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M a n u a l Té c n i c o

Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina

Manual Técnico

1ª edição - outubro 2008

Por Vinícius Junqueira Hermont, Médico Veterinário

Manual Técnico 1ª edição - outubro 2008 Por Vinícius Junqueira Hermont, Médico Veterinário

Pesquisadores UFMG

11

Pesquisadores Hertape Calier

13

 

15

Agradecimentos Leishmanioses

 

19

 

Introdução Classificação e agentes etiológicos

20

 

Leishmaniose visceral Leishmaniose tegumentar

Leishmaniose cutânea Leishmaniose cutânea difusa Leishmaniose mucocutânea

Leishmaniose visceral

21

 

Agentes etiológicos e vetores

22

Morfologia e ciclo biológico Forma amastigota Forma promastigota

Epidemiologia e distribuição geográfica

24

 

27

 

Aspectos clínicos da doença em cães animais assintomáticos animais oligossintomáticos animais sintomáticos

29

Diagnóstico Métodos sorológicos Métodos parasitológicos Métodos moleculares

30

 

31

 

Prevenção e controle Controle do vetor no ambiente Controle do vetor no animal Imunoprofilaxia Resposta Imune

32

Índice

Vacinas recombinantes

34

 

36

A proteína A2 Espaço científico

38

 

Publicações sobre a proteína A2 Apresentações em congressos científicos

40

Desenvolvimento da Leish-Tec ® - Fase I

42

 

Introdução Descrição do experimento Relato Resultados

43

Resultados e discussão

45

Conclusões

46

Desenvolvimento da Leish-Tec ® - Fase II

47

 

Objetivo geral Objetivos específicos Descrição do experimento Resultados Resposta Humoral Resposta Celular

50

53

Conclusões

54

Produção da Leish-Tec ®

58

 

Biossegurança Boas Práticas de Fabricação (BPF)

61

Processo produtivo

62

 

66

Protocolo de vacinação/informações comerciais Referências bibliográficas

70

Hertape Calier Saúde Animal

Em 1944, partindo do ideal cientista, surge o Laboratório Hertape, fundado por professores da UFMG e tendo sua estratégia empresarial voltada para a viabilização comercial dos desenvolvimentos tecnológicos voltados à saúde animal daquela universidade. Com essa determinação, pôde oferecer ao mercado brasileiro a

atualização tecnológica oriunda da excelência existente na UFMG e em seus laboratórios, disponibilizando fontes de pesquisa e desenvolvimento

à inspiração científica ao longo desses anos.

No início dos anos 2000, transferindo-se para a cidade de Juatuba, o

Laboratório Hertape inicia a construção do que é hoje o maior parque

científico de produção de medicamentos veterinários, alicerçando ainda mais sua vocação científica. Em 2004, com sua destacada atuação no segmento de saúde animal por mais de meio século e dispondo de uma estrutura industrial comparável às melhores plantas de produção de medicamentos veterinários do mundo, o Laboratório Hertape une-se ao Laboratório Calier.

O Laboratório Calier pertence ao Grupo Indukern, da Espanha, que atua

mundialmente na indústria veterinária, farmacêutica, na distribuição de produtos químicos e em vários outros segmentos mercadológicos, mantendo forte presença nos continentes europeu e americano. Surgiu, então, a Hertape Calier Saúde Animal S.A. Com a certeza da manutenção de Pesquisa & Desenvolvimento

Tecnológico e da excelência industrial, uniram, assim, padrões internacionais de Medicina Veterinária e expertise das necessidades do mercado brasileiro, tudo a serviço da saúde animal. Considerada a mais moderna indústria veterinária da América Latina, a Hertape Calier é certificada em Boas Práticas de Fabricação (BPF), elevando seu status de pesquisa, desenvolvimento, produção, armazenamento e logística.

A estrutura industrial possibilita a produção de linha própria e de

terceiros, atendendo a laboratórios de renome mundial que atuam no

Brasil, assegurando a todos a garantia de qualidade exigida no mercado mundial.

A planta industrial localizada próximo à capital do Estado de Minas

Gerais, na cidade de Juatuba, com área próxima a duzentos mil metros

quadrados, dispõe de excelente infra-estrutura de construção, dedicando espaços suficientemente confortáveis e seguros ao desenvolvimento, suprimento, produção, armazenamento, rotulagem e expedição dos produtos.

As instalações existentes visam a assegurar as rigorosas exigências de

Boas Práticas de Fabricação (BPF), assim como respeito e preservação ao meio ambiente, conforto e segurança aos seus colaboradores

e segurança em armazenamento de matérias-primas e produtos

acabados.

A constante evolução do mercado de reprodução assistida, fez com

que a Hertape Calier Saúde Animal S.A. se posicionasse de forma decisiva para oferecer contribuição positiva ao desempenho produtivo e

lucratividade dos rebanhos. De olho no atendimento às demandas futuras do mercado mundial, mantém convênios com as universidades Federal de Minas Gerais (UFMG), Católica (PUC-MG), Federal de Viçosa (UFV), Universidade de Ouro Preto (Ufop), Fiocruz e Biomanguinhos. Participa do Instituto do Milênio, criado pelo Ministério da Ciência e Tecnologia, representando o segmento destinado aos estudos e desenvolvimento de novas vacinas. Tem por princípio a incessante busca de soluções que valorizem a Medicina Veterinária no Brasil. Com uma vasta rede de colaboradores, a Hertape Calier é capaz de assistir técnica e comercialmente a todos os criadores de pequenos e grandes animais, com uma vasta linha de produtos do seu portfolio, oferecendo-lhes produtos veterinários produzidos com técnicas capazes

de

valorizar o bem-estar e a saúde animal.

“A

Hertape Calier é originalmente brasileira, fabricando produtos com

expertise mundial e desenvolvendo o futuro da Medicina Veterinária no Brasil.”

Pesquisadores UFMG

Ana Paula Fernandes

Possui graduação em Ciências Biológicas (1986), mestrado em Microbiologia (1990) e doutorado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1997). Durante o mestrado e o doutorado, fez estágio sandwich na Harvard Medical School (USA). Atualmente, é pesquisadora do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e professora associada da Universidade Federal de Minas Gerais. Atua na área de Farmácia, com ênfase em Biologia Molecular. Atualmente, desenvolve projetos nas linhas de pesquisa de diagnóstico, vacinas e tratamento contra leishmaniose, alterações genéticas associadas a estados de hipercoagulabilidade e no diagnóstico e epidemiologia molecular de doenças infecciosas. Participação no projeto Identificação do antígeno A2 e caracterização da resposta imune e parasitológica induzida pela imunização durante os estudos de Fase I em camundongos e Fase II em cães. Coordenação científica e da equipe de pesquisadores e técnicos envolvidos no estudo de Fase II em cães. Redação dos artigos científicos e da patente. Orientação de estudantes de mestrado e doutorado envolvidos com os projetos de pesquisa. Delineamento, condução, avaliação e análise e interpretação de resultados dos testes de Fase I e II.

Ricardo Tostes Gazzinelli

Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Minas Gerais (1985), doutorado em Bioquímica e Imunologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1989) e pós-doutorado pelo National Institutes Of Health, Estados Unidos (1994). Livre Docência pela Universidade Federal de São Paulo, Brasil (1996). Atualmente, é pesquisador titular da Fundação Oswaldo Cruz (CPqRR) e professor titular da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Atuação na área de Bioquímica, com ênfase em Bioquímica dos Microorganismos. Participação no projeto Caracterização da resposta imune e parasitológica induzida pela imunização durante os estudos de Fase I em camundongos e Fase II em cães. Coordenação científica e da equipe de pesquisadores e técnicos envolvidos no estudo de Fase II em cães. Redação dos artigos científicos e da patente. Orientação de estudantes de mestrado e doutorado envolvidos com os projetos de pesquisa. Delineamento, acompanhamento, avaliação e análise e interpretação de resultados dos testes de Fase I e II.

Pesquisadores Hertape Calier

Christiane de Freitas Abrantes

Mestre em Microbiologia com ênfase em Biologia Molecular pela UFMG, atua na Gerência de Produção e Desenvolvimento de Vacinas Recombinantes da Hertape Calier Saúde Animal. Atuou na definição e implantação do processo de produção industrial e forneceu subsídios técnicos para o desenvolvimento do Projeto da Unidade de Produção de Vacinas Recombinantes NB-2, hoje certificada e apta a produzir em larga escala produtos a partir de Organismos Geneticamente Modificados do nível 2 de biossegurança atendendo às normas de Boas Práticas de Fabricação. Participação no projeto Avaliação do antígeno existente em testes na UFMG. Determinação da formulação vacinal. Viabilidade para transferência de tecnologia para a Hertape Calier. Determinação e implantação do processo produtivo. Determinação dos controles de qualidade necessários à fabricação. Coordenação logística e científica de teste clínico de Fase II. Depósito de patente – participação na formulação, processo produtivo e estabilidade. Produção da vacina.

Vinícius Junqueira Hermont

Possui graduação em Medicina Veterinária pela Pontifícia Universidade Católica de Minas

Gerais – Unidade Betim (2006). Coordenador e responsável do Laboratório pela elaboração

e execução dos testes Fase II, Fase III e dos Trabalhos de Campo realizados com a vacina.

Atualmente, é o gerente de produto - Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina e o responsável técnico / comercial da Hertape Calier pela vacina.

Participação no projeto Integrante da equipe responsável pelo delineamento e execução do projeto Fase II, referentes ao desenvolvimento e testes da vacina Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina. Responsável pela documentação e procedimentos necessários para implantação e execução dos testes, a fim de trabalhar dentro de parâmetros adequados regidos pelo Ministério da Agricultura, Ministério da Saúde e COBEA e pela manutenção da interface empresa/pesquisadores. Determinação e aquisição de materiais para a execução dos testes, assim como seleção e treinamento dos profissionais (equipe) envolvidos nas atividades. Aquisição, preparação e manutenção clínica dos animais, análise de resultados e execução dos procedimentos realizados nos animais durante o experimento. Responsável pelo delineamento e execução do Trabalho de Campo realizado com a vacina

e coordenador da equipe envolvida.

Colaboração no delineamento e execução da Fase III.

Agradecimentos

Carlos Alberto Pereira Tavares

Possui graduação em Farmácia e Bioquímica pela Universidade Federal de Minas Gerais (1968), mestrado em Microbiologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1977), doutorado em Microbiologia e Imunologia pela Universidade Federal de São Paulo (1980), e pós-doutorado pelo National Institute for Medical Research, Londres. É professor titular do Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Foi coordenador do curso de pós-graduação em Bioquímica e Imunologia (1998-2002), diretor do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG (2002-2006) e é pró-reitor de Pesquisas da UFMG. Tem experiência na área de Imunologia, atuando principalmente nos seguintes temas: identificação e isolamento de antígenos parasitas com objetivo de induzir proteção e diagnóstico imunológico. Participação no projeto Contribuição durante os estudos de Fase I realizados em camundongos, dando apoio às atividades de avaliação da resposta imune e protetora nos animais.

Eduardo Antonio Ferraz Coelho

Doutorando. Graduado pela Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF), mestrado em Ciências Farmacêuticas pela Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG) e doutorado em Ciências, ênfase em Imunologia, pelo Departamento de Bioquímica e Imunologia do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG. Atualmente, é professor efetivo da UFMG. Tem experiência científica aprofundada nas áreas de Parasitologia, Imunologia Celular e de Vacinas, Diagnóstico de Doenças Parasitárias, Imunoquímica, Bioquímica, Hematologia, Microbiologia e Biologia Molecular, atuando, principalmente, nos seguintes temas: aprimoramento do diagnóstico laboratorial e desenvolvimento de vacinas contra as leishmanioses; estudo de

anergia e tolerância imunológica nas leishmanioses; hemoglobinopatias e hemofilias. É, atualmente, presidente do Comitê Interno de Biossegurança (CIBio) da Hertape-Calier Saúde Animal S.A. Participação no projeto Avaliação da resposta imune humoral e celular e dos níveis de proteção nos testes de Fase I em camundongos. Avaliação da resposta imune humoral e celular durante os testes de Fase II em cães.

Eloísa de Freitas

Veterinária. Participação no projeto Avaliação clínica dos animais. Testes sorológicos para diagnóstico da leishmaniose.

Maria Norma Mello

Graduada em Farmácia Química pela Universidade Federal de Minas Gerais (1965), com especialização em Engenharia Sanitária pela Universidade Federal de Minas Gerais (1966), mestrado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1973), doutorado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1983), pós-doutorado pela Harvard University (1988) e pós-doutorado pela University of London (1992). Atualmente,

é professora titular da Universidade Federal de Minas Gerais. Tem experiência na área

de Parasitologia, com ênfase em Protozoologia de Parasitos. Atua principalmente nos

seguintes temas: Leishmania, Meio Quimicamente Definido, Estudos Nutricionais. Participação no projeto Isolamento e caracterização da cepa de Leishmania chagasi empregada. Cultivo das formas promastigotas utilizadas no desafio dos cães.

