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FACULDADE DE FARMCIA
MESTRADO EM ANLISES CLNICAS
HOSPITAL DR. NLIO MENDONA, FUNCHAL
ORIENTADORA:
DRA. MARLENE PIRES
ALUNO: EILYN MARISOL GOMES RODRIGUES
LISBOA, 2013
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ndice
Resumo .................................................................................................................. 7
Lista de abreviaturas ............................................................................................... 8
1- Controlo de qualidade em anlises clnicas ................................................. 10
1.1- Fase pr-analtica ....................................................................................... 11
1.1.1- Colheita de amostras biolgicas .......................................................... 12
1.2- Fase analtica .............................................................................................. 16
1.3- Fase ps-analtica ....................................................................................... 17
2- Resduos hospitalares ....................................................................................... 17
Microbiologia ...................................................................................................... 19
I- Bacteriologia .................................................................................................... 20
I- 1- Diagnstico das infees bacterianas e fngicas ...................................... 21
I- 1.1- Amostras ............................................................................................. 22
I- 1.2- Exame microscpico ........................................................................... 23
I- 1.3- Meios de cultura slidos ..................................................................... 27
I- 1.4- Meios lquidos de enriquecimento ...................................................... 32
I- 1.5- Geradores ............................................................................................ 33
I- 1.6- Floras bacterianas e fngicas normais ................................................ 33
I- 2- Provas de identificao de bactrias e fungos leveduriformes ................. 37
I- 3- Processamento dos produtos para exame bacteriolgico .......................... 39
I- 3.1- Urina ................................................................................................... 39
I- 3.2- Hemocultura ....................................................................................... 41
I- 3.3- Vias respiratrias: superiores e inferiores .......................................... 43
I- 3.4- Exsudado ocular e exsudado do ouvido ............................................. 45
I- 3.5- Feridas, abcessos, exsudados purulentos, bipsia de tecido e contedo
de bomba ........................................................................................................ 45
I- 3.6- Lquidos biolgicos ............................................................................ 47
3
I- 3.7- Fezes ................................................................................................... 49
I- 3.8- Aparelho genital .................................................................................. 51
I- 3.9- Pontas de cateter ................................................................................. 53
I- 4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos .............................................. 54
I- 4.1- Mtodos laboratoriais utilizados no estudo da atividade dos
antibiticos ..................................................................................................... 54
I- 4.2- Mtodos automatizados-VITEK ......................................................... 59
I- 5- Teste de despiste de resistncia meticilina do Staphylococcus em meio
de cultura slido ................................................................................................ 62
I- 6- Controlo de qualidade interno e externo na Bacteriologia ........................ 64
II- Serologia ......................................................................................................... 65
II- 1- Colheita e amostra ................................................................................... 65
II- 2- Metodologia ............................................................................................. 66
II- 2.1- Metodologia automatizada ................................................................ 66
II- 2.2- Metodologia manual .......................................................................... 68
II- 3- Testes serolgicos realizados na Serologia.............................................. 69
II- 4- Interpretao e validao das provas serolgicas .................................... 70
II- 5- Controlo de qualidade interno e externo na Serologia ............................ 71
III- Parasitologia e Urinas tipo II...................................................................... 72
III- 1- Pesquisa de sangue oculto ...................................................................... 72
III- 2- Exame parasitolgico nas fezes .............................................................. 73
III- 3- Urianlise (Urinas Tipo II) ..................................................................... 74
III- 3.1- Anlise bioqumica .......................................................................... 75
III- 3.2- Sedimento urinrio ........................................................................... 76
III- 4- Controlo de qualidade interno e externo na seco de Parasitologia e
Urinas ................................................................................................................ 77
IV- Hematologia .................................................................................................. 78
IV- 1- Amostra .................................................................................................. 81
IV- 2- Metodologia ........................................................................................... 82
IV- 3- Hemograma ............................................................................................ 82
4
IV- 4- Esfregao de sangue perifrico .............................................................. 86
IV- 4.1- Colorao de May-Grnwald-Giemsa ............................................. 87
IV- 5- Separao de hemoglobinas ................................................................... 88
IV- 5.1- HbA1C ............................................................................................. 88
IV- 5.2- HbA2 e HbF ..................................................................................... 89
IV- 6- Teste da fragilidade osmtica ................................................................. 90
IV- 7- Velocidade de sedimentao .................................................................. 91
IV- 8- Coagulao ............................................................................................. 91
IV- 8.1- Avaliao laboratorial ...................................................................... 94
IV- 8.2- Patologias mais comuns na seco de Hematologia ........................ 97
IV- 9- Controlo de qualidade interno e externo em Hematologia .................... 98
V- Bioqumica ..................................................................................................... 99
V- 1- Amostra ................................................................................................... 99
V- 2- Metodologia e anlises efetuadas na seco de Bioqumica ................. 101
V- 2.1- Equipamento automatizado e mtodo ............................................. 103
V- 2.2- Urina de 24h .................................................................................... 105
V- 2.3- Lquidos biolgicos ......................................................................... 106
V- 2.4- Testes de diagnstico rpido ........................................................... 107
V- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Bioqumica ...................... 108
VI- Hormonologia ............................................................................................. 109
VI- 1- Amostra e metodologia ........................................................................ 110
VI- 2- Anlises efetuadas na seco de Hormonologia .................................. 112
VI- 3- Controlo de qualidade interno e externo em Hormonologia ................ 114
VII- Imunologia ................................................................................................ 115
VII- 1- Amostra ............................................................................................... 116
VII- 2- Metodologia ........................................................................................ 116
VII- 2.1- Tcnicas ........................................................................................ 116
VII- 2.2- Equipamentos automatizados ....................................................... 118
VII- 3- Anlises efetuadas na seco de Imunologia ...................................... 120
5
VII- 3.1- Teste de diagnstico rpido para a pesquisa da protena de Bence-
Jones............................................................................................................. 121
VII- 4- Controlo de qualidade interno e externo em Imunologia ................... 121
VIII- Bibliografia .............................................................................................. 122
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Agradecimentos
Deixo aqui expressos os meus agradecimentos Dra. Graa Andrade, pela
oportunidade de realizar o meu estgio no Hospital Dr. Nlio Mendona,
Funchal.
s minhas orientadoras, a Dra. Marlene Pires e a Prof. Leonor Correia, por todo
o apoio, ateno, carinho, exigncia, disponibilidade e pacincia que dispensaram
neste meu percurso.
A todas as pessoas das seces do Servio de Patologia Clnica em que estagiei,
que contriburam para que eu fizesse deste estgio uma grande experincia a
nvel de formao e a nvel pessoal.
Ao servio de Hemato-Oncologia, pela informao cedida, sobre os doentes de
mieloma mltiplo. Ao Departamento de Informtica e ao Departamento de
Estatstica Dra. Alexandra Borges por toda a ajuda prestada.
minha famlia e amigos.
E por fim, um agradecimento muito, mas muito especial, minha me, por toda a
ateno e carinho, por estar sempre presente em todas as fases da minha vida,
pelo apoio incondicional e pelos seus grandes conselhos. Sem ti, nada disto seria
possvel.
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Resumo
O meu estgio teve lugar no Hospital Dr. Nlio Mendona, situado na avenida
Lus de Cames, no Funchal. Passei por todas estas valncias do Servio de
Patologia Clnica: Bacteriologia; Serologia; Parasitologia e Urinas; Bioqumica;
Hormonologia; Imunologia; Hematologia, por um perodo total de 6 meses. Este
servio est integrado no Hospital Dr. Nlio Mendona a par dos restantes
servios clnicos, departamentos clnicos, unidades clnicas, unidades de apoio
clnico, consulta externa, servio de urgncia e outros servios. Funciona 24
sobre 24 horas dando resposta aos pedidos de anlise de rotina e urgncia.
Este servio tambm recebe as colheitas efetuadas no Hospital dos Marmeleiros e
no Hospital Joo da Almada, assim como, nos restantes centros de sade da
Regio Autnoma da Madeira, casas de sade, lares, domiclio, que esto todos
estes integrados, no Servio de Sade da Regio Autnoma da Madeira.
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Lista de abreviaturas
Ac/Acs- Anticorpo/anticorpos
ADA- Adenosina desaminase
Ag/Ags- Antignio/ antignios
AT- Aspirado traqueal
ATB- Antibiograma
ATCC- American type culture collection
BAAR- Bacilo lcool-cido resistente
CDE- Coeficiente de disperso eritrocitria
CHGM- Concentrao de hemoglobina globular mdia
CLSI- Clinical and laboratory standards institute
CMI- Concentrao mnima inibitria
EDTA- Etilenodiaminotetraacetato tripotssico
ELFA- Enzyme linked fluorescent assay
ELISA- Enzyme-linked immunosorbent assay
EQAS- External quality assurance services
EXP- Expetorao
FT- Fator tecidular
HbA1C- Hemoglobina glicada
hCG- Hormona gonodatrofina corinica humana
HGM- Hemoglobina globular mdia
HPLC- High-performance liquid chromatography
INSA- Instituto Nacional de Sade Dr. Ricardo Jorge
ITU- Infeo do trato urinrio
LBA- Lavado bronco-alveolar
LCR- Lquido cefalorraquidiano
LDH- Lactato desidrogenase
McK- MacConkey
NEQAS- National external quality assessment service
PNAEQ- Programa nacional de avaliao externa da qualidade
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RAM- Regio autnoma da Madeira
RID- Imunodifuso radial
RLV- Unidade de luz relativa
RNI- Razo normal internacional
RPR- Rapid plasma reagin
SB- Secrees brnquicas
SESARAM- Servio de sade da regio autnoma da Madeira
SS- Salmonella & Shigella
TP- Tempo de protrombina
TPHA- Treponema pallidum haemagglutination
TSA- Teste de sensibilidade antibitica
TTP- Tempo de tromboplastina parcial
TTPA- Tempo de tromboplastina parcial ativada
VDRL- Venereal disease research laboratory
VGM- Volume globular mdio
VS- Velocidade de sedimentao
vW- VonWillebrand
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1- Controlo de qualidade em anlises clnicas
A qualidade consiste num espetro de atividades e processos que formam as
caractersticas de um produto ou servio. Esse espectro divide-se em 5 nveis:
qualidade total ou gesto total da qualidade ou melhoria contnua da qualidade; a
gesto da qualidade; o sistema da qualidade; a garantia da qualidade e o controlo
da qualidade.
Atualmente, a maioria dos servios de sade operam duas etapas: a nvel da
garantia da qualidade, que consiste num conjunto de atividades que demonstram
que uma organizao atingiu um nvel aceitvel de qualidade; e a nvel do
controlo de qualidade, que se baseia em tcnicas operacionais para medir,
comparar com objetivos, identificar erros ou problemas e respetivas medidas
corretivas.
Para que uma organizao como um hospital atinja os padres de qualidade
desejados necessria a participao ativa de todo os seus funcionrios. Num
hospital, as funes de cada grupo funcional tm que estar definidas na estrutura
da gesto da qualidade da instituio.
O conceito de qualidade nas anlises clnicas dever, portanto, ser encarado
como parte do conceito mais vasto da qualidade dos servios de sade. Assim,
cada laboratrio dever procurar implementar sua escala o sistema de
qualidade.
Para implementar um sistema de qualidade no laboratrio tem de ser
implementado pelo menos estes trs conceitos:
Controlo de qualidade
Resume numa monitorizao contnua das prticas de trabalho, do equipamento e
dos reagentes, em que o prprio pessoal faz a avaliao dos resultados/dados,
chamando-se assim o controlo de qualidade interno.
Avaliao da qualidade
Ou a avaliao do desempenho, que se apoia na avaliao por terceiros, do
desempenho do laboratrio atravs da anlise dos resultados obtidos em anlises
de material de controlo (amostras fictcias) realizados da forma e nas condies
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habituais do laboratrio, como se de uma amostra de um doente se tratasse,
denominada como a avaliao da qualidade externa ou controlo de qualidade
externo.
Garantia da qualidade
o processo total que garante a qualidade dos resultados finais fornecidos pelo
laboratrio. Esta garantia da qualidade compreende no s o controlo da fase
analtica mas tambm das fases pr e ps analticas do ciclo analtico. O controlo
da fase analtica compreende tanto o controlo de qualidade interno como o
externo.
1.1- Fase pr-analtica
Esta fase consiste todo o processo que envolve e antecede fase de execuo
analtica da amostra, a solicitao da amostra, a preparao do paciente, o registo,
a colheita da amostra biolgica, a preparao, o transporte e a receo da
amostra.
Esta fase da inteira responsabilidade pelo pessoal administrativo e do pessoal
da triagem dentro do servio de Patologia Clnica (SPC), em caso das no
conformidades e das medidas corretivas. H erros que tm de ser
resolvidos/retificados nesta fase para que no cheguem fase analtica, por
exemplo, uma incorreta identificao da amostra (erro no nome do utente), este
problema sendo resolvido na fase pr-analtica, evitar certos problemas na
atribuio dos valores analticos obtidos a um utente que no fez colheita,
gastando desta forma o hospital, recursos humanos e materiais, levando o
laboratrio algum prejuzo. A maior parte dos erros executados no ciclo
laboratorial cometida na fase pr-analtica, cerca de 60%.
Na solicitao das anlises, seja em formato eletrnico ou em papel, necessrio
adquirir a mxima e correta informao sobre o utente: o servio requisitante, a
informao clinica, os dados completos do paciente, a data de solicitao e
carimbo.
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Na preparao do doente, necessitou-se fornecer as recomendaes corretas do
preparo prvio para a colheita, no jejum, no realizar atividade fsica, no
consumir drogas e/ou lcool antes da colheita e evitar o stress.
1.1.1- Colheita de amostras biolgicas
A avaliao das funes fisiolgicas, recorrendo a exames laboratoriais hoje
em dia importante e indispensvel.
