos de
preparados: coloreados y sin colorear.
Observar protozoos de vida libre y otras clulas (eritrocitos) para poder establecer comparaciones en lo que
se refiere a tamao celular.

Materiales
Porta objetos
Cubreobjetos
Preparados coloreados
Pipetas Pasteur
Microscopios
Centrfuga
Tubos de centrfuga

Procedimiento
-Centrifugar aproximadamente entre 3 y 7 ml de agua estancada durante 5 minutos a 2.500 RPM.
Descartar el sobrenadante, observar el sedimento en el microscopio ptico, colocndolo entre porta y
cubreobjetos.
-Colocar una gota de sangre entera entre porta y cubreobjetos y observar en el microscopio ptico.
-A partir de una muestra coloreada en un portaobjeto, entregada por el docente, observar en el microscopio
ptico.


Resultados
Realizar un informe detallado, dibujando todo lo observado en cada uno de los preparados.

Cuestionario
Realice un esquema alineando microorganismos de menor a mayor tamao. Comenzar con los virus hasta
llegar a las clulas eucariotas colocando las dimensiones en micrones.



-















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Trabajo Prctico N 2




Distribucin de los microorganismos en el medio ambiente


Objetivos:
Demostrar la presencia de microorganismos en el medio ambiente
Describir las caractersticas morfolgicas que presenta un cultivo microbiano a simple vista
Clasificar los diversos caracteres culturales de los microorganismos


Materiales:
3 placas de petri
Agar nutritivo estril y/o CLDE
Hisopos de algodn
Mechero
Ansa rulo


Procedimiento:

1 Exposicin al aire:
Dejar expuesta al aire libre durante 30 minutos una caja de Petri destapada conteniendo el medio. Tapar e
incubar la placa invertida en estufa a 37 C por 24 / 48 Hs.

2 Siembra con hisopo:
Tomar el hisopo, humedecerlo con agua y pasarlo sobre la piel o dientes o mesa del laboratorio, etc. Abrir la
caja de Petri y con el hisopo en posicin oblicua, depositarlo muy suavemente sobre la superficie del medio
en forma de zig-zag.
Tapar la caja e incubarla invertida en estufa a 37 C por 24 / 48 Hs.

3 Siembra con ansa:
Sobre el agar de una placa estriar con el ansa suavemente en forma de zig-zag el material de una muestra
bacteriana entregada por el docente.
Tapar la caja e incubarla invertida en estufa a 37 C por 24 / 48 Hs.


Resultados:
Al cabo de la incubacin, elegir distintos tipos de colonia de cada placa y describirlas. Para examinarlas, es
conveniente utilizar una lupa (si se trabaja con bacterias patgenas, las cajas deben permanecer cerradas).
Describir y dibujar las colonias elegidas, de acuerdo con la gua de reconocimiento.


Gua de reconocimiento:

1 Forma




Circular Puntiforme Irregular Filamentosa Rizoide

2 Superficie
Se llama superficie a la parte superior de la colonia en contacto con la atmsfera.
Pulida: lisa y regular
spera: pequeas irregularidades
Anillos concntricos
Radiada
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3 Elevacin
Es la diferencia de nivel entre la superficie de la colonia y el medio de cultivo.




Difusa Plana Elevada Convexa Umbilicada Mamelonar

4 Borde
Es la periferia de la colonia




Entero Ondulado Lobulado Erosionado Filamentoso Enrulado

5 Cromognesis
Refiere al color de la colonia. Se clasifican en pigmentadas o no pigmentadas.

6 Olor
El olor de las colonias puede ser frutal, cido, etc.

7 Dimetro
Es el dimetro aproximado en mm


Cuestionario:

1 Cul es la fuente de los microorganismos encontrados en el aire y en la superficie del laboratorio ?

2 Qu es una colonia bacteriana ?

3 Una colonia bacteriana contina incrementando su dimetro por incubacin prolongada ? Explique.

4 Qu importancia prctica tienen los microorganismos del aire para la persona que trabaja en un
laboratorio de bacteriologa ?

5 Cul es la finalidad de incubar con la placa invertida ?
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Trabajo prctico N 3
Aislamiento de cultivos puros. Mtodo por estra


Objetivo:
Obtener colonias puras a partir de una mezcla de dos tipos de bacterias.


Materiales:
Suspensin de mezcla bacteriana entregada por el docente.
3 placas de Petri.
Medio CLDE.
Ansa rulo.


Procedimiento:
Preparar tres cajas de Petri con medio CLDE.
Estriar la mezcla bacteriana con un ansa esterilizada a la llama del mechero, en las placas conteniendo el
medio slido de acuerdo al siguiente esquema y sin re cargar el ansa:






Incubar las cajas invertidas en estufa a 37 C 24 / 48 Hs.


Examen del crecimiento bacteriano:
Examinar las colonias obtenidas despus del perodo de incubacin sin abrir la caja, y describirlas segn la
Gua de Reconocimiento del prctico N 1.
Seleccionar colonias morfolgicamente diferentes de las placas examinadas. Las cajas deben conservarse
para su utilizacin en el prctico siguiente.
En caso de no obtener colonias aisladas, o una sola variedad de ellas, se proceder a un nuevo re
aislamiento.

Cuestionario:

1 De qu se origina cada colonia visible en el agar ?

2 Establezca la diferencia entre clula bacteriana y colonia.

3 Cul es la forma ms comn de las colonias separadas ?

4 Cul es la ventaja de los medios slidos sobre los lquidos en el aislamiento de los microorganismos ?

5 Cul es la ventaja del medio CLDE con respecto al agar nutritivo ?

6 Cul es la importancia de cada uno de los componentes en el agar nutritivo y en el medio CLDE ?

7 Es el agar agar un nutriente ? Lo reemplazara por gelatina ? Explique.
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Trabajo Prctico N 4
Tincin de Gram


Objetivo:
Observar microscpicamente una clula bacteriana.