Participação na condução dos testes moleculares para detecção de Leishmania, discussão

e interpretação dos resultados do teste de Fase II.

Marilene Suzan Marques Michalick

Graduada em Farmácia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1972), com mestrado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1977) e doutorado em Parasitologia pela Universidade Federal de Minas Gerais (1996). É professora e orientadora no Programa de Pós-Graduação em Parasitologia do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. Atualmente, é professora-adjunta e vice-diretora da Faculdade de Ciências da Saúde da FUMEC e aposentada da Universidade Federal de Minas Gerais. Tem experiência na área de Parasitologia, com ênfase em Protozoologia Parasitária Animal, Diagnóstico das Leishmanioses, Tratamento da leishmaniose visceral canina, atuando principalmente nos seguintes temas: Leishmania e Leishmanioses, Leishmaniose Visceral Canina, Modelos Experimentais para Estudos da Relação Hospedeiro-Parasito e Teste de Novas Drogas e Novas Formulações para o Tratamento das Leishmanioses. Participação no projeto Isolamento e caracterização da cepa de Leishmania chagasi empregada. Infecção-desafio dos cães. Participação na condução dos testes sorológicos para diagnóstico de leishmaniose e discussão e interpretação dos resultados do teste de Fase II.

Miriam Maria da Silva Costa

Bacharel em Ciências Biológicas, com mestrado em Bioquímica pela UFMG. Participação no projeto Avaliação da resposta imune humoral e celular durante os testes de Fase II em cães. Avaliação da infecção por Leishmania por PCR.

Wagner Luiz Tafuri

Possui graduação em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Viçosa (1989), título de Mestre em Ciências pelo Curso de Patologia (área de Concentração Patologia Geral) da Universidade Federal de Minas Gerais (1992), e título de Doutor em Ciências pelo Curso de Parasitologia (área de concentração Protozoologia) da Universidade Federal de Minas Gerais (1995). Realizou um pós-doutoramento na Universidade de Temple, Philadelphia, USA, sob a supervisão do Prof. Dr. David Mosser. Atualmente, é professor associado II do Departamento de Patologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais. Tem experiência na área de Patologia Geral, atuando, principalmente, nos seguintes temas: patologia e alguns aspectos imunológicos da leishmaniose visceral canina e leishmaniose experimental murino. Participação no projeto Avaliação clínica dos animais ao longo de todas as etapas do teste. Avaliação anatomopatológica dos animais. Participação na condução dos testes imunocitoquímicos para diagnóstico de leishmaniose e discussão e interpretação dos resultados do teste de Fase II.

Weverton Sampaio (in memoriam)

Veterinário. Participação no projeto Avaliação clínica dos animais.

Introdução

Leishmanioses

As leishmanioses constituem um grupo de doenças parasitárias de caráter zoonótico de ampla distribuição geográfica, causadas por uma variedade de espécies de protozoários pertencentes ao gênero Leishmania. A leishmaniose é considerada

a segunda principal doença causada por protozoário, perdendo somente

para a Malária em incidência e é considerada a quinta maior endemia

mundial, segundo a Organização Mundial de Saúde. A leishmaniose visceral

é uma doença de grande importância médico-veterinária e é transmitida

no Brasil pela picada da fêmea de Lutzomyia longipalpis, popularmente conhecida como flebotomíneo, mosquito-palha ou birigui, infectada. Um importante aspecto epidemiológico consiste no fato de que as fêmeas destes flebotomíneos possuem caráter oportunista, no qual uma ampla variedade de vertebrados faz parte de sua alimentação no meio ambiente, parasitando roedores, carnívoros, marsupiais, edentados, insetívoros e, principalmente, cães e humanos, sendo caracterizada em ambos por lesões na pele (leishmaniose tegumentar) ou envolvimento visceral generalizado (leishmaniose visceral). Devido à elevada prevalência de infecção canina, o cão é considerado o principal reservatório da doença em ambientes domésticos.

Classificação e agentes etiológicos

Diversas espécies de Leishmania causam diferentes aspectos clínicos da doença, sendo classificadas em:

Leishmaniose visceral – mais conhecida como “calazar”. É a forma mais grave da doença, sendo fatal se não tratada. Ela pode ser causada pelas espécies L. donovani e L. infantum no Velho Mundo e pela L. chagasi nas Américas (Muigai et al.,1987; Desjeux, 1996 e Matlashewski, 2001).

Leishmaniose tegumentar – compreende três manifestações clínicas da doença:

Leishmaniose cutânea – conhecida como “úlcera de Bauru”. A leishmaniose cutânea é caracterizada por lesões localizadas, geralmente únicas. Normalmente, as lesões apresentam cura própria, sem a necessidade de tratamento (Grimaldi & Tesh, 1993, Desjeux, 2004). Ela pode ser causada pelas espécies L. tropica, L. major, L. aethiopica, L. mexicana, L. amazonensis, L. guyanensis, L. peruviana, L. braziliensis e L. panamensis. Leishmaniose cutânea difusa – leishmaniose dérmica ocorrida após infecção com calazar. Causa lesões dermatológicas extensas, disseminadas e de caráter crônico, sendo de difícil tratamento (Grimaldi & Tesh, 1993). Ela pode ser causada pelas espécies L. mexicana, L. amazonensis e L. venezuelensis, no Novo Mundo (Weigle & Saravia, 1996) e pela L. aethiopica, no Velho Mundo (Dowlati, 1996). Leishmaniose mucocutânea – inicia-se com lesões aparentemente simples na pele e mucosas, principalmente, na boca e na cavidade nasal, podendo se estender, causando graves lesões ulcerativas até destruição de todo o tecido afetado. Pode ainda afetar faringe, laringe e traquéia, provocando quadros de desnutrição e obstrução respiratória (Grimaldi & Tesh, 1993 e Weigle & Saravia, 1996). Ela pode ser causada pelas espécies L. braziliensis, L. panamensis, L. guyanensis e L. major

20 (Desjeux, 2004).

Leishmaniose visceral

Agentes etiológicos e vetores

A Leishmaniose Visceral é causada por protozoários do gênero Leishmania, pertencentes à família Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida, filo Sarcomastigophora e sub- reino Protozoa. No Velho Mundo, a L. donovanni tem sido incriminada como agente etiológico do calazar indiano (Laveran & Mesnil, 1903). Na bacia do Mar Mediterrâneo, o parasito incriminado é a L. infantum (Nicolle, 1908) e no Novo Mundo, segundo Cunha & Chagas (1937), a L. chagasi é a espécie incriminada como agente causador da Leishmaniose Visceral e americana (LVA). Esses parasitos são digenéticos e são transmitidos ao homem e aos animais após a picada do inseto vetor do gênero Lutzomyia, em países do Novo Mundo, e do gênero Phlebotomus, em países do Velho Mundo. Os vetores pertencem à ordem Diptera, família Psychodidae e subfamília Phlebotominae (Grimaldi & Tesh, 1993).

vetores pertencem à ordem Diptera , família Psychodidae e subfamília Phlebotominae (Grimaldi & Tesh, 1993). 21
vetores pertencem à ordem Diptera , família Psychodidae e subfamília Phlebotominae (Grimaldi & Tesh, 1993). 21

Morfologia e ciclo biológico

O

morfologicamente distintas: amastigota e promastigota. Forma amastigota: forma arredondada, aflagelada e com aproximadamente, 5µm de diâmetro. É responsável pelo desenvolvimento da doença no hospedeiro vertebrado. Parasita intracelular obrigatório, sendo encontrado no interior de células fagocíticas, como monócitos e macrófagos, do hospedeiro mamífero. Forma promastigota: forma alongada que possui um núcleo central e um longo

formas

ciclo

biológico

(Figura

1)

do

parasita

Leishmania

compreende

duas

flagelo. É encontrada no hospedeiro invertebrado, vetor da doença (Ashford, 2000).

hospedeiro invertebrado, vetor da doença (Ashford, 2000). Forma amastigota Forma promastigota O parasita é

Forma amastigota

vetor da doença (Ashford, 2000). Forma amastigota Forma promastigota O parasita é transmitido ao homem

Forma promastigota

O

parasita é transmitido ao homem após a picada do inseto vetor infectado, que injeta,

na

pele do hospedeiro vertebrado, as formas promastigotas metacíclicas. Cabe ressaltar

que apenas os vetores fêmeas são capazes de transmitir o parasita, pois apenas eles são hematófagos. As formas promastigotas, na sua maioria, são fagocitadas pelos macrófagos, formando-se organelas denominadas de fagolisossomos. Dentro dos fagolisossomos, elas

se transformam nas formas amastigotas que se replicam por divisão binária. Macrófagos

infectados podem então ser ingeridos por insetos vetores sadios durante o repasto

sanguíneo. No intestino dos vetores, as formas amastigotas são então liberadas após a lise dos macrófagos. Os parasitas liberados se transformam rapidamente em promastigotas procíclicas, não infectivas. Essas formas se multiplicam rapidamente e se aderem à parede

do intestino. Enquanto migram para a porção anterior do órgão, elas se diferenciam nas

formas promastigotas metacíclicas, não replicativas, mas altamente infectivas, que podem

ser transmitidas após a picada do inseto durante o seu repasto sanguíneo, completando o ciclo biológico do parasita (Matlashewski, 2001 e Sacks & Noben-Trauth, 2002).

2 6 1 4 3 VL 8 CL 5 7
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Adaptado da OMS - Organização Mundial da Saúde

Fig. 1 - Ciclo biológico do parasita Leishmania: 1 - Macrófagos infectados podem ser ingeridos por insetos vetores fêmeas durante a refeição. 2 - No intestino do inseto vetor, as formas amastigotas se diferenciam até promastigotas metacíclicas, que migram para a porção anterior do intestino e são transmitidas após a picada do vetor. 3 - Fagocitose das formas promastigotas metacíclicas pelos macrófagos. 4 - Lise do macrófago, liberando formas amastigotas que podem infectar outros macrófagos. 5 - Hospedeiros vertebrados. 6 - Hospedeiros invertebrados (inseto vetor fêmea do gênero Lutzomyia, em países do Novo Mundo, e do gênero Phlebotomus, em países do Velho Mundo). 7 - Manifestação clínica da leishmaniose tegumentar. 8 - Manifestação clínica da leishmaniose visceral.

23

Epidemiologia e distribuição geográfica

A leishmaniose visceral e cutânea possui larga distribuição em áreas tropicais e subtropicais, estendendo-se desde a América Central e do Sul até os países mediterrâneos como África, Ásia Central, Índia e China, conforme demonstrado no mapa abaixo.

Distribuição Geográ ca de Leishmaniose Cutânea

Distribuição Geográ ca de Leishmaniose Cutânea Distribuição Geográ ca de Leishmaniose Visceral

Distribuição Geográ ca de Leishmaniose Visceral

Distribuição Geográ ca de Leishmaniose Visceral Atualmente, as leishmanioses, além de prevalentes nos

Atualmente, as leishmanioses, além de prevalentes nos quatro continentes, são consideradas endêmicas em 87 países (21 no Novo Mundo e 66 no Velho Mundo). Destes, 16 são países desenvolvidos, 72 em desenvolvimento e 13 estão entre os menos desenvolvidos. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS), há uma prevalência de 12 milhões de casos humanos no mundo. Estima-se que a incidência anual varie de 1 milhão a 1,5 milhão de novos casos de leishmaniose tegumentar americana (LTA) e cerca de 500 mil casos novos de leishmaniose visceral humana (LVH). Calcula-se que cerca de 350 milhões de pessoas estejam em área de risco para desenvolver alguma forma de leishmaniose. Mais de 90% dos casos de leishmaniose visceral (LV) no mundo estão notificados em Bangladesh, Brasil, Índia e Sudão e mais de 90% dos casos de leishmaniose cutânea (LC) ocorrem no Afeganistão, Irã, Arábia Saudita, República Árabe, Síria, Brasil e Peru (Desjeux, 1991; Arias et al. 1996). Nas Américas, cerca de 90% dos casos humanos de LV têm sido registrados no Brasil, onde foi observado um aumento progressivo no número de notificações dessa endemia. Atualmente, o calazar está registrado em 19 dos 27 estados, atingindo quatro das cinco regiões geográficas do País (Monteiro, 2002). Sua maior incidência é no Nordeste, com
24

92% do total das notificações, seguido pelas regiões Sudeste (4%), Norte (3%) e Centro- Oeste (1%) (Vieira & Coelho, 1998). Esses dados estão associados às precárias condições socioeconômicas da população, evidenciadas nos locais de maior prevalência (Almeida- Silva, 2002)

Distribuição de Leishmaniose Visceral no Brasil 1980 a 2003

RR: 296

A leishmaniose visceral, inicialmente, era considerada uma doença de caráter exclusivamente rural. Entretanto, Deane (1956) observou, no Brasil, o fenômeno da urbanização

RN: 1391

PE: 2904

AL: 1857

SE: 2153

da

doença

e,

notadamente,

desde a década

de

70,

esse

fato

está

consolidado

AP: 1 AM: 2 PA: 1416 MA: 7171 CE: 6367 PI: 6302 AC: 0 RO:
AP: 1
AM: 2
PA: 1416
MA: 7171
CE: 6367
PI: 6302
AC: 0
RO: 0
TO: 1379
MT: 99
BA: 15.488
DF: 3
GO: 262
MG: 2.515
MS: 945
ES: 119
SP: 413
RJ: 73
PR: 1
SC: 0
RS: 1
MS: 945 ES: 119 SP: 413 RJ: 73 PR: 1 SC: 0 RS: 1 Nº de

Nº de casos/UF 1980 a 2003 Fonte: MS/SVS; SES e SINAM a partir de 1998

em cidades de médio e grande porte tais como Teresina, Fortaleza, São Luís do Maranhão, Santarém,

Recife, Salvador, Rio de Janeiro, Belo Horizonte e Montes Claros, entre outras (Marzochi et al., 1983; Badaró et al., 1986c; Tavares, 2000; Mendes et al., 2000; Oliveira et al., 2001; Silva et al., 2001).