Os problemas mais comuns aquando da colheita e no armazenamento das
amostras podem ser:
Hemlise: trata-se da lise dos glbulos vermelhos. Estes libertam lactato
desidrogenase e potssio, resultando numa amostra no representativa do estado
real do paciente. A hemlise pode ser causada por centrifugao excessiva,
agitao brusca, congelamento das clulas, colheita mal executada;
Hemoconcentrao: acontece quando o garrote deixado muito tempo no brao,
podendo ocorrer estase na veia e alguns constituintes do sangue podem ficar mais
concentrados em relao ao sangue, numa circulao normal;
Centrifugao: s deve ser feita depois do sangue repousar cerca de 20-30
minutos, aps a colheita, para obteno de soro;
Evaporao: quando as amostras no se encontram devidamente tapadas;
Contaminao qumica: quando as amostras mltiplas de sangue so obtidas com
o sistema fechado de colheita por vcuo. Os tubos de soro devem ser colhidos
antes dos tubos com anticoagulantes.
A colheita deve ser feita 12 horas aps a ltima refeio, e a recolha deve ser
feita antes da realizao de determinados procedimentos diagnsticos ou
teraputicos. Na altura da colheita, procede-se confirmao de toda a
informao com o utente.
As administrativas, aps receberem a requisio mdica e preencherem a ficha
informtica, emitem e anexam as etiquetas de cdigo de barras (tantas quanto
forem necessrias, conforme a requisio e os tubos de colheita necessrios). A
etiqueta possui os seguintes elementos: nome completo, sexo, idade, servio, n
do processo clnico, se urgente ou de rotina e a data da colheita.
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As amostras so rececionadas na sala de triagem, vindas das diversas unidades de
sade do servio de sade da regio autnoma da Madeira (SESARAM), e as
administrativas processam os pedidos de requisio. As amostras so rejeitadas
se estiverem indevidamente acondicionadas, mal vedadas e com derramamento
de produto, coaguladas, hemolisadas ou se as propores de sangue
anticoagulante no foram respeitadas.
A colheita da amostra constitui uma das etapas mais importantes para assegurar
um resultado laboratorial correto. Representa o primeiro contato entre o
laboratrio e o paciente. O sangue o produto biolgico mais utilizado no
laboratrio.
O mtodo mais comum para obter uma amostra de sangue atravs de uma
puno venosa. O sangue venoso retirado atravs de uma agulha e recolhido
para uma seringa ou para um tubo de vcuo.
1.1.2- Execuo da puno venosa
A execuo da puno venosa, executou-se em vrias etapas:
1- Preparao do utente:
Identificou-se e preparou-se o paciente: identificao completa; requisio
analtica corretamente preenchida; explicao do procedimento;
Efetuou-se um exame visual e a palpao das veias: viabilidade,
estabilidade, direo e profundidade da veia. As veias mais
frequentemente utilizadas so: veia ceflica mediana, veia cubital
mediana, veia ceflica e veia baslica;
Procedeu-se aos seguintes cuidados: seleo do brao do paciente do lado
de uma mastectomia e /ou onde fora submetido a uma infuso intravenosa,
de um local com hematoma, edema ou contuso, e de um local com
mltiplas punes;
Caso as veias anteriormente referidas no forem viveis h outros locais de
puno: regio dorsal da mo/ face plantar do p.
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2- Preparao do material de colheita
Depois de escolhido o local de puno, deu-se a seleco do material necessrio,
as etiquetas para identificao das amostras, as luvas, o algodo ou gaze
esterilizada, o lcool etlico a 70%, o adaptador para colheita por vcuo e a
butterfly ou seringa (o mtodo mais utilizado no SPC o sistema fechado de
colheita por vcuo tipo Vacuette)
Os tubos de vcuo mais utilizados no SPC so:
Tampa de cor amarela (bioqumica)
Possuem um gel ativador da coagulao para obteno de soro. Os tubos para
bioqumica so revestidos internamente com partculas de slica micronizada, as
quais ativam a coagulao quando os tubos so gentilmente invertidos. Esses
tubos contm uma barreira de gel presente no fundo do tubo. Este material possui
densidade intermediria entre o sangue coagulado e o soro. Durante a
centrifugao, a barreira de gel move-se para cima posicionando-se entre o soro e
o cogulo, onde forma uma barreira estvel, separando o soro dos outros
componentes celulares. O soro pode ser utilizado diretamente do tubo de colheita
(tubo primrio). Esta barreira permite a estabilizao da maioria dos parmetros
no tubo primrio, sob as condies de armazenamento recomendadas, at 48
horas.
Tampa de cor lils (hematologia)
Com anticoagulante etilenodiaminotetraacetato tripotssico (EDTA) que um
quelante do clcio, forma sais de clcio insolveis e impede a coagulao do
sangue. As anlises no setor de Hematologia so executadas em sangue total.
Tampa de cor azul (coagulao)
Com anticoagulante citrato de sdio que forma sais de clcio e remove o clcio.
Tampa de cor verde
A parede interna deste tubo revestida com heparina de ltio. Esse anticoagulante
ativa as enzimas antiplaquetrias, bloqueando, assim, a coagulao em cascata
dos elementos do sangue. Normalmente so utilizados nos exames de qumica
clnica.
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Cada tipo de anticoagulante exerce o seu efeito de maneira prpria. A proporo
do anticoagulante em relao ao volume de sangue uma varivel importante, de
forma a evitar erros nos resultados.
3- Execuo da colheita da amostra
Assegurou-se o correto posicionamento do antebrao e desinfeco do local da
puno com uma mecha de algodo, ou gaze embebida em lcool etlico a 70 %,
e deixou-se secar ao ar livre, logo de seguida:
1- aplicou-se o garrote;
2- associou-se a agulha ao adaptador;
3- descapsulou-se a agulha;
4- com o indicador ou o polegar de uma das mos, esticou-se a pele do paciente
fixando a veia escolhida e, com o sistema agulha-adaptador na outra mo,
puncionou-se a veia com preciso e rapidez (movimento nico). O sistema
agulha-adaptador deve estar a um ngulo de 15 em relao ao brao do paciente;
6- com a outra mo pegou-se no tubo de colheita adequado e conectou-se ao
adaptador;
7- com o tubo de colheita dentro do adaptador pressionou-se com o polegar, at
que a tampa ficasse perfurada;
8- logo que o sangue flui para dentro do tubo, retirou-se o garrote;
9- medida que foram sendo preenchidos os tubos, homogeneizou-se
gentilmente por inverso os tubos com anticoagulante;
10- aquando da utilizao ltimo tubo, retirou-se a agulha. A agulha foi
descartada no contentor para resduos corto-perfurantes;
11- colocou-se os tubos no suporte, devidamente identificados que de seguida
foram levados para a sala de triagem;
12- pediu-se ao paciente que exercesse presso sobre o local da puno com
algodo, sem dobrar o brao, at que parasse de sangrar e aplicou-se um penso
rpido.
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Consideraes aquando da colheita
Todo o produto de origem humana deve ser considerado um potencial
transmissor de infeo e, como tal, manuseado de acordo com regras de
segurana. Contudo, necessrio especial cuidado com os produtos provenientes
de doentes com hepatites, sida e com patologias infecto-contagiosas.
Na preveno do risco biolgico, no ato da colheita, deve-se:
- usar luvas descartveis de plstico ou de borracha. Se houver um risco alto,
tomar outras precaues adicionais como usar um avental de plstico descartvel
e uma mscara;
- ter cuidado para prevenir feridas com agulhas e lancetas. No manipular
agulhas usadas;
- utilizar sempre seringas, agulhas e lancetas descartveis;
- o material usado nas colheitas (compressas e algodo) deve ser deitado no
contentor preto de PVC;
- as amostras devem ser enviadas ao laboratrio em contentores prprios,
suficientemente resistentes, para evitar acidentes.
1.2- Fase analtica
Aps a obteno das amostras, seguiu-se a marcha laboratorial analtica. O
controlo desta fase analtica compreende tanto o controlo de qualidade interno
como o externo.
Esta fase compreende a execuo da amostra, bem como tudo o que lhe est
inerente: as tcnicas, os reagentes, os equipamentos, os controlos, os
calibradores, a refrigerao.
Monitorizou-se todos os reagentes e todas as tcnicas todos os dias, com uma
especial ateno, na seco de Bioqumica, em que as tcnicas so mais sensveis
e os valores so mais apertados (e.g. creatinina), bem como nas seces de
Hormonologia e Imunologia.
17
1.3- Fase ps-analtica
Muito sucintamente, esta fase surge depois da fase analtica e nesta deu-se a
validao dos resultados, de acordo com a informao clnica do doente e a
entrega atempada ao mdico ou ao servio requisitante.
2- Resduos hospitalares
Triagem e acondicionamento dos resduos hospitalares
No SPC e em qualquer outro hospital, existem preocupaes ambientais e com a
sade pblica, existindo um sistema de triagem e de acondicionamento de
resduos em todos os sectores (quadro I).
Quadro I: Gesto de resduos dos grupos I, II, III e IV
Resduos dos grupos I e II
(resduos no perigosos):
Resduos dos grupos III e IV (resduos
perigosos):
So resduos equiparados a urbanos no
apresentam exigncias especiais no seu
tratamento (I) e resduos hospitalares no sujeitos
a tratamentos especficos, podendo ser
equiparados a urbanos (II).
Depositam-se nos
sacos de plstico preto e destinam-se lixeira
comum. A ttulo de exemplo, invlucros de
vrios materiais em papel plastificado, papel
autocolante, papel encerado, papel metalizado,
toalhetes de papel, material de escritrio.
So resduos de risco biolgico: resduos
contaminados ou suspeitos de contaminao,
suscetveis de incinerao ou de outro pr-
tratamento eficaz, permitindo uma posterior
eliminao como resduo urbano (III) e resduos
hospitalares especficos; resduos de vrios tipos
de incinerao obrigatria (IV). So depositados
nos contentores de polietileno, de cor preta, e
destinam-se incinerao. Encaixam-se nessa
categoria: tubos j analisados, frascos de reagentes
vazios, calibradores vazios, controlos utilizados,
monovettes utilizadas, compressas, qualquer
material que teve contacto com os produtos
biolgicos.
Resduos corto-perfurantes
Deu-se a colocao destes resduos (exemplos: lminas, agulhas e restante
material corto-perfurante que constituem um risco potencial de ocorrer acidentes
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por picada ou corte.) nos contentores estanques e rgidos, identificados com o
smbolo de BioHazard, geralmente so de cor amarela e vermelha.
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Microbiologia
A microbiologia mdica uma cincia que estuda a interao entre o ser humano
e os microrganismos, nomeadamente as bactrias, vrus, fungos e parasitas.
A microbiologia clnica ocupa-se primordialmente com a etiologia das doenas
infeciosas, com o estudo da suscetibilidade aos antimicrobianos e o controlo da
infeo associada aos cuidados de sade. Esta valncia no Hospital Dr. Nlio
Mendona est dividida em 5 seces: Bacteriologia I; Serologia; Biologia
Molecular, que do apoio aos vrios hospitais, a Bacteriologia II e seco de
Parasitologia / Urinas direcionadas essencialmente para a sade pblica.
Na seco de Bacteriologia I, na qual realizei o meu estgio, deu-se resposta ao
diagnstico hospitalar, desde consulta externas e servios de internamento dos
trs Hospitais (H. Dr. Nlio Mendona (HNM), H. dos Marmeleiros e o H. Dr.
Joo de Almada) incluindo o Servio de Urgncia.
Na seco de Bacteriologia II, respondeu-se aos pedidos de todos os centros de
sade da regio e da unidade Dr. Agostinho Cardoso.
A seco de Serologia contempla as anteriores Bacteriologias, I e II e onde se
realizaram anlises de biologia molecular e micobacteriolgico.
Na seco de Parasitologia e Urinas, executou-se a anlise sumria da urina
(urinas Tipo II), as pesquisas de parasitas e tambm de sangue oculto nas fezes.
O meu estgio teve a durao de dois meses, durante os quais acompanhei as
seces de Bacteriologia I, onde permaneci por um perodo maior, da Serologia e
da Parasitologia/Urinas.
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I- Bacteriologia
No campo das doenas infeciosas, os resultados laboratoriais dependem, em
grande parte, da qualidade da amostra, do momento em que o produto colhido,
dos cuidados a ter com a sua manipulao, bem como dos conhecimentos e
experincia dos profissionais.
Na maior parte dos casos de doena infeciosa, o diagnstico de entrada feita pelo
mdico um diagnstico presuntivo, tendo em conta os sinais e sintomas
apresentados pelo doente, sendo o diagnstico definitivo realizado aquando da
identificao do agente patognico.
O diagnstico microbiolgico abrange a caracterizao de milhares de agentes
que provocam doenas infeciosas ou esto associadas a elas, sejam elas causadas
por bactrias, vrus, parasitas e fungos. As tcnicas utilizadas para caracterizar
estes agentes infeciosos dependem da clnica e do tipo de agente que est a ser
investigado, tendo em conta, sempre, a flora normal da amostra para saber o que
realmente patolgico a fim de fazer uma correta reportao de resultados.
Nenhum teste, por si s, permite o isolamento ou a caracterizao de todos os
organismos patognicos potenciais. As informaes clnicas do paciente e toda a
diagnstica envolvente, como a Bioqumica ou a Hematologia, so de extrema
importncia e um auxlio para um correto diagnstico com a mxima qualidade e
fidelidade.
A maior parte dos microrganismos patognicos cresce lentamente, levando no
mnimo 24 horas ou mais, dias ou mesmo at semanas, para o seu isolamento e
identificao. Porm o tratamento a administrar ao paciente no pode ser adiado
at que esse processo tenha sido concludo. Aps a obteno das amostras
adequadas e da informao do diagnstico clnico presuntivo ao laboratrio, o
mdico inicia o tratamento antibitico emprico contra o(s) microrganismo(s),
eventuais responsveis pela infeo do paciente. Quando obtm resultados do
laboratrio o mdico poder ponderar a eventual mudana de teraputica e
reavaliar o diagnstico. Essas informaes por parte do laboratrio consistem em
21
relatrios preliminares dos resultados, obtidos em cada etapa de isolamento e
identificao do agente etiolgico da doena.