Materiales:
Portaobjetos
Colorantes
Ansa rulo
Aceite de inmersin
Microscopio ptico


Procedimiento:
Se realizar la tincin de Gram a cada uno de los distintos tipos de colonias aisladas en el trabajo prctico
N 2, segn la siguiente tcnica:
Lavar cuidadosamente un portaobjetos con agua y detergente, enjuagar con alcohol y dejar secar.
En caso de partir de una colonia proveniente de un medio slido, colocar una gota de agua destilada
en el centro del portaobjetos, tomar con un ansa parte del material y homogeneizarlo en la gota de agua.
Si se trata de un cultivo en medio lquido, agitar el caldo y tomar una gota del mismo con un ansa rulo
y extenderlo directamente sobre el portaobjeto seco.
Dejar secar el extendido al aire
Fijarlo pasando el mismo tres veces por la llama del mechero (con el extendido hacia arriba).
Cubrir el portaobjeto con el colorante Violeta de Gram. Dejar actuar 2 minutos. Eliminar el exceso de
colorante, sacudiendo ligeramente el portaobjeto.
Cubrir el portaobjeto con lugol. Dejar actuar 1 minuto.
Enjuagar con decolorante (alcohol : acetona 1+1), hasta decoloracin.
Lavar con agua.
Cubrir el portaobjeto con safranina. Dejar actuar 1 minuto.
Lavar con agua corriente.
Secar al aire.
Observar los distintos preparados al microscopio, con el objetivo de inmersin a 100 X.
Relacionar lo observado al microscopio con la descripcin morfolgica hecha en el Trabajo
N 2


Resultados:
Los resultados se deben expresar segn la siguiente clasificacin:


Morfologa:

Cocos

Diplococos (de a 2) Streptococos (en cadena) Stafilococos (en racimos)



Bacilos

Cocobacilos



Retencin del colorante por la clula:
Violeta = Gram (+)
Rosa intenso = Gram (-)

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Cuestionario:

1 Por qu se fijan los extendidos bacterianos ?

2 Qu cambios qumicos se producen durante el proceso de fijado ?

3 Cul es la naturaleza qumica de los colorantes empleados ?

4 Describa un objetivo de inmersin y su importancia prctica.

5 Qu sucede en cada paso de la coloracin de Gram, tanto en bacterias Gram (+) como en Gram (-) ?

6 Qu factor puede influir en los resultados de esta tincin ?

7 Qu importancia prctica tiene la coloracin de Gram para el bacterilogo ?
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Trabajo Prctico N 5
Integratorio


Objetivo:
Aplicar los conocimientos adquiridos en los trabajos prcticos realizados hasta el momento.


Procedimiento:
Cada alumno recibir muestras incgnitas aisladas de materiales clnicos previamente sembradas en
distintos medios slidos.
Clasificar los distintos tipos de colonias encontradas, de acuerdo a lo realizado en el Trabajo N 1.
Realizar a cada tipo de colonia la Tincin de Gram


Resultados:
Para la expresin de los resultados, deben relacionarse los aspectos macroscpicos de las diferentes
colonias con su observacin microscpica.


Cuestionario:

1 De acuerdo a lo observado en la Tincin de Gram, qu tipo de bacterias predominan en las muestras ?

2 La Tincin de Gram, sirvi para identificar la presencia de patgenos en las muestras clnicas ?

3 Cul es la utilidad de los distintos medios slidos que fueron utilizados, en funcin de la muestra
recibida ?
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Trabajo Prctico N 5
Recuento de bacterias viables aerobias mesfilas en placa


Introduccin:
Este mtodo cuantifica el nmero de bacterias vivas (viables) que posee una muestra a investigar, ya que
se basa en el recuento de colonias de microorganismos que crecen en un medio de cultivo slido apropiado.
El recuento de bacterias aerbicas no mide necesariamente el nmero total de bacterias viables por gramo
de muestra analizada, puesto que las clulas bacterianas se encuentran aisladas en pares, cadenas o
racimos. Por este motivo, el conteo debe expresarse como colonias por gramo o mililitro, o UFC (Unidades
Formadoras de Colonia) por gramo o mililitro.
Cuando se cuentan colonias debe recordarse que no todos los microorganismos crecen en las mismas
condiciones. Esto es debido a los requerimientos especiales de nutrientes, oxgeno, temperatura de
incubacin, presencia de clulas daadas, etc. Recordemos que, en contraposicin, al mtodo de recuento
microscpico lo denominamos Recuento Total Directo, ya que all cuantificamos tanto los microorganismos
vivos como los muertos.
En este mtodo se trabaja con diluciones de la muestra. El objeto de diluir reside en la necesidad de
transportar la carga microbiana de la muestra a nmero de microorganismos aproximadamente ubicados
entre 30 y 300 colonias por placa. Valores menores de 30 no son representativos estadsticamente, y
valores mayores de 300 pueden estar influenciados por problemas de inhibicin en el crecimiento a raz de
la competencia que se genera al encontrarse las colonias muy cerca unas de las otras (antagonismo).
Una vez listas las diluciones, se pueden realizar dos tipos de siembras: por extensin en superficie y en
profundidad.


Objetivo:
Conocer el manejo de la tcnica de recuento de bacterias viables en una muestra incgnita (aguas,
alimentos, etc) y poder evaluar as el grado de contaminacin de las mismas.


Materiales:
Caldo con bacterias entregado por el docente
Tubos de ensayo estriles con tapa
Placas de Petri estriles
Agua destilada estril
Erlenmeyer conteniendo agar nutritivo o para recuento estril
Esptulas de Drigalsky


Procedimiento:

1 Preparacin de las diluciones:
Le ser entregado al alumno una muestra de caldo conteniendo aproximadamente 10
8
bacterias / ml.
Las diluciones se realizan segn lo indica el siguiente esquema:

100 l 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l 1000 l







Mc. Farland
10
7
- 10
8

9,9 ml H2O
1/10
2

9 ml H2O
1/10
3

9 ml H2O
1/10
4

9 ml H2O
1/10
5

9 ml H2O
1/10
6

9 ml H2O
1/10
7







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Las diluciones se realizan junto al mechero, utilizando pipetas estriles con filtro de algodn. El agua
utilizada debe ser estril. Para homogeneizar el contenido del tubo, debe agitarse luego de cada adicin. Es
importante enjuagar bien la pipeta despus de cada dilucin, para no alterar las concentraciones. Esto se
logra aspirando y soplando el lquido dentro del tubo varias veces, produciendo un burbujeo. El filtro de
algodn de las pipetas impedir que la muestra se contamine.

