Centrifugacin

1

La centrifugacin biolgica es un proceso que utiliza la fuerza centrfuga para separar y
purificar mezclas de partculas biolgicas en un medio lquido. Es una tcnica clave para
el aislamiento y anlisis de las clulas, fracciones subcelulares, complejos
supramoleculares y macromolculas aisladas, tales como protenas o cidos nuclicos.
Hoy, las tcnicas de centrifugacin representan una herramienta crtica para la bioqumica
moderna y se emplean en casi todos los estudios subcelulares invasivos. Mientras la
centrifugacin analtica se centra principalmente en el estudio de macromolculas
purificadas o conjuntos supramoleculares aislados, la metodologa de la centrifugacin
preparativa se dedica a la separacin real de los tejidos, clulas, estructuras subcelulares,
vesculas de membrana y otras partculas de inters bioqumico.
De la experiencia cotidiana, el efecto de la sedimentacin debido a la influencia del campo
gravitatorio de la Tierra comparado al tasa de sedimentacin mayor en un campo
centrfugo es evidente. Las estructuras biolgicas presentan un aumento drstico en la
sedimentacin cuando se someten a la aceleracin en un campo centrfugo. El campo
centrfugo relativo se expresa generalmente como un mltiplo de la aceleracin debido a
la gravedad.
En el diseo de un protocolo de centrifugacin, es importante tener en cuenta que:
Cuanto ms densa es una estructura biolgica, ms rpido se sedimenta en un
campo centrfugo.
Si una partcula biolgica es ms masiva, ms rpido se mueve en un campo
centrfugo.
Entre ms denso es el sistema buffer, ms lenta es el movimiento de la partcula
en un campo centrfugo.
Cuanto mayor sea el coeficiente de friccin, ms lento es el movimiento de una
partcula.
Cuanto mayor es la fuerza centrfuga, ms rpido se sedimenta de la partcula.
la velocidad de sedimentacin de una partcula ser cero cuando la densidad de la
partcula y el medio circundante son iguales.
Las partculas biolgicas que se desplazan a travs de un medio viscoso experimentan un
arrastre por friccin, mediante el cual acta una fuerza de friccin en la direccin opuesta
a la sedimentacin y es igual a la velocidad de la partcula multiplicada por el coeficiente
de friccin. El coeficiente de friccin depende del tamao y la forma de la partcula
biolgica. Como la muestra se mueve hacia la parte inferior de un tubo de centrfuga, su
velocidad aumentar debido al aumento de la distancia radial. Al mismo tiempo, las

1
(Wilson & Walker, 2010)
partculas tambin se encuentran con una resistencia de friccin que es proporcional a su
velocidad. La fuerza de friccin de una partcula que se mueve a travs de un fluido
viscoso es el producto de su velocidad y su coeficiente de friccin, y acta en la direccin
opuesta a la sedimentacin.
De la ecuacin que describe el clculo del campo centrfugo relativo se hace evidente que
cuando se describen las condiciones para la separacin centrfuga de una partcula
biolgica, una lista detallada de la velocidad del rotor, dimensiones radiales y la duracin
de la centrifugacin tiene que ser proporcionada. Esencialmente, la tasa de sedimentacin
es dependiente del campo centrfugo aplicado (cm*s
-2
), , que se determina por la
distancia radial, , de la partcula desde el eje de rotacin (en cm) y el cuadrado de la
velocidad angular, , del rotor (en radianes por segundo):

La velocidad angular media de un cuerpo rgido que gira alrededor de un eje fijo se define
como la relacin entre el desplazamiento angular en un intervalo de tiempo dado. Un
radin, por lo general abreviado como 1 rad, representa el ngulo subtendido en el centro
de un crculo por un arco con una longitud igual al radio del crculo. Desde es igual a
radianes, una revolucin del rotor se puede expresar como rad. De acuerdo con
ello, la velocidad angular en radianes por segundo del rotor se puede expresar en
trminos de la velocidad del rotor como:

y por lo tanto el campo centrfugo se puede expresar como:

En una suspensin de partculas biolgicas, la tasa de sedimentacin es dependiente no
slo del campo centrfugo aplicado, sino tambin de la naturaleza de la partcula, es decir,
su densidad y el radio, y tambin la viscosidad del medio circundante. Ley de Stokes
describe estas relaciones para la sedimentacin de una partcula esfrica rgida:

Donde es la velocidad de sedimentacin de la esfera,

es el factor de forma constante

para una esfera, es el radio de la partcula,

es la densidad de la partcula,

es la
densidad del medio, es la aceleracin de la gravedad y es la viscosidad del medio.
Por consiguiente una mezcla de partculas biolgicas que presentan una forma
aproximadamente esfrica se puede separar en un campo centrfugo en base a su
densidad y/o su tamao. El tiempo de sedimentacin (en segundos) para una partcula
esfrica es:

Donde es el tiempo de sedimentacin, es la viscosidad del medio,

es el radio de la
partcula,

es la distancia radial desde el centro de rotacin a la parte inferior del tubo,

es la distancia radial desde el centro de rotacin al menisco lquido,

es la densidad de
la partcula,

es la densidad del medio y es la velocidad angular del rotor.

La velocidad de sedimentacin o la velocidad de una partcula biolgica tambin se
pueden expresar su coeficiente () de sedimentacin, segn el cual:

Diafiltracin:
Es una extensin de la ultrafiltracin, en donde se utilizan membranas semipermeables
para separar solidos suspendidos y solutos de alto peso molecular (protenas en nuestro
caso) del agua y otros solutos de bajo peso molecular. En la diafiltracion se aade agua a
la corriente de rechazo, aquella que no atraviesa la membrana, para despus ultrafiltrar
nuevamente con el fin de bajar an ms la concentracin de los solutos permeables.
La diafiltracion puede ser de forma discontinua (DD) o continua (CD):
Diafiltracion discontinua: Los solutos permeables son eliminados de la corriente de
alimentacin, posteriormente se disuelve la corriente rechazada con agua para despus
reultrafiltar, de esta forma en etapas repetitivas hasta alcanzar la concentracin deseada.

CONCENTRACION
PERMEADO
DILUCION C/AGUA
PERMEADO
RE-
CONCENTRACION
MEMBRANA





Diafiltracion contina: Se mantiene un volumen constante a medida que se agrega agua a
las condiciones apropiadas de Ph y temperatura a la misma razn que la corriente de
permeado. Con lo cual la concentracin de solutos permeables disminuir de manera
exponencial como sigue en la expresin:

Dnde:
CR= concentracin de solutos en la corriente
de rechazo
CP= concentracin de solutos en el
permeado
C0= concentracin inicial de solutos
Vd= relacin entre volumen de lquido
permeado (Vp) y el volumen inicial (V0)



Filtracin Frontal (Dead End):
Es el tipo de filtracin ms simple, la direccin del fluido es normal al filtro por lo que se
genera una acumulacin del material retenido sobre el filtro. La principal ventaja que
presenta es que se recupera casi todo el material filtrado pero debido a la acumulacin el
filtro debe ser limpiado o remplazado con alta frecuencia.
Es utilizado debido a su simplicidad cuando la
concentracin de partculas que deben ser removidas es
baja. En el proceso de produccin de insulina este
mtodo de separacin se usa para eliminar los residuos
que quedan posteriores a la diafiltracin para proteger el
equipo de cromatografa de la entrada de partculas no
deseadas tales como residuos de biomasa, debris y
cuerpos de inclusin.
La filtracin se basa en la velocidad de flujo a travs de un medio poroso que
bsicamente se define como la relacin entre la fuerza impulsora, que puede ser la
gravedad o una diferencia de presin y la resistencia del medio poroso y de la torta de
solido que se forma sobre el filtro.
Fuente:
http://en.wikipedia.org/wiki/Filtration
La resistencia en el medio poroso se ve determinada por el paso irregular del fluido por
los canales del medio poroso y la torta, por lo que se pude aplicar la ley de Hagen-
Poiseuille

En esta Ley se relaciona la velocidad del fluido por unidad de tiempo y unidad de rea con
la fuerza impulsora que se representa por la cada de presin sobre el producto de la
viscosidad y la resistencia de a torta y el medio filtrante. La resistencia de la torta est
dada por el peso sobre el rea de la misma y una constante caracterstica. Esta constante
est dada en funcin de la presin y la resistencia especifica de la torta que depende del
tamao de las partculas que conforman la torta.