I- 1- Diagnstico das infees bacterianas e fngicas
O exame laboratorial bacteriolgico iniciou-se com o exame direto, seguindo-se
do exame cultural, ambos realizados em ambiente estril. Se for isolado um
microrganismo especfico na cultura passa-se respetiva identificao e a
avaliao quanto a sua suscetibilidade aos antimicrobianos.
Utilizou-se os seguintes procedimentos laboratoriais (metodologia) no
diagnstico clnico das causas infeciosas:
- Exame macroscpico;
- Exame microscpico;
- Sementeira em meios de cultura adequados para o enriquecimento, isolamento e
seleo de colnias;
- Caraterizao das bactrias patognicas ou potencialmente patognicas
isoladas:
Caratersticas morfolgicas;
Caratersticas culturais;
Caratersticas tintoriais;
Caratersticas bioqumicas;
Estrutura antignica;
- Provas de sensibilidade aos agentes quimioteraputicos e a respetiva
interpretao de acordo com o microrganismo identificado e origem do produto a
partir do qual foi isolado;
- Deteo do antignio do agente por ensaio imunolgico (aglutinao do latex)
ou anticorpos marcados com fluorescena ou com peroxidase (Serologia);
- Hibridizao DNA-DNA ou DNA-RNA para a deteo de genes especficos do
agente patognico nas amostras do paciente (biologia molecular).
22
I- 1.1- Amostras
Deu-se a identificao adequada da amostra e rotulao, com a introduo da
informao clnica relevante ao diagnstico, os dados de identificao do
paciente, a identificao do mdico e servio requisitante. Estes critrios esto
enquadrados na fase pr-analtica, tanto na microbiologia, como nas outras
valncias do SPC, dado que um erro a esse nvel pode comprometer as fases
seguintes: a analtica e a ps-analtica.
Uma colheita correta da amostra constitui uma das etapas mais importantes da
marcha laboratorial, visto que os resultados vo depender em grande parte desta
etapa (pr-analtica).
A amostra deve ser obtida do local que provavelmente h presena do agente
infecioso (num determinado estadio da doena), devendo ser manipulada de
modo a favorecer a sua sobrevida e crescimento do microrganismo.
Algumas regras gerais da colheita e manipulao das amostras:
a) a quantidade de material deve ser adequada e bem representativa (e.g. uma
amostra salivar em vez de uma expetorao);
b) obteno de amostras significativas para o diagnstico preferencialmente antes
da administrao de antimicrobianos;
c) evitar a contaminao da amostra , utilizando apenas equipamento estril e
sempre com precaues asspticas;
d) a amostra deve ser levada de imediato para o laboratrio e processada o mais
rapidamente possvel.
Acompanhou-se a rotina do laboratrio, e adquiriu-se treino na execuo do
exame bacteriolgico de diferentes produtos:
- urina;
- sangue;
- expetorao (EXP), secrees brnquicas (SB), aspirado traqueal (AT), lavado
bronco-alveolar (LBA);
- exsudados nasais, farngeos, ocular e ouvido;
23
- pus e lquidos biolgicos (LCR, L. asctico, L. pleural, L. peritoneal, L.
pericrdico e L. sinovial);
- exsudado vaginal, uretral e perianal;
- fezes;
- pontas de cateter.
I- 1.2- Exame microscpico
O exame macroscpico a primeira etapa do estudo, seguido do exame
microscpico e identificao de um microrganismo com a observao e anlise
da forma, tamanho e organizao/agrupamento dos microrganismos.
o Exame a fresco
O exame a fresco utilizado por e.g. no estudo das urinas, com a visualizao do
sedimento urinrio (e.g. com a presena de leuccitos em caso de infeo) e no
estudo micolgico no exsudado vaginal para a visualizao de elementos
leveduriformes (Candida albicans). Este tipo de exame utilizado sempre que
necessrio ou em caso de dvidas.
o Exame direto
O exame direto constitui um mtodo relativamente simples, permite o
diagnstico presuntivo devendo ser sempre acompanhado pelo exame cultural.
um exame de baixo custo e institui-se como uma ferramenta de apoio
identificao do microrganismo (embora muito menos sensvel que o exame
cultural).
No laboratrio so efetuados dois tipos de colorao: a colorao pelo mtodo de
Gram; a colorao para as bactrias lcool-cido resistentes (BAAR) de Ziehl-
Neelsen:
24
Colorao pelo mtodo de Gram
Constitui um procedimento de grande utilidade no diagnstico microbiolgico.
Quando h suspeita de infeo bacteriana, deve-se efetuar um esfregao, corado
pelo mtodo de Gram, figura 1, e examinadas ao microscpio
Fig. 1: Colorao pelo mtodo de Gram.
Os corantes combinam-se quimicamente com o protoplasma bacteriano. Se a
clula ainda no estiver morta, o prprio processo de colorao ir destru-la.
Os corantes mais utilizados so os sais. Os corantes bsicos consistem num
catio dotado de cor com um anio incolor e os corantes cidos comportam-se de
modo inverso.
As clulas bacterianas so ricas em cido nucleico, que apresentam cargas
negativas na forma de grupos fosfato que se combinam com os corantes bsicos
de carga positiva. Os corantes cidos no coram as clulas bacterianas e podem
ser utilizados para corar o material de fundo com uma cor contrastante. Os
corantes bsicos coram uniformemente as clulas bacterianas, a no ser que o
RNA citoplasmtico seja inicialmente destrudo. Entretanto, podem-se utilizar
tcnicas especiais de colorao para diferenciar flagelos, cpsulas, paredes
celulares, membranas celulares, grnulos, ncleos e esporos.
1.Fixao com calor ou lcool 96%: 1min.;
2.Cobrir com soluo de cristal de violeta: 1
min.;
3.Lavar com H2O;
4.Cobrir com Iodo: 5 min.;
6.Descorar lcool-acetona: 10 a 30s;
7. Cobrir com Safranina: 1min.;
8. Lavar com H2O e secar.
25
Colorao de Ziehl-Neelsen
Utilizada para corar as BAAR, que so aquelas que retm carbol-fucsina (fucsina
bsica dissolvida numa mistura de fenol-lcool-gua), mesmo quando descoradas
com cido clordrico em lcool. Um esfregao de clulas em lmina banhado
com carbol-fucsina e aquecido em vapor, procedimento aps o qual a
descolorao com cido- lcool efetuada. Por fim, aplica-se um contra corante
contrastante (azul de metileno). As BAAR (micobactrias e alguns dos
actinomicetos relacionados) adquirem cor vermelha, enquanto as outras
apresentam a cor do contra corante.
Os verdadeiros bacilos da tuberculose caracterizam-se pela sua lcool-cido-
resistncia, isto , o lcool etlico a 95% contendo 3% de cido clordrico
descolora rapidamente todas as bactrias, exceto as micobactrias. As amostras
destinadas pesquisa de BAAR, so para a pesquisa de Mycobacterium
tuberculosis. Estas so pesquisadas normalmente no trato respiratrio no LBA,
na EXP, nas SB, no LCR e no suco gstrico.
Na bacteriologia, s se realizam as coloraes para suspeita de tuberculose,
sendo o resto do diagnstico realizado na Serologia: o exame cultural, o teste de
sensibilidade antibitica (TSA) e tambm a confirmao por Biologia Molecular.
Sendo a M. tuberculosis a BAAR mais comum, as amostras de excelncia
destinadas para a sua pesquisa so: LCR, lavado bronco alveolar e suco gstrico.
No exame direto, corado pelo mtodo de Gram, os microrganismos Gram +
apresentam uma colorao prpura-azulada, ao passo que a cor vermelha
indicadora de microrganismos Gram -. Este exame tambm permite avaliar a
morfologia (cocos, bacilos, vibrio, etc.) das bactrias (fig.2).
26
Fig.2: Morfologia bacteriana.
Embora no permitindo a identificao da espcie, clarifica-nos apenas se so
bactrias gram-positivas ou gram-negativas, e tambm se so cocos, bacilos,
diplococos. Este mtodo de Gram permite realizar um diagnstico presuntivo e
orientar o estudo para a identificao do microrganismo, por exemplo, se forem
observados cocos gram-positivos dispostos em cadeia so sugestivos de
estreptococos e cocos gram-positivos dispostos em cacho so sugestivos de
estafilococos. Algumas bactrias gram-positivas no viveis podem exibir
colorao gram-negativa, da a importncia de uma boa colorao para que no
haja enganos na identificao do tipo de bactrias presentes.
o Exame cultural
O exame cultural consiste em semear amostras biolgicas, em meios de cultura,
gerais ou seletivos. Este processo feito em meio prprio (culturas) que permita
a nutrio, o crescimento e a multiplicao de microrganismos. Para cada
produto biolgico, so utilizados diferentes meios, consoante os microrganismos
possveis de se encontrar nessa amostra e o diagnstico clnico do doente. Este
exame permite, tambm, a identificao do gnero/espcie do agente causador da
infeo.
27
Nota: Para a realizao do exame cultural, a amostra deve conter pelo menos 10
5
microrganismos por mililitro (mo/ml) para que possam ser detetados num
esfregao. O meio de cultura lquido contendo 10
5
mo/ml tem um aspeto
macroscopicamente turvo, que tambm pode ser observado em algumas amostras
lquidas (urina turva pode ser um sinal de infeo). Nas amostras que contm 10
2
a 10
3
mo/ml h crescimento em meios slidos de culturas, enquanto as que
contm 10 mo/ml ou menos bactrias podem produzir crescimentos em meios
lquidos, sendo estes meios utilizados apenas para enriquecimentos para garantir
o crescimento da bactria.
I- 1.3- Meios de cultura slidos
Os meios de cultura utilizados para a realizao do exame cultural, so muito
mais sensveis e especficos que o exame direto.
Para o diagnstico bacteriolgico utilizaram-se vrios meios de cultura gerais,
seletivos e diferenciais para as bactrias aerbias, as anaerbias facultativas e
obrigatrias.
O conhecimento sobre os mecanismos e exigncias da nutrio microbiana
permite, aos microbiologistas, cultivar microrganismos em laboratrio, usando
meios de cultura adequados. Uma m escolha do tipo de meio compromete, de
certo modo, a amostra e o tempo de identificao. Nos meios de cultura, os
microrganismos multiplicam-se, o que vai permitir isola-los e identifica-los. Para
alm dos nutrientes necessrios s exigncias dos microrganismos, os meios de
cultura devem ser estreis.
Para caracterizar individualmente um microrganismo, necessrio obt-lo em
cultura pura (apenas um tipo de microrganismo). Essas culturas podem ser
obtidas pelos mtodos de estrias ou de espalhamento em placa, obtendo-se
colnias, que so visveis macroscopicamente e so provenientes da
multiplicao celular. partida, as colnias individualizadas e bem distanciadas
umas das outras, so originadas, em princpio a partir de uma nica clula.
O isolamento de uma estirpe bacteriana, em cultura pura a partir de uma cultura
mista (cultura que tem mais do que um tipo de microrganismos), requer o uso de
28
meios de cultura seletivos e/ou diferenciais. Os meios seletivos so formulados
para suprimir o crescimento dos microrganismos que no interessam, permitindo
o crescimento dos microrganismos que se desejam isolar.
I- 1.3.1- Meios de cultura no seletivos
Meios de cultura no seletivos utilizados na Bacteriologia do HNM:
Gelose de sangue
um meio de cultura padro para qualquer tipo de amostra. Geralmente
preparado com 5% de sangue de carneiro, sendo um meio geral, permite a
deteo da maioria dos microrganismos aerbios e anaerbios facultativos,
bactrias exigentes e tambm permite a evidncia de hemlise.
Gelose de chocolate Polivitex
um meio que contm sangue aquecido com ou sem suplementos sendo um
meio no seletivo. Alguns microrganismos que no crescem em gelose de sangue
como a Neisseria spp. e Haemophilus spp. patognicos e crescem nesta gelose.
Muller-Hinton
Este meio usou-se para o estudo da suscetibilidade aos antimicrobianos.
I- 1.3.2- Meios seletivos
Meios seletivos utilizados:
Gelose chocolate PolyVitex V.C.A.T
Normalmente denominada por gelose de chocolate. Pode ser suplementada para o
isolamento de determinadas bactrias, uma vez que inclui os seguintes
antibiticos vancomicina, colistina, anfotericina e trimetropim com incubao a
35C em atmosfera enriquecida com 5% de CO2, o que provoca o isolamento de
Neisseria gonorrhoeae em amostras com flora autctone, mais utilizado para os
gonococos, visto que uma bactria muito exigente.
A gelose chocolate com bacitracina vai favorecer o crescimento de Haemophilus
spp. nos produtos com flora mista, devido inibio das bactrias gram-positivas
e a maioria das Neisserias spp..
29
Gelose MacConkey (McK)
um meio de cultura seletivo para bactrias gram-negativas suprimindo as gram-
positivas (atravs dos sais biliares).
Num meio diferencial podem crescer vrios tipos de microrganismos, mas devido
ao diferente aspeto que tomam nesse meio, podem distinguir-se entre si as
colnias microbianas (e.g. o meio de cultura McK contm lactose e vermelho
neutro, um indicador de pH que amarelo, a pH neutro, e rosa ou vermelho, a pH
cido. A Escherichia coli fermenta lactose e produz cidos originando nesse
meio colnias vermelhas ou rosa. A Salmonella, no fermenta a lactose, origina
colnias incolores nesse meio, ou seja, a presena de lactose permite diferenciar
as bactrias fermentadoras das no fermentadoras).
As amostras que so semeadas para a pesquisa de anaerbios obrigatrios devem
ser semeadas em pelo menos dois tipos de meios, um que seja enriquecido e
suplementado e um meio seletivo contendo substncias que inibem o crescimento
de bacilos gram-negativos e cocos gram-positivos anaerbios facultativos.
Gelose de Chapman (manitol salgado)
um o meio de cultura que favorece o crescimento dos gram-positivos,
precisamente para o isolamento de Staphylococcus spp. e identificao
presuntiva de S. aureus (fermentao do manitol).