2 Siembra por extensin en superficie
Los erlenmeyers conteniendo el medio de cultivo slido se calientan en bao de agua o microondas hasta
que el mismo funda completamente.
Una vez fundido el medio, se plaquean 5 cajas de Petri estriles y se deja solidificar.
Se secan las placas en la estufa hasta la completa eliminacin de las gotas que haya en la superficie del
agar. Este paso es de extrema importancia debido a que el agua remanente sobre la superficie de la
placa puede arruinar o distorsionar todo el trabajo.
Transcurrido el perodo de secado de la superficie, las placas se tapan y retiran de la estufa y se dejan
enfriar.
Comenzando por el tubo ms diluido (1/10
7
), se inocula en forma asptica un volumen conocido de entre 0,1
y 0,2 ml en el centro de una de las placas de Petri. Se procede de igual manera con los tubos ms
concentrados hasta la dilucin 1/10
3
. Como se utiliza la misma pipeta, es importante seguir el orden que se
indica, para evitar alteraciones en las concentraciones. Las placas se rotulan.
El inculo se distribuye por toda la superficie del medio utilizando una esptula de Drigalsky.
Se dejan las placas unos minutos en el lugar, cerradas, para que la muestra sea absorbida por el medio.
Luego se llevan a la estufa de incubacin durante 48 Hs a 37 C (temperatura y tiempo requeridos por los
microorganismos mesfilos)
Se procede al recuento de las colonias.
Este mtodo tiene ciertas ventajas sobre el mtodo en profundidad:
No es esencial el uso de medios traslcidos.
Se puede observar la morfologa de las colonias.
Los microorganismos no estn expuestos al calor del medio fundido, que puede dar lugar a recuentos ms
bajos en algunos casos.
Tiene como desventaja la necesidad de usar volmenes pequeos (0,1 / 0,5 ml) que lo hacen perder
exactitud en muestras que contienen microorganismos.

3 Siembra en profundidad
Se funde el medio nutritivo al igual que en el mtodo anterior.
Con una pipeta estril de 1ml, se toma exactamente ese volumen de la muestra ms diluida y se vierte en el
centro de una placa de Petri estril. Se repite la misma operacin utilizando la misma pipeta, siempre del
tubo ms diluido al ms concentrado. Se inoculan cinco placas (no se trabaja con las dos diluciones ms
concentradas). Es importante rotular la base de las placas con las diluciones realizadas para evitar
confusiones. El prximo paso debe realizarse antes de que transcurran 15 minutos.
Una vez fundido el medio de cultivo, se deja enfriar hasta los 45 C aproximadamente y se vierte sobre las
placas anteriormente inoculadas en forma totalmente asptica. El agregado del medio a mayor temperatura
puede provocar la muerte de microorganismos, induciendo a errores por defecto en el recuento. Debe
cuidarse tambin que la temperatura del agar no baje a menos de 45 C, puesto que comenzara a
solidificarse. En las placas de Petri normales se agregan entre 15 y 20 ml de medio de cultivo.
Una vez agregado el medio de cultivo sobre la siembra, se debe homogeneizar . Para esto se apoya la
palma de la mano sobre la placa y suavemente se realizan varios movimientos en forma de ocho. Se deja
solidificar en el lugar y se incuban las placas invertidas en la estufa.


Resultados:

a) Recuento de colonias
Despus de la incubacin se procede al recuento de colonias. Si las colonias son pocas, se cuentan
directamente. Si no, se divide la caja en cuadrantes y se cuentan las colonias de cada uno de ellos. Si son
numerosas, se cuentan con la ayuda de una lupa.
Se aconseja tomar en cuenta las cajas que contienen no ms de 300 colonias y no menos de 30, por los
errores que se cometen.
Si las placas de todas la diluciones dan menos de 30 colonias cada una, se registra el nmero de colonias
sobre la dilucin ms baja y se informa el valor estimado.
Si las placas de todas las diluciones no presentan colonias, se informa que el recuento de colonias estimado
es menor a 1 x 1 / dilucin por gr o ml, segn corresponda.
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Si todas las placas presentan ms de 300 colonias, se cuentan las colonias en aquellas porciones que sean
representativas de la distribucin de colonias en la placa ms diluida, y se informa el valor estimado.
Como el nmero de colonias que desarrollan en el medio de cultivo a la temperatura indicada es slo una
porcin reducida de la cantidad de bacterias de la muestra en examen, es ms correcto expresar el
resultado como colonias / ml en vez de bacterias / ml.
Se expresar as que la muestra tiene tantas colonias / ml que desarrollan aerbicamente en agar nutritivo,
incubado a 37 C. El error cometido por este mtodo es relativamente considerable, por lo tanto, no deben
expresarse los resultados de manera que den una exactitud que pueda garantizar el mtodo, pero de todas
maneras se obtiene as un ndice de contaminacin del agua o de la muestra en estudio.

b) Clculos:
El nmero de microorganismos se obtiene segn la siguiente frmula:

N de colonias contadas x factor de dilucin
N de microorganismos viables / ml =
Volumen de siembra

Donde factor de dilucin es 1/dilucin.

Es conveniente redondear los resultados para no dar una idea equvoca de exactitud. Si el ltimo dgito es
mayor o igual a 5 se aproxima a la decena siguiente, si es menor a la decena anterior.


Cuestionario:

1 Discuta brevemente la ventajas y desventajas de los dos mtodos utilizados.

2 En base a esto, explique cul mtodo elegira para el trabajo en el laboratorio.

3 Describa otros mtodos de recuento.

4 En una placa se cuentan 200 colonias proveniente de una dilucin de la muestra incgnita 10
-4
(1/10.000).
Se haban sembrado 0,2 ml por el mtodo de superficie. Qu concentracin de bacterias tiene el cultivo
original ?.

5 Proponga un esquema en el laboratorio aplicando el mtodo de recuento aprendido para realizar una
curva de crecimiento de un determinado microorganismo.
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Trabajo Prctico N 6
Anlisis bacteriolgico de aguas


Introduccin:
La bsqueda directa de los microorganismos patgenos causantes de enfermedades hdricas no se realiza
con frecuencia en los exmenes bacteriolgicos de aguas. Estas bacterias son de vida precaria fuera del
organismo animal; casi siempre llegan a los cursos de agua en forma intermitente y en reducido nmero.
Esto provoca que su investigacin, ya de por s laboriosa, pocas veces de resultados satisfactorios.
La corriente es determinar la calidad higinica del agua en una forma directa, como es la investigacin de
bacterias tpicas del intestino humano o animal. Este es un mtodo seguro, relativamente rpido y de
extrema sensibilidad. Una muestra de agua que contenga bacterias de origen intestinal indica la existencia
de una contaminacin fecal, y por lo tanto la posibilidad de contener bacterias patgenas intestinales, lo cual
es potencialmente peligroso.
Entre las bacterias de origen intestinal se han elegido como indicadores de contaminacin las que integran
el grupo coliforme, es decir, bastones Gram (-) no esporulados que fermentan lactosa con
produccin de cido y gas,



Parte1: Anlisis cuantitativo


Determinacin de bacterias aerobias totales


Objetivo:
Determinar cuantitativamente la cantidad de bacterias aerobias totales mediante el mtodo de recuento en
profundidad.


