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1.

INTRODUCCIN














2
Los continuos y generalizados incrementos de la produccin agrcola que se han
producido durante los ltimas dcadas, no han llegado a equilibrar la incesante demanda de
alimentos a nivel mundial. Por otra parte la presin sobre los sistemas agrcolas y forestales ha
generado graves problemas de contaminacin debido al empleo de fertilizantes y pesticidas.
Las tendencias actuales de la investigacin en este campo, se integran en tres aspectos
fundamentales:
- Mejora de la produccin mediante biotecnologa.
-Estudio de la dinmica de ciclos biogeoqumicos y sus implicaciones en la nutricin
vegetal.
- Estudio de la fisiologa de las plantas para su aplicacin en la mejora de la produccin.
Las tres reas de investigacin se encuentran ntimamente relacionadas entre s,
interaccionando de forma que el estudio de cualquiera de ellas obliga a considerar las restantes.
En la presente memoria se pretenden abordar aspectos fundamentales que inciden en la
productividad de una especie, Vicia villosa, con un considerable impacto econmico en la
agricultura de determinados pases. El estudio se realiza considerando la interaccin de la
planta, con el sistema edfico, separndonos de los sistemas de produccin clsicos en los que el
factor productividad anulaba otras consideraciones vitales, como el mejor aprovechamiento de
los recursos edficos con la mnima presin externa. El objetivo es reducir los efectos nocivos
de la produccin sobre el ambiente, optimizndola y permitiendo una agricultura sostenible
basada en el conocimiento de la fisiologa de las plantas y del sistema edfico en que se
desarrollan.
1.1. El ciclo del nitrgeno

El nitrgeno, elemento muy abundante en el planeta, se encuentra formando rocas gneas
(14x10
9
Tg), sedimentos y rocas sedimentarias (4x10
9
Tg), como nitrgeno atmosfrico
(3.9x10
9
Tg), nitrgeno de biomasa ocenica (5x10
2
Tg) y nitrgeno de biomasa terrestre
(1.5x10
4
Tg). Sin embargo, a pesar de su abundancia, la biodisponibilidad es baja y los niveles
de nitrgeno en la biomasa total vienen a ser una milsima parte de las reservas orgnicas. La
causa de ello est en que la molcula de nitrgeno es inaccesible para la mayor parte de los seres
vivos por lo que no se puede utilizar como fuente de nitrgeno. Las consecuencias de la escasa
biodisponibilidad suelen ser muy negativas ya que el nitrgeno es un constituyente esencial de
las biomolculas y junto con el agua y el fsforo es el factor principal que aumenta la



3
produccin primaria (Gutschick, 1981; Risser y Parton, 1982; Vitousek y Howarth, 1991;
Danso, 1995).
Las carencias de nitrgeno se suplen artificialmente mediante la administracin de
fertilizantes qumicos, con el consiguiente aumento en la contaminacin de los acuferos (NRC,
1989; Ollinger et al., 1993), eutrofizacin de las costas (Estavillo et al., 1996), y el incremento
en la produccin de gases como N
2
O ( Anderson y Levine, 1987; Nevison et al., 1996 ).
La biomasa microbiana del suelo es un factor esencial para la descomposicin de
residuos, ciclo del nitrgeno y flujo de energa (J enkinson y Ladd, 1981)(2070). Esta biomasa
funciona como fuente y como sumidero de nutrientes en la mayora de los ecosistemas
terrestres (Okano et al., 1989)(2070).
El ciclo del nitrgeno edfico est controlado principalmente por bacterias, y su
actividad afecta la distribucin de compuestos nitrogenados en el sistema. Las condiciones
ambientales que regulan la actividad de las bacterias determinan donde ocurre cada proceso, el
grado de intercambio entre las distintas formas de nitrgeno y las posibles interacciones fsicas,
qumicas y biolgicas que pueden darse (Ward, 1996)(2534). Por tanto, el nmero de
interacciones que se pueden desarrollar es tal que, aunque existe mucha informacin bioqumica
sobre las reacciones bacterianas, no es suficiente para entender el control y para predecir los
procesos en distintos ambientes.
El ciclo del nitrgeno consiste en una serie de reducciones y oxidaciones sucesivas, que
conducen a la transformacin del nitrgeno en formas accesibles al metabolismo de animales,
plantas y microorganismos. De esta manera el nitrgeno circula de forma cclica a travs del
suelo y de la atmsfera (Figura 1.1).



4
N
Aporte de
seres vivos
Amonificacin
Inmovilizacin
SERES VIVOS Y
MATERIA ORGANICA
EDFICA
Fijacin
(libre, industrial o simbitica)
N atmosfrico
2
Reduccin
asimilatoria
Arcillas
NH
4
+
NH
3
Volatilizacin
Nitrificacin
Nitrosa
Prdidas gaseosas
NO
2
-
Nitrificacin
Ntrica
Reduccin
desasimilatoria
Lixiviacin
Prdidas gaseosas
Desnitrificacin
NO
NO
3
-
2
O N
2

Figura 1.1. Representacin esquemtica del ciclo del nitrgeno.

El ciclo del nitrgeno ha sido objeto de especial atencin por diversas razones, entre las
que podemos destacar:
- El incremento de nitrificacin y desnitrificacin puede ir acompaado, directa o
indirectamente, de un aumento de la produccin de xido nitroso y ntrico. El N
2
es un producto
final ms favorable ecolgicamente hablando (Burns et al., 1996)(2200) y adems es un
componente de la deposicin cida (Logan, 1983)(2194). El N
2
O es un gas con efecto
invernadero y adems est implicado en la destruccin cataltica de la capa de ozono (Crutzen,
1981)(2624). Aunque su concentracin absoluta es baja comparada con el CO
2
, contribuye de
forma significativa al efecto invernadero, por su capacidad de absorcin de IR y a que reside en
la atmsfera durante mucho tiempo. Desde la poca preindustrial hasta nuestros das ha
aumentado un 5% la concentracin de N
2
O atmosfrico (Houghton et al., 1990)(2191) lo que
supone una concentracin de N
2
O de 310 ppb y aumenta entre un 0.2 a un 0.3% al ao (Papen y
Seiler, 1994)2619). Un aumento del 0.25% corresponde con una adicin de 3.5 Tg de N
2
O/ao
en la escala global (Benkise et al., 1996)(2619). El N
2
O es responsable de un 2 a un 3% del
calentamiento global del planeta (Watson et al., 1992)(2191) y puede contribuir hasta en un
10% en el futuro (Cicerone, 1989)(2191) y por otra parte doblar la concentracin de este gas en
la atmsfera se estima que puede hacer disminuir la capa de ozono en un 10% (Mosier et al.,



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1996)(2191). Los suelos contribuyen con un 70% del total de emisiones de N
2
O antropognicas
(Kroeze, 1993)(2624). Los procesos microbiolgicos en los suelos son las fuentes ms
importantes de N
2
O (Granli y Bck,man, 1994)(2194), razn por la cual se asume que los
cambios en el ciclo del nitrgeno a nivel edfico han influido decisivamente en el aumento de
N
2
O en la atmsfera durante el pasado centenio y pueden ayudar a predecir futuros cambios
(Bowman, 1990)(2191).
- La desnitrificacin es uno de los procesos causantes de la disminucin de eficacia de
los fertilizantes qumicos. Tiedje (1988) estima que entre el 52 y el 100% del nitrgeno fijado
vuelve a la atmsfera por procesos de desnitrificacin. Bouwman (1990) calcula que en
ecosistemas naturales terrestres se emiten entre 9.7 y 12 Tg de nitrgeno al ao y entre 2.3 y 3.7
Tg en suelos cultivados; si a esto unimos los datos anteriormente comentados, se comprende la
gran importancia de este proceso.
- Algunas formas de nitrgeno combinado afectan a la tasa de produccin primaria, a la
descomposicin de la materia orgnica y a las propiedades fsicas, qumicas y biolgicas del
suelo (Cannon et al., 1984; J uma, 1993).
- El incremento o disminucin de la concentracin de nitratos asociado al proceso
nitrificante se propone como factor regulador de la dinmica de cationes en los ecosistemas
edficos (Klling y Prietzel, 1995).
- Las prdidas de nitrgeno en forma de nitratos son, en muchas ocasiones, mayores que
las prdidas de cualquier otro nutriente (Vitousek et al., 1989).
- La disponibilidad de nitrgeno para la nutricin vegetal es uno de los factores
determinantes de la riqueza en lignina en las paredes celulares, lo que condiciona los aportes de
compuestos fenlicos y de materia orgnica fcilmente degradable. Adems los compuestos
fenlicos acidifican el sustrato, dificultando la movilizacin de nutrientes (Gosz, 1981).
- Efectos negativos de exceso de nitritos y nitratos sobre la salud humana (Prasad y
Power, 1995).
A continuacin se comentan los aspectos ms importantes de las distintas etapas del
ciclo del nitrgeno, as como algunos de los trabajos ms sobresalientes al respecto.




1.1.1. Fijacin biolgica del nitrgeno (FBN)



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La FBN es la etapa reguladora del ciclo. J unto con la fotosntesis, dicho proceso es clave
en la produccin de los ecosistemas (Worthington, 1975). Slo ciertos procariotas poseen el
aparato enzimtico necesario para reducir el nitrgeno molecular, de estado de oxidacin 0,
hasta amonio, estado de oxidacin -3. Este amonio se incorpora a compuestos orgnicos
formando glutamina y otros compuestos nitrogenados (Schubert, 1986).
Las entradas de nitrgeno va fijacin biolgica se estiman en 139-170 millones de t
N/ao (Paul, 1988) de los cuales un 25-30% se deben a asociaciones simbiticas en suelo
cultivado, otro 30% a travs de pastizales permanentes, y el resto se explica por otras
asociaciones o por fijacin libre (Peoples et al., 1995). Estas entradas de nitrgeno en el
ecosistema compensan las prdidas por desnitrificacin (14.75 Tg N/ao) (IPCC, 1994),
cosechas (830 kg N/ha) (Soon y Arshad, 1996), volatilizacin de amonio (13-23 Tg N/ao),
lixiviacin (30 Tg N/ao) y erosin (2-20 Tg N/ao) (Roswal y Paustian, 1984).
Este proceso requiere un gasto energtico elevado. Los microorganismos implicados
pueden obtener los compuestos orgnicos necesarios para conseguir energa, directamente del
sustrato sobre el que se desarrollan (fijacin libre), o bien colonizar races de ciertas plantas que
les suministran compuestos orgnicos (fotosintatos) que utilizan como fuente energtica. De
esta forma se establece una relacin simbitica, ya que parte del nitrgeno fijado es asimilado
por la planta, que lo integra en su metabolismo (fijacin simbitica).
Las implicaciones de ambos sistemas de fijacin de nitrgeno son decisivas en lo que se
refiere a su efecto sobre la produccin primaria, sin embargo los mecanismos por los que el
nitrgeno fijado queda a disposicin de las plantas son muy distintos, as como el rendimiento
energtico del proceso y los factores que regulan el flujo de energa que se establece en cada
caso. Por esta razn pasamos a considerar los procesos por separado.