O crescimento desordenado das cidades,

ocasionando a destruição do meio ambiente, e o aumento da crise social têm sido apontados como principais e determinantes promotores das condições adequadas para ocorrência da leishmaniose visceral humana (LVH) na área urbana. Além disso, a identificação da doença nos centros urbanos é freqüentemente postergada, devido à carência de informação e treinamento adequados para os profissionais da saúde (Almeida- Silva, 2002).

No Brasil, a leishmaniose visceral canina tem precedido a ocorrência de casos humanos.

A infecção em cães tem sido mais prevalente, constituindo um severo problema de saúde pública em todo o País.

A cadeia epidemiológica da leishmaniose visceral inclui a presença, concomitante, do

vetor, do reservatório, do parasita e do hospedeiro susceptível. Cada elo dessa cadeia tem sido estudado em detalhes, objetivando obter maior compreensão da doença para otimizar

o seu controle (Almeida-Silva, 2002).

Número de casos e coeficiente de incidência de leishmaniose cutânea, Brasil - 1985 a 2005

Incidência por 100 mil Habitantes 40.000 25 35.000 20 30.000 25.000 15 20.000 10 15.000
Incidência por 100 mil Habitantes
40.000
25
35.000
20
30.000
25.000
15
20.000
10
15.000
10.000
5
5.000
0
0
1985
1988
1991
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Nº de Casos
13.654
25.153
28.450
35.103
35.748
30.030
31.303
21.801
32.439
33.720
37.713
34.156
31.379
28.712
24.291
Incidência
11,60
21,37
19,43
22,85
21,62
19,34
19,61
14,67
20,50
15,48
17,79
21,47
17,71
15,79
13,19
Número de casos

Fonte: COVEV/ CCDT/ DEVEP/ SVS/ MS

Número de casos e coeficiente de incidência de leishmaniose visceral, Brasil - 1985 a 2005

Incidência por 100 mil Habitantes 6.000 3 5.000 2,5 4.000 2 3.000 1,5 2.000 1
Incidência por 100 mil Habitantes
6.000
3
5.000
2,5
4.000
2
3.000
1,5
2.000
1
1.000
0,5
0
0
1985
1988
1991
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
Nº de Casos
2.224
816
1.510
3.426
3.885
3.246
2.570
1.977
3.624
4.858
3.646
3.102
2905
3418
3481
Incidência
1,89
0,69
1,03
2,23
2,49
2,09
1,61
1.33
2,29
2,23
1,72
1,95
1,64
1,88
1,89
Número de casos

26

Fonte: COVEV/ CCDT/ DEVEP/ SVS/ MS

Aspectos clínicos da doença em cães

Os cães são importantes reservatórios no ciclo doméstico da leishmaniose visceral (LV)

(Deane e Deane, 1962; Keenan et al., 1984a; Marzochi, et al., 1985) e são considerados

a principal fonte de infecção dos flebotomíneos devido à forte prevalência da infecção canina, quando comparada à infecção humana (Chagas et al., 1938; Deane, 1955

e 1956).

As manifestações clínicas da doença podem variar consideravelmente, sendo dependentes da interação da espécie do parasita, da resposta imunológica de cada hospedeiro e da fase atual da doença. O período de incubação da doença pode variar de 1 mês a 4 anos (Lanotte et al., 1979). Examinando cães infectados com L. infantum na Ilha de Elba (Itália), Mancianti et al. (1988) classificou clinicamente esses animais como:

animais assintomáticos: ausência de sinais ou sintomas sugestivos de infecção por Leishmania; animais oligossintomáticos: adenopatia linfóide, pequena perda de peso e/ou pêlo opaco; animais sintomáticos: todos ou alguns dos sinais sugestivos da doença, como: alterações cutâneas (alopecia, eczema furfuráceo, úlceras, hiperqueratose), onicogrifose, emagrecimento, ceratoconjuntivite e paresia dos membros posteriores. Entretanto, cães infectados podem permanecer clinicamente normais por um período muito longo de tempo. As principais manifestações clínicas na fase aguda da doença são linfadenomegalia generalizada, febre, apatia e ausência de lesões na pele (Alvar et al., 1994; Ciaramella et al.,1997 e Ferrer, 2003). As manifestações clínicas clássicas da leishmaniose visceral canina são linfadenomegalia, caquexia (enfraquecimento crônico do animal), lesões cutâneas como alopecia periocular, dermatite descamativa e seborréica, hiperqueratoses, úlceras com aspecto de queimaduras, nódulos subcutâneos

27

(que podem ser pequenos ou grandes) e erosões (mais freqüentes na ponta da orelha e nariz), onicogrifose, anemia, hepatoesplenomegalia, disfunção renal severa, aplasia de medula, trombose, colites, hemorragia nasal, pneumonias, lesões oculares e poliartrites (Abranches et al., 1991; Ciaramella et al., 1997 e Tafuri et al., 2001). Aproximadamente 50% a 60% dos cães infectados são assintomáticos, o que sugere a existência de animais resistentes ou com infecção recente na população. Cães infectados, mesmo assintomáticos, podem apresentar grande quantidade de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no ciclo biológico da doença.

de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no
de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no
de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no
de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no
de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no
de parasitos na pele, o que favorece a infecção do inseto vetor, permanecendo um elo no

Diagnóstico

O diagnóstico da leishmaniose visceral canina apresenta-se dificultado por vários fatores, principalmente devido à presença de manifestações clínicas variadas e à ausência de lesões características (patognomônicas) da doença. O médico veterinário conta com uma série de métodos de diagnóstico para auxiliá-lo na conclusão da suspeita clínica da doença. São eles:

Métodos sorológicos

São utilizados no diagnóstico da leishmaniose visceral e visam à

detecção de anticorpos específicos ao parasita. Em geral, as técnicas mais utilizadas são a Reação de Imunofluorescência Indireta (RIFI),

a Análise de Imunoadsorção por Ligação Enzimática (ELISA), o Teste

de Aglutinação Direta e o Western Blot, pois apresentam sensibilidade e especificidade que alcançam entre 80 e 100%. Cabe ressaltar que, geralmente, nos estágios iniciais da doença os cães são soronegativos, portanto, deve-se estar atento quando exames sorológicos forem utilizados no diagnóstico da doença.

Métodos parasitológicos

São métodos confirmativos por terem especificidade de 100% para o diagnóstico da leishmaniose visceral, porém apresentam sensibilidade relativamente baixa, em torno de 60 a 80%. Através deles, faz-se a detecção do parasita a partir de biópsias de tecidos ou aspirados de líquidos corporais.

O teste parasitológico mais simples e mais utilizado pelos veterinários

é a identificação microscópica das formas amastigotas, a partir da

confecção em lâminas de esfregaços de aspirados da medula óssea ou de linfonodos, coradas com Giemsa (Deane e Deane, 1955). Esse teste

é rápido, barato e de alta especificidade, entretanto, exibe baixa sensibilidade, pois

estudos demonstram ser a sensibilidade menor que 60% em aspirados de medula óssea e menor que 30% nos linfonodos. Análises histológicas da pele e linfonodos também são técnicas freqüentemente utilizadas para o diagnóstico da leishmaniose visceral, entretanto, deve-se procurar dissociar as alterações histopatológicas, como inflamação ou granuloma de um diagnóstico positivo da doença (Tafuri et al., 1996 e Tafuri et al., 2001). Este deverá ser confirmado pela presença das formas amastigotas do parasita. Entretanto, na maioria dos casos de leishmaniose visceral, poucas formas amastigotas estão presentes, o que dificulta a avaliação. Nessas situações, a análise histológica deve ser associada à imuno-histoquímica, que apresenta elevada sensibilidade e detecta o parasita em cortes de tecidos, através do uso de anticorpos específicos (Bourdoiseau et al., 1997 e Tafuri et al., 2004). Outra forma de diagnóstico corresponde ao isolamento do parasito através de cultura, in vitro ou pela inoculação de aspirados em animais de laboratório, como hamster (Sundar e Rai, 2002).

Métodos moleculares

Com o avanço da tecnologia biomédica, técnicas moleculares vêm sendo também

empregadas no diagnóstico da leishmaniose visceral. A detecção do DNA do parasita, pela técnica da PCR, é realizada através da coleta de amostra de vários tipos, como aspirados de medula óssea, sangue, linfonodos e tecidos. Essa técnica, apesar do custo elevado, apresenta alta sensibilidade e especificidade em torno de 100% e é

a mais utilizada em pacientes humanos (Mathis & Deplazes, 1995 e Reithinger & Davies, 2002).

Prevenção e controle

O controle da leishmaniose visceral tem como objetivo principal interromper a cadeia de

transmissão da doença em uma população. Essa medida é de difícil execução, por exigir uma perfeita integração das ações direcionadas ao ambiente e aos animais que nele vivem.

A

Organização Mundial da Saúde (OMS) recomenda o diagnóstico precoce

e

tratamento dos casos humanos, diagnóstico e sacrifício dos animais

soropositivos e a identificação e eliminação do vetor como medidas de controle da doença. Os cães são considerados infectados ao apresentar resultados soropositivos em testes de diagnóstico sorológico, ELISA e RIFI, conforme preconizado no Programa Nacional de Controle de Leishmaniose Visceral no Brasil. Dentre as medidas profiláticas contra a leishmaniose, o controle do vetor tem se mostrado eficaz na prevenção da doença. Diversas ações podem ser adotadas, visando a esse controle no animal ou no ambiente.

Controle

do

vetor

no

ambiente:

recomenda-se

borrifação

com

inseticidas à base de piretróides, remoção de qualquer espécie de matéria

orgânica em decomposição, mantendo o ambiente limpo e plantio de repelentes naturais, dentre outras.

Controle do vetor no animal: a utilização de inseticidas tópicos ou repelentes naturais em loções ou incorporados em coleiras tem se mostrado um método auxiliar eficaz contra a doença. Estes exercem efeito repelente e letal sobre os flebótomos, minimizando a possibilidade de ocorrência do repasto sanguíneo e, conseqüentemente, de infecção dos animais.

Imunoprofilaxia: é considerada a forma mais eficaz no controle da leishmaniose visceral canina por proteger o animal da doença e impedir que se torne um reservatório potencial do parasita, servindo como fonte de infecção dos vetores. É recomendado associar a outros métodos preventivos contra o vetor.

Resposta Imune

O desenvolvimento dos sintomas clínicos da leishmaniose visceral em animais infectados,

assim como a progressão da doença, está diretamente relacionado à fase atual da doença, ao estado físico e ao sistema imune de cada indivíduo. Em animais saudáveis e sem outras doenças intercorrentes, o aparecimento dos sintomas clínicos pode demorar longos períodos. Em contrapartida, animais debilitados estão mais sujeitos a apresentar sintomatologia clínica da doença mais rapidamente e de forma mais grave. Estudos em animais infectados com Leishmania mostram que a resistência ou a susceptibilidade à doença estão associadas ao desenvolvimento de uma resposta imune Th1 (resposta imune celular) ou Th2 (resposta imune humoral), respectivamente (Tabela

1).