Materiales:
3 cajas de Petri
Agar nutritivo o agar recuento estril
3 tubos estriles
Pipetas de 1 y 10 ml estriles
Agua destilada estril
Muestra de agua


Procedimiento:
Se efectan tres diluciones a partir de una muestra de agua contaminada empleando agua destilada estril.
Deben utilizarse tubos de ensayo y pipetas estriles.
Si se trata de aguas poco contaminadas, se utilizar la muestra original y dos diluciones de 1/5 y 1/10.
Si se trata de aguas muy contaminadas, se realizarn 3 diluciones sucesivas de 1/10 cada una, para
obtener tres muestras cuyas concentraciones finales sean 1/10, 1/100 y 1/1000.
Se funde el medio y se enfra a 45 50 C.
Se coloca aspticamente 1 ml de cada dilucin en cada una de las cajas de Petri, previamente marcadas
con las diluciones a sembrar.
Se vierte en cada una de las cajas de Petri el medio fundido. Se mezcla con suaves movimientos de
rotacin y se deja solidificar.
Las cajas se incuban invertidas en estufa a 37 C durante 48 Hs. El tiempo transcurrido desde que se
efecta la dilucin hasta el agregado del medio de cultivo no debe ser superior a los 15 minutos.


Resultados:
Despus de la incubacin se procede al recuento de colonias, al igual que se realiz en el prctico anterior.
El valor normal admitido es de 50 colonias de bacterias aerobias totales / ml.

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Parte 2: Investigacin de coliformes


Determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes totales:
METODO DE WILSON


Objetivo:
Determinar el grado de contaminacin a travs de la bsqueda de bacterias coliformes en la muestra de
agua en estudio.


Materiales:
Muestras de agua
3 tubos de crioscopia conteniendo caldo Mac Conkey doble concentracin y campanita Durham.
6 tubos de ensayo con caldo Mac Conkey simple concentracin y campanita Durham.
Erlenmeyer conteniendo 90 o 99 ml de agua destilada estril segn la dilucin a realizar
Pipetas de 10, 1 y 0,1 ml estriles.
Tubos con caldo Mac Conkey simple concentracin y campanita Durham. *
Tubos con caldo Citrato de Koser. *

* Cantidad variable segn los resultados obtenidos en la primera parte de la experiencia.


Procedimiento:
Segn el origen de la muestra se realizar la dilucin correspondiente.
En tres tubos con 10 ml de caldo Mac Conkey doble concentracin sembrar 10 ml de agua muestra.
En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentracin sembrar 1 ml de agua muestra.
En tres tubos con 5 ml de caldo Mac Conkey simple concentracin sembrar 0,1 ml de agua muestra.
Llevar todos los tubos a incubar a 37 C 24 48 Hs.


Resultados:
Se considera positivo todo tubo que presenta cido y gas, lo que indica que el agua posee bacterias
coliformes.
El nmero ms probable (NMP) de bacterias coliformes por 100 ml se calcula mediante una tabla estadstica
teniendo en cuenta la combinacin de tubos sembrados con 10, 1 y 0,1 ml de agua y la combinacin de
tubos positivos.



Diferenciacin de las bacterias coliformes


Determinacin del NMP de bacterias colifecales
De cada uno de los tubos Mac Conkey positivo, se repica con ansa rulo a tubos con 5 ml de caldo Mac
Conkey concentracin simple. Se incuba a 44 C durante 48 Hs.
A esta temperatura dan cido y gas las bacterias colifecales. Mediante el empleo de esta tabla y usando la
combinacin original sembrada y la combinacin de tubos positivos, tendremos un valor *a que mediante
la aplicacin de una frmula convencional permitir determinar el NMP de bacterias colifecales por 100 ml.


Determinacin del NMP de bacterias intermedias aerogenes cloacae (IAC).
De todos los tubos positivos del caldo Mac Conkey incubado a 37 C hacer repiques con ansa recta a tubos
con medio Citrato de Koser e incubar a 37 C durante 48 Hs. Se utiliza ansa recta con el objeto de no llevar
a los tubos con citrato, material nutritivo del cultivo original. Esto es importante, pues pequeas cantidades
de peptona son suficientes para permitir el desarrollo de E. coli fecal y modificar por lo tanto los resultados
del ensayo.
Se consideran como positivos los tubos que presenten coloracin azul. Si el medio permanece verde, el
ensayo se considera negativo. Si la coloracin es dudosa, pueden agregarse unas gotas de solucin de azul
de bromotimol. El citrato es utilizado por las bacterias como nica fuente de carbono produciendo amonaco;
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esto hace que el pH aumente junto con el desarrollo microbiano y produce el viraje del indicador, lo que es
originado nicamente por las bacterias del grupo IAC.
Mediante el empleo de la tabla y usando la combinacin original sembrada y la combinacin de tubos
positivos obtendremos un valor **b que mediante la aplicacin de una frmula convencional permite
determinar el NMP de las bacterias del grupo IAC por 100 ml.

a
NMP colifecales por 100 ml = X
a+b

b
NMP bacterias IAC por 100 ml = X
a+b

Siendo: X = NMP coliformes por 100 ml
*a y **b ya se explic como se obtienen


Determinacin de Pseudomonas aeruginosa:
Pasar 100 ml de muestra por filtro Millipore y colocar sobre Agar Cetrimida. Utilizar otra placa como control
de esterilidad del medio. Incubar a 37 por 24 horas.
Para confirmar, observar las placas de Agar Cetrimida con exposicin a lmpara de luz UV (longitud de
onda larga). Las colonias de Pseudomonas aeruginoasa se ven fluorescentes.
Informar como Presencia o Ausencia.