Gelose de CNA (meio de azido)
Gelose com sangue, colistina e cido nalidxico, onde a colistina e o cido
nalidxico inibem o crescimento das Enterobacteriaceae e Pseudomonas spp., o
que torna o meio seletivo para bactrias gram-positivas. Contudo, algumas
bactrias gram-negativas como Gardnerella vaginalis e alguns Bacteroides spp.
tambm se desenvolvem neste meio.
Gelose CLED (cistina- lactose - dfice de eletrlitos)
um meio no seletivo, diferencial, que vai permitir o isolamento dos agentes
mais frequentes de infeo urinria. A insuficincia de eletrlitos inibe o
30
swarming dos Proteus spp. e a lactose permite diferenciar os fermentadores dos
no fermentadores.
Gelose Salmonella & Shigella (SS)
Para a cultura de fezes existem meios especficos, seletivos e diferenciais como,
por exemplo, a gelose SS que favorece o crescimento da Salmonella e da
Shigella e o seu isolamento. As colnias distinguem-se pela cor. Este meio inibe
tambm dos coliformes pelo verde brilhante e sais biliares. A presena de sais
de ferro permite a deteo das estirpes produtoras de H2S.
Gelose SMID
um meio cromogneo para o isolamento seletivo e de diferenciao destinado
deteo das Salmonella a partir de fezes
A colorao das colnias obtm-se atravs da associao de substratos:
- Dois substratos nutritivos hidrocarbonados (sorbitol e glucuronato) combinados
com um indicador colorido (vermelho neutro) que provoca a colorao rosa das
colnias de Salmonella;
- Dois substratos cromogneos que provocam a colorao azul das colnias que
possuem uma -glucosidade (no Salmonella).
Gelose campylobacter
um meio para campylobacter, requer uma temperatura muito particular de
crescimento, os 42C durante 3 dias.
Gelose sorbitol
um meio cromogneo especfico para Escheriachia coli O157, em que as
colnias apresentam-se de cor violeta. Se houver outro tipo de bactrias no meio,
estas apresentam-se de cor azul metlico. A incubao durante 18h, a uma
temperatura de 35-37C.
31
Gelose sabouraud
Para o isolamento de fungos, um meio que possui essencialmente glicose.
Muitas leveduras crescem em gar de sangue. Os fungos dimrficos, na fase de
miclio crescem bem em meio sabouraud. As culturas para fungos costumam ser
efetuadas em duplicado, sendo um conjunto incubado entre 25 e 30C e o outro
entre 35 e 37C (isto em zonas endmicas com essas temperaturas que
desenvolvam esse tipo de fungos).
Gelose candida (CAN)
um meio seletivo e cromognico destinado ao isolamento das leveduras,
identificao imediata de Candida albicans e diferenciao de um conjunto de
espcies agrupando C. tropicalis, C. lusitaniae e C. Kefyr.
A hidrlise especfica de um substrato cromogneo de hexosaminidase na
presena de um indutor da enzima leva colorao azul das colnias de C.
albicans. A hidrlise de um segundo substrato permite diferenciar as culturas
mistas e orientar a identificao para as outras espcies. As colnias que
hidrolisam este substrato so pigmentadas a rosa.
A inibio da flora bacteriana obtida pela adio de uma mistura de
antibiticos.
Gelose de Lowenstein-jensen
Para a cultura das micobactrias (realizado na Serologia) utilizado o meio
slido com uma incubao at 45 dias. As culturas so observadas
periodicamente durante o perodo de incubao, ao fim do qual, se no houver
crescimento, dado como resultado negativo. A colnia da micobactria muito
particular, sendo em forma de couve-flor. utilizado tambm um meio lquido
de referncia que leva ao crescimento mais rpido destas colnias do que no
meio slido.
32
I- 1.4- Meios lquidos de enriquecimento
As culturas em caldo em meios altamente enriquecidos, os caldos de carne, so
importantes para culturas de lquidos biolgicos e tecidos obtidos de bipsia.
Caldo Cooked Meat Medium (caldo de carne) e caldo Todd Hewitt
Meio lquido em tubo para o crescimento de micro-organismos.
Caldo selenito
Os meios de cultura que permitem o crescimento de uma espcie bacteriana em
detrimento de outras, caldo selenito ou caldo de tetrationato permitem o
crescimento de Salmonella a partir de fezes, sem o crescimento da flora
autctone existente no intestino. A subcultura para meio slido deve ocorrer
entre as 6 e 12 horas, pois esse o prazo mdio de inibio de outras estirpes, tal
como o Proteus spp..
Granada (IGLB) - caldo bifsico
Meio seletivo para o rastreio e a identificao dos estreptococos do grupo B (S.
agalactiae).
Rota-Adeno) que
permite a dupla deteo qualitativa do rotavrus e do adenovrus.
Os rotavrus e os adenovrus so responsveis por gastroenterites agudas,
principalmente nas crianas mais novas. As diarreias virais, frequentemente
sazonais, evoluem favoravelmente. No estado agudo da doena, so excretadas
grandes quantidades de vrus, sendo estes responsveis pela propagao da
epidemia. A cultura dos rotavrus e dos adenovrus difcil, o que explica a
utilizao preferencial das tcnicas imunolgicas.
I- 3.8- Aparelho genital
A Neisseria gonorrhoeae uma bactria associada a uma doena sexualmente
transmissvel, a Gonorreia. transmitida por contacto sexual e nos homens a
infeo assintomtica. A infecciosidade to elevada que a probabilidade de
contrair a infeo de uma nica exposio sexual no protegida a partir de um
parceiro infetado de 20 a 30% nos homens e uma probabilidade ainda maior
nas mulheres.
As amostras de eleio so um exsudado vaginal ou num exsudado uretral e
necessrio fazer a pesquisa do gonococo quer em meios de cultura (Gelose de
Chocolate em CO
2
), quer em esfregaos corados pelo mtodo de Gram. Neste
ltimo mtodo, possvel observar nos polimorfonucleares, a incluso destas
bactrias intracelulares obrigatrias (diplococos gram-negativos).
52
I- 3.8.1- Exsudado vaginal e uretral
No exsudado vaginal, o estudo bacteriolgico, micolgico e parasitolgico.
No exame a fresco, pesquisaram-se clulas, leuccitos e os elementos
leveduriformes. Aquando da presena de leveduras, a amostra semeou-se para
um meio de Candida spp., que, na maior parte das vezes, albicans. Para alm
da gelose de Candida, o exame cultural tambm se executou para uma gelose de
sangue e uma gelose chocolate polyvitex (jarra com CO
2
) e incubou-se a 37C,
durante 24h em aerobiose.
Efetuou-se a pesquisa de Trychomonas vaginalis, um parasita flagelado.
possvel visualiza-lo, pela sua movimentao no exame a fresco (uma
caracterstica particular, para confirmar a presena deste parasita) e causador de
infeo na vulva, na vagina e no colo uterino, em geral no se estende para o
tero. A sua transmisso feita por via sexual.
I- 3.8.2- Exsudado vaginal e perianal na grvida
O exsudado vaginal e perianal consiste numa pesquisa orientada para o estudo de
Streptococcus agalactiae (Streptococcus beta hemoltico do grupo B de
Lancefield). Estes estreptococos do grupo B fazem parte da flora normal da
vagina em 5 a 25% das mulheres.
Esta pesquisa feita nas grvidas no ltimo trimestre de gravidez (entre as 35 e
as 37 semanas), para poder prevenir a colonizao no recm-nascido por estes
estreptococos. Se o recm-nascido for infetado pode desenvolver uma meningite,
uma spsis fulminante ou at mesmo um sndrome respiratrio.
No exame direto realizou-se o esfregao para a colorao de Gram e no exame
cultural fez-se uma gelose de sangue e o meio granada (IGLB).
Incubou-se a 37C, durante 24 a 48h em aerobiose.
53
I- 3.9- Pontas de cateter
O uso generalizado de acessos vasculares cria uma porta de entrada de risco
significativo de bacterimia.
Os Staphylococcus spp. so bactrias que, mais frequentemente colonizam, os
cateteres pois tm adesinas especiais para os plsticos de que eles so feitos. Os
Staphylococcus coagulase negativa so colonizadores mais frequentes que os
Staphylococcus aureus.
O cateter semeou-se por rolamento, pela tcnica de Maki, em gelose de sangue.
Aps 24h de incubao, a 37C, realizou-se a avaliao semiquantitativa do
crescimento bacteriano, sendo valorizado e identificado um nmero de colnias
15.
O microrganismo normalmente isolado em cateter e de importncia clnica o
estafilococo coagulase negativa.
Notas:
- Em caso de infeo associada a cateter (um fragmento do cateter), enviado ao
laboratrio, associado ou no a uma hemocultura, caso esteja associado, tanto o
cateter, como a hemocultura tem que se obter o mesmo microrganismo em caso
de infeo, e descartar a hiptese de contaminao da flora da pele ou dos
procedimentos.
- Para fazer o diagnstico de bacterimia relacionada com cateter necessrio o
isolamento do mesmo microrganismo nas amostras obtidas de diferentes locais
em espaos de tempo diferentes, (hemocultura perifrica, ponta do cateter,
zaragatoa da zona de insero do cateter). O crescimento de diferentes
microrganismos em frascos de cultura diferentes pode sugerir uma contaminao.
54
I- 4- Teste de sensibilidade aos antimicrobianos
Os TSA so indicados para qualquer microrganismo que contribua para um
processo infecioso, que justifique uma terapia antimicrobiana.
O reconhecimento do padro de sensibilidade teraputica antimicrobiana
fundamental na medida em que se assiste ao aparecimento de estirpes
microbianas resistentes a alguns antibiticos que, por isso, deixam de ser eficazes
no tratamento das infees.
Os antibiticos distinguem-se em:
- bactericidas: quando eliminam as bactrias, provocando a destruio da parede
bacteriana;
- bacteriostticos: detm o crescimento das bactrias, deixando ao sistema
imunitrio a tarefa de eliminar a infeo.
O estudo do comportamento de uma bactria aos antibiticos permite avaliar a
sua sensibilidade ou a sua resistncia.
Existem vrios mtodos de execuo do TSA ou antibiograma (ATB). A sua
seleo deve ter em conta, para alm da rapidez do resultado e de uma resposta
facilmente interpretvel pelo clnico, a poltica de utilizao de antibiticos do
hospital, assim como, a poltica nacional de administrao destes frmacos.
I- 4.1- Mtodos laboratoriais utilizados no estudo da atividade dos
antibiticos
Para avaliar in vitro a suscetibilidade bacteriana aos antibiticos, podem usar-se
vrias metodologias, o mtodo de diluio, o mtodo de difuso (Kirby-Bauer e
E-test) e mtodos automatizados (VITEK).
O mtodo de diluio consiste em meios de cultura lquidos ou slidos
adicionados de concentraes crescentes de um dado antibitico. Para cada um
destes meios, adiciona-se a mesma quantidade de inculo (suspenso bacteriana).
Aps a incubao temperatura adequada, observa-se se ocorreu crescimento
bacteriano. Deste modo, avalia-se a concentrao mnima inibitria (CMI) em
mg/L de antibitico.
55
A CMI a mais fraca concentrao de um antibitico em soluo, capaz de
impedir o crescimento de uma estirpe, em relao qual se determina a CMI
relativamente a um determinado antibitico, num meio de composio
estandardizada.
O mtodo de difuso consiste na utilizao de meios slidos, a inoculao de
uma dada suspenso bacteriana por espalhamento superfcie do meio. Na
superfcie do meio slido inoculado, colocam-se discos de papel impregnados
com antibiticos. Aps incubao de 24 horas temperatura adequada, medem-
se os halos de inibio volta dos diferentes discos de papel impregnados com os
diferentes antibiticos.
O tamanho dos halos expresso em milmetros, avaliado em sensvel (S)
resistente (R) e intermdio (I). sensvel quando o microrganismo responde
teraputica com o antimicrobiano utilizando a dosagem normalmente
recomendada para aquele tipo de infeo e espcie bacteriana (aparece um halo
na placa, volta do disco do antibitico). resistente quando no h uma boa
resposta teraputica, s concentraes de antimicrobiano atingidas, com as
dosagens habitualmente utilizadas com aquele antimicrobiano, e/ou logo, est
presente um mecanismo especfico de resistncia (no aparece o halo). E por fim
intermdio quando a CMI do antimicrobiano para o microrganismo prxima
do valor que ele pode atingir no sangue ou tecidos, para a qual a resposta clnica
inferior de uma estirpe sensvel.
Na seco de Bacteriologia utilizou-se os mtodos de difuso de Kirby-Bauer e o
E-test.
Mtodo Kirby-Bauer
Consiste num mtodo qualitativo que permite classificar os microrganismos em
resistentes, sensveis ou intermedirios em relao a uma grande variedade de
agentes antimicrobianos.
Nesta tcnica utilizado o meio de cultura Mueller-Hinton. A densidade da
suspenso bacteriana a inocular deve ser equivalente a 0,5 unidade Mac Farland e
a concentrao de cada antibitico em discos de papel determinada segundo as
regras Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI). A droga difunde-se
56
radialmente, ocorrendo em simultneo a multiplicao do microrganismo. Em
reas onde a concentrao do agente antimicrobiano inibitria, no ocorre
crescimento, formando-se uma zona (halo de inibio) volta de cada disco. O
halo de inibio corresponde ao nmero de microrganismos mortos.
Seleo dos antibiticos
A seleo dos discos de antibiticos, depende do produto donde provm o
microrganismo isolado. Os discos utilizados na seco foram adaptados da FDA-
EUA e recomendado pelo CLSI. Segue-se algumas tabelas (II-VIII), da seleo
dos antibiticos utilizados, consoante o microrganismo isolado e o respetivo
produto (amostra) e/ou espcie.
Tabela II: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Enterobacteriaceaeas.