1.1.1.1. Fijacin libre del nitrgeno (FLN)

Blackburn (1983) apunta a los microorganismos fijadores libres fotosintticos como los
reductores ms eficaces, sin embargo, como quiera que la energa solar incide escasamente
sobre la productividad del suelo, la mayora de los fijadores libres, a nivel edfico son
microorganismos hetertrofos (Evans y Burris, 1992) que se ven obligados a competir por su
sustrato con el resto de los microorganismos hetertrofos, y su actividad depender en gran
parte del xito en la competencia por el sustrato (Hill, 1992)(libro).



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El grupo funcional de los fijadores libres de nitrgeno atmosfrico est formado por
numerosos microorganismos, entre ellos podemos citar las cianofceas (Haselkorn y Buikema,
1992); bacterias aerobias y microaerobias hetertrofas, como Azotobacter spp. y Azospirillum
spp. respectivamente (Evans y Burris, 1992) o Beijerinkia spp. y Derxia spp. (Boddey y
Dobereiner, 1995); bacterias quimioauttrofas, incluyendo aquellas que oxidan metano (Dalton
y Chatfield, 1985) y azufre (Mackintosh, 1978) y las que utilizan H
2
como fuente de energa
para el crecimiento auttrofo (Berndt et al., 1976); bacterias anaerobias facultativas como las
del gnero Klebsiella y Enterobacter, que requieren compuestos nitrogenados para crecer bajo
condiciones aerobias pero fijan nitrgeno en anaerobiosis (Aho et al., 1976); bacterias
pertenecientes a los gneros Bacillus (Line y Loutit, 1971) y Pseudomonas, que son
probablemente los gneros ms abundantes en la rizosfera (Acero et al., 1994; Puente y Bashan,
1994); y por ltimo, bacterias anaerobias estrictas, siendo el gnero Clostridium el ms
importante (Rosenblum y Wilson, 1948; Flather y Beauchamp, 1992)(2624).
En ecosistemas terrestres, las cianobacterias fijan cerca de 30 kg N ha
-1
ao
-1
en
pastizales, mientras que en los sistemas agrcolas slo fija entre 3 y 5 kg N ha
-1
ao
-1
.
Azotobacter spp. fija entorno a 1 kg N ha
-1
ao
-1
en estado libre, mientras que asociado a
gramneas fija 20 kg N ha
-1
ao
-1
(Paul y Clark, 1989)(2518).
Una asociacin de gran inters, que no se puede considerar exactamente como
simbiosis, es la formada por la bacteria fijadora de nitrgeno Azospirillum, que prolifera sobre
races de maz, trigo, cebada, avena y otros cereales, constituyendo una rizocenosis no nodulante
que conduce a un aumento del nmero de espigas y de biomasa vegetal (Bashan y Levanony,
1990; Zaady et al., 1994).

1.1.1.1.a. Factores que afectan a la fijacin libre de nitrgeno y microorganismos
implicados en el proceso

Los diazotrofos libres, estn marcadamente afectados por las propiedades y
requerimientos del complejo nitrogenasa. El oxgeno es uno de los factores que ms afecta al
proceso, dada la sensibilidad de la nitrogenasa a este gas (Drevon et al., 1988; Hunt y Layzell,
1993). Las condiciones microaerfilas son ptimas para el crecimiento de estas bacterias es la
microaerofilia, ya que en estos hbitats las bacterias tienen el oxigeno necesario para su
respiracin, pero la nitrogenasa no se encuentra inhibida (Hill, 1992)(Libro)



8
La presencia en el suelo de nitrgeno inorgnico inhibe la actividad de las bacterias
fijadoras de nitrgeno (Kitoh y Shiomi, 1991; Roper et al., 1994)(2518). Por el contrario, las
condiciones inducen la inmovilizacin del nitrgeno estimulan la actividad nitrogenasa en el
suelo (Roper et al., 1994)(2518). Rao (1976) y Sawicka (1982, 1983) (368), indican que la
adicin de pequeas cantidades de nitrgeno junto con carbono orgnico incrementan la FLN de
estos suelos.
Las bacterias diazotrofas libres estn estimuladas y su actividad nitrogenasa aumenta en
presencia de altos niveles de materia orgnica en el suelo. La rizosfera es una zona con elevada
concentracin de compuestos orgnicos fcilmente degradables debido a la exudacin radical,
razn por la cual las bacterias fijadoras libres encuentran en la rizosfera un lugar muy apropiado
para fijar nitrgeno (Glick, 1995)(1141). Distintas plantas creciendo en el mismo suelo y bajo
las mismas condiciones climticas poseen distintas tasas de fijacin en su rizosfera (Sawicka,
1983)(368). Estas diferencias se deben a la composicin especfica de los exudados de cada
planta (Rovira, 1956)(368). La adicin de compuestos no nitrogenados exudados por las races,
confiere a las bacterias diazotrofas ventajas competitivas sobre el resto de los hetertrofos de la
rizosfera, as como la liberacin de diversas vitaminas, como tiamina, que aumenta de forma
considerable el nmero de bacterias diazotrofas en la rizosfera (Azaizeh et al., 1995)(2254).
Dado el efecto de la naturaleza y cantidad de carbono orgnico disponible sobre la FLN
(Alexander y Zuberer, 1989)(2518), cierto tipo de manejo, como el aporte de restos vegetales de
leguminosas al suelo aumenta los niveles de fijacin al proporcionar niveles ms altos de
carbono lbil a las bacterias fijadoras (Wander et al., 1994)(2518).
Esta etapa del ciclo es especialmente sensible a la presencia de metales pesados en el
suelo, por lo que se han propuesto como indicadores biolgicos de la toxicidad de estos
elementos (Lorenz et al., 1992)(567). Sin embargo, las bacterias fijadoras hetertrofas y
anaerobias, en presencia de metales pesados, son capaces de fijar en un amplio rango de
condiciones de alcalinidad y acidez del suelo (Paul y Clark, 1989)(567), y adems su actividad
nitrogenasa es normalmente mayor que la de aquellas que crecen en condiciones aerobias
(J ones, 1977)(567).
Otros factores que afectan considerablemente al proceso son: pH (DeLuca et al.,
1996)(2518); fsforo (Grant y Binkley, 1987; Kay y Virginia, 1989; Smith, 1992; Crews, 1993),
tipo de suelo (Azaizeh et al., 1995b)(2254), temperatura (Stewart, 1974; Granhall, 1981; Lynch
y Smith, 1993) y el estrs hdrico (Venkateswarlu, 1990).
1.1.1.2. Fijacin simbitica del nitrgeno (FSN)



9

La fijacin simbitica de nitrgeno tiene un papel muy importante sobre la produccin
primaria ya que supone la entrada de nitrgeno ms importante en los ecosistemas terrestres
(Tamm, 1991). Por tanto, este proceso resulta fundamental en la nutricin y crecimiento de las
plantas (Michiels y Vanderleyden, 1994).
Bumb (1994) indica que la mejora de la fijacin simbitica reducira en esta dcada el
uso de fertilizantes nitrogenados en 80-90 millones de t de N, por lo que actualmente se est
realizando un esfuerzo para intentar aumentar la eficiencia fijadora (Hardarson, 1993),
profundizando en el estudio de mtodos agronmicos, microbiolgicos y biotecnolgicos. El
anlisis es complejo ya que la fijacin de nitrgeno no est regulada slo por la demanda de
nitrgeno de una planta individual, tambin, de forma indirecta por la demanda del ecosistema
como un todo (Hartwing et al., 1996)(2450).
Las relaciones simbiticas ms estudiadas corresponden a Rhizobium y Bradyrhizobium
con las fabceas, y al actinomiceto Frankia con angiospermas no leguminosas. Algunas
cianofceas tambin establecen simbiosis, si bien lo hacen con pteridofitos del gnero Azolla,
pudiendo fijar entre 70-110 kg de nitrgeno por hectrea y ao (Ventura y Wantanbe, 1993). As
mismo, las cianobacterias del gnero Nostoc, establecen simbiosis con una herbcea tropical del
gnero Gunnera (Rasmussen, 1996)(2304).
Aproximadamente 194 especies de plantas se han descrito como actinorrizas no
leguminosas y estn englobadas dentro de ocho familias y cuatro subclases de plantas
angiospermas (Cronquist, 1981)(2592). Estas plantas tienen tendencia a crecer en suelos
marginales y juegan un papel importante como pioneras en las primeras etapas de sucesin.
Aparecen en muy diversos hbitats como la tundra (Dryas), bosques (Alnus, Comptonia,
Coriaria y Sheperdia), dunas (Casuarina, Hipopha, Myrica y Elaeagnus) bosques riparios
(Alnus, Myrica y Datisca) y chaparrales (Ceanothus, Comptonia, Cerocarpus, Cowania y
Purshia). La cantidad de nitrgeno fijado por las plantas actinorrizas es similar al fijado por las
leguminosas (40-350 kg N ha
-1
ao
-1
)(Torrey, 1978), y algunas especies pueden devolver
al ecosistema hasta un 70% de este nitrgeno (Schwintzer, 1984)(2592). Adems de su
importancia como pioneras, son importantes como fuentes de biomasa y sirven de plantas
nodrizas para otras especies de inters econmico.
Rhizobium, Bradyrhizobium y Azorhizobium son capaces de nodular nicamente plantas
leguminosas. Dentro de las leguminosas podemos distinguir tres subfamilias, Mimosoideae,
Papilionoideae y Caesalpinoideae. Un 90% de las dos primeras familias entran en simbiosis