O

desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 é essencial para resistência e proteção

à

infecção por Leishmania chagasi. A produção de níveis elevados de IFN-γ é fundamental

e

constitui um marcador desse tipo de resposta. Níveis de IgG2 específicos contra

antígenos do parasita correlacionam também com esse tipo de resposta que é favorável para o combate da doença no organismo. Na resposta Th1, citocinas como interferon-

gama (IFN-γ), interleucina 2 (IL-2), interleucina 12 (IL-12) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) são produzidas e atuam combatendo o parasita invasor. A elevação dos níveis de IgG2 também está associada a proteção, sendo encontrada em animais resistentes

à infecção (Oliveira da Silva et al., 2001). Sendo, assim, esse o perfil imunológico ideal favorável à proteção do animal. Por outro lado, a resposta Th2 está envolvida com um aumento na produção de citocinas

como interleucina 4 (IL-4), interleucina 5 (IL-5), interleucina 6 (IL-6), interleucina 10 (IL-10)

e interleucina 13 (IL-13), as quais favorecem o desenvolvimento da doença em animais

infectados e com o aumento de anticorpos do subtipo IgG1, sendo assim desfavorável para o controle da leishmaniose visceral (Heinzel et al., 1989; Heinzel et al., 1993; Scharton & Scott, 1993; Sypek et al.; Belkaid et al., 2001; Jones et al., 2002 e Ji et al., 2003).

Desenvolvimento da doença

Proteção contra a doença

Resposta imune humoral

Resposta imune celular

Resposta Th2

Resposta Th1

Níveis baixos de IFN- γ

Níveis altos de IFN- γ

Aumento dos níveis de IL-10

Aumento dos índices de IL-2 e IL-12

Aumento dos níveis de IgG1

Aumento dos níveis de IgG2

Tabela 1: Resposta Imune Leishmaniose Visceral Canina

Vacinas recombinantes

As atuais estratégias utilizadas para o controle da leishmaniose visceral consistem na detecção dos cães infectados, seguida do seu sacrifício, no controle do vetor e no tratamento dos casos humanos. Entretanto, tais medidas não têm se mostrado eficazes. Dessa forma, o desenvolvimento de vacinas caninas surge como uma estratégia importante no controle da doença (Tesh, 1995). As vacinas convencionais, em sua maioria, são compostas por partículas íntegras de microrganismos, contendo inúmeras proteínas não relacionadas com a resposta imune ou até mesmo relacionadas à imunossupressão do indivíduo. Enormes vantagens foram trazidas pela Tecnologia do DNA Recombinante. As vacinas recombinantes são derivadas de modificações genéticas em microrganismos. Elas podem ser compostas por proteína ou por vírus recombinante e apresentam a vantagem de permitir uma avaliação detalhada da resposta imune induzida pela imunização. Outra vantagem das vacinas recombinantes está associada ao fato de que é possível empregar antígenos extremamente bem caracterizados, em que todas as propriedades imunogênicas (epítopos) das diferentes porções da molécula possam ser identificadas e caracterizadas. Com isso, resolvem-se os inconvenientes das vacinas constituídas por porções purificadas diretamente do parasita e da presença de epítopos que possam estar associados a mecanismos supressores da resposta imune e de evasão típicos do microrganismo. Em ambos os casos, tem-se a eliminação do patógeno para dar lugar a um ativo que não tem relação com a doença, tornando o produto altamente seguro e capaz de induzir resposta imune protetora. Diversas preparações vacinais têm sido estudadas em camundongos e/ou cães contra a infecção com Leishmania, incluindo formas promastigotas mortas, promastigotas vivas atenuadas ou irradiadas (revisto por HANDMAN, 2001). Estudos recentes têm empregado antígenos na forma de vacinas recombinantes. Dentre os antígenos que têm sido avaliados, encontra-se o antígeno A2, que atualmente é considerado o antígeno de Leishmania melhor caracterizado, capaz de induzir uma resposta imune protetora contra leishmaniose visceral canina. Esse antígeno é um fator de virulência de Leishmania, associado à capacidade de
34

visceralização dos parasitas.

Artigo científico publicado demonstrando a caracterização do antígeno A2.

Vaccine, v.26, p.4585 - 4593, 2008. Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation with IFN-g and cytolytic activity by CD8+ T cells. RESENDE, D. M., CAETANO, B, DUTRA, M., BRUNA-ROMERO, O, FERNANDES, A. P., GAZZINELLI, R. T.

A proteína A2

O antígeno A2 é uma proteína específica do estágio amastigota de várias espécies

de Leishmania e foi identificado inicialmente na espécie L. donovani por Charest &

Matlashewski (1994). Análises cariotípicas realizadas por Southern-blot de várias espécies

de Leishmania revelaram que os genes A2 são conservados nas espécies L. donovani, L.

infantum, L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana, o que é importante para indução da proteção cruzada entre espécies diferentes (Ghedin et al., 1997).

A vacina é composta pelo ativo A2 (proteína recombinante), adjuvante e excipiente. A

proteína recombinante foi obtida a partir de gene de Leishmania donovani e sua identidade foi confirmada por meio de testes laboratoriais, frente à proteína existente na forma amastigota nativa. Esta comprovação é importante, uma vez que se pretende utilizar esta proteína como antígeno em imunizações contra leishmaniose visceral canina e é sabido

que a forma amastigota é a mantida pelo protozoário no hospedeiro mamífero.

Vários estudos demonstraram que o antígeno A2, específico do estágio amastigota de Leish- mania, tem grande potencial como antígeno vacinal, pois anticorpos anti-A2 foram detectados em amostras de soro de pacientes e cães acometidos pela leishmaniose visceral, mostrando que a proteína A2 é altamente antigênica (Ghedin et al., 1997 e Carvalho et al., 2002).

A proteína A2 representa o primeiro fator de virulência amastigota-específico identificado em L. donovani (Zhang & Matlashewski,1997). Ao avaliarem a infecção de macrófagos in

vitro e de camundongos BALB/c por amastigotas deficientes na produção da proteína A2 (obtidas pela inibição da expressão do gene A2), observaram que houve uma diminuição na proliferação dos parasitas no interior dos macrófagos e da carga parasitária avaliada pela LDU, através de esfregaços por aposição do fígado dos animais infectados. A introdução do gene A2 de L. donovani em L. major resultou num aumento significativo do tamanho do baço e do número de parasitas neste órgão (LDU) nos camundongos estudados. Esse achado pode estar relacionado com a diferença que existe na estrutura do gene A2 entre

as espécies causadoras da infecção visceral e cutânea. Essa diferença na estrutura do

gene pode ser uma possível explicação para o variado tropismo entre as espécies (Zhang

& Matlashewski, 2001).

Alguns trabalhos foram realizados utilizando o antígeno A2 como candidato à vacina. Em geral, esses antígenos são testados primeiramente em camundongos e posteriormente em cães. Estudos conduzidos pela equipe de pesquisadores da UFMG permitiram identificar nesse antígeno o epítopo responsável pela indução da produção de anticorpos em camundongos vacinados e, talvez mais importante, os epítopos associados

à indução de resposta celular e que, nesse antígeno, estão associados à

indução de resposta do tipo Th1 e, portanto, proteção.

A imunização com o antígeno A2 foi capaz de induzir proteção significativa

contra a infecção por L. donovani e L. amazonensis e L. chagasi em camundongos (estudos de Fase I) e em cães (estudos de Fase II e trabalhos de campo). Os níveis de proteção observados foram associados à resposta imune Th1, caracterizada por altos níveis de IFN-γ específica à proteína A2, bem como reduzida produção de IL-4 e IL-10 em animais imunizados. Além disso, apresentaram redução significativa da carga parasitária, quando comparados aos grupos controle (Ghosh et al, 2001; Ghosh et al., 2002; COELHO et al., 2003; COELHO,

2004).

Portanto, o antígeno A2 recombinante induziu uma resposta imune protetora e se mostrou eficaz contra a leishmaniose visceral canina.

Proteína A2 codificada
Proteína A2 codificada

Espaço científico

Publicações sobre a proteína A2

Proc. Natl. Acad. Sci. USA, v. 94, p. 8807–8811, (Aug) 1997 Loss of virulence in Leishmania

donovani deficient in an amastigote-specific protein, A2 Matlashewski.

Wen-Wei Zhang e Greg

Molecular and Biochemical Parasitology,v. 78, p.79-90, (Mar) 1996 Identification and overexpression of the A2 amastigote-specific protein in Leishmania donovani Wen- Wei Zhang, Hugues Charest, Elodie Ghedin e Greg Matlashewski.

BMC Infectious Diseases, v. 5, n. 18, (Mar) 2005 A2 gene of Old World cutaneous Leishmania is a single highly conserved functional gene Yves JF Garin, Pascale Meneceur, Francine Pratlong, Jean-Pierre Dedet, Francis Derouin e Frédéric Lorenzo

The Journal of Biological Chemistry, v. 278, n. 37, p. 35508–35515, (Sep) 2003 Comparison of the A2 gene locus in Leishmania donovani and Leishmania major and its control over cutaneous infection Wen-Wei Zhang, Susana Mendez, Anirban Ghosh, Peter Myler, Al Ivens, Joachim Clos, David L. Sacks e Greg Matlashewski

Infection and immunity, v. 74, n. 12, p. 6940–6948, (Dec) 2006 Leishmania chagasi T-cell antigens identified through a double library screen Daniella R. A. Martins, Selma M. B. Jeronimo, John E. Donelson, e Mary E. Wilson

Vaccine, v. 20, p. 59–66, (Jul) 2002 Immunization with A2 protein results in a mixed Th1/Th2 and a humoral response which protects mice against Leishmania donovani infections Anirban Ghosh, Wen Wei Zhang e Greg Matlashewski

Journal of Bioscience and Bioengineering, v. 101, n. 3, p. 203-211, (Nov) 2006. REVIEW - Immunogenic and allergenic potentials of natural and recombinant innocuous proteins Tsukasa Matsuda, Takeski Matsubara e Shingo Hino

Infect Immun., v. 71, n. 7, p. 3988–3994, (Jul) 2003. Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 Antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection Eduardo Antonio Ferraz Coelho, Carlos Alberto Pereira Tavares, Fernando Aécio Amorim Carvalho, Karina Figueiredo Chaves, Kadima Nayara Teixeira, Rafaela Chitarra Rodrigues, Hugues Charest, Greg Matlashewski, Ricardo Tostes Gazzinelli, e Ana Paula Fernandes

Microbes and Infection, v. 9, n. 9, p. 1070-1077, (Jul) 2007 Evaluation of immune responses and protection induced by A2 and nucleoside hydrolase (NH) DNA vaccines against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis experimental infections Francisca H.C. Zanin, Eduardo A.F. Coelho, Carlos A.P. Tavares, Eduardo A. Marques-Da-Silva, Miriam Maria Silva Costa, Simone A. Rezende, Ricardo T. Gazzinelli e Ana Paula Fernandes

Vaccine, v.26, p.4585 - 4593, 2008. Epitope mapping and protective immunity elicited by adenovirus expressing the Leishmania amastigote specific A2 antigen: Correlation with IFN-g and cytolytic activity by CD8+ T cells. RESENDE, D. M., CAETANO, B, DUTRA, M., BRUNA-ROMERO, O, FERNANDES, A. P., GAZZINELLI, R. T.

Vaccine (2008), doi:10.1016/j, in press. Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein.Ana Paula Fernandes, Miriam Maria Silva Costa, Eduardo Antonio Ferraz Coelho, Eloisa de Freitas, Christiane de Freitas Abrantes, Vinícius Hermont; Wagner Luiz Tafuri, Maria Norma Melo, Marilene Suzan Marques Michalick and Ricardo T. Gazzinelli.

Apresentações em congressos científicos

Immunization with the A2 antigen against Leishmania (L.) amazonensis infection:

comparison of the protection induced by protein or DNA vaccination. COELHO, E.A.F.; FERNANDES, A.P.S.M.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.; TEIXEIRA, K.N.; GOMES, B.A.; Costa, J.P.; TAVARES, C.A.P. ESTE TRABALHO FOI ELEITO COMO O MELHOR TRABALHO NA ÁREA DE IMUNOLOGIA, TENDO SIDO PREMIADO NO REFERIDO CONGRESSO. XXX ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS DISEASE. XIX MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 10 a 12/11/2003.

Immune responses induced by Leishmania (L.) donovani A2, but not by LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (L.) amazonensis infection. COELHO, E.A.F.; FERNANDES, A.P.S.M.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.; TEIXEIRA, K.N.; TAVARES, C.A.P. XXX ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS DISEASE. XIX MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 10 a

12/11/2003.

Assessment of the efficacy of immunization with a recombinant antigen expressed in Leishmania amazonensis amastigotes. COELHO, E.A.F.; FERNANDES, A.P.S.M.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A.; CHAVES, K.F.; RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; TAVARES, C.A.P. ESTE TRABALHO FOI ELEITO COMO O MELHOR TRABALHO NA ÁREA DE IMUNOLOGIA, TENDO SIDO PREMIADO NO REFERIDO CONGRESSO. ENAPEBI - ENCONTRO ANUAL DE PESQUISA EM BIOQUIMICA E IMUNOLOGIA DA UFMG. Belo Horizonte, 03 a

06/06/2003.