Enterobacteriaceaeas
Produto Antibitico
Urina Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina 10g, Nitrofurantoina, Cotrimoxazol,
Amoxicilina+Ac. Clavulmico, Cefuroxime, Levofloxacina/Ciprofloxacina,
Cefotaxime, Ceftazidime, Amicacina e Ofloxacina
Pus, Expetorao
ou Hemocultura
Ampicilina, Cefalotina, Gentamicina, Amoxicilina+Ac. Clavulmico, Co-
trimoxazol, Amicacina, Cefuroxime, Cefotaxime, Aztreonam,
Imipenem/Meropenem, Piperacilina+Tazobactam, Tobramicina, Ceftazidime e
Levofloxacina/Ciprofloxacina
LCR Ampicilina, Gentamicina, Cefotaxime, Amicacina, Meropenem, Co-trimoxazol
e Ceftazidima
Fezes Ampicilina, Ciprofloxacina e Co-trimoxazol
Se o microrganismo isolado for Salmonella typhi, utilizar os seguintes
antibiticos: ampicilina, ciprofloxacina, cotrimoxazol e cefotaxime.
Se o microrganismo isolado for Listeria, utilizar os seguintes antibiticos:
ampicilina, co-trimoxazol e gentamicina. Nas Pseudomonas, utilizar os seguintes
antibiticos: piperacilina+tazobactam, ceftazidime, amicacina, gentamicina,
imipenem/meropenem, tobramicina, aztreonam e ciprofloxacina.
57
Tabela III: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Sthaphilococcus.
Sthaphilococcus
Produto Antibitico
Urina Penicilina, Oxacilina, Novobiocina, Nitrofurantoina, Gentamicina,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Vancomicina, Co-trimoxazol, Teicoplanina
Pus, Expetorao
ou Hemocultura
Penincilina, Oxacilina, Co-trimoxazol, Cefalotina, Teicoplanina, Clindamicina,
Eritromicina, Rifampicina, Vancomicina, Amicacina, Gentamicina,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Tetraciclina, Amoxicilina+Ac. Clavulmico
LCR Penicilina, Oxacilina, Clindamicina, Co-trimoxazol, Vancomicina,
Teicoplanina, Amicacina, Rifampicina, Cloranfenicol, Gentamicina,
Eritromicina, Levofloxacina/Ciprofloxacina.
Exsudado nasal Penincilina, Oxacilina, Vancomicina, Eritromicina, Amoxicilina+Ac.
Clavulmico, Gentamicina e Teicoplanina
Tabela IV: Seleo de antibiticos consoante a espcie aquando do isolamento de
Neisseria.
Neisseria
Espcie Antibitico
Meningococcus Penicilina, Cefotaxime, Cloranfenicol, Ampicilina
Gonococcus Penincilina, Tetraciclina, Spectinomicina, Cefalotina, Cefuroxime, Cefas de 3
gerao, Ciprofloxacina e pesquisa da -lactamase (nitrocefina).
Moraxella
catarrhalis
Penicilina, Amoxicilina+Ac.Clavulmico, Cefuroxime, Cefotaxime,
Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa da -lactamase (nitrocefina).
Tabela V: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Haemophilus.
Haemophilus
Produto Antibitico
Hemocultura e
LCR
Ampicilina, Cefotaxime, Cloranfenicol e pesquisa da -lactamase (nitrocefina).
Expetorao, Ex.
nasal e pus
Ampicilina, Co-Trimoxazol, Eritromicina, Amoxicilina+Ac.Clavulmico,
Levofloxacina/Ciprofloxacina, Cefuroxime, Tetraciclina e pesquisa da -
lactamase (nitrocefina).
Tabela VI: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico e espcie, na presena de
Streptococcus.
Streptococcus
Espcie Antibitico
Pneumococcus Expetorao e
Exsudados
Penicilina, Ampicilina, Optoquina
LCR e
Hemocultura
Penicilina, Oxacilina, Cefotaxime, Cloranfenicol,
Optoquina, Ampicilina, Vancomicina, Eritromicina
Streptococcus
diversos
Penicilina, Tetraciclina, Ampicilina, Cefalotina, Clindamicina, Gentamicina,
Vancomicina, Teicoplanina, Ciprofloxacina, Eritromicina
Streptococcus A Penicilina, Ampicilina, Eritromicina, Clindamicina
58
Tabela VII: Seleo de antibiticos em cada produto biolgico, na presena de
Enterococcus.
Enterococcus
Produto Antibitico
Urina Penicilina, Ampicilina, Nitrofurantoina, Co-Trimoxazol, Eritromicina,
Gentamicina HC, Estreptomicina HC, Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa
da -lactamase (nitrocefina).
Pus Penicilina, Ampicilina, Gentamicina HC, Eritromicina, Vancomicina,
Teicoplanina, Levofloxacina/Ciprofloxacina e pesquisa da -lactamase
(nitrocefina)
LCR e Hemocultura Ampicilina, Estreptomicina HC, Teicoplanina, Gentamicina HC, Vancomicina e
pesquisa da -lactamase (nitrocefina).
Tabela VIII: Seleo de antibiticos usados no exsudado ocular consoante o
microrganismo isolado.
Exsudado ocular
Microrganismo Antibitico
Pneumococcus Cloranfenicol, Tetraciclina
Staphilococcus
aureus
Cloranfenicol, Ac. Fusidico, Gentamicina, Tetraciclina, Ofloxacina
Haemophilus Cloranfenicol, Tetraciclina
Enterobacteriaceaes Cloranfenicol, Tetraciclina, Colistina, Gentamicina
Pesudomonas Colistina, Gentamicina, Ofloxacina
psilon test (E-test)
O E-test permite determinar quantitativamente a suscetibilidade de determinado
microrganismo. Consiste na aplicao de uma tira impregnada com um gradiente
de antibitico, tornando possvel determinar o CMI pela linha de interseco do
crescimento bacteriano com a respetiva tira.
Neste teste, a CMI lida diretamente na escala da tira, no ponto onde a elipse de
inibio do crescimento intercepta a tira. Usou-se o E-test da vancomicina e o da
penicilina.
E-test vancomicina
Procedimento laboratorial:
- efetuou-se uma suspeno de 0,5 de Mcfarland;
- numa placa de Muller-Hinton, efetuou-se estrias apertadas em 3 direes;
- colocou-se a tira E-test e incubou-se a 37C durante 24h ao ar.
59
E-test penicilina
Procedimento laboratorial:
- efetuou-se uma suspeno de 0,5 de Mcfarland;
- numa placa de gelose de sangue, efetuou-se estrias apertadas em 3 direes;
- colocou-se a tira E-test;
- incubou-se a 37C durante 24h em CO
2
.
I- 4.2- Mtodos automatizados-VITEK
Na seco de Bacteriologia existe o sistema automatizado denominado VITEK 2
da bioMrieux, o qual permite a identificao do microrganismo isolado, assim
como, a determinao tambm da sua suscetibilidade aos antimicrobianos.
O sistema VITEK automatiza todas as etapas necessrias para a realizao dos
testes de identificao, usando as cartas VITEK para Gram-positivos,
estreptococos e estafilococos, para os Gram-negativos, para as Pseudomonas
spp., para fungos e para anaerbios.
O teste de identificao pelas cartas do VITEK consiste numa combinao de
acares e substratos bioqumicos desidratados, os quais vo ser digeridos e
provocar uma reao, em que o VITEK, com uma memria implementada dos
vrios microrganismos existentes industrializados, identifica o microrganismo
em estudo.
O TSA umas das tcnicas que se baseia na determinao da capacidade que um
microrganismo tem de se multiplicar in vitro na presena de diferentes frmacos.
O TSA nas cartas do VITEK consiste numa combinao de frmacos para
determinados microrganismos (e.g. gram-positivos ou gram-negativos) em que o
resultado dado como sensvel, resistente e intermdio, ao antibitico.
de salientar, que para a leitura das cartas de identificao e das cartas de TSA
necessrio fazer suspenses padronizadas das colnias (Mac Farland) para que o
teste seja bem-sucedido quer na identificao acertada do microrganismo quer no
TSA na sensibilidade e resistncias reais dos microrganismos.
60
O aparelho VITEK 2 executa as anlises de identificao e sensibilidade, atravs
da monitorizao contnua do crescimento e da atividade dos microrganismos no
interior das cartas. Existem 2 sistemas ticos que executam esta funo:
Sistema tico de fluorescncia
Deteta indiretamente o crescimento e a atividade dos microrganismos, usando um
derivado qumico do seu crescimento, em vez dos prprios microrganismos. Esta
substncia qumica, denominado fluorforo, absorve a luz num comprimento de
onda de 365nm, reemitindo imediatamente a luz num comprimento de onda de
445nm.
So utilizados tubos de luz xnon e filtros ticos para criar o comprimento de
onda especfico da luz. Posteriormente, um detetor de fluorescncia captura a luz
reemitida pelo fluorforo. O sistema bioqumico nestes poos foi concebido para
produzir esta substncia em proporo direta ao crescimento e atividade dos
microrganismos. A quantidade de luz reemitida que produzida, fornece um
excelente indicador do crescimento e da atividade dos microrganismos,
utilizando uma referncia interna.
Sistema tico de transmitncia
Utiliza luz visvel para medir diretamente o crescimento dos microrganismos.
Este sistema baseia-se numa leitura de luz inicial do poo, antes do incio de
crescimento microbiano significativo. Amostragens de transmitncia de luz do
mesmo poo, com intervalos de 15 minutos, medem o crescimento de
microrganismos, atravs da quantidade de luz que impedida de atravessar o
poo.
O sistema tico utiliza dodos emissores de luz (LED) que produzem luz nos
comprimentos de onda apropriados e fotodetetores de silicone para capturar a luz
transmitida. O sistema efetua autocalibrao.
A identificao VITEK cobre mais de 300 espcies encontradas em clnica e na
rea industrial.
61
Galerias de antibiograma
A seco de Bacteriologia possui algumas galerias de ATB para algumas
estirpes, nomeadamente as enterobactrias, as pseudomonas e outros bacilos
gram-negativos no fermentadores, os haemophillus e as neisserias.
Estas diferentes galerias de ATB comportam 16 pares de cpulas. O primeiro
par, sem antibitico, que vai servir de controlo de crescimento. Os 14 pares
seguintes contm antibiticos com uma ou duas concentraes. O ltimo par, no
tem antibitico, permitindo a adio de um antibitico suplementar, caso seja
necessrio.
A bactria a analisar foi colocada em suspenso. Depois transferida para o meio
de cultura e inoculada na galeria. Aps 18 a 24h de incubao, a leitura de
crescimento, por vezes, fez-se visualmente, ou no aparelho Vitek systems-ATB
expression. O resultado obtido permitiu classificar a estirpe como sensvel,
intermdia ou resistente
62
I- 5- Teste de despiste de resistncia meticilina do
Staphylococcus em meio de cultura slido
Os Staphylococcus aureus resistentes meticilina, normalmente designados por
MRSA, so comuns em ambientes hospitalares e pouco comuns em indivduos
provenientes da comunidade.
A resistncia oxacilina utilizada para detetar a presena de estafilococcus
resistentes meticilina. A maioria destes microrganismos so geralmente
resistentes tambm a mltiplos antibiticos, incluindo outros -lactmicos,
aminoglicosdeos, macrlidos, clindamicina e tetraciclina.
Realizou-se o seguinte procedimento laboratorial:
1- Fazer uma suspenso de densidade de 0,5 da escala de Mac-Farland;
2- A partir desta suspenso fazer uma diluio de 1:2;
3- Numa placa de Mueller-Hinton suplementado com 4% de cloreto de sdio
efetuar estrias apertadas em 3 direes;
4- Colocar o disco de oxacilina;
5- Incubar durante 24h, temperatura 35-37C;
Nota: A ausncia de um halo de inibio, sinnimo de resistncia.
Pesquisa de - lactamases
As -lactamases (penicilinases) so enzimas bacterianas heterogneas que clivam
o anel -lactmico das penicilinas e cefalosporinas para inativar o
antimicrobiano.
As -lactamases conferem, s bactrias que as contm, resistncia s
cefalosporinas de amplo espectro de ao (3 gerao) como a ceftazidima,
cefotaxima e ceftriaxone (oximino-cefalosporinas) e aos monobactmicos, como
o aztreonam.
Dos vrios processos usados na Bacteriologia para a pesquisa das -lactamases,
utlizou-se o mtodo da cefalosporina cromognica.
63
Princpio
O disco de cefinase est impregnado com cefalosporina cromognica
(nitrocefina). O teste baseado na liberao de um radical cromogneo, que ir
ocasionar uma mudana rpida de cor (de amarelo para vermelho) quando a
ligao amido no anel -lactmico hidrolisado pela ao da -lactamase.
O teste para a deteo de -lactamase deve ser realizado em todas as amostras de
Haemophillus spp.. Quando o resultado for positivo para produo de -
lactamase, reportar resistncia ampicilina e amoxicilina. O resultado negativo
no garante sensibilidade ampicilina e um outro teste dever ser realizado.
O teste da nitrocefina apresenta resultados fidedignos para a deteo da produo
de -lactamases em isolados de Haemophillus spp., Neisseria gonorrhoeae,
Moraxella catarrhalis, Staphylococcus spp. e Enterococcus spp..
Procedimento laboratorial:
1- Humedecer com gua destilada e esterilizada o disco de nitrocefina
previamente colocado na lmina de vidro;
2- Utilizando uma ansa, remover 4 a 5 colnias morfologicamente
semelhantes da cultura e depositar na superfcie do disco;
3- Verificar se h modificao da cor: resultados positivos aparecem 15
segundos a 5 minutos. Se no houver alterao da cor, o teste negativo.
64
I- 6- Controlo de qualidade interno e externo na Bacteriologia
O controlo de qualidade interno um controlo que assegura a qualidade dos
resultados diariamente. Atravs do controlo interno, pode-se avaliar o
funcionamento confivel e eficiente dos procedimentos laboratoriais, fornecendo
resultados vlidos, que possam contribuir de forma eficaz no estabelecimento do
diagnstico pelo clnico.
Na seco, fez-se diariamente a monitorizao da temperatura das estufas,
mensalmente a temperatura dos frigorficos e de acordo com o aparecimento dos
erros detetados, fez-se a monitorizao dos reagentes, meios de cultura e
tcnicas. Procedeu-se tambm manuteno e controlo dos equipamentos.