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con rizobios del suelo formando ndulos tanto radicales, como en algn caso caulinares, sin
embargo, slo unos pocos miembros de la familia Caesalpinoideae son capaces de establecer
este tipo de relacin (Doyle, 1994).(993)
La diversidad taxonmica de familias dentro de las plantas actinorrizas, en comparacin
con las leguminosas, hace pensar que la simbiosis actinorrzica se origin repetidamente en la
evolucin de las angiospermas (Mullin, Swensen y Goetting-Minesky, 1990; Baker y Mullin,
1992; Swense, 1996).
Desde un punto de vista agronmico, la fijacin de nitrgeno mediante la simbiosis
rizobio-leguminosa tiene gran importancia ya que su rendimiento se estima entre 41-51 millones
de t N/ao (Paul, 1988). La fijacin se lleva a cabo por los rizobios en estructuras de morfologa
definida, denominadas ndulos, que se desarrollan en las races (Bergersen, 1982) o en los
tallos (Loureiro et al., 1995) de plantas leguminosas.
Por las razones expuestas, los procesos de simbiosis entre fabceas y
Rhizobium/Bradyrhizobium y entre otras angiospermas no leguminosas y Frankia resultan de
gran importancia en agricultura y silvicultura, respectivamente. La asociacin de vegetales
nodulados con otros revierte en una mejor nutricin nitrogenada de estos ltimos (Cochran y
Schlentner, 1995). Haynes et al. (1979) encontraron en plantaciones de Platanus occidentalis
que si se incorporaba una vegetacin acompaante de leguminosas herbceas, aumentaba
considerablemente el volumen, dimetro e ndice volumtrico de las plantas con respecto al
control. Pero tambin se ha visto que las leguminosas herbceas fijadoras de nitrgeno, tienen
una gran importancia en sistemas agrcolas cuando se utilizan en programas de rotacin de
cultivos, ya que aumentan significativamente la produccin de cereal, principalmente trigo y
cebada (King, 1984; Reeves et al., 1984; Rowland et al., 1986; Doyle et al., 1988). Reynolds et
al. (1994) observan en cultivos mixtos de leguminosas con trigo o cebada, en suelos pobres en
nitrgeno, un aumento en la cantidad de protenas en el grano, hecho que relacionan con un
mejor transporte del nitrgeno en presencia de las leguminosas.
Los rizobios son bacterias Gram negativas que pertenecen a la familia Rhizobiaceae.
Actualmente se engloban en tres gneros, Rhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium
constituidos por los rizobios de rpido crecimiento clsicos (2-4 horas de tiempo de generacin)
y Bradyrhizobium de lento crecimiento con un tiempo de generacin de 8 horas o ms.
Los rizobios presentes en el suelo interaccionan con las races de distintas leguminosas,
induciendo la formacin de ndulos, estructuras en los que se produce la fijacin del nitrgeno.
El desarrollo del ndulo y la fijacin de nitrgeno es un proceso complejo que requiere seales



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entre los rizobios y las clulas de la planta. Los polisacridos superficiales de los rizobios,
particularmente exopolisacridos y lipopolisacridos, parecen estar implicados en el
establecimiento de la simbiosis con distintas leguminosas (Gray y Rolfe, 1990; Leigh y Coplin,
1992). Los lipopolisacridos, no slo se necesitan a distintos tiempos durante el desarrollo del
ndulo, tambin estn encargados de proteger al rizobio por supresin de los mecanismos de
defensa de la planta (Noel, 1992)(2176). El papel de estos polisacridos en la infeccin y
desarrollo del ndulo depende de que el ndulo sea determinado o indeterminado (Ko y Gayda,
1990; Parniske et al., 1993, 1994)(2154). Los exopolisacridos tienen mayor importancia en la
formacin de los ndulos indeterminados, mientras que los lipopolisacridos en los
determinados (Eggleston et al., 1996)(2154).
Los mecanismos de reconocimiento clula-clula vienen determinados en un primer
momento por una protena calcio dependiente muy comn en las rizobiaceas, que permite a las
bacterias ligarse a la raz (Smit et al., 1992)(2130). En una segunda etapa, que depende de las
condiciones de crecimiento, las lectinas de la planta suponen puntos de anclaje para las bacterias
(Wsniewski y Delmotte, 1996)(2130). Adems, parece ser que las lectinas inducen la capacidad
de nodulacin de Rhizobium (Halverson y Stacey, 1986)(2130).
Los flavonoides presentes en los exudados radicales, tambin juegan un papel
importante en los procesos de nodulacin. Estos compuestos fenlicos atraen a los rizobios e
inducen genes de nodulacin (Dharmatilake y Bauer, 1992)(2130). Adems estos compuestos
pueden modificar el metabolismo bacteriano provocando un aumento en la sntesis de
exopolisacridos (Hartwing et al., 1991; Dunn et al., 1992). As mismo, otros productos
presentes en los exudados radicales como isoflavonoides y sacridos, estimulan a las bacterias
para iniciar la nodulacin (Wisniewski y Delmotte, 1996)(2130).
Existen una serie de genes, tanto de la planta (Nif y Fix) como de la bacteria (Nod) que
codifican para protenas necesarias para el desarrollo del ndulo y para el proceso posterior de
fijacin de N. Los genes Nif y Fix se activan durante la formacin del ndulo y que dan lugar a
protenas denominadas nodulinas (Sanchez et al., 1991)(2118). Entre estas nodulinas podemos
destacar: leghemoglobina (Brisson y Verma, 1982), una glutamina sintetasa especfica del
ndulo (Cullimore et al., 1984) y polipptidos ricos en lisina que se expresan en los primeros
estados del desarrollo del ndulo (Franssen et al., 1987; Scheres et al., 1990)(2118). Los genes
Nod codifican para los factores Nod que llevan a cabo cambios morfolgicos en la raz de la
planta huesped como deformaciones de los pelos radicales (Lerouge et al., 1990), formacin del
canal de infeccin (van Brussel et al., 1992) y formacin del primordio nodular (Spaink et al.,



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1991; Truchet et al., 1991)(sep J avier). Adems los factores Nod inducen alteraciones en la
composicin de flavonoides de los exudados radicales que provocan una activacin de los genes
inductores de los Nod (van Brussel et al., 1990)(sep J avier). Entre los factores Nod podemos
citar: quitina y celulosa sintasas, acetiltransferasas y ATP sulfurilasa.

1.1.1.2.a. Factores que afectan a la fijacin simbitica de nitrgeno y microorganismos
implicados en el proceso

La fijacin simbitica de nitrgeno (FSN) se ve afectada por un amplio espectro de
factores biticos y abiticos. La mejora del proceso controlando los factores que a continuacin
se mencionan puede constituir una de las principales vas de investigacin en este campo.
Entre los factores biticos los ms relevantes son: el tipo de inculo y la va de
inoculacin (Brockwell et al., 1988), la eleccin de cultivares apropiados que influye
decisivamente sobre las entradas de nitrgeno en sistemas agrcolas (Wani et al., 1995), el
control de las pestes y enfermedades que afectan al vigor de la planta y a su potencial de
crecimiento ( J ohnstone y Barbetti, 1987; Sinclair, 1994).
En cuanto a los factores abiticos, son muchos los que inciden sobre el proceso, factores
que adems suelen interaccionar entre s. Uno de los ms estudiados es la concentracin de
nitrato, ya que es una de las formas de nitrgeno ms utilizada como fertilizante y acta como
un potente inhibidor de la FSN (Streeter, 1988). Por otra parte los niveles de nitrato en el suelo
intreraccionan con la concentracin de oxgeno en el mismo (Arrese-Igor et al., 1993(656); de
Lorenzo et al., 1994), este ltimo factor afecta al funcionamiento de la nitrogenasa nodular
(Ianneta et al., 1995). Se han observado cambios de la resistencia a la difusin de oxgeno en el
cortex nodular implicados en el descenso de la FSN en presencia de altas concentraciones de
nitrato (Vessey y Waterer, 1992)(2461) as como una regulacin por retroalimentacin basada
en el estatus de nitrgeno mediado por los aminocidos que fluyen por el floema y que actan
en el ndulo (Parsons et al., 1993)(2461). Sin embargo, concentraciones bajas de nitrato
estimulan la FSN, particularmente, durante la poca de crecimiento de la planta (Allos y
Bartholomew, 1959; Ingestad, 1980; Rigaud, 1981; Macduff et al., 1989)(2185). Durante esta
poca, un pequeo suplemento de nitrato, aumentara la actividad fotosinttica de la planta y el
aporte de carbohidratos al ndulo, lo que favorece su desarrollo y actividad. Sin embargo, los
niveles no deben ser lo suficientemente elevados (<2 mol m
-3
) como para provocar altos niveles



13
de nitrgeno en el floema (Macduff et al., 1996)(2185) que disparara el mecanismo de
retroalimentacin propuesto por Parsons (1993) y que ya hemos mencionado.
El NH
4
+
inhibe la FSN de forma indirecta por un incremento en la concentracin
citoplasmtica de amonio o de aminocidos derivados de la asimilacin de amonio por parte de
las races, lo que puede llegar a exceder temporalmente la capacidad constitutiva de las rutas
asimilatorias de las races (Svenning y Macduff, 1996)(2461). Por otro lado, el amonio, puede
regular la nodulacin reprimiendo los genes Nod (Dusha et al., 1989; Kondorosi et al., 1989).
El fsforo, es uno de los factores limitantes de la produccin vegetal en muchos
ecosistemas (Andrew y Robins, 1969)(2668). La FSN depende de la energa que le
proporcionan los fotosintatos traslocados a las races (Graham, 1984)(2393), el fsforo es
esencial en la formacin de fotosintatos y en su traslocacin, por lo tanto es un factor esencial
(Soliman et al., 1996)(2393). Las leguminosas estn especialmente afectadas por este factor, ya
que necesitan ms fsforo que otras plantas no simbiticas (Isral, 1987)(2668). En leguminosas
noduladas un 20% del fsforo total de la planta se localiza en los ndulos (Adu-Gyamfi et al.,
1989; Gunawardena et al., 1992)(2668). Adems, la masa nodular desciende drsticamente en
condiciones de deficiencia de este nutriente (OHara et al., 1988; Gunawardena et al.,
1992)(2668)(Ribet y Drevon, 1995a). Sin embargo, Ribet y Drevon (1995a)(2668) observan un
aumento en la permeabilidad del cortex nodular al oxgeno. Vadez et al. (1996) encuentran los
mismos resultados y proponen algn tipo de relacin entre la tolerancia a bajas concentraciones
de fsforo frente a la FSN mediante una regulacin de la permeabilidad nodular.
El hierro es uno de los nutrientes necesario para la iniciacin de la nodulacin,
desarrollo de la bacteria en el ndulo, produccin de leghemoglobina y de nitrogenasa (Barton
et al., 1994)(2503). Por este motivo, se propone que la produccin de siderforos por parte del
simbionte puede ser importante para el metabolismo del ndulo, sobre todo bajo condiciones de
limitacin de hierro. Ciertos rizobios producen siderforos como carboxilatos, fenolatos, catecol
e hidroxamato (Barran y Bromfield, 1993)(2503). Persmark et al. (1993)(2503) caracterizan la
rizobactina, un siderforo especfico de Rhizobium meliloti, que aumenta la FSN en plantas
noduladas que crecen bajo condiciones deficientes de hierro (Gill et al., 1991; Barton et al.,
1992)(2503). Tanto la ausencia como la produccin continuada de siderforos afecta
negativamente a la FSN (Barton et al., 1996)(2503). La produccin continuada resulta txica
para la bacteria en el ndulo. Sin embargo, una produccin adecuada estimula el crecimiento de
la planta y regula la fijacin de nitrgeno en condiciones de deficiencia de hierro (Gill et al.,
1991; Barton et al., 1992)(2503).