Assessment of the efficacy of immunization with a recombinant antigen expressed in Leishmania amazonensis amastigotes. COELHO, E.A.F., TAVARES, C.A.P.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; FERNANDES, A.P.S. M. XXIX ANNUAL MEETING ON BASIC RESEARCH IN CHAGAS DISEASE. XVIII MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF PROTOZOOLOGY. Caxambu, 04 a 06/11/2002.

Assessment of the efficacy of immunization with a recombinant antigen expressed in Leishmania amazonensis amastigotes. COELHO, E.A.F., TAVARES, C.A.P.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; FERNANDES, A.P.S.M. XXVII MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. V INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY. Bahia, 20 a 23/11/2002.

Assessment of the efficacy of immunization with recombinant antigens expressed in amastigotes of Leishmania amazonensis. COELHO, E.A.F., FERNANDES, A.P.; CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., GAZZINELLI, R.T., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; TAVARES, C.A.P. I ENCONTRO DA PÓS-GRADUAÇÃO ENTRE BIOQUÍMICA E IMUNOLOGIA E CIÊNCIAS BIOLÓGICAS FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA. Belo Horizonte, 17 a 21/06/2002.

Avaliação da capacidade da proteína A2 recombinante de induzir proteção contra a infecção por Leishmania amazonensis em camundongos. RODRIGUES, R.C.; COELHO, E.A.F.; TAVARES, C.A.P.; CARVALHO, F.A.A.; CHAVES, K.F.; FERNANDES, A.P., ESTE TRABALHO FOI SELECIONADO ENTRE OS MELHORES TRABALHOS DA ÁREA DE CIÊNCIAS DA SAÚDE. X SEMANA DE INICIAÇÃO CIENTÍFICA. Belo Horizonte, 21 a 23/02/2002.

Assessment of immunization efficiency using recombinant antigens from amastigotes of Leishmania amazonensis. COELHO, E.A.F., CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., GAZZINELLI, R.T., TAVARES, C.A.P., FERNANDES, A.P. XXVI MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. Campos do Jordão, 07 a 10/10/2001.

Th1 adjuvants are required to induce a protective response against Leishmania amazonensis infection. COELHO, E.A.F., TAVARES, C.A.P.; GAZZINELLI, R.T.; CARVALHO, F.A.A., CHAVES, K.F., RODRIGUES, R.C.; TEIXEIRA, K.N.; FERNANDES, A.P.S. M. XXVII MEETING OF THE BRAZILIAN SOCIETY OF IMMUNOLOGY. V INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON ALLERGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY. Bahia, 20 a 23/11/2002.

Desenvolvimento da Leish-Tec ® - Fase I

Para o desenvolvimento de vacinas contra leishmaniose, é exigida pelo Ministério da Agricultura, Abastecimento e Pecuária a realização de testes para a comprovação de resultados.

Introdução

As propriedades imunogênicas do antígeno A2 recombinante foram demonstradas no trabalho de Fase I, tendo como resultado a capacidade de conferir proteção em camundongos BALB/c contra a infecção desafio com L. donovani, L. chagasi e L. amazonensis. A proteção foi associada à elevada resposta imune Th1, específica ao parasita e caracterizada pela grande produção de IFN-γ.

Descrição do experimento Estudos conduzidos pelos doutores Ricardo Tostes Gazzinelli e Ana Paula Fernandes realizados na Universidade Federal de Minas Gerais. Foi avaliada a proteção conferida pela imunização com o antígeno A2 vacinal em camundongos BALB/c como modelo experimental. Grupos de animais utilizados como controle negativo e positivo da doença e o grupo vacinado. Desafio via endovenosa ou subcutânea com elevada carga de protozoários.

Relato

Em nossos estudos, realizamos a clonagem em plasmídeos de expressão em células eucariotas e procariotas do gene codificador do antígeno A2 e avaliamos a proteção conferida pela imunização com esse antígeno, sob a forma de proteína recombinante associada à adjuvante de resposta imune Th1 ou de DNA, contra a infecção desafio com

L. amazonensis, em camundongos BALB/c. A imunização com o antígeno A2, tanto sob a forma de proteína quanto de DNA, foi capaz de conferir proteção contra o desafio com L. amazonensis. Os animais vacinados apresentaram níveis significativamente maiores de IFN-γ e menores de IL-4 e IL-10 quando comparados aos animais- controles infectados. Observaram-se baixos níveis de anticorpos específicos ao parasita (Coelho et al., 2003) e também a presença de anticorpos IgG2 específicos à proteína A2. Os resultados indicaram, portanto, o potencial de utilização da proteína A2 como candidata à vacina contra leishmaniose, principalmente, contra espécies que apresentam seus genes conservados, como L. donovani, L. infantum, L. chagasi, L. amazonensis e L. mexicana.

Resultados

Fígado Baço 9 9 8 8 7 7 6 6 5 5 4 4 3
Fígado
Baço
9
9
8
8
7
7
6
6
5
5
4
4
3
3
2
2
1
1
0
0
Log of parasite numbers
Log of parasite numbers

PBS1 1 0 0 Log of parasite numbers Log of parasite numbers DNA pCDNA3 DNA A2

DNA pCDNA30 0 Log of parasite numbers Log of parasite numbers PBS DNA A2 As setas indicam

DNA A2of parasite numbers Log of parasite numbers PBS DNA pCDNA3 As setas indicam a redução de

As setas indicam a redução de carga parasitária, determinada pelo método de diluição limitante, em camundon- gos BALB/c vacinados com DNA A2 e desafiados com Leishmania chagasi. Como controles, animais receberam apenas DNA controles (DNA pCDNA3) ou solução salina.

10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 PBS rIL-12 rA2 rA2/rIL-12
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
PBS
rIL-12
rA2
rA2/rIL-12
rA2/ C.
DNA A2
DNA A2/
parvum
DNA IL-12
Log of parasite numbers at skin

Redução do número de parasitos na pele de camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 ou com proteína recombinante A2, associados a Corynebacterium parvum ou interleucina-12 (rIL-12) e infectados com Leishmania amazonensis.

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0 Meio A2 SLA LLa IFN-gamma
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
Meio
A2
SLA LLa
IFN-gamma (pg/mL)

PBS3000 2000 1000 0 Meio A2 SLA LLa IFN-gamma (pg/mL) rIL-12 rA2 rA2/rIL-12 rA2/ C. parvum

rIL-122000 1000 0 Meio A2 SLA LLa IFN-gamma (pg/mL) PBS rA2 rA2/rIL-12 rA2/ C. parvum DNA

rA21000 0 Meio A2 SLA LLa IFN-gamma (pg/mL) PBS rIL-12 rA2/rIL-12 rA2/ C. parvum DNA A2

rA2/rIL-121000 0 Meio A2 SLA LLa IFN-gamma (pg/mL) PBS rIL-12 rA2 rA2/ C. parvum DNA A2

rA2/ C. parvumA2 SLA LLa IFN-gamma (pg/mL) PBS rIL-12 rA2 rA2/rIL-12 DNA A2 DNA A2/ DNA IL-12 Níveis

DNA A2IFN-gamma (pg/mL) PBS rIL-12 rA2 rA2/rIL-12 rA2/ C. parvum DNA A2/ DNA IL-12 Níveis de IFN-

DNA A2/ DNA IL-12(pg/mL) PBS rIL-12 rA2 rA2/rIL-12 rA2/ C. parvum DNA A2 Níveis de IFN- γ produzidos por

Níveis de IFN- γ produzidos por esplenócitos de camundongos BALB/c vacinados com DNA A2 ou proteína A2, associados a Coryne- bacterium parvum ou interleucina-12 (rIL-12) em resposta ao estímulo com A2 ou com extrato total de antígenos de Leishmania.

1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Antes do desa o Após o desa o
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Antes do desa o
Após o desa o
Abs 492 nm

PBS0,4 0,2 0 Antes do desa o Após o desa o Abs 492 nm rlL-12 rA2

rlL-120,2 0 Antes do desa o Após o desa o Abs 492 nm PBS rA2 rA2/rIL-12

rA20 Antes do desa o Após o desa o Abs 492 nm PBS rlL-12 rA2/rIL-12 C.

rA2/rIL-12Antes do desa o Após o desa o Abs 492 nm PBS rlL-12 rA2 C. parvum

C. parvumo Após o desa o Abs 492 nm PBS rlL-12 rA2 rA2/rIL-12 rA2/C. parvum SLA/rIL-12 Níveis

rA2/C. parvumo desa o Abs 492 nm PBS rlL-12 rA2 rA2/rIL-12 C. parvum SLA/rIL-12 Níveis de anticorpos

SLA/rIL-12Abs 492 nm PBS rlL-12 rA2 rA2/rIL-12 C. parvum rA2/C. parvum Níveis de anticorpos IgG no

Níveis de anticorpos IgG no soro de animais imunizados, antes e após a infecção, que reagem em ELISA com ex- trato de antígenos totais do parasita. Neste teste, camundongos BALB/c receberam vacinas contendo a proteína A2 em associação ao Corynebacterium parvum (C. parvum) ou interleucina 12 (rIL-12) como adjuvantes. Como controles, camundongos BALB/c receberam solução salina (PBS) ou somente C. parvum ou rIL-12 ou ainda extrato total de antí- genos de formas promastigotas de Leishmania associado a IL-12 (SLA/rIL-12). Anticorpos IgG foram dosados no soro dos animais antes e após a infecção.

Resultados e discussão

a) Nos

camundongos que desenvolveram a doença.

b) Todos os controles positivos infectados desenvolveram a doença e

apresentaram níveis elevados de parasitas em órgãos como fígado, baço e pele.

c) Os camundongos vacinados apresentaram redução expressiva da

carga parasitária e a resposta imune desenvolvida por estes tem perfil

Th1.

d)

vacinados.

e) Os camundongos mantiveram, após vacinação, sorologia não reativa

contra anticorpos de antígeno total do parasita.

testes

apresentados,

é

bem

definida

a

resposta

Th2

em

Os

elevados

níveis

de

IFN-γ

foram

encontrados

em

animais

45

Conclusões

a) A imunização com o antígeno A2-HIS foi capaz de conferir proteção contra o desafio

com L. amazonensis e L. chagasi.

b) Os animais vacinados apresentaram níveis significativamente maiores de IFN-γ e

menores de IL-4 e IL-10, quando comparados aos animais controles infectados.

c) Observaram-se baixos níveis de anticorpos específicos ao parasita (Coelho et al.,

2003), reafirmando a manutenção da soronegatividade para leishmaniose dos animais vacinados.

d) Observada a presença de anticorpos IgG2 específicos à proteína A2, caracterizando a

resposta Th1 protetora.

Artigos científicos publicados referentes à Fase I

Infect Immun., v. 71, n. 7, p. 3988–3994, (Jul) 2003. Immune responses induced by the Leishmania (Leishmania) donovani A2 Antigen, but not by the LACK antigen, are protective against experimental Leishmania (Leishmania) amazonensis infection Eduardo Antônio Ferraz Coelho, Carlos Alberto Pereira Tavares, Fernando Aécio Amorim Carvalho, Karina Figueiredo Chaves, Kadima Nayara Teixeira, Rafaela Chitarra Rodrigues, Hugues Charest, Greg Matlashewski, Ricardo Tostes Gazzinelli e Ana Paula Fernandes.

Microbes and Infection., v.9, p.1070 - 1077, 2007. Evaluation of Immune Responses and Protection Induced by A2 and Nucleoside Hydrolase (NH) DNA vaccines Against Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis Experimental

.ZANIN, F. H. C., COELHO, E. A. F., MARQUES-DA-SILVA, E., REZENDE,

S. A., COSTA, M. M. S., TAVARES, C. A. P., GAZZINELLI, R. T., FERNANDES, A. P.

Infections.

Desenvolvimento da Leish-Tec ® - Fase II

Objetivo geral

Avaliar a imunogenicidade da proteína recombinante A2-HIS, sob a forma da vacina comercial Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina na proteção de cães da raça Beagle contra a infecção desafio com L. chagasi.

Objetivos específicos

a) Imunizar grupos de cães com a vacina Leish-Tec® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina e grupos controle com PBS e com adjuvantes.

b) Avaliar a resposta imune humoral através dos níveis de anticorpos IgG

total e dos isotipos IgG1 e IgG2 específicos à proteína A2 recombinante e ao extrato solúvel do parasita (LcPA) em amostras de soro dos animais antes e após as imunizações e após a infecção desafio com L. chagasi.

c) Avaliar a resposta imune celular através da dosagem de IFN-gama, por

ELISA de captura, após a coleta e cultivo de PBMC (Peripheral blood mononuclear cells) e o estímulo com a proteína A2-HIS e com o extrato

solúvel dos parasitos, antes da infecção desafio com L. chagasi.