Rotoevaporavor
2

Los rotoevaporadores son un dispositivo comn en la mayora de los laboratorios
universitarios. Su propsito principal es eliminar el disolvente despus de un reflujo, tal
vez antes de la cristalizacin de un producto de reaccin.
Para operar el evaporador, se coloca la solucin de reaccin en un matraz de fondo
redondo, mientras que la presin dentro del evaporador se reduce a alrededor de

.
Se hace entonces girar el matraz. El disolvente se evapora ms fcilmente a esta baja
presin que a la

. El disolvente eliminado bajo vaco es atrapado por un condensador

y se recoge para su reutilizacin fcil, o la eliminacin de una manera ambientalmente
responsable
Pero las molculas necesitan energa para que puedan salir de la solucin durante la
ebullicin. La energa proviene de la solucin. La temperatura de la solucin tiende a
disminuir rpidamente si no hay un suministro externo de energa disponible, esto debido
a la disminucin en la presin. De hecho, la solucin se congelara durante la
evaporacin, para evita esto el matraz que rota est normalmente sumergido en un bao
de agua tibia.
Una atmsfera de vapor siempre se encuentra por encima de un lquido as este sea puro,
parte de una mezcla, o tiene soluto disuelto en l. La presin que produce esta fase
gaseosa se llama la presin de vapor. La presin de vapor aumenta con el aumento de la
temperatura hasta que, en el punto de ebullicin

, esta iguala la presin externa por

encima del lquido. La evaporacin se produce a temperaturas por debajo de

, y slo
por encima de esta temperatura la presin de vapor puede superar la

. La presin

2
(Monk, 2004)
aplicada en un rotoevaporador es inferior a

y, por lo tanto la presin de vapor del

disolvente puede superar la presin aplicada (y que el lquido hierva) a temperaturas
inferiores a

.
Se observa como la disminucin de la presin produce la ebullicin del disolvente a una
temperatura ms baja que a su temperatura de ebullicin normal (a 1 bar), es decir, si la
presin externa fuera de

. Tal destilacin al vaco es deseable, porque una

temperatura de ebullicin ms baja disminuye el grado en que los compuestos se
degradan.
El transporte de masa en un rotoevaporador no es muy diferente al que se da en una
evaporacin al vacio.
Evaporacin al vacio
3

La saturacin o presin de vapor de equilibrio de un material se define como la presin de
vapor de ese material en equilibrio con la superficie slida o lquida, en un recipiente
cerrado. En el equilibrio, igual cantidad de tomos dejan y retornan a la superficie, de tal
manera que la presin de vapor de equilibrio de un elemento se puede estimar como:

Donde

es el calor molar de vaporizacin, es la constante de los gases, es la

temperatura, y es una constante.
La evaporacin de los compuestos es ms complicado, como compuestos pueden
someterse a reacciones qumicas tales como la pirlisis, la descomposicin y la
disociacin, la composicin del vapor resultante a menudo pueden diferir de la
composicin de origen durante la evaporacin a temperaturas elevadas. Cabe sealar
que, a medida que un material se calienta, los primeros componentes a ser volatilizados
son los contaminantes de alta presin de vapor en la superficie, los gases absorbidos, y
las impurezas de alta presin de vapor.
Un material se vaporiza libremente de una superficie cuando el material vaporizado sale
de la superficie sin colisiones por encima de esta. La tasa de vaporizacin libre a travs
de la superficie es proporcional a la presin de vapor, y est dada por la ecuacin de
vaporizacin de Hertz-Knudsen:

Donde es el nmero de tomos que se evaporan por cm
2
de rea de superficie,

es
el coeficiente de pegado para las molculas en la superficie, es la presin de vapor del
material a la temperatura , es la presin del vapor por encima de la superficie, es la

3
(Chi, 2010)
constante de Boltzmann, es la temperatura absoluta, y es la masa del material
vaporizado.
Columnas de afinidad
4

Los mtodos tradicionales de purificacin de protenas se basan en las propiedades
fisicoqumicas de las protenas, tales como carga elctrica (cromatografa de intercambio
inico), tamao (cromatografa de filtracin en gel), y la hidrofobicidad (cromatografa de
interaccin hidrofbica).
Algunos procedimientos de purificacin tienden a dejar diversas protenas en el material
tratado, si el material inicial es una mezcla compleja. En contraste, la cromatografa de
afinidad se basa en la interaccin especfica de las protenas con molculas especficas.
Intercambio inico
5

El intercambio inico es una operacin unitaria, donde los iones adheridos a una
sustancia solida se intercambian con iones en la solucin alimentada.
Los materiales ms comunes en el intercambio inico son resinas polimricas con grupos
con carga unidos a ellas. Las resinas intercambiadores de cationes tienen cargas
negativas fijas, mientras que las resinas intercambiadores de aniones contienen cargas
positivas fijas. La resina es fuerte, si est totalmente ionizada y dbil si no est totalmente
ionizada.
Principios del intercambio inico
6

Cromatografa de intercambio inico separa las molculas sobre la base de las diferencias
en su carga superficial neta. Las molculas varan considerablemente en sus propiedades
de carga y exhiben diferentes grados de interaccin con los medios de cromatografa
cargados de acuerdo a las diferencias de su carga total, densidad de carga y distribucin
de carga superficial. Los grupos cargados dentro de una molcula que contribuyen a la
carga superficial neta poseen diferentes valores de pKa (logaritmo de la constante de
disociacin acida) dependiendo de su estructura qumica y microambiente.
Puesto que todas las molculas con grupos ionizables se pueden titular, su carga neta
superficial es altamente dependiente del pH. En el caso de las protenas, que se
construyen de muchos diferentes aminocidos que contienen grupos cidos y bsicos
dbiles, su carga superficial neta cambiar gradualmente a medida que el pH del medio
ambiente cambia, es decir, las protenas son anfteras. Cada protena tiene su propia
carga neta nica frente a la relacin pH.
La cromatografa de intercambio inico se aprovecha del hecho de que la relacin entre la
carga superficial neta y el pH es nica para una protena especfica. En una separacin de

4
(Glazer & Nikaido, 2007)
5
(Wankat, 2008)
6
(GE Healthcare, 2010)
intercambio inico las interacciones reversibles entre molculas cargadas y los medios de
intercambio de carga opuesta se controlan con el fin de favorecer la elucin o la unin de
molculas especficas y lograr la separacin. Una protena que no tiene carga neta a un
pH equivalente a su punto isoelctrico (pI) no va a interactuar con un medio cargado. Sin
embargo, a un pH por encima de su punto isoelctrico, una protena se unir a un medio
cargado positivamente y, a un pH por debajo de su pI, una protena se unir a un medio
negativamente. Adems de la interaccin por el intercambio de iones, pueden producirse
otros tipos de unin, pero estos efectos son muy pequeos y son debidos principalmente
a fuerzas de Van der Waals y las interacciones no polares.
Cintica
7