Usou-se na seco de Bacteriologia o controlo de qualidade interno
quinzenalmente, as estirpes american tipe culture collection (ATCC): S. aureus
ATCC, E.fecalis ATCC, E.coli ATCC, K. pneumoniae ATCC, P. aeruginosa
ATCC.
Realizou-se o controlo de qualidade externo, o UK national external quality
assessment service (UK NEQAS) for Microbiology, numa periocidade mensal.
Este controlo externo consiste em amostras desconhecidas, testadas como
amostras biolgicas e cujos resultados so enviados ao laboratrio de referncia
(Londres) dentro do prazo solicitado por esta entidade. Os resultados so
pontuados e comparados com outros laboratrios participantes.
A seco recebe mensalmente o controlo de qualidade externo-NEQAS, que
consiste em 5 amostras:
- 1 amostra de fezes que tem como objetivo, a identificao de bactrias
patognicas;
- 2 amostras variveis, que tem como objetivo, a identificao de bactrias
patognicas;
- 2 amostras variveis para, a identificao de microrganismos e TSA.
65
II- Serologia
A seco de Serologia do SPC consiste no diagnstico laboratorial atravs de
tcnicas imunolgicas, que detetam a resposta imune especfica do hospedeiro
infetado, contra o microrganismo causador da infeo, sejam eles, vrus,
bactrias, fungos e parasitas.
O diagnstico serolgico baseia-se na resposta imune humoral dependendo da
atividade dos linfcitos B, na presena de microrganismos (antignios (Ag))
estranhos ao indivduo infetado, pela produo de anticorpos (Ac) e por uma
reao Ag-Ac. A produo de Ac quantificada e, a partir dessa quantificao
dos Acs, podemos obter o diagnstico, se bem que a sua presena nem sempre
confirma o diagnstico e podem permanecer para sempre, ou seja, um resultado
positivo nem sempre sinal de doena contrada recentemente.
II- 1- Colheita e amostra
Os Ac so pesquisados no soro, plasma e lquidos biolgicos (LCR, urina e
outros).
Colheita
A colheita muito importante tal como a sua manipulao. Deve evitar-se
sempre a contaminao, porque se trata de uma colheita estril.
A refrigerao deve ser feita entre as temperaturas de 2 a 8 C nos 7 dias
posteriores colheita. Em caso de perodos mais prolongados conservar a uma
temperatura de -20C.
As amostras devem ser colhidas em tempos especficos, em que o 1 soro dever
ser na fase aguda da doena e um 2 soro colhido na fase de convalescena (pelo
menos com 15 dias de intervalo).
Amostra
No usar soros lipmicos, hemolisados ou contaminados, e em caso de soros com
partculas, deve-se proceder a uma centrifugao.
Sempre que possvel evitar congelamentos e descongelamentos da amostra,
porque pode levar a alteraes no doseamento das Imunoglobulinas.
66
II- 2- Metodologia
Os mtodos utilizados em diagnstico serolgico so ensaios com grande
afinidade entre o Ac e o Ag, sendo uns mais sensveis que outros.
As reaes antignio Ag-Ac podem ser detetadas num nvel primrio pela
marcao de um Ag com uma enzima ou com uma substncia fluorescente,
ensaios imunoenzimticos e de imunofluorescncia, ou, secundariamente, pelo
reconhecimento de alteraes fsicas (precipitao e aglutinao) resultantes
destas reaes.
II- 2.1- Metodologia automatizada
Utilizou-se vrios mtodos de ensaio nesta seco, nomeadamente por, enzyme-
linked immunosorbent assay (ELISA), Imunofluorescncia, enzyme linked
fluorescent assay (ELFA) e quimioluminescncia.
A seco possui um equipamento, o Ap 22, que executa mtodos de ELISA e de
imunofluorescncia.
ELISA
Consiste na reao dos Ac presentes na amostra, com o Ag fixo superfcie de
poliestireno da microplaca, onde num primeiro passo h uma reao Ag-Ac e um
tempo de incubao. As imunoglobulinas no ligadas nesta reao so eliminadas
durante um processo de lavagens, onde, posteriormente, aps a adio do
conjugado, h novamente um tempo de incubao. A globulina anti-humana
conjugada com uma enzima vai reagir com o complexo Ag-Ac formado
anteriormente. Procede-se novamente s lavagens e a globulina que no se fixou
ao complexo eliminada nesta etapa. H a adio do substrato, mais tempo de
incubao, e o conjugado que contm a enzima, reage originando uma reao de
cor azul. adicionado uma soluo de paragem e a reao de cor azul altera-se
para amarelo quando positivo. Quando no h reao Ag-Ac (no primeiro
passo) a amostra negativa e no h cor no poo. Por fim, feita a leitura por um
espetrofotmetro a um comprimento de onda de 450/620 nm.
67
Imunofluorescncia
A Imunofluorescncia aplicada tambm para a deteo de Ac e/ou Ag. Na
seco de Serologia utilizou-se dois tipos de imunofluorescncia:
Imunofluorescncia indireta: consiste na pesquisa de Ac marcados em que
a reao imunolgica baseia-se em duas etapas;
Imunofluorescncia direta: consiste na pesquisa de Ag por uma s reao
imunolgica (1 s Ac) que habitualmente a lmina visualizada num
microscpio de fluorescncia.
Os Ac so marcados com fluorescena, quer na imunofluorescncia direta, quer
na indireta, que, sob uma radiao ultravioleta, emitem uma luz verde (cor de
ma). A imunofluorescncia direta a mais utilizada na seco, pelo
equipamento Ap 22.
ELFA
Ainda nos mtodos serolgicos automatizados, usado tambm um equipamento
VIDAS, baseado na Tcnica ELFA, a qual associa o mtodo imunoenzimtico
sanduche em duas etapas, com uma deteo final em fluorescncia. Esta tcnica
realizada no VIDAS (testes de rubola e de Citomegalovrus).
Quimioluminescncia
Tambm utilizado o equipamento LIAISON que usa a tecnologia de
quimioluminescncia:
Principio:
Consiste numa fase slida, composto por partculas magnticas, onde fixam-se os
Ag. Numa primeira etapa d-se a reao Ac-Ag, numa segunda fase junta-se o
conjugado (Ac monoclonais de ratinho anti-IgG humana conjugado com um
derivado do isoluminol). O reagente iniciador induz uma reao de
quimioluminescncia (emisso dum sinal luminoso), em que o sinal luminoso e
por conseguinte a quantidade de conjugado anticorpo-isoluminol e medido por
um fotomultiplicador em unidades relativas de luz (RLU).
68
Nota: Todos estes reagentes e procedimentos so fornecidos pelas casas
comerciais que obedecem a protocolos de validao e controlos de qualidade
interno. So fornecidos controlos positivos, negativos e, para cada reagente
utilizado, so fornecidos valores de cut-off para interpretao dos resultados.
A execuo das tcnicas tem de ser feitas de forma rigorosa (os critrios e
normas propostas para execuo dos testes, manuteno, conservao dos
reagentes) para uma boa e correta interpretao dos resultados.
II- 2.2- Metodologia manual
No diagnstico serolgico, para alm dos ensaios mencionados anteriormente,
utilizou-se as tcnicas manuais (as reaes de aglutinao e as reaes de
hemaglutinao).
Reaes de aglutinao
Baseiam-se na agregao de partculas (latex, eritrcitos, bactrias) que tm na
sua superfcie o Ag, quando em contacto com os Acs especficos presentes no
soro do doente. Estas provas de aglutinao so usadas na deteo de Ag em
soro, LCR, urina, LBA (por ex. na pesquisa do Cryptococcus neoformans).
Outro exemplo de reao de aglutinao o teste de Rosa Bengala (Brucella) que
consiste num teste rpido para a deteo de Ac aglutinantes anti-brucella no soro
(teste de despiste). O mtodo consiste num mtodo em carto que deteta Ac
aglutinantes, utilizando clulas de Brucella inativada, coradas com rosa bengala e
suspensa num tampo cido. O pH cido da suspenso impede a aglutinao no
especfica das bactrias. Nesta reao so detetados Ac aglutinantes das classes
IgA, IgM e IgG. A suspenso bacteriana (suspenso antignica) vem corada para
facilitar a interpretao dos resultados.
Reaes de hemaglutinao
Utilizou-se por e.g. no serodiagnstico da distomatose (fascola heptica) e
treponema pallidum hemaglutination assay (TPHA). Esta reao opera-se em
microplacas (poos com fundo em U). So utilizadas hemcias de carneiro
69
sensibilizadas, cobertas com o Ag da fascola e no TPHA- hemcias de galinha
sensibilizadas e estabilizadas com Ags solveis de Treponema pallidum. A
presena de anticorpos faz com que haja uma aglutinao de hemcias, que tem
um aspeto de vu uniforme (acastanhado ou avermelhado) que cobre o poo. A
ausncia de Acs especficos faz com que as hemcias se sedimentem no fundo do
poo, assumindo a forma de boto compacto. Usa-se um controlo do soro num
dos poos, com hemcias no sensibilizadas (excluir interferncias de outras
aglutininas assegurando a especificidade da reao).
Utilizaram-se tambm as tcnicas do ttulo de Antiestreptolisina O (ATPO -
Estreptococcus A), para a sfilis os testes rapid plasma reagin (RPR) e venereal
disease research laboratory (VDRL) (teste de screening) e o TPHA para o teste
confirmatrio, a reao de Paul Bunnel para o vrus Epstein Barr (mononucleose
infeciosa) e a reao de Waller Rose para a artrite reumatoide.
II- 3- Testes serolgicos realizados na Serologia
Os testes analticos realizados com mais frequncia na seco so demostradas na
tabela IX.
Tabela IX: Testes realizados na seco de Serologia com a respetiva metodologia.
Mtodo Testes
ELISA
Enterovrus; Adenovrus; Vrus Influenza A e B; Parainfluenza 1,2 e 3;
Vrus Sincicial Respiratrio; Parvovrus B19; Vrus Epstein Barr (anti-
VCA e anti-EBNA); Mycoplasma pneumoniae; Clamydia trachomatis;
Aspergillus spp.; Helicobacter pylori e Leptospira spp.
ELFA Toxoplasma, Toxoplasma, Rubola, Citomegalovrus e Herpes Simplex 1 e
2.
Aglutinao
Reao de Paul- Bunnell (anticorpos heterfilos do vrus EBV); Anti-
estreptolisina O (TASO) do Strepto -hemoltico do grupo A; Reao de
Rosa Bengala (pesquisa de Ac anti-Brucella); Treponema pallidum pelo
teste no treponmico RPR.
Hemaglutinao Treponema pallidum pelo teste treponmico (TPHA); Aspergillus
fumigatus; Fascola heptica e o Echinococcus.
Pesquisa de Antignios Strepto -hemoltico do grupo B (soro e urina); Cryptococcus neoformans.
70
II- 4- Interpretao e validao das provas serolgicas
Os resultados destes testes, tais como outros realizados em outras valncias do
SPC, devero ser valorizados em conjunto com a informao clnica e com o
resultado de outros meios complementares de diagnstico.
Em geral, so tidas em conta as principais imunoglobulinas, a IgG e a IgM. As
IgM surgem logo no incio da resposta humoral, podem persistir aps a doena
aguda (de 2 meses at um ano) e com o passar da infeo so substitudas pelas
IgG. A imunoglobulina IgA surge muito cedo na fase aguda da doena. Esta
imunoglobulina tem aplicao no diagnstico de algumas infees o que permite
fazer diagnstico serolgico mais precoce.
Estes anticorpos especficos surgem na 1 a 2 semana, aps o contato com os
antignios do agente infecioso, atingindo e evoluindo para um valor mximo, que
depois desce para valores basais, nem sempre detetveis.
Na interpretao e na validao dos resultados serolgicos, necessrio
distinguir uma infeo antiga de uma infeo primria. Os critrios de infeo
primria consistem num aumento de 2 vezes ou mais de ttulo de IgG, h
presena de IgM (podem persistir at um ano) possvel visualizar a
seroconverso (inexistncia de Ac na amostra anterior). Na infeo antiga, a
quantidade de Ac residuais no se altera ao longo do tempo, e na reinfeo
normalmente s h um aumento acentuado das IgGs.
Na interpretao da evoluo do ttulo de Acs:
Se as duas colheitas apresentam uma subida exponencial, significa que a
infeo muito recente (titulo ainda a subir). Caso o ttulo seja igual ao
anterior doseado (1 soro) ou apresente uma descida significa, indica uma
infeo antiga, ou seja, houve contacto com o agente infecioso em estudo,
mas no h relao com a situao presente.
A ausncia de um aumento significativo do nvel de Ac no exclui a
possibilidade de infeo. As amostras colhidas numa fase precoce no
decurso duma infeo podem no apresentar nveis de IgG detetveis.
Nestes casos, recomenda-se a realizao de teste para IgM ou obteno de
71
uma 2 amostra decorridos 14 a 21 dias que dever ser testada em paralelo
com a amostra original.
No recm-nascido tambm poder haver dificuldade na interpretao dos
testes serolgicos, devido presena da IgG da me e da imaturidade do
sistema imune. Neste caso se dever pesquisar os Ac nucleicos para o
diagnstico correto.
Consideraes
- A evoluo do ttulo de Ac entre duas colheitas espaadas no tempo pode
avaliar a sua possvel relao com a doena aguda que queremos diagnosticar.
- Os Ag utilizados no teste podem ser comuns a outros organismos e que por isso
podemos ter resultados falsos positivos por reaes cruzadas.
- As reaes cruzadas surgem quando os testes so muito sensveis mas pouco
especficos. Devem ser confirmados por outros mais especficos.
- A 1 colheita pode ser muito precoce levando a falsos negativos. importante
considerar os imunocomprometidos que no respondem s infees com nveis
de Ac detetveis.