14
El tipo de manejo afecta a este proceso, Herridge y Bergarser (1988)(2586) observan
diferencias en la fijacin de nitrgeno segn el tipo de prctica agrcola, y Horn et al.(1996)
observan que el momento de la siembra afecta, obteniendo mayores tasas de fijacin sembrando
prematuramente. Sin embargo, estos ltimos autores aclaran, que el momento de siembra debe
ser elegido segn el tipo de planta, la humedad del suelo, y momentos, en que los niveles de
nitratos sean bajos para mejorar as, la produccin y el rendimiento de la fijacin de nitrgeno.
Goh et al. (1996)(2634) observan una variacin estacional en la fijacin simbitica de
nitrgeno que explican, al menos en parte por variaciones en la temperatura. Las temperaturas
ms bajas del invierno, afectan al metabolismo de la planta (Lie, 1981), a la formacin de races
(Rohini-Kumarashinghe et al., 1979), al crecimiento del rizobio, a su capacidad de infeccin y a
la formacin del ndulo (Roughley y Dart, 1970)(2634), lo que reduce las tasas de fijacin
durante estos meses. As mismo, temperaturas por debajo de 5-10C limitan la fijacin de forma
indirecta impidiendo el crecimiento de los pelos radicales y de forma directa al disminuir la
demanda de nitrgeno por la planta (Svenning y Macduff, 1996)(2461). La temperatura de la
zona radical parece afectar al balance entre la cantidad de nitrgeno mineral absorbido por las
races y la fijacin de nitrgeno por parte de los ndulos (Svenning y Macduff, 1996)(2461). Por
otro lado la temperatura afecta de forma indirecta al proceso, puesto que es responsable, en
parte, de los niveles de humedad en el suelo (Yunusa et al., 1995 a)(2634), aspecto en el que se
incide a continuacin.
La humedad del suelo es un factor de incidencia crtica sobre el proceso (Weisz et al.,
1985)(2282). La FSN es incluso ms sensible a la humedad del suelo que otros parmetros
fisiolgicos como la fotosntesis (Durand et al., 1987)(2282), transpiracin (Sall y Sinclair,
1991)(2282) o la asimilacin de nitratos (Obaton et al., 1982)(2282). Pankhurst y Sprent
(1975)(2282) proponen que el principal efecto de la sequa sobre la actividad nodular es un
descenso de la permeabilidad a la difusin del oxgeno en el ndulo. As mismo, la sequa
produce alteraciones en el metabolismo del nitrgeno. Los uridos deben estar directamente
implicados en la regulacin de la permeabilidad del ndulo al oxgeno (Streeter, 1992; Purcell y
Sinclair, 1994). Serraj y Sinclair (1996)(2282) proponen que la sntesis y transporte de uridos
est ntimamente ligada a la disminucin de la fijacin de nitrgeno durante la sequa. Como
consecuencia del estrs hdrico: baja la demanda de nitrgeno por parte de las races y se limita
el agua disponible para el ndulo; baja el transporte de solutos nitrogenados, incluidos los
uridos; se acumulan los productos de la fijacin de nitrgeno en el ndulo y se inhibe la
actividad nitrogenasa en los bacteroides. As mismo, altos niveles de agua en el suelo resultan



15
tambin negativos para este proceso (Serraj y Sinclair, 1996)(2282). El ptimo parece
encontrarse en una humedad edfica entorno a la capacidad de campo (Castellanos et al.,
1996)(2081).
La competencia por la luz puede darse en algunas ocasiones, como en cultivos mixtos, y
ser un factor limitante de la FSN. Este hecho se debe a una disminucin de la fotosntesis en la
planta y por lo tanto una menor disponibilidad de fotosintatos para la formacin del ndulo y
para el proceso de fijacin en los mismos (Wahua y Miller, 1978)(2571).
Por otra parte la concentracin de protones en el medio est ligada a la concentracin de
cationes como Al
3+
, Mn
2+
, Ca
2+
y Mo
2+
. Cuando baja el pH se movilizan Al
3+
y Mn
2+
que
resultan txicos para muchos poblaciones microbianas (Coventry et al., 1985; Richardson et al.,
1988; Evans et al., 1990)(2202). Adems el Al
3+
y la concentracin elevada de H
+
inhiben
especficamente el crecimiento radical y la formacin del ndulo (Munns, 1968; Whelan y
Alexander, 1986; Blamey et al., 1993; Brady et al., 1994)(2202). En cuanto al Ca
2+
y Mo
2+
, su
disponibilidad evoluciona de forma inversa a la concentracin de protones (Unkovich et al.,
1996)(2202). La carencia de Ca
2+
en el medio inhibe la formacin de pelos radicales (Loneragan
y Dowling, 1958; Evans et al., 1988; Flis et al., 1993)(2202), lo que influye decisivamente en el
proceso de infeccin. Adems dado que el anclaje de los rizobios a la raz est mediado por una
protena dependiente de calcio, la nodulacin resulta fuertemente inhibida. Por otro lado, al
bajar el pH tambin descienden las concentraciones de molibdeno, lo cual revierte en una
supresin de la actividad nitrogenasa de los ndulos ya existentes (Coventry et al., 1985)(2202).
El oxgeno es necesario para mantener la respiracin bacteriana, ya que los rizobios son
aerobios estrictos, sin embargo el oxgeno inhibe la nitrogenasa, razn por la cual, los niveles en
el interior del ndulo son bajos, oscilando entre 3 y 25 nM, concentracin determinada por la
permeabilidad del cortex al O
2
(Hunt y Layzell, 1993; Serraj et al., 1995). En estas condiciones
para proveerse del oxgeno necesario para la respiracin, la bacteria utiliza la leghemoglobina,
una protena que transporta O
2
, directamente a los bacteroides pero no deja oxgeno libre que
inhibira la nitrogenasa (Appleby, 1984)(2092). La sntesis de ATP en el ndulo a bajas
concentraciones de oxgeno requiere una alta afinidad por parte de las oxidasas (Appleby,
1984)(2668) y por la mitocondria (Millar et al., 1995)(2668). Al exponer los ndulos a altas
concentraciones de oxgeno, se ha observado, que en un primer momento, su actividad
nitrogenasa aumenta, as como la respiracin (King y Layzell, 1991; Roy, 1993)(2668). Sin
embargo, con el tiempo la nitrogenasa queda inhibida, existiendo dos hiptesis para explicar
este hecho. Por un lado Hunt et al. (1984)(2373), opinan que al someter al ndulo a altas



16
presiones de oxgeno, se producen alteraciones en la barrera de difusin de este gas en el cortex
nodular. Sin embargo, Zeng y Tjepkema (1996)(2373) observan que existe un retraso en la
respuesta de la respiracin nodular al aumento de las presiones de oxgeno en el exterior, y
como consecuencia aumenta la concentracin de este gas en el interior del ndulo. Este aumento
interno, inhibe a la nitrogenasa, hasta que la respiracin aumenta y la inhibicin revierte.
La actividad nitrogenasa de leguminosas se ve incrementada por presiones parciales de
CO
2
altas (Finn y Brun, 1982; Williams et al., 1982)(2450). Este hecho puede ser debido, a que
bajo estas altas presiones, la relacin C/N aumenta tanto en los exudados radicales como en la
hojarasca, lo cual favorece a las bacterias implicadas en la FSN (Curtis et al., 1994; Norby,
1994)(2450). El aumento en la actividad nitrogenasa en los ndulos puede deberse a una mayor
disponibilidad de C, necesario para la reduccin del N
2
, (Hardy y Havelka, 1976)(2450). Sin
embargo, Zanetti et al. (1996) observan que la mayor fijacin de nitrgeno por parte de la planta
bajo altas concentraciones de CO
2
, coincide con el aumento en el nmero y peso de los ndulos.
Otros factores abiticos que afectan directa o indirectamente a este proceso son, entre
otros, el magnesio, necesario para el funcionamiento de una pirofosfatasa en la membrana
peribacteroide (Bassarab y Werner, 1989), el boro (Bolaos et al., 1996), la concentracin salina
(Delgado et al., 1993; Cordovilla et al., 1996), la concentracin de cidos orgnicos en el suelo
(Yuen y Stacey, 1996), la defoliacin (Hartwig et al., 1987)(2259) y el etileno (Suganuma et al.,
1995).

1.1.2. Amonificacin

La amonificacin, tambin denominada mineralizacin del nitrgeno, consiste en un
conjunto de reacciones a travs de las cuales el nitrgeno de protenas y otros compuestos
presentes en la materia orgnica se libera en forma de amonio, siendo sta forma asimilable
por las plantas (Singh y Kashyap, 1996) (Sep 2181). Este proceso es complejo y depende de
la actividad de microorganismos aerobios y anaerobios (Nugroho y Kuwatsuka, 1990)(sep
2365) que utilizan los compuestos orgnicos nitrogenados como fuente de energa (J arvis et
al., 1996)(sep 2579). Parte del amonio que es liberado por la accin de los microorganismos
mineralizadores es utilizado para su propio desarrollo quedando inmovilizado.
Mineralizacin e inmovilizacin son procesos ntimamente conectados y se dan
simultneamente en el suelo (Recous et al., 1992; Hart et al., 1994)(sep 2189). La
inmovilizacin es responsable de una demora en el rendimiento de fertilizantes (Broadbent y



17
Nakashima, 1967). Benkiser et al. (1989) sitan entre un 20 y un 40% el nitrgeno de
fertilizantes que es inmovilizado en suelos agrcolas, y Hadas et al. (1989) establecen una tasa
algo menor (13-26%) en suelos adaptados para el cultivo en Israel. No obstante esta
inmovilizacin es relativa, toda vez que el amonio asimilado no escapa a la dinmica del
ciclo y a medio plazo se volver a incorporar al suelo, siendo disponible para las plantas. En
teora el balance entre stos dos procesos podra fluctuar segn las condiciones ambientales,
el suelo y la cantidad y naturaleza de los sustratos orgnicos. La tasa de mineralizacin
depende de la relacin C/N de las bacterias en comparacin con la relacin de su sustrato.
Cuando las bacterias descomponen la materia orgnica se libera mayor cantidad de amonio si
la bacteria tiene mayor proporcin de C/N que su sustrato (Hassink et al., 1994)(1003). En la
mayora de los casos, existe una mineralizacin neta a lo largo del ao, aunque en breves
periodos de tiempo pueda dominar la inmovilizacin (Ocio et al., 1991)(Sep 2579). El
balance entre estos dos procesos determina el flujo y la disponibilidad de nitrgeno (Powlson
et al., 1994)(Sep. 2180) y han sido reconocidos como importantes procesos edficos desde
principios de siglo (Lhnis, 1910)(Sep 2579) ya que las formas minerales del nitrgeno son
esenciales para el crecimiento y desarrollo de las plantas (J arvis, 1996)(2579). Por tanto, su
estudio es necesario para tomar decisiones sobre las necesidades de fertilizantes, reciclado de
nitrgeno proveniente de restos de cultivos, abonos animales, mantenimiento de la materia
orgnica del suelo, emisin de gases con efecto invernadero y futuras prcticas agrcolas
(J arvis, 1996)(Sep 2180).