Consideraciones tericas para la selectividad de las resinas de intercambio inico estn
bien desarrolladas. Por desgracia, este no es el caso con la cintica de las reacciones de
intercambio de iones. Los problemas que plantean los sistemas con mayor complejidad
que el caso "ideal" de intercambio inico binario de electrolitos fuertes, ya sea con resinas
catinicas de cido fuerte o resinas aninicas de base fuerte, siguen siendo objeto de
trabajos de investigacin.
El proceso de intercambio se puede dividir generalmente en cinco pasos secuenciales: (1)
la difusin de iones a travs de la solucin a la superficie de las partculas de intercambio
inico, (2) la difusin de estos iones a travs de la partcula de intercambio inico, (3) el
intercambio de estos iones con los iones unidos al grupo funcional, (4) la difusin de estos
iones desplazados a travs de la partcula, y (5) la difusin de estos iones desplazados a
travs de la solucin. Cada paso de la difusin, ya sea en la resina o en la solucin, debe
ser acompaado por un ion de carga opuesta para satisfacer la ley de neutralidad
elctrica.
La cintica del intercambio inico se considera generalmente para ser controlada por la
transferencia de masa en partculas de resina de intercambio de iones o en la fase lquida
que la rodea. La teora utilizada para describir la transferencia de masa en la partcula se
basa en las ecuaciones de Nernst-Planck desarrolladas por Helfferich que representan el
efecto del campo elctrico generado por difusin inica, pero excluye la conveccin.
La ecuacin de Nernst es:

)
Donde es la constante de los gases ideales, es la constante de Faraday, es la
temperatura absoluta, es la carga del ion determinante de potencial,

es la actividad
del ion determinante de potencial en la solucin y es una constante.
De esto, la ecuacin de Nernst-Planck generalizada puede ser escrita como:

7
(Dechow, 1989)

)

Se reconoce que la teora no tiene en cuenta la hinchazn y los cambios de tamao de la
partcula que son fenmenos que acompaan al intercambio inico ni tiene en cuenta el
fenmenos de relajacin en la configuracin de la resina que ocasiona que el coeficiente
de difusin vare con el tiempo. Sin embargo, las aproximaciones que las ecuaciones de
Nernst-Planck proporcionan son un punto de partida razonable y es probable que sean
suficientes para el ingeniero en biotecnologa. Cualquier mejora nueva no traer
rendimientos importantes. Por lo tanto, la transferencia de masa en la fase lquida se
describe por lo general de acuerdo con el concepto de pelcula de Nernst una versin de
la ecuacin de Nernst-Planck o una aproximacin ms simple de la fuerza impulsora lineal
de Glueckauf.
Hay cinco modelos que pueden ser utilizados para representar la cintica en los sistemas
de intercambio de iones que implican transferencia de masa en fase liquida, transferencia
de masa de fase slida y reaccin qumica en los grupos de intercambio.
En el modelo 1, la transferencia de masa en fase lquida con una fuerza impulsora lineal
es el elemento de control. Este modelo supone que no hay gradientes de concentracin
en la partcula, que hay un estado cuasi-estacionario de transferencia de masa en fase
lquida, que hay una fuerza impulsora lineal y que hay un factor de separacin constante a
una concentracin de la solucin dada.
En el modelo 2, el factor limitante es la difusin dentro de las partculas de intercambio
inico. Este modelo supone que no hay gradientes de concentracin en la fase lquida y
que no hay conveccin, ya sea a travs de la absorcin de disolvente o liberacin en la
fase slida.
En el modelo 3 se controla por la reaccin de intercambio en los grupos inicos fijos. Este
modelo supone que la lentitud de la reaccin de intercambio permite tiempo suficiente a
la transferencia de masa para establecer y mantener el equilibrio de manera que no existe
ningn gradiente de concentracin, ya sea en las partculas de intercambio inico o en la
fase lquida.
El modelo 4 es una variacin del modelo 3 en la que los contraiones de la solucin no
penetran ms all de la parte de la partcula que se ha convertido a la forma inica que
intercambia. El lmite del ncleo sin reaccionar se reduce con el tiempo, de tal manera que
esto se llama el modelo de ncleo en contraccin. Este es el lmite claro entre la parte que
ha reaccionado y la que no es lo que distingue el modelo 4 del modelo 3.
En el modelo 5, la etapa que controla es la difusin del contrain travs de la parte
convertida de la partcula. Dado que los grupos de intercambio se someten a una reaccin
rpida y esencialmente irreversible con los contraiones, su tipo de reaccin afecta a la
velocidad de reaccin y la geometra de la zona de difusin.