Em suma, a altura da colheita, a evoluo da doena, a especificidade e classe
das imunoglobulinas e a avaliao da evoluo dos ttulos de Ac ao longo do
tempo so consideraes importantes a reter aquando na validao e
interpretao dos resultados.
II- 5- Controlo de qualidade interno e externo na Serologia
O controlo de qualidade interno na Serologia feito a partir dos controlos das
casas comerciais, seguindo rigorosamente o recomendado.
No controlo de qualidade externo realizou-se o Programa Nacional de Avaliao
Externa de Qualidade do Instituto Nacional Ricardo Jorge (PNAEQ-INSA).
72
III- Parasitologia e Urinas tipo II
A seco de Parasitologia e Urinas do SPC completamente automatizada, com
a exceo da pesquisa de parasitas nas fezes, que feita por microscopia tica.
Nesta seco executou-se as seguintes anlises: pesquisa de sangue oculto nas
fezes, a anlise sumria da urina (Urianlise), pesquisa de parasitas nas fezes
(pesquisa de Giardia lamblia) e na urina.
III- 1- Pesquisa de sangue oculto
A quantidade de hemoglobina presente nas fezes aumenta com alguns tipos de
patologias que vm associadas a leses hemorrgicas no intestino. A
determinao da quantidade de hemoglobina nas fezes um mtodo eficaz para
analisar precocemente o diagnstico e tratamento em patologias como o cancro
do clon.
A amostra de fezes dever ser colhida durante os 3 dias consecutivos e anteriores
anlise (so 3 amostras por paciente para aumentar a probabilidade de encontrar
sangue, caso exista).
A pesquisa de sangue oculto nas fezes feita por um equipamento OC-Sensor em
que o princpio do mtodo baseia-se numa reao de aglutinao-ltex:
Princpio
Um reativo ao ltex prepara-se sensibilizando partculas de ltex de poliestireno
com anticorpos anti-HbA
o
humana. Quando este reativo se mistura com a
amostra, os anticorpos anti-HbAo humana ligadas as partculas do ltex reagem
com a hemoglobina da amostra. A mudana na absorvncia por unidade de
tempo resultante da reao de aglutinao-ltex proporcional concentrao
da hemoglobina na amostra. Os resultados obtidos so analisados por uma curva
de calibrao dose-resposta da unidade de absorvncia frente concentrao. A
concentrao de hemoglobina na amostra do paciente determina-se a partir desta
curva dose-resposta.
So cerca de 3000 amostras por ms, em que so pedidas a anlise de pesquisa de
sangue oculto nesta seco.
73
III- 2- Exame parasitolgico nas fezes
Na pesquisa de parasitas nas fezes, que so cerca de 220 amostras por ms,
utilizado um mtodo de concentrao, o Easy-Copros
, de modo a facilitar a
pesquisa. Esta tcnica aumenta o nmero de cistos, trofozotos, ovos ou larvas na
preparao, elimina a maior parte do material orgnico fecal (resduos) e
apresenta o organismo inalterado, de forma a serem facilmente identificados.
Princpio
As tcnicas de concentrao esto divididas em dois tipos principais, a flutuao
e sedimentao. As tcnicas de flutuao usam solues de densidades
especficas superiores s dos ovos e cistos (normalmente sulfato de zinco ou
acar de Sheather) separando-os dos resduos fecais, permitindo que os ovos e
os cistos se concentrem superfcie do tubo e a maior parte dos resduos
depositados no fundo do tubo. As tcnicas de sedimentao usam uma ao
reserva, fazendo com que os ovos e os cistos concentrem-se no fundo do tubo e a
maior parte dos resduos fecais no topo, de forma a serem removidos. As tcnicas
de sedimentao so as recomendadas para diagnstico laboratorial porque so
fceis de executar e menos sujeitas a erros tcnicos.
A Easy-Copros um dispositivo que tem por base o mtodo de sedimentao por
centrifugao de Ritchie (mtodo de sedimentao), simplificado, com a
finalidade de concentrar ovos e cistos de parasitas das amostras fecais para
posteriormente identificar.
No decorrer do estgio, observou-se os seguintes parasitas: Trichuris trichiura,
Taenia spp., Entamoeba coli e a Giardia intestinalis nas fezes e o Oxyorus na
urina (contaminao fecal). A maior parte destes parasitas transmitida por m
higienizao das mos, contaminadas com ovos do solo e so acidentalmente
ingeridos em alimentos mal confecionados (carne crua- Taenia spp.).
A Giardia intestinalis ou Giardia lamblia um protozoria flagelado patognico
encontrado no duodeno e no jejuno dos seres humanos. H indivduos totalmente
assintomticos que possuem este parasita (cistos) em grande nmero nas fezes
mas em contrapartida existem outros indivduos cuja presena deste parasita
74
fixado parede intestinal pode causar irritao e infeo da mucosa do duodeno
ou do jejuno que consequentemente ir provocar diarreia, aguda ou crnica,
associada a hipertrofia das criptas, atrofia das vilosidades e leso nas clulas.
Pesquisa da Giardia lamblia
A Giardia lamblia pode ser pesquisada por uma tcnica rpida, que consiste na
utilizao de tecnologia de membrana com ouro coloidal.
Princpio da tcnica:
Uma membrana de nitrocelulose sensibilizada com um Ac dirigido contra os
quistos da Giardia lamblia. A especificidade garantida por um anticorpo
especfico aos antignios da membrana do quisto da Giardia lamblia e que se
conjuga com o ouro coloidal. Este conjugado seco numa membrana. A amostra
por sua vez tem que ser diluda no tampo de diluio fornecido com o teste.
Quando a fase lquida da suspenso fecal entra em contato com a tira, o
conjugado solubilizado migra com a amostra por difuso passiva e o conjugado e
amostra entra em contacto com o Ac anti-Giardia adsorvido na nitrocelulose. Se
a amostra contiver quistos de Giardia lamblia, o complexo conjugado-quisto
permanece ligado ao reagente anti-Giardia e aparece uma linha vermelha. A
soluo continua a migrar at encontrar um controlo que confirma o correto
funcionamento do teste.
III- 3- Urianlise (Urinas Tipo II)
A urianlise o estudo da urina no assptica, que consiste num estudo
bioqumico por tiras reativas, e no estudo citolgico pelo sedimento urinrio.
Consiste numa anlise de screening de doena renal para os utentes no geral.
feito uma primeira avaliao macroscpica, que inclui a avaliao do parmetro
da cor, a avaliao bioqumica, com o estudo de alguns parmetros bioqumicos,
(e.g. glucose) por fim, a observao do sedimento urinrio ao microscpio para a
visualizao dos elementos figurados.
um teste rotineiro, simples e barato. Nesta seco, a urianlise encontra-se
completamente automatizada, o equipamento SediMax, desde a anlise
75
bioqumica, centrifugao e a visualizao do sedimento por fotografias de
imagens do sedimento (cmara digital incorporada que tira 15 fotografias por
cada urina que possvel visualizar como se fossem 10 campos visuais do
microscpio).
III- 3.1- Anlise bioqumica
A anlise bioqumica consiste em tiras reativas, que esto impregnadas por
reagentes bioqumicos. A tira reativa ao entrar em contato com a urina vai fazer
com que haja reaes e envolvimento de cor, que depois so avaliados numa
escala.
So analisados os seguintes parmetros: a glicose; as protenas; a bilirrubina; o
urobilinognio; o pH; o sangue; os corpos cetnicos; os nitritos; leuccitos.
necessrio ter em conta a idade do doente, o sexo, dieta e exerccio fsico. A
presena de glicose na urina denomina-se glicosria, que poder tratar-se de
diabetes mellitus ou no, no caso das grvidas.
A bilirrubina existe sob duas formas, conjugada e no conjugada, mas apenas a
conjugada solvel em gua, logo a bilirrubinria significa a presena de
bilirrubina conjugada na urina. Isto acontece quando a circulao enteroheptica
interrompida por mecanismos de obstruo o que resulta em elevados nveis de
conjugada na circulao sistmica e que, por sua vez, excretada.
O urobilinognio avaliado juntamente com a bilirrubina (produtos de excreo).
O pH varia consoante a dieta, a ingesto de frmacos. A presena de cristais
surge na variao do pH.
As cetonas so produtos dos cidos gordos. O aparecimento das cetonas pode
indicar uma diabetes descontrolada (cetoacidose), no alcoolismo, em jejum
prolongado e vmitos.
As protenas elevadas so indicadores de uma m excreo por parte do rim, leva
ao aumento da produo e pode aparecer em situaes no patolgicas, como o
excesso de exerccio fsico ou em situaes patolgicas, como por exemplo, no
mieloma mltiplo.
76
O sangue na urina (hematria) pode ocorrer em situaes como na ITU,
contaminao menstrual no caso das mulheres ou em casos neoplsicos, bexiga/
prstata. No caso da tira positiva ser forte e no for visualizado eritrcitos no
sedimento porque se trada de mioglobina e no de hemoglobina.
Os nitritos dependem da converso de nitratos (da dieta) para nitritos pela ao
redutora das bactrias (caso estejam presentes) na urina. Um resultado positivo
indica a presena de bactrias, logo uma possvel infeo.
Os leuccitos na urina sugerem a presena de uma ITU.
Estas tiras reativas (URIFLET S
:
AutoMate Sample Processing System
o
Centrifugao; determinao do nvel de soro mnimo para a realizao de
alquotas; mdulo de descapsulao; execuo de alquotas para as
seces de Serologia, Imunologia e Hormonologia e sua etiquetagem;
o Separao de amostras (tubos primrios e alquotas) para as vrias seces
do servio, assim como para o servio de imunohemoterapia;
o Separao das amostras destinadas seco de hematologia de acordo
com os parmetros a analisar (hemograma, VS e hemoglobina glicada).
Cadeia robtica
o Mdulo de entrada
102
Unidade Inlet (entrada de amostras no sistema informtico
do laboratrio)
Unidade Outlet (para separao de amostras rejeitadas);
o Centrfuga;
o Descapsulador;
o Analisador automatic UniCel DxI 800 (Hormonologia);
o Analisador automatic Dxi Au 5400 (Bioqumica analtica);
o Recapsulador;
o Armazenador frigorfico para amostras;
o Mdulo de sada
Unidade outlet (para amostras com parmetros analticos a
determinar fora da cadeia robtica).
Rotina
Quando as amostras chegam seco (aps terem passado pela triagem do SPC),
so colocadas em racks do automate: com centrifugao ou sem centrifugao
(Imunologia, Serologia, Hematologia, Imunohemoterapia) e robtica
(Bioqumica e Hormonologia). Insere-se as duas primeiras no automate e a
ltima na cadeia robtica. Esta ltima colocada na cadeia robtica se as
amostras tiverem somente pedidos de parmetros que se realizem nos aparelhos
da cadeia.
O equipamento automate faz tambm a separao para uma rack especfica de
amostras que no obedeam aos critrios definidos para a sua colocao na
cadeia robtica, tais como tubos peditricos, amostras com quantidade de soro
insuficiente ou alquotas. No final da anlise, os tubos so armazenados no
armazm refrigerado, atravs da seleo automtica da cadeia robtica.
A fase pr-analtica uma das fases suscetvel de maior nmero de erros
analticos na marcha laboratorial.
Esta automatizao (LabCore) do SPC traz muitas vantagens, nomeadamente:
- reduz a exposio do tcnico ao risco biolgico;
- permite padronizar as vrias etapas e atividades da fase pr-analtica;
103
- reduz o tempo de manipulao das amostras (preparao das amostras,
alquotas e etc.);
- diminuio da ocorrncia de erros;
- permite visualizar o trajeto da amostra (rastreabilidade da amostra).
V- 2.1- Equipamento automatizado e mtodo
A tabela seguinte mostra os testes e a respetiva metodologia executadas no
equipamento Dxi Au5400.
Tabela XIII: Testes realizados na seco de Bioqumica .
Testes Metodologia Interesse
Glucose Ensaio enzimtico (mtodo de
hexoquinase)
Diabetes; Defeitos
congnitos enzimticos
Bilirrubina direta
Ensaio colorimtrico
Funo heptica
Bilirrubina total
Albumina Funo heptica e renal;
Perturbaes metablicas e
nutricionais.
Protenas totais
2-microglobulina
Imuno-turbidimtrico
Patologias renais,
oncolgicas, auto-imunes,
infees bacterianas e
vricas
Ck (creatinina quinase) Ensaio enzimtico com imuno-inibio
Funo cardaca
Ck-mb (creatinina quinase
miocrdio)
Teste de imuno-inibio enzimtica
AST (Aspartato
aminotransferase)
Ensaio enzimtico cintico
Funo Heptica e
Cardaca
ALT (Alanina
aminotransferase)
Funo Heptica
104
Testes Metodologia Interesse
ApoB (Apolipoprotena B) Imuno-turbidimtrico
Avaliao cardiovascular
Perfil lipdico
Colesterol Total Ensaio enzimtico colorimtrico
LDL
HDL
Triglicridos Ensaio enzimtico colorimtrico
Ureia Ensaio enzimtico cintico
Funo renal
Creatinina Mtodo de Jaff (cintico colorimtrico)
Microalbumina Ensaio imuno-turbidimtrico
Magnsio Ensaio colorimtrico - mtodo direto no
qual os ies de magnsio formam um
complexo colorido com azul de xilidil
numa soluo fortemente bsica.
cido rico Ensaio enzimtico colorimtrico Doena renal e Gota
Fosfatase alcalina Ensaio cintico
colorimtrico
Funo heptica e
Metabolismo sseo
Amnia Ensaio enzimtico Insuficincia renal;
Acidoses tubulares;
Insuficincia hepatocelular
Ferro
Ensaio colorimtrico
Anemias
Fsforo inorgnico Aporte nutricional
GT (gama-glutamil
transferase)
Ensaio cintico
colorimtrico
Funo heptica
Lactato Ensaio enzimtico colorimtrico Hipoxia e distrbios
metablicos
LDH- Lactato
Desidrogenase
Ensaio enzimtico cintico
Enzima inespecfica
(heptica, msculo
cardaco, sistema msculo-
esqueltico, doenas
Hemato-oncolgicas: e.g.
testculos, linfomas e
leucemias
Protena C-reativa Ensaio de imuno-turbidimtrico Processo inflamatrio
agudo
Transferrina Ensaio de imuno-turbidimtrico Anemias
Sdio
Potssio e Cloro
Potenciometria indireta
Funo Hidro-electroltica
Funo renal
105
V- 2.2- Urina de 24h
A colheita de urina de 24h constitui uma parte importante do exame. Se o
volume de urina colhida muito reduzido, necessrio repetir a colheita.