1.1.2.a. Factores que afectan a la amonificacin y microorganismos implicados en el
proceso

El rendimiento de la amonificacin es muy variable y viene determinado por la
resultante de complejas interacciones entre los componentes biolgicos, qumicos y fsicos
del suelo, que a su vez estn sujetos a influencias externas.
McKenney et al. (1995) (sep 1068) indican que la naturaleza de la materia orgnica,
as como la cantidad y calidad de los restos vegetales es el principal factor que regula la
mineralizacin. Mengel y Kirkby (1978)(sep 2579) estiman que las proporciones relativas de
compuestos nitrogenados en los residuos vegetales son: menos de un 2% correspondiente a
fraccin mineral (NO
3
-
, NH
4
+
, NO
2
-
); aproximadamente un 5% de compuestos amino solubles
(cidos, amidas y aminas); 90-95% protenas y cidos nucleicos. La proporcin de cada una



18
de las tres fracciones esta influida por el estado de crecimiento de las plantas y tipo del
cultivo y nutricin, sobre la que tiene una especial incidencia los aportes de sustancias
nitrogenadas. Por tanto, atendiendo a las observaciones de McKenney et al. (1995) (sep 1068)
el tipo de cultivo y su manejo afecta de manera decisiva a la mineralizacin.
Las plantas inciden en la amonificacin por el aporte de materia orgnica nitrogenada
de restos vegetales y a travs de la exudacin radical (Swift et al., 1979; Aber et al.,
1990)(sep 1992). Los exudados radicales no slo afectan al proceso debido a que suponen una
fuente de materia orgnica, sino tambin porque en su composicin aparecen diversas
sustancias que alteran el metabolismo de los microorganismos implicados en la
mineralizacin del nitrgeno (von Ltzow y Ottow, 1994; Martens, 1995)(Sep 2070);
Badalucco et al., 1996)(sep 2544). Sobre este aspecto incidiremos ms adelante al describir el
efecto de las plantas sobre los microorganismos rizosfricos.
Con respecto al aporte de compuestos orgnicos a travs de los restos vegetales, su
riqueza en sustancias fenlicas solubles en agua es uno de los factores ms importantes que
afectan la mineralizacin en suelos forestales, ya que dichos compuestos provocan la
estabilizacin de los compuestos orgnicos. La mayora de los extractos acuosos de la
hojarasca incrementan la amonificacin, pero otros la inhiben (Palm y Sanchez, 1991;
Gallardo y Merino, 1992)(Sep 1992). Hobbie (1996)(Sep 2511) afirma que la descomposicin
viene controlada principalmente por la proporcin de lignina y carbohidratos ms que por el
nitrgeno presente en la hojarasca. Sin embargo en suelos agrcolas la situacin parece ser
distinta, Broersma et al. (1995)(2098) encuentran que la tasa de mineralizacin en suelos
donde se han cultivado leguminosas es diez veces mayor que aquellos en los que han crecido
otro tipo de cultivo. Este hecho lo atribuyen a que estas plantas proporcionan mayores
cantidades de nitrgeno mineral al medio edfico. Como se puede apreciar la diferencia
bsica es que en sistemas agrcolas el aporte de compuestos polifenlicos no suele ser
importante si lo comparamos con sistemas forestales. Adems el rgimen de manejo del
suelo es completamente distinto. Gonzlez-Prieto et al. (1996)(sep 2116) observan que la
mineralizacin neta a lo largo del ao es mayor en suelos forestales que en suelos agrcolas.
El manejo de los suelos explicara segn estos autores alrededor del 20-25% de la varianza en
los ndices de mineralizacin.
Hasta ahora se ha comentado el efecto de la materia orgnica sobre el proceso
amonificante derivado simplemente del aporte de sustrato metabolizable y su degradabilidad.
Sin embargo la presencia de sustancias que afectan al proceso metablico en si tambin se



19
puede dar en esta va adems de por exudacin radical. Durante la ltima dcada se ha
prestado especial atencin a los mecanismos empleados por las plantas para controlar la
actividad de los microorganismos del ciclo del nitrgeno mediante toxinas o inductores. En
dichos procesos estn implicados compuestos orgnicos complejos (taninos, terpenos y
fenoles) que alteran directamente la actividad microbiana en el suelo (Palm y Sanchez, 1990,
1991; Irons et al., 1991; Gallardo y Merino, 1992)(Sep 1992). Por lo tanto los metabolitos
secundarios afectan de forma importante al ciclo del nitrgeno y a la disponibilidad del
mismo (Schimel et al., 1996)(Sep 1992).
La textura controla la mineralizacin afectando a la distribucin fsica de la materia
orgnica y confirindole cierto grado de proteccin a travs de la asociacin con partculas de
arcilla (Hassink et al., 1993)(2180). Por otra parte cuando la textura del suelo favorece las
condiciones aerobias aumenta la actividad amonificante (Drazkiewicz, 1995, 1996)(2365).
Por tanto los suelos con texturas ms finas tienen menores tasas de amonificacin que en
aquellos en los que la textura es ms gruesa (van Veen et al., 1985; Catroux et al., 1987;
Hassink, 1994a)(1003). La textura del suelo no solo influye por su efecto sobre la aireacin
del mismo, la reduccin de los poros del suelo despus de la compactacin reduce el
transporte de sustancias solubles, disminuyendo el aporte de nutrientes (Drazkiewicz,
1996)(2365). Esto puede inhibir la degradacin de lignocelulosa (Colberg, 1988)(2203), que
tiene una gran influencia en la degradabilidad de los residuos vegetales (Pinck et al.,
1950)(2203). Breland y Hansen (1996)(2203) encuentran que la mineralizacin disminuye en
un 18% en un suelo compactados, frente a otro no compactado.
La humedad del suelo es otro factor que afecta a la amonificacin (Moorhead et al.,
1988)(Sep 1737). La deficiencia de agua hace disminuir la tasa de mineralizacin, ya que
determina la difusin de solutos y la distribucin de los productos de la actividad microbiana
(Cabrera, 1993)(2579). Sin embargo, el exceso reduce la aerobicidad del suelo y altera las
actividades de distintas poblaciones bacterianas en diferentes micrositios. Se ha comprobado
que existe un aumento de la mineralizacin despus de secar y rehidratar el suelo (Stevenson,
1956; Nordmeyer y Richter, 1985; Cabrera, 1993)(2606). La explicacin de este hecho es que
mediante el secado del suelo y posterior rehumedecimiento los compuestos orgnicos se
vuelven disponibles para la extraccin y tambin para la descomposicin. Gestel et al.
(1991)(2606) proponen que los compuestos orgnicos mineralizados despus de rehidratar el
suelo seco derivan principalmente de materia orgnica no bitica.



20
Existe una fuerte interaccin entre la temperatura y la mineralizacin (Addiscott,
1983; Beck, 1983; Lochman et al., 1989; (2188) Neve et al., 1996) (Sep 2188), siendo
responsable de entre un 31 y un 41% de la varianza en las tasas de mineralizacin anuales de
un pastizal (Gill et al., 1995)(2579). La mayora de los microorganismos del suelo son
mesfilos y prefieren temperaturas moderadas con un ptimo entre 25 y 37C y una
temperatura base de 5C. Los cambios de congelacin descongelacin tienen efectos similares
a los de secado y rehidratado (J arvis et al., 1996)(2579). En general la mineralizacin
aumenta con la temperatura y tiende a ser menos variable a temperaturas altas (Stanford et al.,
1973)(2579), vindose ms favorecida la mineralizacin de residuos ms resistentes (Neve et
al., 1996)(2188).
Un concepto interesante que puede aportar datos al conocimiento de la dinmica de la
mineralizacin del nitrgeno en el suelo es el introducido por Bonde et al. (1988)(2606).
Estos autores indican que slo una pequea parte del nitrgeno orgnico en el suelo es
realmente accesible a la mineralizacin y de sta una proporcin importante corresponde ala
propia biomasa bacteriana. Estos resultados encajan con los resultados de Choi y Nelson
(1996)(2553) que encuentran en la biomasa bacteriana un fertilizante nitrogenado de
excelente calidad ya que su nitrgeno es rpida y fcilmente utilizable por la planta, ms que
los compuestos orgnicos procedentes de restos vegetales (Abuzinadah et al., 1986)(2446).
Un factor que puede tener influencia sobre la tasa de mineralizacin es la actividad de
la mesofauna y microfauna. La mineralizacin en la rizosfera se ve incrementada por el
pastoreo de los protozoos (Clarholm, 1985)(2544). Los protozoos estimulan la tasa de
crecimiento bacteriano (Coleman et al., 1978; Woods et al., 1982; Clarholm, 1985)(1003) as
como la produccin de enzimas bacterianas implicadas en la mineralizacin (Badalucco et al.,
1996)(2544). Por otro lado la proporcin C/N es normalmente mayor en la microfauna
comparada con la relacin de su sustrato, mientras que para las bacterias es al revs y por ello
la microfauna excreta mayor cantidad de nitrgeno en forma de NH
4
+
(Hunt et al., 1987)
(1003). La textura afecta de forma indirecta, en ste sentido, a la mineralizacin del
nitrgeno, ya que la compactacin del suelo disminuye el volumen de poros disponible para
los nemtodos, organismos que incrementan el reciclado de nitrgeno por la predacin de
microorganismos (Elliott et al., 1980; Woods et al., 1982; Griffiths, 1986)(2203). En los
suelos con textura ms gruesa la presin de pastoreo de nemtodos y flagelados sobre
bacterias es mayor y las tasas de mineralizacin tambin (Hassink et al., 1994)(1003). Se ha
comprobado que el pastoreo es mayor en suelos dedicados a pastos, donde la entrada de