Tabla de modelos
Factor Modelo 1 Modelo 2 Modelo 3 Modelo 4 Modelo 5

Tamao de
partcula ()

Concentracin
de la solucin ()

Factor de
separacin (a)

independiente hasta
un tiempo especifico
cuando a >=1; a
cuando a<<1

Velocidad de
agitacin

Capacidad de
intercambio de
la resina ()

Temperatura
(T)

El modelo 5 es aplicable para intercambio directo nicamente.
En el modelo 5 el coeficiente de particin es independiente de la concentracin en la
solucin.
El modelo 5 es independiente del factor de separacin cuando la conversin es completa
y composicin de la solucin es constante.









Cromatografa de interaccin hidrofobica:
Es una tcnica de separacin que se vale de las propiedades hidrofobicas de distintas
molculas para separar distintos tipos de protenas. Se usan grupos hidrofobicos tales
como fenil, octil o butil adheridos a la columna estacionaria que generalmente est
compuesta por una estructura
polimrica o de agarosa en donde se
depositan los grupos que
proporcionaran la adherencia, las
protenas que pasan por la columna
con cadenas laterales de aminocidos
hidrofobicos (Fenilalanina, Triptfano,
Metionina, Alanina) en su superficie si
adhieren a los grupos hidrofobicos de la
columna gracias a la presencia de
grandes concentraciones de sales (1-
2M) generalmente Sulfato Amnico, de
esta concentracin de sales depende la
cantidad de protenas que puedan
quedar en la pared de la columna,
igualmente se debe controlar el flujo a
la columna, la temperatura y el pH.
Estas condiciones deben ser determinadas por experimentacin para lograr las ptimas
para la protena que se desea separar. Las dems protenas pasan por la columna y son
retiradas al final. Posteriormente las protenas adheridas pueden ser separadas de los
grupos hidrofobicos al disminuir la concentracin de sales en la columna y creando un
gradiente decreciente. Finalmente se lava la columna con agua limpia para eliminar todas
las molculas hidrofobicas que pudieron haber quedado adheridas a la columna y se
vuelve a iniciar el proceso. Gracias a que no requiere de modificadores orgnicos para
lograr la separacin posterior de las protenas adheridas a la columna. Es til para ser
aplicada posterior a un proceso que utilice grandes concentraciones de Sulfato Amnico,
adems no requiere un cambio de buffer y la presencia de sales estabiliza la solucin de
protenas.
Fuente:
http://en.wikibooks.org/wiki/Proteomics/Protein_Separations_-
_Chromatography/Hydrophobic_Interaction_Chromatography_(
HIC)
La hidrofobicidad es un fenmeno que consistente en la repulsin que existe entre
molculas no polares y el agua haciendo que se formen agregados al estar en un medio
acuoso. El factor determinante para una adherencia deseada es la hidrofobicidad de las
molculas superficiales de las protenas que se van a separar. La hidrofobicidad de cada
molcula se da por distintas escalas basadas en diferentes principios (Lesser et al, 1987).
Como este mtodo se basa en un fenmeno superficial se debe terminar la hidrofobicidad
superficial. Esta fue dada por Berggren y colaboradores (2000) como:

Donde es la hidrofobicidad de cada aminocido y es el rea expuesta relativa
de cada aminocido que esta dada por:

Saai es el rea expuesta de cada aminocido y Sproteina es el rea total de la proteina
Cromatografa liquida de alta eficiencia:
Es un tipo de cromatografa en donde un lquido (fase mvil) pasa con intimo contacto con
un slido u otro liquido inmiscible (fase estacionaria), que tiene naturaleza apolar
(cadenas de hidrocarburos, grupos fenilo), la separacin se debe a las diferentes
interacciones entre los componentes de la fase mvil y la fase estacionaria.
Esta tcnica presenta una gran variedad de ventajas para el anlisis de pptidos y
protenas:
- Permite una excelente resolucin tanto para molculas estrechamente
relacionadas como las que varan estructuralmente.
- Fcil manipulacin de la selectividad cromatografa a travs de cambios en las
caractersticas de la fase mvil.
- Presenta altas recuperaciones y por lo tanto una alta productividad.