Cuestionario:

1 Qu significado tienen las bacterias coliformes en un agua de bebida ?

2 Existen otras bacterias normalmente en el intestino humano ? Cules recuerda ?

3 Qu bacterias patgenas pueden transmitirse por el agua y ocasionar infecciones intestinales ?

4 Qu caractersticas definen al grupo coliforme

5 Qu lmite de bacterias coliformes se ha adoptado como mximo para una agua de bebida

6 Qu volumen tienen las porciones que se acostumbra sembrar cuando se trata de agua de bebida

7 Describa el mtodo usado en clase para el examen bacteriolgico de aguas.

8 Una muestra de agua de ro dio los siguientes resultados:
Anlisis cuantitativo: se realiza una dilucin 1/100 y se siembra 1,0 ml de la misma en profundidad.
Se cuentan 50 colonias.
NMP por esquema de Wilson:

Tubos positivos por
10 ml 1,0 ml 0,1 ml
Mac Conkey 37 C 3 1 1
Mac Conkey 44 C 2 1 0
Citrato de Koser 37 C 1 1 0

Cmo informara dicha muestra ?
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TABLA PARA LA DETERMINACIN DEL NMP


NMP por 100 ml usando tres tubos inoculados con 10, 1 y 0,1 ml de muestra

Tubos Positivos Tubos Positivos
10 ml 1 ml 0,1 ml
NMP
10 ml 1 ml 0,1 ml
NMP
0 0 1 3 2 0 1 14
0 0 2 6 2 0 2 20
0 0 3 9 2 0 3 26
0 1 0 3 2 1 0 15
0 1 1 6 2 1 1 20
0 1 2 9 2 1 2 27
0 1 3 12 2 1 3 34
0 2 0 6 2 2 0 21
0 2 1 9 2 2 1 28
0 2 2 12 2 2 2 35
0 2 3 16 2 2 3 42
0 3 0 9 2 3 0 29
0 3 1 13 2 3 1 36
0 3 2 16 2 3 2 44
0 3 3 19 2 3 3 53
1 0 0 4 3 0 0 23
1 0 1 7 3 0 1 39
1 0 2 11 3 0 2 64
1 0 3 15 3 0 3 95
1 1 0 7 3 1 0 43
1 1 1 11 3 1 1 75
1 1 2 15 3 1 2 120
1 1 3 19 3 1 3 160
1 2 0 11 3 2 0 93
1 2 1 15 3 2 1 150
1 2 2 20 3 2 2 210
1 2 3 24 3 2 3 290
1 3 0 16 3 3 0 240
1 3 1 20 3 3 1 460
1 3 2 24 3 3 2 1100
1 3 3 29 3 3 3 >1100
2 0 0 9

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Trabajo Prctico N 7
Pruebas Bioqumicas Bacilos Gram (-)


Objetivo:
Estudiar un grupo de bacterias pertenecientes a la familia de las Enterobacteriaceae, que son: bacilos
Gram (-), no esporulados, mesfilos, fermentadores de glucosa, oxidasa (-), nitrato reductasa (+).


Introduccin:
Las pruebas bioqumicas son muy importantes para la clasificacin bacteriana. Estas pruebas se basan en
diferentes reacciones qumicas que se realizan con el fin de clasificar las bacterias. Estas utilizan los
catalizadores biolgicos conocidos con el nombre de enzimas.
Equipo enzimtico bacteriano: a pesar de su tamao microscpico las bacterias poseen innumerables
enzimas que aseguran sus funciones metablicas.
El equipo enzimtico y la cantidad de cada una de las enzimas presentes en un momento dado en la
bacteria, estn determinados por un sistema gentico de control.
Localizacin: la mayora de las enzimas estn contenidas en la estructura celular bacteriana: intracelulares.
Tambin estn aquellas que las bacterias excretan al exterior: extracelulares.


Desarrollo de las diferentes pruebas bioqumicas para la tipificacin de este grupo:


1 Accin de los microorganismos sobre los hidratos de carbono:

Materiales:
Cultivos puros entregados por el docente
Medios:
Caldo glucosa 1% con indicador prpura de bromocresol y campanita Durham
Caldo lactosa 1% con indicador prpura de bromocresol y campanita Durham
Caldo sacarosa 1% con indicador prpura de bromocresol y campanita Durham

Procedimiento:
Rotular cada uno de los tubos.
Inocular con los microorganismos puros los tubos con caldo glucosa, lactosa y sacarosa.
Incubar a 37 C y observar a las 48 Hs.

Resultado:
El ataque al azcar se evidencia por:
Acidificacin del medio, visualizada por el viraje del indicador al amarillo (originalmente prpura).
Formacin de gas, evidenciada por la presencia del mismo dentro de la campanita.
Si no se visualizan cambios significa que el microorganismo no ataca ese azcar.


2 Metabolismo de protenas y aminocidos - Ataque de la gelatina:

Materiales:
Tubos con gelatina nutritiva. Mantener gelatina en cmara fra hasta el momento del uso.

Procedimiento:
Inocular por puncin el tubo con el microorganismo aislado. Dejar un tubo como control sin inocular.
Incubar el tubo inoculado a 37 C.
Examinar diariamente los tubos incubados a 37 C y durante 7 das. Para ello al retirarlos de la estufa
colocarlos verticalmente en un bao fro o heladera durante 10 minutos, para poder as determinar si hay
licuacin por accin bacteriana o solo fusin por accin del calor.

Resultados:
Observan ausencia o presencia de licuacin. La prueba se tomar como positiva en este ltimo caso.

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Interpretacin:
La formacin de proteasas extracelulares se detecta generalmente por la licuacin de la gelatina, la cual es
susceptible de ser hidrolizada por una variedad de proteasas (la gelatina es una protena desnaturalizada,
no posee estructura terciaria ni cuaternaria).



Carboxipeptidasas

Peptidasas (exoenzimas)


atacan enlaces peptdicos terminales
Proteasas
Aminopeptidasas
(extracelulares)
Proteinasas (endoenzimas)
atacan enlaces peptdicos no terminales


Esta prueba, salvo algunas excepciones, es generalmente negativa en esta familia.


3 Metabolismo de protenas y aminocidos - Ataque de bacterias sobre la leche:

Materiales:
Leche en polvo descremada al 10% adicionada con prpura de bromocresol con campanita Durham.