21
residuos orgnicos es mayor que en suelos arados donde las entradas son menores, y adems
se concentran sobre todo en la poca de cosecha. (Hassink et al., 1994)(1003).
Tietma et al. (1992)(2116), no encuentran ninguna relacin entre el pH del suelo y la
mineralizacin. sin embargo, trabajos posteriores como los de Gonzlez-Prieto et al.
(1996)(2116) demuestran que la mineralizacin es mayor en suelos cidos (pH<4.5), aunque
la incidencia de este factor slo explicaba en torno a un 3-17% de la varianza. Pese a que la
mineralizacin se ve completamente inhibida en suelos bajo la influencia de lluvia cida
(Wolters, 1991)(2116), estos resultados no se pueden extrapolar a suelos no alterados, en los
cuales las poblaciones microbianas estn adaptadas a pH cidos (Bramley y White,
1990)(2116).
Otros factores que afectan a la mineralizacin son: CIC (Gonzlez-Prieto et al.,
1996)(Sep 2116). el fuego (Fritze et al., 1994; Singh, 1994), el estado de la sucesin (White
et al., 1988; Vitousek et al., 1989), la adicin de nitrgeno (J enkinson et al., 1985; Hart et al.,
1986)(2579), la disponibilidad de nutrientes (Entry et al., 1986), la presencia de
contaminacin por metales pesados (Chang y Broadbent, 1982)(2579) y el pretratamiento de
los suelos (Campbell et al., 1993)(Sep 2098).
El grupo funcional de los mineralizadores es amplio y abarca a hongos y bacterias.
Entre los primeros destacan gneros del orden Mucorales (Mucor y Rhizopus) y
ascomycotinas del orden Aspergillales (Aspergillus y Penicillium), (Garrt 1963 y Alexander,
1980). Los hongos liberan menos amonio que las bacterias, dada su mayor necesidad de
nitrgeno para la sntesis celular y abundan en medios con pH cido (Garret, 1963). Llevan a
cabo las primeras etapas de la descomposicin de la materia orgnica vegetal especialmente
la de la hojarasca ms recalcitrante. Hace falta un primer paso en la descomposicin por parte
de hongos saprfitos para liberar el nitrgeno contenido en la hojarasca (Colpaert y Laere,
1996)(2446). Ectomicorrizas y basidiomicetos colonizan los horizontes orgnicos de los
suelos forestales y movilizan nutrientes a partir de los sustratos orgnicos (Read,
1991)(2447). Una vez los carbohidratos son metabolizados por los microhongos, los
basidiomicetos saprfitos se encargan de descomponer y mineralizar los compuestos ms
recalcitrantes (Colpaert y van Tichelen, 1996)(2447). Las bacterias hetertrofas, son los
principales descomponedores y suponen ms de un 90% del flujo de energa en el suelo
(Ladd y Foster, 1988). Normalmente se dividen en dos grupos: a) especies autctonas que
mantienen relativamente constante su actividad y b) especies zimgenas que reaccionan
rpidamente ante nuevos aportes de sustrato y luego permanecen en dormicin (Ladd y



22
Foster, 1988)(2579). Las bacterias estn representadas por diversas especies de los gneros
Pseudomonas, Bacillus, Clostridium, Serratia y Micrococcus. A diferencia de los hongos,
Colpaert y van Tichelen (1996)(2447) sealan una mayor abundancia de bacterias en medios
bsicos o neutros.

1.1.3. Nitrificacin

La nitrificacin es el proceso microbiolgico que transforma el N-NH
4
+
en formas
oxidadas de N, nitrato y nitrito. De este proceso depende en parte la productividad del suelo, ya
que el nitrato suele ser la forma nitrogenada que prefieren las plantas para su nutricin (Tu,
1996)(2527). Segn Manzhosov y Maymusov (1994) la productividad de un suelo depende de
la cantidad de nitratos que pueda producir y retener.
Benckiser, et al. (1996) esquematizan el proceso de la siguiente manera:

NH
3
NH
2
OH HNO NO NO
2
-
NO
3
-


N
2
O N
2
O, N
2


La transformacin de NH
4
+
, relativamente inmvil, a NO
3
-
, extremadamente mvil,
pasando por NO
2
-
proporciona la oportunidad de escape de numerosos formas nitrogenadas
(NO
3
-
, NO
2
-
, NO
x
, N
2
O, N
2
). Estudios in vitro con Nitrosomonas europea (Yoshida y
Alexander, 1970; Ritchie y Nicholas, 1972)(2620) demostraron que las bacterias oxidantes de
amonio eran capaces de producir N
2
O bajo determinadas condiciones. Ritchie y Nicholas
(1972)(2620) concluyeron que stas bacterias reducan el nitrito a xidos de nitrgeno para
minimizar la acumulacin de niveles txicos de nitrito intracelulares. Sin embargo, Poth y Focht
(1985) observaron que N. europea usa el nitrito como aceptor de electrones bajo condiciones de
anaerobiosis. Estudios posteriores han confirmado esta hiptesis (Benckiser et al., 1996)(2619).
Maag y Vinther (1996)(2620) estiman que un 1% del nitrgeno nitrificado se pierde en forma de
N
2
O. Esta ruta alternativa de los nitrificantes para continuar sintetizando ATP usando parte de
los productos de su metabolismo aerobio cuando estn en condiciones de anaerobiosis, supone
una va de reduccin de la contaminacin de aguas por nitratos, pero un aumento de los niveles
de N
2
O en la atmsfera (Benckiser et al., 1996)(2619). Si excluimos las prdidas de nitrgeno
como N
2
O va desnitrificacin, las perdidas de nitrgeno aadido como fertilizante por
volatilizacin de amonio y por emisin de xido ntrico va nitrificacin, se estiman



23
aproximadamente en un 20%, si los fertilizantes son orgnicos, y en un 10% si son qumicos
(Schepers y Mosier, 1991). Por otra parte las prdidas de nitratos a travs del lavado pueden
llegar a ser mayores que las prdidas de cualquier otro nutriente (Vitousek et al., 1989; Davies y
Williams, 1995). Por las razones anteriormente expuestas se ha prestado especial atencin
durante los ltimos aos al estudio de la nitrificacin y al empleo de inhibidores de la misma,
que permitan mantener la productividad del suelo alcanzando un equilibrio entre las perdidas
por volatilizacin del amonio, por produccin de xidos de nitrgeno y por lavado de nitratos
(Davies y Williams, 1995). Diversas sustancias se han utilizado como inhibidoras de la
nitrificacin, como por ejemplo herbicidas (Tu, 1996)(2527), insecticidas, fungicidas, as como
diversos compuestos qumicos (Prasad y Power, 1995)(1304). El estudio de esta etapa del ciclo
del nitrgeno, se hace indispensable, no slo por ser un proceso limitante, que adems es vital
para el flujo, transferencia , prdidas y utilizacin del nitrgeno, si no por las implicaciones
ecolgicas que conlleva (J arvis, 1996)(2180).

1.1.3.a. Factores que afectan a la nitrificacin y microorganismos implicados en el proceso

Holmes et al. (1996)(2548) sealan la disponibilidad de amonio como regulador de la
nitrificacin (Vitousek et al., 1982). Por esta razn, Standford et al. (1975) sealan como factor
limitante de la nitrificacin la velocidad de mineralizacin y como ya hemos puntualizado en el
apartado anterior, la naturaleza y cantidad de los restos vegetales afectan de forma indirecta a
ste proceso (Paul y Clarck 1989)(2481). Sin embargo, Hjberg et al. (1996) encuentran que en
suelos con niveles de amonio en torno a los 40 g/g son otros factores distintos de la
disponibilidad de sustrato los que afectan al proceso, como aireacin y humedad del suelo.
La disponibilidad de oxgeno es otro de los factores que ms afecta a la nitrificacin,
puesto que es un proceso aerobio. La supervivencia de las bacterias nitrificantes en ambientes
con concentraciones bajas de oxgeno, depende de su capacidad para competir con las races de
las plantas, con otras bacterias aerobias hetertrofas y con procesos qumicos de oxidacin
(Bodelier et al., 1996)(2458). Laanbroek y Gerards (1993) y Laanbroek et al. (1994)(2458),
demuestran que las bacterias nitrificantes son malas competidoras por el oxgeno comparadas
con bacterias hetertrofas (Laanbroek y Woldendorp, 1995)(2458). Sin embargo Bodelier et al.
(1996)(2458) observan que las bacterias nitrificantes que viven en ambientes donde se dan
fluctuaciones xicas y anxicas, son capaces de desarrollar adaptaciones fisiolgicas,



24
aumentando su afinidad por el oxgeno para sobrevivir a las condiciones de microaerofilia.
Gunderson (1966) observa que un 10% de O
2
, es el ptimo para el crecimiento de nitrificantes.
Presiones superiores de oxgeno se han descrito como inhibidoras de Nitrobacter, siendo
necesarias bajas presiones de O
2
para su crecimiento en medio slido (Prosser, 1989)(2200).
Determinadas plantas promueven la aparicin de nitrificantes en su rizosfera aportando oxgeno
a travs del aernquima (Lodhi et al., 1996)(2331). Sin embargo, como ya se ha indicado
anteriormente stas bacterias deben competir con las plantas por el oxgeno y por tanto, la
disponibilidad de ste depende en gran parte de el estado de desarrollo de la planta y de la poca
de crecimiento (Bodelier et al., 1996)(2458).
La humedad del suelo afecta a la nitrificacin tanto por deshidratacin como por
limitacin de sustrato. Esta sensibilidad de los nitrificantes a la humedad del suelo est
relacionada con sus altos requerimientos energticos, al diversificar su energa para sintetizar
solutos como aminas o polioles, que les ayudan a soportar situaciones de sequa (Sprent, 1987).
En organismos de crecimiento lento como los nitrificantes, se espera una fuerte seleccin
(seleccin k), y por ello, sus poblaciones suelen variar poco en el tiempo (Woldendorp y
Laanbroek, 1989)(2181), aunque Focht y Verstraete, (1977) (2548) observan variaciones
estacionales en estas poblaciones.
Las alteraciones del suelo debidas a la accin antropognica afectan al funcionamiento
del ciclo del nitrgeno. El aumento en las concentraciones de nitratos, por deposicin, tiene
diversos efectos sobre el suelo forestal, como por ejemplo, aumentar el lavado de Ca
2+
,
aumentar la solubilidad de Al
3+
y disminuir la relacin Ca/Al (Aber et al., 1989; Foster et al.,
1989)(2336). Este dato resulta de gran importancia, ya que la nitrificacin se inhibe a altas
concentraciones de Al
3+
y Fe
3+
, aunque las concentraciones de amonio sean altas (Liang y
Tabatabai, 1978)(2336). Como consecuencia del cultivo se altera la estabilidad del suelo y se
reduce la cantidad de carbono orgnico (Bauer y Black, 1981; Gupta y Germida, 1988;
Srivastava y Sing, 1989)(2181). Las prdidas de carbono orgnico reducen el nmero de
macroagregados en los suelos cultivados (Sing y Sing, 1995)(2181) y esto tiene un considerable
impacto sobre la mineralizacin ya que la materia orgnica de macroagregados es ms lbil y
ms fcil de mineralizar que la asociada a microagregados (Gupta y Germida, 1988)(2181). J ha
et al. (1996)(2181) calculan que el nmero de oxidantes de amonio y de nitrito en suelo agrcola
es un 48 y 31% del presente en suelo forestal lo que podra deberse a los factores antes
sealados.