Cromatografa de filtracin en gel: Tambin conocida como Cromatografa de exclusin
molecular, es una de las tcnicas ms sencillas usadas para la separacin de protenas y
cidos nucleicos en funcin de su tamao molecular.
Est tcnica se lleva a cabo en una columna en donde el medio filtrante (gel) se envasa
para formar un lecho compacto. El medio es una matriz porosa en forma de partculas
esfricas (fase inmvil o estacionaria) las cuales han sido seleccionadas por su
estabilidad fsico-qumica y dependiendo el dimetro de poro que se desea. Estos geles
son materiales esponjoso, comnmente polmeros como. dextranos con enlaces cruzados
(sephadex) o poliacrilamida. Como el analito no puede interacta con la fase estacionaria,
la capacidad de separacin se debe nicamente al gel y a su eficacia de retencin.
Funcionamiento: Cuando se hace pasar una mezcla de molculas de distinto tamao
(fase mvil), a travs de una columna de filtracin en gel; aquellas molculas con un
tamao mayor que el dimetro de los poros de las partculas, no entrarn en la fase
estacionaria, permaneciendo en la solucin (fase mvil ) que rodea los granos; y por lo
tanto, no se vern retrasadas en su descenso. En cambio aquellas molculas capaces de
penetrar en las partculas se vern retrasadas por la fase estacionaria; en mayor medida,
cuanto menor sea su tamao. Por lo tanto, las molculas eluyen en este tipo de
cromatografa por orden decreciente de tamao molecular
8
.



8
Caballero, J Muo, J. Moyano, E. Cromatografa de filtracin en gel: Departamento de Bioqumica y
Biologa Molecular, Campus Universitario de Rabanales .Argentina.

Figura 1. Pasos en una cromatografa de exclusin molecular.
Fuente: Universidad Nacional de Quilmes: Cromatografa de exclusin molecular o
filtracin en gel. Recuperado desde: http://ufq.unq.edu.ar

a) Grnulo del gel, puntos rosados: partculas pequeas. Puntos azules: Partculas de
mayor tamao.
b) Sembrado de la muestra.
c) Y d) Elucin de las partculas segn su tamao.
e) Diagrama de elusin: cromatograma.

Factores que influyen en la separacin:
a) Longitud de la columna: la capacidad de separacin de sustancias de diferente
tamao aumenta con la longitud de la columna
1
.
b) Flujo: La resolucin de la cromatografa de la separacin disminuye al aumentar el
flujo del lquido con que son arrastradas las molculas a lo largo de la columna.
Normalmente el flujo oscila entre 2 y 10 cm h-1
1
.
c) El volumen de la muestra a cromatografiar debe ser pequeo comparado con el
volumen total de la columna. Las mejores separaciones se obtienen aplicando
volmenes de muestra iguales o menores al 5% del volumen total
1
.
d) Empaquetado del gel en la columna. Las propiedades separadoras del gel se
alteran profundamente, e incluso desaparecen, cuando un gel no est
empaquetado homogneamente en la columna o se encuentra excesivamente
comprimido
1
.

Por qu se utiliza para separar la insulina?

Esta tcnica es muy ventajosa frente a otros mtodos para purificar insulina ya que est
no requiere la unin de la protena ni ningn tipo de afinidad a la fase inmvil, lo cual
reduce significativamente la posibilidad de perder la protena por una unin irreversible o
bien por inactivacin de la misma. Como la insulina es una protena sensible a los
cambios de pH, este tipo de cromatografa permite mantener el pH neutro colocando una
pequea cantidad de solucin buffer en la columna donde se lleva a cabo el proceso,
permitiendo mantener la actividad biolgica de la insulina ya purificada.

Con este procedimiento se puede lograr obtener una insulina con una pureza hasta del
99.999%, lo cual es un factor muy importante ya que este producto ser comercializado
como medicamento.