Procedimiento:
Inocular un tubo de leche con el microorganismo aislado. Guardar un tubo como control.
Incubar a 37 C durante 1 semana practicando lecturas cada 48 Hs.

Resultados:
Expresar el cambio de pH del medio por el viraje del indicador.
Indicar la presencia o ausencia de gas.
Indicar la produccin de cogulo.
Indicar la redisolucin o no del cogulo (peptonizacin).

Interpretacin:
La leche es un excelente medio de cultivo porque contiene hidratos de carbono (lactosa), protenas
(casena), grasas (fosfolpidos), vitaminas y sales minerales.
Existen dos tipos de reacciones sobre la leche, segn el microorganismo:
Coagulacin cida: los microorganismos fermentan la lactosa con produccin de cido y gas. Al
producir cido, bajan el pH y coagulan las protenas de la leche. En este tipo de coagulacin se debe
observar viraje del indicador, formacin de cogulo y produccin de gas.
Coagulacin dulce: se produce por la accin de una enzima llamada renina, que es capaz de hidrolizar
casena a p-casena. La p-casena, que es soluble, reacciona con sales clcicas para precipitar p-caseinato
de calcio. El lquido claro que rodea al precipitado, es suero. Esta coagulacin es usualmente seguida de
una protelisis, dependiendo del microorganismo usado. En la protelisis o peptonizacin, se produce
acumulacin de compuestos nitrogenados solubles, que implican disolucin del cogulo, cambio de pH y el
consecuente viraje del indicador a prpura.


4 Rojo de Metilo:

Introduccin:
El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo
de metilo detecta cido es considerablemente menor que el de otros indicadores utilizados en medios de
cultivo bacteriolgicos. Por ende, a fin de provocar un cambio de color, el organismo en estudio debe
producir grandes cantidades de cido a partir del sustrato hidrocarbonado que emplea.

Principio:
La prueba del rojo de metilo es cuantitativa para la produccin de cido y requiere microorganismos
positivos que produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico) a partir de glucosa, por la va de la
fermentacin cida mixta. Dado que son muchas las especies de enterobacterias que pueden producir
cantidades suficientes de cidos fuertes detectables con el indicador rojo de metilo durante las fases
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iniciales de la incubacin, slo se consideran positivos aquellos microorganismos que pueden mantener el
pH bajo luego de una incubacin prolongada de entre 48 a 72 Hs. contrarrestando el sistema estabilizador
del pH del medio.
El medio utilizado ms comnmente es el caldo RM/VP (rojo de metilo Voges-Proskauer).

Procedimiento:
Inocular el caldo RM/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio.
Incubar el caldo a 37 C durante 48 a 72 Hs.
Luego de la incubacin agregar directamente al caldo 5 gotas del reactivo rojo de metilo.

Resultado:
El desarrollo de un color rojo estable en la superficie del medio indica que la produccin de cido es
suficiente como para bajar el pH a 4,4 y es una prueba positiva. Dado que otros organismos pueden
producir cantidades menores de cido a partir del sustrato, es posible el desarrollo de un color naranja
intermedio entre el amarillo y el rojo. Esto no indica una prueba positiva.


5 Voges Proskauer:

Introduccin:
La reaccin de Voges Proskauer recibe el nombre de dos microbilogos que trabajaron a comienzos del
siglo XX, siendo los primeros en observar la reaccin de color roja producida en medio de cultivo apropiado
por tratamiento con hidrxido de potasio. Posteriormente se descubri que el principio activo formado en el
medio por metabolismo bacteriano es el acetilmetilcarbinol, un producto de la va del butilenglicol.

Principio:
El cido pirvico, componente fundamental formado en la degradacin fermentativa de la glucosa, es
metabolizado luego a travs de varias vas, de acuerdo con los sistemas enzimticos que poseen las
diferentes bacterias. Una de dichas vas lleva a la produccin de acetona (acetilmetilcarbinol), un
subproducto de reaccin neutra. En presencia de oxgeno atmosfrico y de hidrxido de potasio al 40%, la
acetona se convierte en diacetilo y el -naftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo.

Procedimiento:
Inocular un tubo de caldo RM / VP con un cultivo puro del organismo en estudio.
Incubar el caldo a 37 C durante 24 Hs.
Luego de la incubacin transferir 1 ml del caldo a un tubo de ensayo limpio.
Aadir 0,6 ml de -naftol al 5% y 0,2 ml de KOH al 40% (relacin 3:1). Es esencial agregar los reactivos en
ese orden. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar de 10 a
15 minutos.

Resultado:
Una prueba positiva est indicada por el desarrollo de un color rojo a los 15 minutos de aadir los reactivos,
revelando la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. La prueba no debe leerse luego
de ms de una hora.


6 Citrato:

Introduccin:
El citrato de sodio es una sal del cido ctrico, un compuesto orgnico simple que constituye uno de los
metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energa
por va distinta de la de fermentacin de hidratos de carbono, utilizando citrato como nica fuente de
carbono. El medio empleado para esta prueba debe estar desprovisto de protenas e hidratos de carbono
como fuentes de carbono.

Principio:
La utilizacin de citrato por una bacteria se detecta en un medio con citrato mediante la formacin de
subproductos alcalinos. El medio incluye citrato de sodio, un anin, como nica fuente de carbono y fosfato
de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato tambin pueden extraer
nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amonaco (NH
3
+
), llevando a la alcalinizacin del medio
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por conversin del NH
3
+
en hidrxido de amonio (NH
4
OH). El azul de bromotimol, amarillo a pH menor de
6,0 y azul a pH mayor de 7,6 es el indicador.

Procedimiento:
Tomar una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento e inocularla en el medio con
citrato.
Incubar a 37 C durante 24 a 48 Hs.
Luego de la incubacin proceder a la lectura.

Resultados:
El desarrollo de un color intenso indica una prueba positiva y revela que el organismo en estudio ha sido
capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con la formacin de productos alcalinos.


7 Fenilalanina desaminasa:

Introduccin:
La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin mediante la enzima desaminasa forma un
cetocido, el cido fenilpirvico.

Principio:
La prueba de fenilalanina se basa en la deteccin de cido fenilpirvico en el medio, tras el desarrollo del
organismo en estudio, mediante la adicin de cloruro frrico.

