O fenmeno de restrio-modificao

Infeces com bacterifagos em

diferentes cepas bacterianas
produziam o fenmeno de restrio-
modificao.
ENZIMAS DE RESTRIO ENZIMAS DE RESTRIO
Tipo I
Atividades de restrio e modificao na mesma subunidade protica.
Tipo I
Atividades de restrio e modificao na mesma subunidade protica.
Cortam o DNA de maneira randmica distante do stio de reconhecimento.
Tipo II
Atividades de restrio e modificao em subunidades protecas diferentes.
Cortam o DNA dentro do stio de reconhecimento ou em posies prximas;
So as endonucleases mais comuns e mais comercializadas para uso em anlise gentica e clonagem.
Ligam-se ao DNA como monmeros, mas clivam o DNA de modo cooperativo, atravs da dimerizao
com uma subunidade contendo um domnio de clivagem.
Tipo IIs
Apresentam atividades de restrio e modificao em subunidades protecas diferentes (sistemas
de modificao/clivagem);
Cortam o DNA prximo ao stio de reconhecimento reconhecendo seqncias simtricas ou
assimtricas;
Ligam-se ao DNA como monmeros, mas clivam o DNA de modo cooperativo, atravs da dimerizao
com uma subunidade contendo um domnio de clivagem.
Tipo III
Atividades de restrio e modificao na mesma subunidade proteca.
Clivam fora do stio de reconhecimento e requerem duas seqncias em orientaes opostas dentro
da molcula de DNA.
Tipo IV
Atividades de restrio e modificao na mesma subunidade protica.
Quando reconhecem um stio simtrico (AcuI: CTTAAG) cortam o DNA fora do stio, mas quando
reconhecem um stio assimtrico (BcgI: CGANNNNNNTGC) cortam o DNA fora do stio e em ambos os
lados, liberando um pequeno fragmento.
Enzimas de Restrio (endonucleases): tesouras do DNA
enzimas produzidas por bactrias para restringir a proliferao de vrus invasores;
diferentes tipos de enzimas clivam diferentes sequncias de bases de DNA;
reconhecem e clivam o DNA em pontos especficos, geralmente em sequncias
de 4, 6 e 8 bases palndromas.
Nomenclatura: as enzimas de restrio so chamadas de acordo com a bactria que a produziu:
Izosquizomeros Izosquizomeros: diferentes enzimas de restrio que possuem a mesma sequncia de reconhecimento
Conceito Conceito de Palndromo de Palndromo
Sequncia simtrica de letras
Exemplos usando o alfabeto:
Exemplos usando o alfabeto do DNA:
a) Clivagem no eixo de simetria b) Clivagem simetricamente situada ao
redor do eixo de simetria
Tipos de corte Tipos de corte
Molculas com extremidades
abruptas ou cegas
Molculas com extremidades coesivas
Extremidades: coesivas X cegas
coesiva = EcoRI =
cega = SmaI =
5-CCCGGG-3
3-GGGCCC-5
5-CCC GGG-3
3-GGG CCC-5
-3
Corte de um palndromo no cromossomo do vrus SV40
Cortando e Juntando o DNA....
Tecnologia do DNA recombinante
Amplificao do DNA recombinante....
Tecnologia do DNA recombinante
Escolha de um vetor de clonagem:
molcula pequena fcil manipulao
capaz de se replicar em uma clula viva
presena de stios de restrio para insero do DNA a ser clonado
possuir um mtodo de identificaoe recuperao das molculas recombinantes
Ex: pUC18
ampR - bactrias transformadas sero
resistntes a ampicilina
popiligador stio de clonagem mltipla
lacZ - codifica para galactosidade que
converte X-Gal em um corante azul
Tecnologia do DNA recombinante
converte X-Gal em um corante azul