25
A pesar de ser microorganismos auttrofos, Berg y Rosswall (1985, 1987)(2181)
encuentran una correlacin positiva entre las cantidades de carbono orgnico y el nmero y
actividad de oxidantes de amonio y nitrito. En este sentido influye el efecto de la materia
orgnica sobre la mineralizacin y la relacin entre este proceso y la nitrificacin (Standford et
al., 1975; Paul y Clark, 1989), pero adems la materia orgnica del suelo aumenta la aireacin
del mismo, lo cual es crucial para los nitrificantes que dependen de los sistemas citocromo para
el transporte de electrones y finalmente del oxgeno (Haynes, 1986). Sin embargo, cantidades
excesivas de materia orgnica junto con una excesiva humedad pueden crear situaciones de
anoxia inhibiendo, por tanto, la nitrificacin (J ha et al., 1996)(2181).
La textura del suelo afecta decisivamente la nitrificacin puesto que la difusin de
oxgeno, as como el mantenimiento del agua se produce de forma desigual segn el tamao del
poro y de los agregados telricos Drazkiewicz (1996)(2289). Por otro lado la heterogeneidad del
suelo y el contenido en arcillas afectan decisivamente al proceso ya que las arcillas adsorben
iones amonio, y como resultado existe una colonizacin entorno a ellos de los oxidantes de
amonio (Powell y Prosser, 1992)(2181).
El metabolismo del nitrito es extremadamente rpido, salvo en ocasiones que queda
retenido en el suelo, dependiendo de las caractersticas del mismo, las prcticas agrcolas como
fertilizacin con amonio, pH, contenido de materia orgnica, temperatura y humedad (Burns et
al., 1995)(2269). La alcalinidad del suelo favorece la acumulacin de nitrito, en los lugares
donde se dan altas concentraciones de NH
3
y altos pH, el nitrito tiende a acumularse, ya que su
oxidacin est inhibida (Van Cleemput y Samater, 1996)(2269). Estos dos factores parecen
afectar ms a los oxidantes de nitrito que a los oxidantes de amonio, lo cual deriva en una
acumulacin de NO
2
-
en el suelo. Otros autores han observado una acumulacin de nitrito a
bajas concentraciones de carbono orgnico y a bajas temperaturas (Habr y Goltermasn,
1990)(2269).
Las plantas afectan a este proceso produciendo compuestos alelopticos que inhiben
directamente la nitrificacin (Rice, 1984)(1992). Entre estos metabolitos secundarios destacan
los taninos (Thibault et al., 1982; Baldwin et al., 1983), fenoles de bajo peso molecular (Lodhi y
Killingbeck, 1980) y terpenos (White, 1986). Por otro lado, los fenoles, taninos y otros
metabolitos secundarios de las plantas afectan a la nitrificacin de forma indirecta, cambiando la
descomponibilidad de los compuestos orgnicos, lo que supone un retraso en la descomposicin
y mineralizacin de los mismos (Palm y Sanchez, 1990, 1991; Irons et al., 1991; Gallardo y
Merino, 1992)(1992).



26
Otros factores que afectan al proceso son la temperatura (Savey, 1967), el pH (Katyal et
al., 1988), la concentracin de cidos orgnicos (Karmarkar y Tabatabai, 1991), metales
pesados (Dusek, 1995), capacidad de intercambio catinico y disponibilidad de fosfatos
(Vitousek et al., 1982), el fuego (Acea y Carballas, 1996)(2658) y concentracin de nitrato
(Gomez et al., 1996)(2127), entre otros.
La nitrificacin la pueden realizar ciertos microorganismos hetertrofos. Estudios
llevados a cabo con cultivos de microorganismos nitrificantes hetertrofos (Doxtader y
Alexander, 1966; Schmidt, 1973; Focht y Verstraete, 1977; Tate, 1985) indican que stos no
hacen uso de la energa liberada en la oxidacin para su crecimiento y, como apunta Alexander
(1980), los productos oxidados no aparecen hasta que ha cesado la fase exponencial de
crecimiento. Todo ello sugiere que la nitrificacin hetertrofa no tiene una importancia muy
grande en lo que respecta a la produccin de N-NO
3
-
.
La nitrificacin quimioauttrofa es llevada a cabo por dos grupos fisiolgicos de
bacterias Gram negativas quimioauttrofas pertenecientes a Nitrobacteraceae (Watson et al.,
1981; Schmidt, 1982)(2181); la primera etapa, la conversin de amonio a nitrito, es mediada por
bacterias oxidantes de amonio (J ha et al., 1996)(2181) que pertenecen sobre todo a los gneros
Nitrosomonas, Nitrosoglea, Nitrosospira, Nitrosococcus y Nitrosocystis. La segunda, el paso de
nitrito a nitrato por bacterias oxidantes de nitrito (J ha et al., 1996)(2181) pertenecientes en su
mayora a los gneros Nitrobacter y Nitrocystis. Entre los microorganismos que realizan la
nitrificacin hetertrofa pueden mencionarse algunos gneros de bacterias como Azotobacter,
Pseudomonas, Streptomyces, Bacillus, Alcaligenes, Nocordia y Thiosphaera, a este ltimo
gnero pertenecen los desnitrificantes aerobios anteriormente mencionados y hongos del orden
Aspergillales de los gneros Aspergillus y Penicillium.

1.1.4. Desnitrificacin

La desnitrificacin microbiolgica consiste en la reduccin del nitrato a xidos de
nitrgeno y nitrgeno molecular. Para ello las formas oxidadas de nitrgeno sirven como
ltimos aceptores de la cadena respiratoria con el subsiguiente rendimiento energtico (Bernet et
al., 1995)(1290), por lo tanto el proceso slo ocurre en condiciones anaerobias. Zanner y Bloom
(1995), detectan actividad desnitrificante en suelos bien aireados, hecho que imputan a la
presencia de microespacios anaerobios entre las partculas constituyentes del suelo o en la
proximidad de residuos orgnicos. En consecuencia, en el suelo se dan simultneamente



27
procesos nitrificantes y desnitrificantes (Burns et al., 1995b)(2200) ocupando los
microorganismos la superficie de agregados del suelo (con mayor tensin de oxgeno) o el
interior de las partculas (con menor tensin de oxgeno), respectivamente (Tate, 1985). Ye et
al., (1994) especifican el conjunto de reacciones constituyentes del proceso como sigue:

NO
3
-
NO
2
-
NO N
2
O N
2


Cada una de las distintas etapas est catalizada por una enzima especfica distinta
(Hochstein y Tomlinson, 1988; Stouthamer, 1991)(2637). As, slo algunos microorganismos
poseedores del juego enzimtico completo pueden producir nitrgeno molecular a partir de
NO
3
-
, por lo que Ingraham (1981) slo considera desnitrificantes estrictos a dichos
microorganismos. Lo ms habitual es, sin embargo, que slo posean algunas de estas enzimas,
por lo cual liberan nicamente productos parcialmente reducidos (Hall, 1978(Tesina Lu);
Tiedje, 1988; Ye et al., 1994)(2637). Las cuatro reductasas implicadas en el proceso difieren en
sus condiciones ptimas con respecto a variables, como: concentracin de oxgeno, pH,
concentracin de NO
3
-
, disponibilidad de carbono, etc. Por tanto las condiciones ambientales
juegan un papel importantsimo determinando si la desnitrificacin es total o parcial y por tanto
que productos del proceso se acumulan (Burns et al., 1996)(2200).
El nitrato puede ser tambin reducido asimilatoriamente (se han encontrado procariotas
capaces de dicha reduccin) sin que ste sea liberado al medio (Blackburn, 1983). Esta ruta,
conocida como reduccin asimilatoria es reprimida por el amonio y no est acoplada a la
produccin de ATP, por lo que se verifica tanto en aerobiosis como en anaerobiosis. Bernet et
al. (1995) apuntan que existe una va desasimilatoria que produce amonio y que est acoplada a
la formacin de ATP. Esto supone para los microorganismos capaces de realizarla una fuente
extra de energa y para los ecosistemas, una va de liberacin de nitrito y del exceso de poder
reductor (Yordy y Ruoff, 1981). La proporcin entre desnitrificacin y reduccin
desasimilatoria es funcin de la relacin carbono disponible/aceptor electrnico, tamao de la
poblacin bacteriana y su actividad (deCatanzaro y Beauchamp, 1985; Fazzolari et al.,
1990)(2481).
Existen tambin procesos de desnitrificacin estrictamente abiticos, aunque su
importancia es mnima (Hutchinson y Davidson, 1993), limitndose a suelos muy cidos o
helados (Vermoesen et al., 1996).




28
1.1.4.a. Factores que afectan a la desnitrificacin y microorganismos implicados en el
proceso

La tasa de desnitrificacin responde a la concentracin de nitrato de acuerdo con una
cintica de Michaelis-Menten (Firestone, 1982)(2209). Sin embargo, esta variable afecta de
forma diferente a las distintas enzimas implicadas en la desnitrificacin. En algunas bacterias el
nitrato inhibe la sntesis de la nitrito reductasa (Unden et al., 1980)(2200). Por lo tanto en suelos
donde la nitrificacin sea intensa y se acumulen altas concentraciones de NO
3
-
, este se reduce a
NO
2
-
, pero su transformacin en xidos de nitrgeno estar bloqueada y se pueden acumular
cantidades elevadas de NO
2
-
. La concentracin de NO
3
-
afecta a la cantidad de N
2
O y N
2

producidas durante la desnitrificacin (Swerts et al., 1996)(2624). Hutchinson y Davidson
(1993)(2624) proponen la hiptesis de que cuando la disponibilidad de oxidantes prevalece
sobre la de reductores, el sustrato nitrogenado es slo parcialmente reducido, por lo que la
relacin N
2
O/N
2
aumenta.
Tambin el NO inhibe la nitrito reductasa (Carr et al., 1989)(2200). Esto supone un
mayor rendimiento en la reduccin completa hasta N
2
y por lo tanto un mejor rendimiento
energtico, al evitar prdidas de NO cuando se sobrepasa la capacidad de la xido ntrico
reductasa.
Al aumentar la humedad del suelo, los niveles de desnitrificacin aumentan (Mosier et
al., 1983; Groffman y Tiedje, 1991; Weier et al., 1993)(2200). Este efecto es muy acusado si la
humedad es superior al 60% (Linn y Doran, 1984; Aulakh et al., 1991). Cuando la humedad del
suelo est en torno a su capacidad de retencin mxima, se favorece el aumento de NO
incrementndose las cantidades de oxido nitroso (Burns et al., 1996)(2200) al mismo tiempo
que la relacin N
2
O/N
2
disminuye (Vinther, 1996)(2620).
La desnitrificacin hetertrofa requiere una abundante fuente de carbono orgnico
degradable, por lo tanto es un factor crtico para dicha actividad (Bowman y Focht, 1974;
Stanford et al., 1975a; Beauchamp et al., 1989)(2209). Cuando en el suelo existen
concentraciones de NO
3
-
no limitantes para el proceso, la disponibilidad de carbono es el factor
ms importante en el control de la desnitrificacin (Lalisse-Swerts et al., 1996)(2624). En
condiciones aerobias las bacterias desnitrificantes son capaces de utilizar gran variedad de
fuentes de carbono, sin embargo, bajo anaerobiosis, este nmero se reduce (Beauchamp et al.,
1989)(2481). Adems, Ganaye et al. (1996) demuestran que el tipo de fuente de carbono afecta