Descrição do experimento

a) Executado em canil experimental da Hertape Calier em parceria

com a UFMG.

b) Utilizados cães da raça Beagle, mantidos por doze meses nos canis.

Durante esse período, os animais, foram submetidos a um programa de vermifugação e imunização de rotina (vacinas contra parvovirose,

cinomose, hepatite infecciosa canina, parinfluenza, coronavirose e leptospiroses). Foram também investigados por meio de exames laboratoriais a respeito de seu perfil imunológico geral, clínico e soro-negatividade para leishmaniose.

c) Os animais receberam três doses de Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra

Leishmaniose Visceral Canina, com intervalos de 21 dias entre elas, conforme

programa vacinal previsto.

d) Grupos de cães utilizados:

f

vacinados e desafiados;

f

vacinados e não desafiados;

f

adjuvante e desafiados;

f

placebo e desafiados;

f

placebo e não desafiados.

e) Os cães foram monitorados mensalmente por meio de exames laboratoriais, com

o objetivo de verificar o estado geral do cão e a evolução sorológica distinta entre

grupo vacinado e não vacinado. Exames executados:

f

hemograma completo;

f

dosagem da taxa de uréia;

f

dosagem da taxa de creatinina;

f

proteínas totais e frações;

f

relação albumina/globulina;

f

exames sorológicos, ELISA e RIFI, contra antígeno total do parasita (SLA) e

contra o antígeno vacinal A2 recombinante. f) O perfil da resposta imune humoral e celular nos animais vacinados e/ou desafiados por L. chagasi. f Avaliados através da produção de anticorpos e citocinas específicas, respectivamente, para a proteína A2-HIS e ao extrato solúvel de L. chagasi.

f As dosagens sorológicas e de citocinas foram conduzidas antes e após a

infecção desafio. f A avaliação sorológica dos cães foi realizada através de reação de imunofluorescência (RIFI) e ELISA.

f Nas reações de ELISA foram utilizados como antígenos o extrato solúvel de L.

chagasi ou a proteína A2-HIS com amostras de soro dos cães coletadas antes das imunizações, após cada dose das vacinas e periodicamente após a infecção desafio. f Foram determinados os níveis dos anticorpos IgG total e dos isotipos IgG1 e IgG2, que se correlacionam com a resposta celular do tipo Th2 e Th1, respectivamente.

f A resposta celular das citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-10, foi avaliada em

amostras de RNA extraídas de PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cells) dos cães imunizados, antes e após o desafio, conforme descrito

por Ramiro et al. (2003).

f Análises por ELISA de captura das citocinas também foram realizadas

através da coleta do sangue e da separação e cultura de PBMC, com posterior estímulo com a proteína A2-HIS ou com o extrato solúvel de L. chagasi.

Resultados Resposta Humoral

IgG Total Anti-A2

1,8 ANTI-A2 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Imunização Ap ós o
1,8
ANTI-A2
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
Imunização
Ap
ós o desa o
Abs (492 nm)
Antes da
Imunização
1ª Dose
2ª Dose
3ª Dose
1º Mês
6º Mês
8º Mês

IgG Total Antipromastigota

VI VNI I AD
VI
VNI
I
AD
2 ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE ANTIGENIC EXTRACT 1,8 1,6 VI 1,4 1,2 VNI 1 I 0,8 0,6
2
ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE
ANTIGENIC EXTRACT
1,8
1,6
VI
1,4
1,2
VNI
1
I
0,8
0,6
AD
0,4
0,2
0
Imunização
Ap
ós o desa o
Abs (492 nm)
Antes da
Imunização
1ª Dose
2ª Dose
3ª Dose
1º Mês
6º Mês
8º Mês

IgG 2 Total Anti-A2

ANTI-A2 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Imunização Ap ós o desa o Abs (492
ANTI-A2
2,5
2
1,5
1
0,5
0
Imunização
Ap
ós o desa o
Abs (492 nm)
Antes da
Imunização
1ª Dose
2ª Dose
3ª Dose
1º Mês
6º Mês
8º Mês
VI VNI I AD
VI
VNI
I
AD

IgG 2 Total Antipromastigota

ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE ANTIGENIC EXTRACT 1 0,9 VI 0,8 0,7 VNI 0,6 0,5 I 0,4 0,3
ANTI-TOTAL PROMASTIGOTE
ANTIGENIC EXTRACT
1
0,9
VI
0,8
0,7
VNI
0,6
0,5
I
0,4
0,3
AD
0,2
0,1
0
Imunização
Ap
ós o desa o
Abs (492 nm)
Antes da
Imunização
1ª Dose
2ª Dose
3ª Dose
1º Mês
6º Mês
8º Mês

IgG 1 Total Anti-A2

ANTI-A2 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Imunização Ap ós
ANTI-A2
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Imunização
Ap
ós o desa o
Abs (492 nm)
Antes da
Imunização
1ª Dose
2ª Dose
3ª Dose
1º Mês
6º Mês
8º Mês

IgG1 Anti-A2

VI VNI I AD
VI
VNI
I
AD

IgG 1 Total Antipromastigota

0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Imunização Ap ós o desa
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
Imunização
Ap
ós o desa o
Abs (492 nm)
Antes da
Imunização
1ª Dose
2ª Dose
3ª Dose
1º Mês
6º Mês
8º Mês
VI VNI I AD
VI
VNI
I
AD

Resposta Celular

7000

6000

5000

4000

3000

2000

1000

0

Control rA2 Vaccinated PBS
Control
rA2
Vaccinated
PBS

Produção de IFN-γ por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a vacina Leish-Tec®, antes da infecção desafio por L. chagasi.

4000 3500 3000 Medium 2500 rA2 2000 LcPA 1500 1000 500 0 IFN-g(pg/mL)
4000
3500
3000
Medium
2500
rA2
2000
LcPA
1500
1000
500
0
IFN-g(pg/mL)

Vaccinated/Infected

Infected

Produção de IFN-γ por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a vacina Leish-Tec®, após a infecção desafio por L. chagasi.

300

250

200

150

100

50

0

A2 LcPa ConA Medium Vaccinatedand Infected Infected
A2
LcPa
ConA
Medium
Vaccinatedand Infected
Infected

Produção de IL-10 por células mononucleadas do sangue periférico (PBMC) de cães da raça Beagle imunizados com a vacina Leish-Tec®, após a infecção desafio por L. chagasi.

Conclusões

a) Os dados obtidos através dos marcadores de resposta imune empregados (dosagem

de anticorpos IgG total, IgG1 e IgG2 e das citocinas IFN-γ e IL-10) indicam que essa formulação vacinal é capaz de induzir resposta imune do tipo Th 1 (níveis elevados

de IgG2 e IFN-gama) e, portanto, associada com desenvolvimento de proteção em todos os animais vacinados, antes da infecção desafio.

b) Animais imunizados com a vacina Leish-Tec ® apresentaram elevada produção de

IFN-γ antes da infecção desafio em cultivo de PBMC estimulados com a proteína recombinante A2, quando comparados aos grupos de cães tratados com PBS (“Controle”) e Adjuvante, sob o mesmo estímulo.

c) No grupo de cães imunizados com a vacina Leish-Tec ® , houve aumento significativo

na produção de anticorpos específicos à proteína recombinante A2 quando comparados ao grupo “Adjuvante”, após a segunda e terceira doses da vacina, e, quando comparados aos grupos “Adjuvante” e “Controle”, após a infecção desafio.

d) A produção de anticorpos anti-LcPA mostrou-se significativamente maior somente

após a infecção desafio, nos grupos “Controle” e “Vacinado”, quando comparados à

produção que ocorreu após as imunizações.

e) Os animais do grupo “Vacinado” apresentaram uma produção significativamente

maior de IgG2, específico à A2, quando comparado à IgG1, antes e após a infecção desafio com L. chagasi.

f) Animais vacinados mantêm sorologia negativa, frente aos testes de rotina, por RIFI ou por ELISA, onde é empregado o SLA como antígeno de captura.

g) A vacina mostrou-se inócua nos testes referenciados em Relatório

Técnico submetido ao MAPA: em modelo animal e na espécie a que se

destina, uma vez que animais vacinados permanecem soronegativos após a imunização.

De acordo com os estudos conduzidos e os dados apresentados, conclui-se que a vacina Leish-Tec induz resposta imune protetora contra a doença leishmaniose visceral canina.

Canil de Experimentação 1 Área externa

Canil de Experimentação 1 Área externa Seis baias / Isolamento / Clínica / Quarentena / Sala

Seis baias / Isolamento / Clínica / Quarentena / Sala de para- mentação / Banhos / Telas / Aeração

Canil de Experimentação 2 Área externa

Telas / Aeração Canil de Experimentação 2 Área externa Cinco baias / Isolamento / Clínica /

Cinco baias / Isolamento / Clínica / Sala de paramentação / 56 Banhos / Telas / Aeração / Acesso a estranhos dificultado

Lateral externa Canil de Experimentação 1

dificultado Lateral externa Canil de Experimentação 1 Clínica - Acompanhamento de quadro clínico, coleta de

Clínica - Acompanhamento de quadro clínico, coleta de sangue para análises clínicas, vacinação e ver- mifugação

1 Clínica - Acompanhamento de quadro clínico, coleta de sangue para análises clínicas, vacinação e ver-

Artigo científico publicado referente à Fase II

Vaccine (2008), doi:10.1016/j, in press. Protective immunity against challenge with Leishmania (Leishmania) chagasi in beagle dogs vaccinated with recombinant A2 protein. Ana Paula Fernandes 1 , Miriam Maria Silva Costa 2 , Eduardo Antônio Ferraz Coelho 2 , Eloísa de Freitas 3 , Christiane de Freitas Abrantes 5 , Vinícius Hermont 5 ; Wagner Luiz Tafuri 4 , Maria Norma Melo 3 , Marilene Suzan Marques Michalick 3 and Ricardo T. Gazzinelli 2,6,7

1 Department of Clinical and Toxicological Analysis, School of Pharmacy, Federal University of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil

2 Department of Biochemistry and Immunology, Institute of Biological Sciences Federal University of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil

3 Department of Parasitology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil

4 Department of Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais – Belo Horizonte, MG, Brazil 5 Hertape-Calier Saúde Animal – Juatuba, MG, Brazil

6 René Rachou Research Center, Oswaldo Cruz Foundation – Belo Horizonte, MG, Brazil

7 Department

Worcester,

of

Medicine, University

of

Massachusetts

Medical

School,

Massachusetts, USA

Produção da Leish-Tec ®

Christiane de Freitas Abrantes, bióloga

A fabricação de vacinas recombinantes envolve a manipulação de um Microrganismo

Geneticamente Modificado (OGM). Dessa forma, faz-se necessário seguir rigorosos critérios que atendam às Normas de Biossegurança e às Normas de Boas Práticas de Fabricação (BPFs).

58

Biossegurança As primeiras normas são ditadas pela Lei de Biossegurança n o 11.105, de março de 2005. Esta lei, em conjunto com suas Instruções Normativas e outras normatizações, rege os critérios a serem adotados em toda e qualquer manipulação de Organismos Geneticamente Modificados (OGMs), incluindo

as estruturas da área de fabricação. A unidade produtiva de vacinas recombinantes foi projetada e construída de forma a atender esses critérios, sendo hoje uma moderna unidade de produção.

A premissa para áreas biosseguras é garantir que o OGM não possa escapar para o

meio ambiente e que os colaboradores não tenham contato direto com o microrganismo manipulado, eliminando riscos. Assim, a

unidade de produção possui características especiais:

f 14 diferentes sistemas de ar, segregados por

dutos e filtros absolutos, impedindo qualquer

segregados por dutos e filtros absolutos, impedindo qualquer tipo de liberação ou contaminação; f diferentes
segregados por dutos e filtros absolutos, impedindo qualquer tipo de liberação ou contaminação; f diferentes

tipo de liberação ou contaminação;

f diferentes pressões de ar aplicadas às salas

que possuem níveis maiores ou menores de risco de acordo com o processo executado;

f autoclaves de fronteira (equipamento que

descontamina e esteriliza por calor úmido), garantindo que todo o material que deixar

a inclusive colaboradores; f a rede de efluentes, coletora de resíduos líquidos provenientes das salas

a

inclusive

colaboradores; f a rede de efluentes, coletora de resíduos líquidos provenientes das salas de manipulação de OGM, está segregada da rede coletora de efluentes do restante do

prédio. A tubulação proveniente da área viva

é designada à ETE. É importante ressaltar que

todo o efluente é descontaminado no interior

das salas da área biossegura, antes de ser descartado na rede de efluentes específica;

f o acesso a essa área se faz por meio de vestiário interno, masculino e feminino.