Los fenmenos de transporte:
Los dos principales fenmenos que se aplican en esta tcnica de purificacin es la
difusin en slidos porosos y el flujo de fluidos a travs de lecho poros. El primero de ellos
se da a travs de un slido poroso con poros interconectados, como resultado de un
gradiente hidrodinmico, debido a una diferencia de presin, generado por el flujo de la
parte mvil y la diferencia entre el tamao de las partculas y el dimetro de poro
9
. El flujo
de fluidos en un lecho poroso consiste en la circulacin de un fluido a travs de un medio
formado por partculas conjuntas que dejan entre ellas espacios libres por los cuales pasa
el fluido.
Liofilizacin: es la etapa final para la obtencin de la insulina como cristales, consiste en
la deshidratacin de productos como las protenas, en busca de mantener las
propiedades funcionales de los mismos, para ello se debe congelar el producto(insulina) y
posteriormente se debe introducir en una cmara de vaco para realizar la separacin del
lquido( agua y otros componentes) por sublimacin, es necesario mantener la
temperatura bastante baja evitando derretir los cristales de hielo presentes.
Para poder desarrollarse la liofilizacin se deben seguir los siguientes pasos: Las etapas
principales de la liofilizacin son:

Preparacin: consiste en el adecuado acondicionamiento de la materia prima, es uno de
los pasos ms importantes ya que pues una vez introducida la materia prima en el
proceso, est ya no puede ser manipulada.
Congelacin: aqu es donde el producto sufre por primera vez una modificacin
condicionando as las etapas sucesivas, se realiza en congeladores independientes o en
el mismo equipo de liofilizacin, all se busca congelar el agua libre de producto,
empleando temperaturas entre -20 y -30 C.

Para el desarrollo de esta etapa es necesario conocer y controlar adecuadamente:

La temperatura en la que ocurre la mxima solidificacin.
La velocidad ptima de enfriamiento.
La temperatura mnima de fusin incipiente.

Lo anterior permitir que la insulina tenga una estructura slida, sin la presencia de lquido
concentrado, garantizando que el secado ocurra por sublimacin

Desecacin primaria: ocurre por medio de la sublimacin del solvente congelado. Para
ello es necesario disminuir la presin al interior de la cmara lo cual se puede realizar con
una bomba de vaco, esto acelera la sublimacin. A dems se debe aplicar calor al
producto sin aumentar la temperatura con el uso de conduccin, radiacin o microondas,
para sublimar el agua. En esta fase se logra eliminar hasta el 95% del agua presente en la
insulina. Esta fase normalmente es lenta, ya que si se aumenta de manera muy rpida el
flujo de calor, la insulina puede desnaturalizarse.

Desecacin secundaria: se lleva a cabo por medio de una desorcin, la cual consiste en
eliminar el agua no congelable, obteniendo porcentajes finales de humedad menor al

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Treybal, E..(1998). Operaciones de trasferencia de masa, segunda edicin. Mxico: McGraw-Hill.

2%.Durante esta etapa la presin cae al mnimo, lo que conlleva a realizar la mxima
capacidad de vaco que pueda alcanzar el equipo, con lo cual se favorece la desorcin. La
temperatura para esta etapa suele ser mayor a la desecacin primaria, y est
aproximadamente en 0c, con el fin de romper las interacciones fsico-qumicas q se dan
entre las molculas de agua y nuestro producto deseado, en este caso la insulina.

Cuando el proceso se ha completado el vaco se altera por medio de un gas inerte, y los
cristales de insulina son empacados y almacenados para ser comercializados.



Figura 2. Pasos para el proceso de liofilizacin

Fuente: BARRETO, H. F. (2010). LIOFILIZACIN UN MTODO PARA SECADO DE ALIMENTOS.
Mxico.Instituto tecnolgico del altiplano de Tlaxcala.

Ventajas del proceso:
- Conservacin del producto, lo que permite un fcil transporte y almacenamiento.
- Inhibe el crecimiento de microorganismos.
- Proporciona estabilidad qumica.
- La insulina puede ser reconstituida fcilmente para su utilizacin como inyeccin.

Desventajas del proceso:
- Alto costo para su desarrollo.
- Alto consumo de energa.

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