Procedimiento:
Inocular el agar en pico de flauta con una colonia de cultivo puro.
Incubar a 37 C durante 24 Hs.
Luego de la incubacin aadir 4 o 5 gotas de reactivo cloruro frrico al 10%, directamente sobre la superficie
del agar.

Resultado:
La inmediata aparicin de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y por ende una
prueba positiva.


8 Ureasa (BAM):

Introduccin:
La urea es una diamida del cido carbnico. Todas las amidas son fcilmente hidrolizadas con liberacin de
amonaco y dixido de carbono.

Principio:
La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar urea. El
amonaco resultante de esta hidrlisis reacciona en solucin para formar carbonato de amonio,
producindose una alcalinizacin y un aumento del pH del medio. El medio utilizado es el BAM (Buenos
Aires Modificado).

Procedimiento:
Inocular el medio mediante ansa recta con el microorganismo aislado en cultivo puro.
Incubar a 37 C durante 24 Hs.
Luego de la incubacin proceder a la lectura.

Interpretacin:
Los microorganismos que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 o 2 Hs,
mientras que las especies menos activas pueden requerir 3 o ms das.


9 SIM:

Introduccin:
Este medio es usado para determinar la produccin de sulfuro, indol y movilidad.
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Principio:
Produccin de sulfuro de hidrgeno:
La capacidad de ciertas especies bacterianas para liberar azufre de aminocidos y otros compuestos que lo
contienen, en forma de H
2
S, constituye una caracterstica importante para su identificacin.
Para que el H
2
S pueda ser detectado, el medio debe contener: una fuente de azufre, un indicador de H
2
S y
debe promover el desarrollo de la bacteria en estudio. Los medios ms comnmente usados a tales fines
son TSI y SIM.
Movilidad:
Las bacterias se mueven por medio de flagelos cuyo nmero y ubicacin vara en las diferentes especies.
Los medios para detectar movilidad contienen concentraciones de agar al 0,4 % o menos. Los medios
combinados, tales como SIM y MIO sirven para tales fines.
Indol:
El indol, un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del triptofano. Las bacterias que
poseen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol,
cido pirvico y amonaco.
La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo color rojo cuando el indol reacciona con el
grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovac. Se debe
utilizar un medio rico en triptofano. En la prctica se emplean medios combinados tales como SIM (sulfuro
indol movilidad) o MIO (movilidad indol ornitina).

Procedimiento:
Realizar una nica puncin en el centro del tubo, utilizando ansa recta.
Incubar a 37 C durante 24 Hs.

Interpretacin:
La produccin de H
2
S se visualiza por la presencia de un precipitado negro.
El indol se revela con el reactivo de Kovacs. Se debe agregar luego de la incubacin 5 gotas por la pared
del tubo. El desarrollo de un color rojo fucsia vivo en la interfase segundos despus de aadir el reactivo
indica la presencia de indol y por lo tanto una prueba positiva.
La movilidad se visualiza, observando si la bacteria invade todo el agar (se observa presencia de turbidez
en todo el medio) o solamente crece en la zona de la estra.


10 TSI Triple Azcar Hierro:

Introduccin:
Este medio sirve para la deteccin de cido y gas a partir de la glucosa, lactosa y sacarosa. Tambin se
detecta la produccin de H
2
S.
La lactosa y la sacarosa estn presentes a una concentracin 10 veces mayor que la glucosa. Se utiliza
sulfato ferroso como detector de H
2
S.

Procedimiento:
Sembrar con ansa recta el pico del tubo.
Incubar a 37 C durante 24 Hs.
Proceder a la interpretacin.

Resultados:
Si no hay cambio en el medio, significa que el microorganismo en estudio es no fermentador, o sea, que es
incapaz de producir cido por fermentacin de glucosa o lactosa.
Una fermentacin inicial del fondo y del pico del medio con posterior retorno del pico al color original (ya que
se forman aminas alcalinas por descarboxilacin oxidativa de protenas cerca de la superficie), indica la
presencia de bacterias que fermentan la glucosa.
Una acidificacin completa permanente del fondo y del pico revelan la presencia de bacterias fermentadoras
de lactosa.


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11 LIA (Agar Lisina Hierro)

Introduccin:
Las descarboxilasas son un grupo de enzimas sustrato especficas, capaces de actuar sobre la porcin
carboxilo (COOH) de los aminocidos, con formacin de aminas de reaccin alcalina. Cada una de las
descarboxilasas es especfica para un aminocido.
Este medio se basa en la descarboxilacin de la lisina, la formacin de sulfuros y la fermentacin de la
glucosa.

Procedimiento:
Estriar con un ansa recta pico y fondo del medio.
Incubar a 37 C durante 24 Hs.
Luego de la incubacin, proceder a la lectura.

Interpretacin:
Se debe leer pico y fondo:
Pico y fondo color violeta indican prueba positiva.
Pico violeta y fondo amarillo, no hay descarboxilacin.
Pico color rojo intenso y fondo amarillo, implica desaminacin.
Fondo con precipitado negro, indica produccin de H
2
S.


12 MIO (Movilidad Indol Ornitina):

Introduccin:
Esta prueba se utiliza para ver movilidad, produccin de indol y actividad de la enzima ornitina
descarboxilasa.

Procedimiento:
Con un ansa recta, realizar una nica puncin en el centro del medio.
Incubar a 37 C durante 24 Hs.
Proceder a la lectura

Interpretacin:
Fondo amarillo, indica reaccin negativa.
Todo el tubo de color violeta igual al original, indica descarboxilacin positiva.
La movilidad y la produccin de indol se interpretan igual que en la prueba SIM.


Identificacin de la bacteria de acuerdo a las pruebas bioqumicas:
Una vez realizadas todas las pruebas bioqumicas, se procede a la identificacin de la bacteria en estudio,
haciendo coincidir los resultados obtenidos en la siguiente tabla.

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Trabajo Prctico N 8
Pruebas Bioqumicas - Cocos Gram (+)


Objetivo:
Estudiar un grupo de cocos gram (+), llamados Estafilococos (cocos en racimo) y su diferencia con los
Estreptococos (cocos en cadena).