Cada um possui entrada e saída segregadas fisicamente, para paramentação adequada

e diferenciada, de uso exclusivo;

f equipamentos dotados de automação para certificar que, durante o processo,

todos os passos sejam seguidos corretamente e, ainda, que qualquer tipo de acidente ou escape seja registrado;

f treinamentos constantes em biossegurança são ministrados à equipe de

vacinas recombinantes; f vistoria semestral por Comissão Interna de Biossegurança (CIBio). Dessa forma, é assegurado que todas as normas estejam sendo aplicadas à produção. O principal propósito da biossegurança é assegurar que os processos que envolvem OGMs sejam executados sem que exista risco de contaminação para o meio ambiente. A Hertape Calier cuida para que essas normas sejam praticadas em sua totalidade.

área

biossegura

a

está

descontaminado,

utilizada

pelos

paramentação

Todos os critérios que regulamentam a biossegurança em OGMs são normatizados por um órgão governamental denominado Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio).

Este tem poderes para liberar ou interditar uma produção, de acordo com a legislação.

É preciso obter certificados para fabricar produtos à base de OGMs. A Hertape Calier já

possui as certificações necessárias, uma vez que a área produtiva foi fiscalizada e aprovada pelo órgão competente.

A seguir, o caminho percorrido para a área produtiva ser certificada para a produção utilizando OGMs:

OGM Extenção de CQB CQB Planta baixa e Layout Scale-up Medidas de contenção Memorial Descritivo
OGM
Extenção
de CQB
CQB
Planta baixa
e Layout
Scale-up
Medidas
de
contenção
Memorial
Descritivo

É observado que, dentre as exigências, encontra-se a descrição de todos os processos que

envolvem a fabricação. Os equipamentos, processos e controles de qualidade aplicados devem ser descritos e planejados anteriormente ao início da produção. Para essa definição, torna-se imprescindível a execução de projeto piloto, onde todos os processos serão testados. Caso aprovados, segue o delineamento do projeto para produção comercial. A Hertape Calier seguiu esses passos e hoje se encontra com a unidade de produção ativa e de acordo com as exigências biosseguras e de processo.

Boas Práticas de Fabricação (BPF) A Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina é um produto injetável e de elevado padrão de qualidade. Para assegurar que será obtido um produto

puro, livre de qualquer tipo de impureza, são seguidas normas de BPFs. Estas resguardam

a qualidade durante todo o processo produtivo.

Da mesma forma, a área produtiva atende a critérios severos de boas práticas de produção, sendo construídas salas limpas de classe ISO 8 e ISO 7. Estas possuem características especiais como:

f linhas de utilidades, dutos de ar e outros sob piso técnico, permitindo

manutenção externa à área de produção;

f

reatores e linhas de aço inox 316L eletropolido;

f

água para fabricação de injetáveis, produzida por estação de tratamento de

água dedicada;

f salas com cantos arredondados, piso, parede e teto com revestimento impermeável

e

resistente a químicos; equipamentos que garantam a biossegurança para o operador e para o meio ambiente; f intertravamento de portas automático, de forma a garantir que o ar de uma sala não seja misturado ao de outra; f fluxo de pessoas e materiais sem cruzamentos. Fluxo de processo em linha contínua, sem cruzamentos; f treinamentos programados para colaboradores em processos, operação e BPFs;

f

linha contínua, sem cruzamentos; f treinamentos programados para colaboradores em processos, operação e BPFs; f 61

f implantação de Plano de Validação para qualificação de equipamentos e funcionários, bem como para a validação de processos produtivos e de limpeza; f manutenção da qualidade do ar das salas limpas por certificação semestral por empresa terceirizada. Outra característica importante da unidade de produção de vacinas recombinantes é a presença de todos os setores de apoio necessários à produção. Torna-se ágil e auxilia a manutenção da biocontenção. A unidade possui setores de almoxarifado, sala de lavagem e esterilização e preparo de meios. Além de área de envase e revisão. Toda essa estrutura foi construída com o objetivo de agilizar a produção e não inchar a atual produção da Hertape Calier. O crescimento planejado é sempre duradouro e oferece maior retorno.

Processo produtivo A Produção de Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina envolve o cultivo de bactérias Escherichia coli modificadas geneticamente em suas características próprias e pela inserção de parte de um gene de Leishmania. Essas bactérias foram geradas em laboratório e, dessa forma, são únicas. Não existem sementes para serem adquiridas no mercado. A semente utilizada na confecção de cada lote é produzida pela Hertape Calier. Utilizando-se de modernas técnicas em biologia molecular, as sementes produzidas são testadas e armazenadas a baixas temperaturas. Um roteiro de produção, de testes e de documentações é seguido, de forma a garantir que a semente produzida possua qualidade e, o mais importante, que preserve todas as características da primeira bactéria gerada. São clones idênticos em diversas gerações. A produção certificada de sementes é cuidadosamente executada

gerada. São clones idênticos em diversas gerações. A produção certificada de sementes é cuidadosamente executada 62
por profissionais treinados e assegurada por técnicos “expertises” em biotecnologia. A implantação do processo

por profissionais treinados e assegurada por técnicos “expertises” em biotecnologia.

A implantação do processo produtivo da linha Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina no formato moderno em que se encontra foi viabilizada pela visão empreendedora do Hertape Calier. A metodologia de obtenção de proteínas recombinantes pelo cultivo de E. coli é de domínio científico, mas em nossa produção alguns passos foram alterados, objetivando reduzir etapas químicas do processo e melhorar a qualidade do produto final obtido.

É importante reduzir o número de reagentes químicos adicionados durante a fabricação

de um produto. Tem-se melhor qualidade e maior pureza com menor número de etapas.

É

uma melhoria importante, pois sempre que um agente químico é adicionado,

o

ideal é que este seja retirado do produto final e testes comprobatórios

são indispensáveis. No caso de Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina, foi implantada em sua linha produtiva um equipamento que substitui uma etapa química de produção. Essa forma de trabalho é amplamente divulgada em indústrias européias e, no Brasil, somos a primeira indústria farmacêutica a utilizar esse processo. Outras importantes otimizações foram implantadas com sucesso ao longo do desenvolvimento produtivo. Temos o orgulho de poder dizer que a linha de produção de Leish- Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina é moderna, utiliza tecnologia avançada mesmo no que tange à biotecnologia e é executada com o aconselhamento de grandes “expertises”. Todo o sistema trabalha em regime de contenção, utiliza válvulas e tubulações de padrão farmacêutico e

obedecendo a normas de biocontenção.

Outro diferencial importante diz respeito às parcerias firmadas, pois, através dessas relações, temos acesso fácil a novas tecnologias de mercado e podemos testar sua implantação no desenvolvimento. Atualmente, a linha produtiva está pronta, mas testes de qualidade sempre são bem-vindos. Quanto mais puder controlar sua produção, melhor

a

qualidade do produto final obtido.

O

sistema de produção de Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral

Canina é muito tranqüilo. Uma vez entendido que a bactéria E. coli é nossa biofábrica, entende-se que ela produzirá a proteína, antígeno para essa vacina. Pensando em linhas gerais, é importante que seja fornecida todas as

condições ideais de crescimento para que nossa bactéria cresça e expresse a proteína-alvo. Após

a produção da semente certificada, esta será

encaminhada a fermentadores, contendo meios

de cultura ricos em aminoácidos, sais especiais e

outros nutrientes importantes ao desenvolvimento celular. Para tanto, diversos estudos foram realizados e muitas culturas foram crescidas até que se pudessem encontrar condições ideais. Depois de desvendados os parâmetros que envolvem o crescimento dessas células, estava encerrada uma

etapa de desenvolvimento de processo. As etapas que sucedem o cultivo celular

promoverão a retirada das proteínas das células

e a limpeza de todas as impurezas restantes.

Essas etapas também envolvem tecnologia no desenvolvimento. É importante obter um produto intermediário livre de substâncias indesejáveis e que possa ser encaminhado ao próximo passo de purificação. O termo tecnologia neste caso refere-

 

Produção da proteína recombinante A2

 

Formas amastigotas de Leishmania sp.

Plasmídio vetor

 
Isolamento do DNA e extração do gene que codifica a proteína A2
Isolamento do DNA e extração do gene que codifica a proteína A2
Isolamento do DNA e extração do gene que codifica a proteína A2

Isolamento do DNA e extração do gene que codifica a proteína A2

Inserção do gene A2 ao plasmídio vetor Inserção do plasmídio vetor com o gene A2
Inserção do gene A2 ao plasmídio vetor Inserção do plasmídio vetor com o gene A2

Inserção do gene A2 ao plasmídio vetor

Inserção do gene A2 ao plasmídio vetor Inserção do plasmídio vetor com o gene A2 na
Inserção do gene A2 ao plasmídio vetor Inserção do plasmídio vetor com o gene A2 na

Inserção do plasmídio vetor com o gene A2 na célula receptora

do plasmídio vetor com o gene A2 na célula receptora Bactéria Escherichia coli recombinante Replicação da
do plasmídio vetor com o gene A2 na célula receptora Bactéria Escherichia coli recombinante Replicação da

Bactéria Escherichia coli recombinante

Replicação da E. coli recombinante

 
  Cultura de E. coli recombinante com proteína A2

Cultura de E. coli recombinante com proteína A2

Ruptura mecânica das células e extração da proteína A2 do citoplasma

Ruptura mecânica das células e extração da proteína A2 do citoplasma

Proteína A2 codificada

Proteína A2 codificada

se a equipamentos implantados e forma de processo diferenciada, que permite eliminar agentes possivelmente alergênicos e irritantes.

Nestaetapa,possui-seaproteína-alvomisturadaaoutrasinúmerasproteínas,principalmente de origem celular. É preciso selecionar apenas a proteína que comporá a vacina. Leish-Tec ® é composta por uma única proteína recombinante como antígeno, com elevado teor de pureza. O método mais indicado para a separação específica de uma proteína é denominado cromatografia. Essa é uma metodologia que exige muito conhecimento agregado e equipamentos dedicados, de alta tecnologia. Todos os passos foram cuidadosamente desenvolvidos e testados para que a cromatografia fosse capaz de selecionar uma única proteína de uma mistura de proteínas. Com a finalização desse processo, tem-se a proteína-alvo pura, podendo ser dosada e encaminhada à formulação de Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina. Importante ressaltar que todo o processo produtivo é acompanhado por testes de controle em processo. Foi criado um laboratório no interior da área biossegura apenas para essa finalidade. Um técnico devidamente treinado é responsável por garantir que o processo siga o caminho que

Controle Semente Certi cada Molecular Cultivo de OGM Controle Microbiológico Separação de Proteínas Puri
Controle
Semente
Certi cada
Molecular
Cultivo de OGM
Controle
Microbiológico
Separação de
Proteínas
Puri cação da
Proteína-Alvo
Controle
Formulação
Físico-químico
Envase
Leish ec ®
Controle
Controle
Controle
Físico-químico
Biológico
Microbiológico

se espera. Esse laboratório de controle, apesar de estar dentro de uma área produtiva, é um braço da Garantia da Qualidade. Assegurando, mais uma vez, a qualidade do produto produzido, não apenas no produto final, mas durante os processos produtivos. A produção e seus devidos controles de qualidade podem ser verificados conforme esquema ao lado.

Protocolo de vacinação/informações comerciais

Indicação: Imunização contra leishmanio- se visceral canina.

Observações: Não é indicado para animais portadores de leishmaniose por não ter ca- ráter curativo.

A Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra

Leishmaniose Visceral Canina será comer- cializada exclusivamente para médicos ve- terinários.

A vacina deverá ser aplicada em cães acima de 4 meses de idade.

A vacinação deverá ser precedida de um

minucioso exame clínico realizado por um médico veterinário.

A vacina deverá ser aplicada somente em

cães assintomáticos com resultados so- rológicos negativos para leishmaniose visceral canina.

Via de administração: subcutânea. Posologia: três doses com intervalo de 21 dias entre as aplicações. Em caso de atraso, iniciar novo protocolo.

O animal apresentará a resposta imunológi-

ca 21 dias após a terceira dose. Revacinação anual a partir da primeira dose. Em caso de atraso até 15 dias, administrar

duas doses com intervalo de 21 dias entre as aplicações. Prazo superior a 15 dias, iniciar novamente todo o protocolo vacinal proposto. Como no uso de todos os produtos biológi- cos, podem surgir reações de hipersensibili- dade, que deverão ser imediatamente trata- das de acordo com a orientação do médico veterinário. A vacinação não é o único instrumento de prevenção e controle dessa enfermidade. Outras medidas também devem ser adota- das, conforme normatização do Ministério

da

Saúde.

Os

animais vacinados que apresentarem si-

nais clínicos de leishmaniose visceral, rea- ções sorológicas positivas estarão passíveis

de

adoção das medidas sanitárias vigentes.