- O incio da colheita dever dar-se referencialmente pela manh, desprezando-
se a primeira mico;
- A partir da, dever colher a urina de todas as mices que se seguirem
durante as 24 horas, se possvel diretamente para o recipiente, sem perder
qualquer quantidade de urina;
A ltima mico dever ser rigorosamente mesma hora em que iniciou a
recolha no dia anterior, neste exemplo s 8 horas da manh seguinte;
A urina desta ltima mico deve ser, totalmente vertida no recipiente de
colheita;
- Se verificar que o frasco de 2L fornecido no suficiente para guardar toda a
sua urina de 24 horas, pode colocar o excesso de urina numa garrafa de gua
de 1,5 litros, limpa e seca.
- Durante o perodo de colheita da urina de 24 horas, o(s) recipiente(s) devero
Testes Metodologia Interesse
Clcio Ensaio colorimtrico Paratiride; Doenas
sseas; Doena renal
crnica; Urolitase e
Tetania
Adenosina desaminase
(ADA)
Mtodo colorimtrico cintico Diagnstico e
monitorizao de
tuberculose pleural e
peritoneal
Aldolase Ensaio enzimtico Doenas primrias do
sistema msculo-
esqueltico
Enzima conversora
Angiotensina (ECA)
Ensaio cintico Sarcoidose; Doena de
Gaucher; Lepra
Amilase Ensaio enzimtico colorimtrico
Patologia pancretica
Lipase Ensaio cintico colorimtrico
106
ser armazenados no frigorfico ou guardados em local muito fresco.
Interesse
Uma das principais indicaes para a utilizao deste tipo de amostra a
avaliao da diurese e funo renal. Neste sentido so determinados os seguintes
parmetros:
- medio do volume da urina;
- anlise bioqumica (uma amostra representativa): proteinria, microalbuminria
e a creatinria;
- clearance da creatinina.
A urina de 24 horas pode ser tambm utilizada para doseamentos de hormonas,
metabolitos ou outras substncias que so excretados na urina.
V- 2.3- Lquidos biolgicos
Na seco de Bioqumica, faz-se o estudo bioqumico dos lquidos biolgicos:
cefalorraquidiano e lquidos serosos - pleural, peritoneal, sinovial e pericrdico.
Para avaliar a citologia do lquido biolgico, efetuou-se uma contagem celular no
autoanalisador hematolgico COULTER LH 750. Se a contagem celular for
inferior a 300 (limite de deteo do analisador), realizada a contagem celular
manual em cmara de Neubauer. A contagem diferencial de clulas e a sua
avaliao morfolgica so realizados em lmina de citoesfregao corado com
colorao de Wright.
Na avaliao bioqumica so determinados, essencialmente, a glucose e as
protenas, teis no diagnstico diferencial entre exsudados e transudados (nos
lquidos serosos), assim como no diagnstico diferencial de meningite bacteriana
e viral (LCR), entre outras patologias que afetam o sistema nervoso central.
Pode haver interesse em determinar outros parmetros analticos, como por
exemplo: triglicridos (na suspeita de lquido quiloso) e adenosina desaminase
(ADA) (suspeita de tuberculose).
107
V- 2.4- Testes de diagnstico rpido
Para alm dos autoanalisadores, a seco possui testes de diagnstico rpido, o
teste de gravidez e o das drogas de abuso.
V- 2.4.1- Teste imunolgico de gravidez
Este teste consiste num teste de imunoensaio cromatogrfico (Nadal hCG
) que
permite a avaliao qualitativa rpida da hormona gonadotrofina corinica
humana (hCG) na urina.
Na membrana da rea do teste, esto fixados anticorpos ligados cadeia da
hCG; na membrana da zona de controlo esto fixados Acs de cabra anti- rato.
Durante o ensaio, a amostra misturada com partculas de ouro coloidal que
possuem sua superfcie Acs monoclonais com afinidade para a cadeia beta da
hCG. Com o resultado positivo, isto , com a presena de hCG, um conjugado
Ac hCG/ Ac - ouro surge, atravs da presena de uma linha de cor na zona do
teste. Se esta linha de cor no aparece na rea do teste, o resultado negativo.
Em ambos os casos (resultados positivo ou negativo), dever aparecer uma linha
de cor (na zona de controlo). Se esta no aparecer, o teste dado como invlido.
V- 2.4.2- Drogas de abuso
Utilizou-se um teste imunocromatogrfico (Drug-Sreen
Aglutinao
a aglomerao ou agregao de clulas ou partculas devido sua reao com
os Acs. Quando clulas ou partculas (ex. partculas de ltex) tm molculas de
Ag na sua superfcie, vo aglutinar ao reagirem com o Ac especfico. A
aglutinao representa um teste positivo. Uma variao do teste de aglutinao
117
a inibio da aglutinao. Nos testes de inibio, um resultado positivo
indicado pela ausncia de aglutinao.
Fixao do complemento
Trata-se de um mtodo sensvel para a deteo da reao Ag-Ac. No laboratrio
este mtodo aplicado para detetar Acs no soro do paciente. O teste de fixao
de complemento baseado na habilidade das protenas do complemento de
interagir com o Ac e o Ag especfico para causar lise. Esse teste feito em duas
partes, o sistema teste e o sistema indicador. No sistema de teste, o soro do
paciente e o Ag (viral, fngico) reage na presena do complemento. Se o Ac
especfico para o Ag estiver presente, ento o complemento fixado na reao
Ag-Ac e torna-se incapaz de reagir na segunda parte do teste. O sistema
indicador adicionado aos tubos, aps o soro, o complemento e o Ag terem
reagido. Um teste negativo indicado pela hemlise, que no pode ocorrer se o
Ac, na amostra, estiver ausente. A ausncia de hemlise um teste positivo,
indicando a presena de Acs no soro do doente.
Tcnica do anticorpo marcado
Os Acs podem ser marcados por molculas (marcadores). Essas molculas so
ligadas (conjugadas) aos Acs, possibilitando a visualizao da reao. Os
marcadores podem ser corantes, enzimas ou radioistopos. A ligao de
marcadores aos Acs no interfere com a capacidade dos Acs de se ligarem aos
Ags.
Ensaio imunoenzimtico
Envolve sempre um Ag, um Ac especfico para um Ag e um segundo Ac
conjugado a uma enzima. O teste permite a deteo de um Ac especial ou um Ag
na amostra do paciente.
Nota: as tcnicas podem ser quantitativas. Nesse caso, requerem diluies
seriadas de tubos para estimar a concentrao de imunoglobulinas para um dado
118
Ag especfico. A concentrao da imunoglobulina expressa em ttulo que o
recproco da ltima diluio que apresentou reao.
VII- 2.2- Equipamentos automatizados
Capillarys 2
O Capillarys 2 um sistema automatizado que consiste numa eletroforese
capilar, usado na electroforese das protenas sricas, utilizando tubos capilares
para mltiplas e simultneas separaes das seis fraes diferentes: albumina;
1-globulinas; 2-globulinas; 1-globulinas; 2-globulinas e as -globulinas.
Este equipamento permite realizar automaticamente todas as sequncias da
eletroforese, desde o tubo de colheita at a obteno do perfil electrofortico:
identificao da amostra; diluio da amostra; lavagem dos capilares; injeo da
amostra nos capilares; migrao; deteo; tratamento dos resultados e a sua
transmisso informtica dos resultados obtidos.
Esta anlise muito til na deteo de anomalias do perfil proteico.
Sebia
A imunofixao destina-se deteo de protenas, quando detetadas na
eletroforese das protenas. Estas apresentam-se sob a forma de bandas anormais
situadas nas zonas de ou globulinas.
A tcnica divide-se em 4 partes: separao; fixao e imunoprecipitao;
lavagem; colorao. As protenas so separadas por eletroforese em meio
alcalino, sendo depois imunoprecipitadas com antissoros monoespecficos. Os
antissoros usados so: anti-cadeias pesadas IgG, IgA e IgM e as anti-cadeias
leves e . Estes antissoros so colocados no gel em poos para a corrida
electrofortica juntamente com o soro a analisar, de modo a identificar de forma
qualitativa a natureza das bandas monoclonais. Em simultneo h uma corrida de
eletroforese srica a fim de orientar/avaliar na interpretao da imunofixao.
Aps a imunoprecipitao, as protenas que no esto ligadas so removidas por
lavagem e as que esto ligadas so coradas.
119
A existncia de gamapatias monoclonais detetada pelo aparecimento de uma
banda monoclonal, revelada por um antissoro de cadeia pesada e de cadeia leve.
Estas duas bandas tm que ser interpretadas em conjunto com a corrida
electrofortica srica na presena da banda monoclonal na zona das -globulinas.
Siemens BN Prospec
A nefelometria utilizada como mtodo, para o doseamento (anlise
quantitativa) de algumas protenas sricas, das imunoglobulinas IgG, IgA, IgM e
das subclasses IgG e das cadeias leves e cadeias leves livres e . Este mtodo
consiste na medio de luz dispersa a partir do feixe principal, por uma
determinada amostra. Esta tcnica baseia-se na reao de Acs especficos.
Forma-se um complexo, por ex. Ac-imunoglobulina, que dispersa a luz do feixe
incidente e a luz dispersa proporcional concentrao de imunoglobulina
presente no soro.
ImmunoCAP 250 da Phadia Sweden Diagnostics
O ImmunoCAP 250 permite efetuar o estudo dos alergnios atravs do
doseamento das IgEs especficas para um vasto painel de alergnios, utilizando
como metodologia o ensaio imunoenzimtico de fluorescncia. A reao produz
fluorescncia diretamente proporcional quantidade de IgE total ou especfica
existente na amostra.
Zenit RA- autoimunidade
Dependendo do tipo de anlise, o equipamento utiliza os princpios de medio,
por luminescncia ou absorvncia.
o Luminescncia
So utilizados subprodutos de steres de acridnio luminescentes como
marcadores de deteo. H uma reao de oxidao para uma forma excitada, em
que o regresso ao estado de estabilidade acompanhado pela emisso de luz, que
medida em unidade de luz relativa (RLU) pelo luminmetro (integrado no
autoanalisador). Os testes so executados usando o mtodo competitivo ou o
mtodo sandwich.
120
o Absorvncia
As amostras e os reagentes so aspirados de acordo com os parmetros validados
para cada teste e so transferidos para uma cuvete onde sero monitorizadas as
alteraes da absorvncia (densidade tica) durante cada reao em progresso.
As medies so executadas a um comprimento de onda especfico para a
anlise.
A pesquisa de Ac anti-dsDNA; Ac antinucleares; Ac anti-citoplasma dos
neutrfilos (MPO e PR3); Ac anti-gliadina IgA e IgG; IgE especficas; citrulina e
transglutaminase IgA so exemplos de alguns testes realizados no estudo da
autoimunidade no sector de Imunologia.
VII- 3- Anlises efetuadas na seco de Imunologia
Realizaram-se vrias anlises nesta seco de demonstradas na tabela seguinte.
Tabela XV: Testes realizados na seco de Imunologia com o respetivo equipamento.
Testes Equipamento Interesse
Proteinograma Capillarys 2 Perfil proteico
IgG, IgA, IgM Siemens BN Prospec Resposta imunitria
Imunofixao
Cadeias Leves Kappa e Lambda Siemens BN Prospec Gamapatias monoclonais
Imunofixao
C3
Siemens BN Prospec
Protenas do complemento
C4
1-antitripsina Enfisema pulmonar; Cirrose
heptica
Haptoglobina Protena de fase aguda
Ceruloplasmina Glicoprotena heptica que
assegura o transporte de cobre
no plasma. Diagnstico na
doena de Wilson.
Cadeias Leves e Cadeias Leves
livres Kappa e Lambda
Gamapatias monoclonais
121
Testes Equipamento Interesse
IgE Total ImmunoCAP Estudo dos alergnios
IgE especfica
ANA/ENA (screen)
Anticorpos anti: mitocrondiais, anticorpos
das clulas parietais gstricas, msculo liso
(e.g. de anticorpos anti-especfico)
Zenit RA
Autoimunidade
Nesta seco, no mbito dos estudos de autoimunidade, tambm se realiza a
pesquisa de auto-Acs por mtodo de imunofluorescncia indireta em clulas
Hep-2 e cortes de tecidos.
VII- 3.1- Teste de diagnstico rpido para a pesquisa da protena de
Bence-Jones
A protena de Bence Jones uma protena de cadeias leves (lambda ou kappa) de
imunoglobulinas, que se pode observar na urina em caso de mieloma mltiplo,
quando a imunoglobulina monoclonal est degradada em cadeias pesadas (que
no passam para a urina) em cadeias leves. Aparece na urina em 60 a 70% dos
casos de mieloma, sendo a sua presena de mau prognstico.
A seco executa um teste imuno-electrofortico rpido, que realizado a partir
de uma amostra de urina de 24 horas.
VII- 4- Controlo de qualidade interno e externo em Imunologia
Consiste essencialmente no controlo dirio (interno) e no controlo mensal
(externo) dos testes imunolgicos, feitos a partir das cartas de Levey-Jennings
(cartas de controlo de qualidade com regras padronizadas).
O controlo de qualidade interno efetuado com controlo das casas comerciais,
disponibilizados geralmente em 2 ou 3 nveis de concentrao. Nos analisadores
automticos utilizam-se, para a maioria dos parmetros, controlos Bio Rad,
tendo alguns parmetros controlos especficos.
No controlo de qualidade externo efetuado, o EQAS da Bio-rad e o NEQAS.
122
VIII- Bibliografia
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