Introduccin:
En el grupo de los cocos gram (+) existen dos familias importantes:
MICROCOCCACEAE: cocos gram (+), catalasa (+)
Se dividen en tres gneros:
Estafilococos: aerobios facultativos
Micrococos: aerobios estrictos, inmviles
Planococos: aerobios estrictos, mviles
STREPTOCOCCACEAE: cocos gram (+), catalasa (-)


Desarrollo de las diferentes pruebas bioqumicas para la tipificacin de este grupo:


1 Prueba de la catalasa:

Introduccin:
La catalasa es una enzima que descompone el perxido de hidrgeno (H
2
O
2
) en oxgeno y agua.
Qumicamente la catalasa es una hemoprotena, de estructura similar a la hemoglobina, excepto que los
cuatro tomos de hierro de la molcula estn en estado oxidado (Fe
3+
). Excluyendo los Estreptococos, la
mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas poseen actividad de catalasa. La mayora de las
bacterias anaerobias descompone el H
2
O
2
con peroxidasas semejantes a la catalasa, salvo que cada
molcula contiene un solo ion frrico.

Principio:
El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de
los hidratos de carbono. Si se deja acumular, el perxido de hidrgeno es letal para las clulas bacterianas.
La catalasa transforma el perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, como lo demuestra la siguiente
reaccin:
H
2
O
2
--------------> H
2
O + O
2

catalasa

Esta prueba es muy comnmente utilizada para diferenciar Estreptococos (-) de Estafilococos (+) o de
especies de bacilos Gram (+) y Micobacterias.

Procedimiento:
Con un palillo aplicador con la punta aguzada transferir clulas del centro de una colonia bien aislada a la
superficie de un portaobjetos limpio.
Aadir 1 o 2 gotas de perxido de hidrgeno al 3% y observar si hay burbujeo. Se recomienda no aadir el
microorganismo al reactivo, especialmente si se utilizan agujas o ansas que contienen hierro, ya que se
pueden producir resultados falsos positivos.

Interpretacin:
La rpida aparicin sostenida de burbujas de gas o efervescencia, indica una reaccin positiva. Dado que
algunas bacterias pueden poseer enzimas distintas de la catalasa, capaces tambin de descomponer el
perxido de hidrgeno, unas pocas burbujas diminutas formadas a los 20 o 30 segundos no se consideran
una prueba positiva.


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2 Prueba de la coagulasa:

Introduccin:
La coagulasa es una enzima proteica de composicin qumica desconocida, con actividad semejante a la
protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina provocando por lo tanto la formacin de un
cogulo visible en un sistema analtico adecuado.

Procedimiento:
Colocar aspticamente 0,5 ml de plasma de conejo reconstituido en el fondo de un tubo estril.
Aadir 0,5 ml de un cultivo puro de 24 hs en caldo del organismo en estudio.
Mezclar por rotacin suave del tubo, evitando remover o agitar el contenido.
Incubar el tubo a 37 C y observar la formacin o no de un cogulo visible.

Interpretacin:
La reaccin se considera positiva ante cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo.


3 Fermentacin del manitol:

Introduccin:
El S. aureus en contraste con el S. epidermiris, fermenta el manitol con produccin de cido. El agar manitol
salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento de estafilococos patgenos en cultivos mixtos.
Este medio aprovecha la capacidad de los estafilococos de desarrollar en presencia de cloruro de sodio al
7,5 % y la del S. aureus de fermentar el manitol.

Procedimiento:
Estriar la muestra con un ansa esterilizada a la llama del mechero, en las placas conteniendo el medio agar
manitol salado. Debe sembrarse masivamente debido al potente efecto inhibidor de este medio.
Incubar a 37 C durante 24 a 48 Hs.

Interpretacin:
Colonias con halo amarillo luminoso y crecimiento intenso corresponden a microorganismos manitol
positivos (S. aureus).
Colonias sin cambio de color y con crecimiento dbil, corresponden a microorganismos manitol negativos
(S. epidermiris y otros).


4 Prueba de la DNAsa:

La prueba consiste en crecer la bacteria en un medio nutritivo que contenga DNA para observar si la
bacteria en estudio tiene la enzima DNAsa. La enzima DNAsa depolimeriza el DNA y alrededor de la colonia
se forma un halo transparente. El medio contiene un indicador, si no lo posee debe ser visualizado con
HCl 1 N.


5 Prueba de oxidacin / fermentacin (OF):

Introduccin:
Los microorganismos sacarolticos degradan glucosa fermentativa u oxidativamente Los productos de la
fermentacin son cidos mixtos relativamente fuertes, que se pueden detectar en un medio de fermentacin
convencional. En cambio, los cidos formados por degradacin oxidativa de la glucosa son sumamente
dbiles y para su deteccin se requiere un medio de oxidofermentacin ms sensible.

Principio:
El medio OF difiere de los medios de fermentacin de hidratos de carbono en lo siguiente: la concentracin
de peptona es ms baja, la concentracin de hidratos de carbono es ms alta y la concentracin de agar es
ms baja (semislido).
La menor relacin de protena a hidratos de carbono reduce la formacin de aminas alcalinas que pueden
neutralizar las pequeas cantidades de cidos dbiles derivados del metabolismo oxidativo. La
concentracin relativamente mayor de hidratos de carbono sirve para aumentar potencialmente la
produccin de cido, mientas que la consistencia semislida del agar permite que los cidos formados en la
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superficie difundan por todo el medio, facilitando la visualizacin del viraje del indicador de pH. Este medio
es tambin apto para determinar movilidad.

Procedimiento:
Se requieren dos tubos para esta prueba, inoculados con el microorganismo en estudio con un ansa de
puncin. Uno de los tubos debe ser cubierto con una capa de 1 cm de aceite mineral estril o parafina
fundida, dejando el otro tubo abierto al aire.
Incubar ambos tubos a 37 C durante 48 Hs.

Interpretacin:
La produccin de cido se detecta en el medio por la aparicin de color amarillo. En el caso de
microorganismos oxidativos, la produccin de color se pueden notar primero cerca de la superficie del
medio.
El siguiente cuadro indica los patrones de reaccin:
Tubo abierto Tubo cerrado Tipo de metabolismo
cido (amarillo) Alcalino (verde) Oxidativo
cido (amarillo) cido (amarillo) Fermentativo
Alcalino (verde) Alcalino (verde) No sacaroltico


6 Prueba de la Bacitracina:

Sobre un medio slido con agar nutritivo, se coloca una suspensin homognea del germen. Se coloca un
disco de Bacitracina, antibitico que inhibe la presencia de los micrococos, a diferencia de los estafilococos
que son resistentes y pueden crecer alrededor del disco de antibitico.