O

médico veterinário deverá, obrigatoria-

mente, manter sob sua guarda, durante no

mínimo 3 (três) anos após a última dose da vacina, cadastro e registro contendo nome

do produto, data de fabricação, data de va-

lidade, nº de partida, nº de doses; o ende-

reço completo e identificação completa do animal vacinado, do responsável civil pelo animal e datas de vacinação.

A Hertape Calier Saúde Animal S.A. deve:

manter obrigatoriamente, durante 3 (três) anos após a data de distribuição do produto, informações completas sobre os médicos veterinários responsáveis pela aplicação da vacina.

Em casos de animais vacinados com outra vacina contra leishmaniose visceral canina, diferente da Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina, o proprietário deverá assinar uma declaração específica e cumprir todo o protocolo proposto da Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra LeishmanioseVisceralCaninaparaimunização do animal. O atestado de vacinação anterior deverá ser mantido anexo ao atual pelo fato da imunização com a Leish-Tec ® - Vacina Recombinante contra Leishmaniose Visceral Canina não ter o condão de reverter uma eventual sorologia positiva decorrente da vacinação anterior do cão com produto distinto desta vacina. Estocagem: entre 2ºC e 8ºC. Validade: 12 meses. Composição: Cada 1 mL contém:

Proteína recombinante (A2-HIS)

0,10 mg

Saponina

0,50 mg

Timerosal 1:10.000

0,01mL

Solução salina tamponada

1,00 mL

Comercialização: Embalagem individual (kit). Cada kit é constituído por 1 frasco com uma dose vacinal de 1 mL acompanhado de seringa e agulha descartáveis. Venda sob prescrição e aplicação obrigatória do médico veteri- nário. Produto licenciado no Ministé- rio da Agricultura sob nº 9270 em 24/01/2007. Proprietário e Fabricante Hertape Calier Saúde Animal S.A. Rodovia MG 050, nº 2001 Distrito Industrial, Juatuba - MG. CEP: 35675-000 CNPJ 07.086.487/0001-16 Indústria Brasileira. www.hertapecalier.com.br Responsável Técnico:

Dr. Eduardo Souto Bernardez CRMV-MG 4339 INDÚSTRIA BRASILEIRA

67
67
Certificado de Vacinação (Consulte as orientações para preenchimento contidas no verso.) Dados do Animal ®

Certificado de Vacinação

(Consulte as orientações para preenchimento contidas no verso.)

Dados do Animal

® Vacina recombinante contra leishmaniose visceral canina
®
Vacina recombinante contra leishmaniose visceral canina
Nome: Raça: Nascimento: Sexo: M F Pelagem:
Nome:
Raça:
Nascimento:
Sexo:
M
F
Pelagem:

Sorologia (preenchimento obrigatório somente antes da 1ª dose)

Laboratório:

Elisa

Data de Emissão do resultado negativo

Laboratório: Elisa Data de Emissão do resultado negativo Resultado Positivo: Negativo: IFI FC Outro: O animal
Resultado Positivo: Negativo: IFI FC Outro: O animal foi vacinado com outra vacina? Sim Não
Resultado
Positivo:
Negativo:
IFI
FC
Outro:
O animal foi vacinado com outra vacina?
Sim
Não

Caso o animal tenha sido vacinado com outra vacina contra a leishmaniose e por este motivo esteja soropositivo, assine a declaração abaixo:

Declaração

O proprietário, abaixo qualificado, declara que o animal acima qualificado foi vacinado em data anterior à presente, com vacina contra a “leishmaniose visceral canina” diferente da Leish-

Tec®. Declaro, ainda, que me foi esclarecido, quando da compra/administração da Leish-Tec®, que a vacinação anterior de meu animal, em razão da forma de indução de imunidade pelo produto então utilizado, faz com que exame sorológico eventualmente feito em meu cão, ainda hoje, possa indicar um resultado positivo para a doença que a vacina visa a prevenir, mesmo que o animal não esteja doente.

Declaro, por fim, que me foi esclarecido que a vacina Leish-Tec® não tem o condão (capacidade) de modificar a eventual sorologia positiva decorrente da vacinação anterior do cão com produto distinto desta vacina, devendo os testes pertinentes, que permitam diferenciar sorologia positiva por infecção e sorologia positiva por vacinação, ser desenvolvidos na forma, por quem e no prazo definidos pela Instrução Normativa Interministerial n.º 31/2007.

Por ser verdade, firmo a presente.

Dados do Proprietário

 

,

,

de

de 2

Comprador/Proprietário

Nome Completo: RG CPF Endereço Residencial: Bairro: CEP -
Nome Completo:
RG
CPF
Endereço Residencial:
Bairro:
CEP
-
Cidade: UF Tel.: e-mail Dados da Clínica Nome da Clínica RG CPF Endereço da Clínica:
Cidade:
UF
Tel.:
e-mail
Dados da Clínica
Nome da Clínica
RG
CPF
Endereço da Clínica:
Bairro:
CEP
-
Cidade:
UF
Tel.:
e-mail

1ª Dose

Preencha aqui a previsão da próxima vacinação

Data:

Obs.: preencha os campos abaixo antes de colar a etiqueta no espaço sombreado

Lote Fabr. Venc.:
Lote
Fabr.
Venc.:

Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior

Carimbo e assinatura do médico veterinário responsável pela vacinação em todas as vias

2ª Dose

Preencha aqui a previsão da próxima vacinação

Data:

Obs.: preencha os campos abaixo antes de colar a etiqueta no espaço sombreado

Lote Fabr. Venc.:
Lote
Fabr.
Venc.:

Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior

Carimbo e assinatura do médico veterinário responsável pela vacinação em todas as vias

3ª Dose

Preencha aqui a previsão da próxima vacinação

Data:

Obs.: preencha os campos abaixo antes de colar a etiqueta no espaço sombreado

Lote Fabr. Venc.:
Lote
Fabr.
Venc.:

Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior

Carimbo e assinatura do médico veterinário responsável pela vacinação em todas as vias

Revacinação Anual

Preencha aqui a previsão da próxima vacinação

Data:

Obs.: preencha os campos abaixo antes de colar a etiqueta no espaço sombreado

Lote Fabr. Venc.:
Lote
Fabr.
Venc.:

Caso seja necessária a utilizacão de novo cartão de vacinação, cite abaixo o número do cartão anterior

Carimbo e assinatura do médico veterinário responsável pela vacinação em todas as vias

Obs.: caso a segunda e/ou terceira doses ocorram em clínica(s) distinta(s), preencha novo formulário, enviando a terceira via para a Hertape Calier S.A. - Não é necessário selar.

Caso seja uma revacinação anual, cite abaixo o número do último certificado de vacinação utilizado.

o número do último certificado de vacinação utilizado. Hertape Calier Saúde Animal S/A. Rodovia MG 050

Hertape Calier Saúde Animal S/A. Rodovia MG 050 - Km 4 Distrito Industrial Juatuba - MG CEP 30675-000 - Tel.: (31) 3537-4300

Nº 000001

1ª via: Proprietário

 

Descrevemos a seguir as exigências da Instrução Normativa Interministerial Nº 31, de 09 de julho de 2007, publicada no Diário Oficial da União de 10 de julho de 2007, Seção 1, Pág. 1, que prevê no seu art.:

Art. 6º O conteúdo e o uso da vacina fora das áreas de risco delimitadas pelo Ministério da Saúde não exime as empresas e

Dose - Quando a aplicação da dose seguinte for executada

pelo mesmo médico veterinário, é importante, antes de

os profissionais de responsabilidade.

colar o selo do frasco vacinal, escrever os dados nos campos

§ 1º Os municípios nos quais a leishmaniose visceral canina é

sombreados, verificando sua leitura na segunda e terceira vias. Neste caso, NÃO será necessário enviar a informação para a Hertape Calier. Oportunamente, será destinado espaço no site www.hertapecalier.com.br para a atualização do Certificado.

endêmica, segundo o Ministério da Saúde, só poderão utilizar

vacinas que permitam diferenciar cães vacinados de cães infectados.

§ 2º Para realizar a comercialização de vacinas que permitem

No

caso da 2ª dose ser executada por outro médico veterinário,

a diferenciação entre cães vacinados e cães infectados nos

o

novo profissional deverá, obrigatoriamente, abrir NOVO

municípios indenes, deverá haver disponibilidade de kits para

FORMULÁRIO, indicando no campo destacado o número do

diagnóstico registrados no MAPA para tal fim.

formulário que o antecedeu. Indique no campo apropriado a

§

3º A indicação de uso do produto deverá ser atribuição

data prevista para a 3ª dose. Importante - carimbe e assine todas

exclusiva de um médico veterinário, salvo casos de interesse público conforme normatização do Ministério da Saúde.

as

vias do Certificado de Vacinação.

4º O médico veterinário deverá emitir atestado ou preencher cartão de vacinação que contenha todos os dados sobre a

§

Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª

via

em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer

identificação do animal, sobre o responsável civil pelo animal, inclusive endereço completo, e informações completas do produto (nome, data de fabricação, data de validade, nº de partida, nº

agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar

-

o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.

Oriente o proprietário do animal a mantê-lo junto com o

de

doses). Essas informações devem ficar armazenadas por 5

Certificado de Vacinação anterior.

(cinco) anos.

 
 

§

5º O proprietário do registro do produto deve manter

 

obrigatoriamente, durante, no mínimo, 3 (três) anos após a data de distribuição do produto, informações completas sobre os médicos veterinários responsáveis pela aplicação da vacina.

Dose - Quando a aplicação da 3ª dose for executada pelo

mesmo médico veterinário que executou a 2ª dose, é importante, antes de colar o selo do frasco vacinal, escrever os dados nos

§

6º O fabricante deverá encaminhar para o Ministério da

campos sombreados, verificando sua leitura na segunda e terceira

Agricultura, Pecuária e Abastecimento relatórios trimestrais

produção, distribuição e os municípios nos quais o produto

esteja sendo comercializado, como também o número de doses vendidas por município. Cabe ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento remeter trimestralmente os dados ao Ministério da Saúde.

7º A vacina deverá ser usada somente em cães com diagnóstico

de

§

vias. Neste caso, NÃO será necessário enviar a informação para

a Hertape Calier. Oportunamente, será destinado espaço no site www.hertapecalier.com.br para a atualização do Certificado. INDIQUE NO CAMPO APROPRIADO, NA ÚLTIMA LINHA DO CERTIFICADO, A DATA DE REVACINAÇÃO ANUAL. No caso da 3ª dose ser executada por médico

veterinário distinto do que efetuou o procedimento da

sorológico negativo para leishmaniose visceral, utilizando kits para diagnóstico registrados no MAPA.

dose, o profissional que a estiver executando deverá,

obrigatoriamente, abrir NOVO FORMULÁRIO, indicando no campo destacado o número do formulário que o antecedeu. Importante - carimbe e assine todas as vias do Certificado de Vacinação.

ORIENTAÇÕES PARA PREENCHIMENTO DO CERTIFICADO DE VACINAÇÃO Dados do Animal, Dados do Proprietário, Dados da Clínica - Preencher com letra de forma, legível e observando a qualidade nas cópias da segunda e terceira vias - se necessário, coloque o formulário sobre uma superfície dura. Sorologia - Anote os dados do atestado obtido junto ao laboratório que o executou.

Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª

via

em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer

agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar

-

o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.

Oriente o proprietário do animal a mantê-lo junto com o Certificado de Vacinação anterior.

Oriente o proprietário do animal a guardar em local seguro o Certificado de Vacinação.

Com o objetivo de cumprimento das normas previstas para a realização

 

da

quarta fase de desenvolvimento da vacina Leish-Tec®, a Hertape

Dose - Após a aplicação da vacina Leish-Tec®, escreva nos

Calier Saúde Animal terá assegurado o direito de acesso aos dados contidos nos Certificados de Vacinação, sendo que a mesma garante

ao responsável toda a segurança quanto a sua confidencialidade para usos distintos àqueles destinados à pesquisa científica.

campos reticulados os dados contidos na etiqueta do frasco da vacina, assegurando sua leitura nas outras vias e, somente após este procedimento, cole-o no local indicado.Indique no campo “próxima vacinação” as datas previstas da segunda e terceira doses. Importante - Carimbe e assine todas as vias do Certificado de Vacinação.

A

Hertape Calier Saúde Animal S.A. declara que a veracidade das

informações contidas no Certificado de Vacinação deverá ser atribuída ao proprietário do animal que as forneceu e ao médico

veterinário responsável pelo preenchimento do mesmo.

Destaque as vias deixando a 1ª com o Cliente, mantendo a 2ª

via

em seu poder por 5 anos. Dobre, cole e coloque em qualquer

agência da ECT ou caixa coletora a 3ª via. Não é necessário selar - o selo será pago pela Hertape Calier Saúde Animal.

 

1ª via: Proprietário

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