29
de forma decisiva a la actividad de las distintas enzimas implicadas en el proceso, de forma que
segn la fuente de carbono empleada, la cantidad de nitrito acumulada vara considerablemente.
El oxgeno afecta de forma diferencial a las distintas enzimas del proceso. La sntesis de
la nitrito reductasa es reprimida por el oxgeno, siendo esta enzima la ms sensible a este factor
de todas las implicadas en la desnitrificacin (Cole, 1994)(2200). Parkin (1987)(1748) introduce
el concepto de puntos calientes, zonas en que la intensidad de respiracin microbiana se ve
favorecida debido a una abundante disponibilidad de carbono orgnico junto con niveles
apropiados de oxgeno. Dicha respiracin excede el suplemento de oxgeno por difusin durante
un tiempo limitado, favoreciendo la desnitrificacin. La variabilidad en la actividad
desnitrificante bajo condiciones de campo sugiere que la desnitrificacin en gran parte debe
estar asociada a estos puntos calientes. En los sistemas agrcolas se forman tipos especiales de
puntos calientes ya que los residuos vegetales proporcionan altas concentraciones de carbono y
nitrgeno (Paul y Beauchamp, 1989; Nielsen y Revsbech, 1994)(1748). Estos puntos calientes
sostienen la actividad desnitrificante durante largos periodos (Thompson et al., 1987)(1748).
El tipo de manejo que se le de al suelo afecta de forma significativa a la desnitrificacin
en el suelo. Los suelos agrcolas son una importante fuente de emisin de xidos de nitrgeno
ya que el cultivo continuo altera la agregacin del suelo (Hart et al., 1985; Burns y Davies,
1986)(1012). Adems en estos suelos la disponibilidad de nitrgeno inorgnico y carbono
orgnico es alta por varias razones: la aplicacin de fertilizantes nitrogenados, la mineralizacin
de nitrgeno orgnico y la disponibilidad de carbono orgnico debido a los aportes de restos
vegetales (Vermoesen et al., 1996)(2194). La desnitrificacin es uno de los procesos causantes
de la disminucin de eficacia de los fertilizantes qumicos y en general del nitrgeno disponible
para los cultivos (Swerts et al., 1996)(2624). Constableet al. (1992)(2582) observan que slo
un 40% del nitrgeno de los fertilizantes pasa a formar parte de la cosecha. Se ha estimado que
cerca de 1.5 Tg de nitrgeno se inyectan directamente a la atmsfera cada ao en forma de N
2
O
como resultado de la aplicacin de fertilizantes en los sistemas agrcolas (CAST, 1992; Watson
et al., 1992)(2191). Esto supone un 44% de las entradas debidas a la accin antrpica y un 13%
del total anual. Estas estimas (Watson et al., 1990, 1992) (2191) no incluyen la produccin de
N
2
O por otras vas como son los abonos animales y la fijacin simbitica de nitrgeno. En los
pastizales las prdidas de N
2
O son normalmente menores que en suelos agrcolas, en torno a un
2% del nitrgeno aplicado por fertilizacin (Granli y Bckman, 1994; Van Cleemput et al.,
1994; Velthof y Oenema, 1994) y la transformacin de pastizal a tierra de cultivo incrementa la
desnitrificacin (Mosier et al., 1996)(2191). Por todas las razones expuestas, la desnitrificacin



30
en suelos cultivados se ha estudiado durante muchos aos para cuantificar las prdidas de
nitrgeno por esta va, determinar el efecto de factores ambientales en las tasas de
desnitrificacin y optimizar el rendimiento de los cultivos (Fuch, 1974; Linn y Doren, 1984;
Myrold y Tiedje; 1985; Prade y Trodlenier, 1989; Klemedtsson et al., 1991; Colbourn,
1993)(1761).
Como ya se ha indicado anteriormente el tipo de materia orgnica disponible afecta
considerablemente al proceso. Por esta razn el tipo de cultivo influye sobre la tasa de
desnitrificacin. McKenney et al. (1993)(2481) observan un aumento significativo de la
actividad desnitrificante al suministrar restos secos de leguminosas. Este aumento es mayor que
si los restos provenan de otro tipo de planta. Galbally et al. (1992) indican que las leguminosas
contribuyen a la emisin de oxido nitroso de varias formas: el nitrgeno atmosfrico fijado por
las leguminosas puede ser nitrificado y desnitrificado del mismo modo que el nitrgeno de los
fertilizantes, y adems los rizobios que viven en simbiosis con este tipo de plantas son capaces
de desnitrificar y de producir N
2
O (Garca Palazola et al., 1995)(1394).
La textura afecta al proceso interaccionando con otros factores como la temperatura
(Vinther, 1996)(2620) y el oxgeno (Corre et al., 1995). Cuando se aade nitrgeno y carbono al
suelo, la desnitrificacin aumenta, pero, este aumento es variable segn la textura y la humedad
del suelo (Paul, et al., 1993; Vinther, 1996)(2620). Diferencias en las propiedades fsicas del
suelo se traducen en diferencias en la capacidad de retencin del agua y capacidad de
percolacin. Esto afecta de modo indirecto a la desnitrificacin, ya que la disponibilidad de
nutrientes tambin vara con estos parmetros. Ensayando agregados simples, Sexstone et al.
(1951) y Lensi et al. (1991) (1012) observan que la actividad desnitrificante no aparece en
todos los agregados telricos, aunque existiesen centros anaerobios (Sexstone et al., 1985)
(1012). Comparando suelos agregados y no agregados, Sexstone et al. (1988) (1012) sugirieron
que la discontinuidad de carbono disponible, concentracin de nitrato y bacterias
desnitrificantes eran los factores limitantes de la desnitrificacin en suelos agregados, mientras
el oxgeno inhibe ms que la disponibilidad de sustratos en suelos no agregados.
Entre otros factores que tambin inciden en la desnitrificacin podemos citar: la
temperatura (Estavillo et al., 1994; Zanner y Bloom, 1995), el pH (Wang et al., 1995;
Vermoesen, et al., 1996)(2194), la vegetacin y sus caractersticas (Garca, 1977; Mikkelsen,
1987; Hjberg et al., 1996), los pesticidas (Goring y Laskowski, 1982; Knowles, 1982), las
condiciones climticas (Aulakh et al., 1992) y el tamao de la poblacin desnitrificante
(Firestone, 1982)(2209).



31
De los microorganismos hetertrofos un 5% son desnitrificantes (Tiedje et al.,
1982)(1012). Las bacterias hetertrofas que llevan a cabo la desnitrificacin pertenecen a
diversos grupos taxonmicos. Garca (1977) seala el gnero Bacillus como el mximo
contribuyente a la desnitrificacin en ambientes naturales. Tiedje et al. (1984) sealan a
Pseudomonas y Gamble et al., (1977) a Clostridium. Existen otros gneros en los que aparecen
especies desnitrificantes como Thiosphaera y Alcaligenes (Robertson et al., 1995) y
Flavobacterium (Wang et al., 1995), pero su menor representatividad cuantitativa en
comparacin con los gneros anteriormente mencionados, hace pensar que su incidencia en la
desnitrificacin a nivel edfico a de ser apreciablemente menor.

1.2. Interacciones del sistema suelo-planta

En 1904, Hiltner define la rizosfera como aquella porcin del suelo en torno a la raz de
leguminosas, con una mayor actividad microbiana dada la alta concentracin de carbono y otros
nutrientes existentes en esta zona. Posteriormente este concepto fue redefinido y actualmente se
considera rizosfera la porcin de suelo influida por las races vivas. Son muchos autores los que
a partir de 1904 se han dedicado al estudio de la rizosfera, cabe destacar, entre otros, los trabajos
de Starkey (1949) en los que demuestra los principales efectos de la planta en el crecimiento de
microorganismos edficos, los de Rovira (1959), Vancura (1964), Rovira y Bowen (1966) y
Rovira et al. (1979) sobre la naturaleza y el papel de los exudados en la rizosfera y toda una
serie de trabajos y revisiones sobre las propiedades y caractersticas de esta regin edfica que
nos permiten considerar el "efecto rizosfera" como uno de los factores clave que afectan a la
produccin primaria (Rovira, 1979; Lynch, 1983; Curl y Truelove, 1986; Wild, 1988; Lynch,
1990)(Agus).
La rizosfera posee una estructura compleja en la que actan gran nmero de variables.
Al igual que cualquier ecosistema, es un sistema termodinmicamente abierto en el que se
produce un intercambio constante de masa y energa (Foster, 1988; Smiles, 1988). El estudio de
este sistema es muy complicado debido al alto nmero de interacciones que en l se dan. La
planta durante su desarrollo va a influir en la microflora edfica, y los microorganismos a su vez
interaccionan con las plantas, encontrndose diferencias importantes en la fertilidad del suelo
segn estudiemos el suelo rizosfrico y el no rizosfrico (Gobran y Clegg, 1996). Los
microorganismos tambin interaccionan con los componentes fsicos del ambiente radical
alterando la naturaleza del suelo, produciendo polisacridos y otros compuestos orgnicos que



32
promueven la formacin de agregados (Lynch, 1987). En resumen, el entorno rizosfrico viene
determinado por la triple interaccin suelo, planta y microorganismos.

1.2.1. Efecto de la planta sobre el suelo y las comunidades microbianas edficas

Las plantas modifican las comunidades microbianas del suelo de un modo fundamental
(Remacle y De Leval, 1975; Acero et al., 1994). Alexander (1980) observa cmo diferentes
especies de plantas en un mismo tipo de suelo, presentan rizosferas muy diversas, mientras que
la rizosfera de una misma especie, cultivada en suelos muy diferentes vara muy poco.
Lozano y Velasco (1972 y 1981), estudian este problema en zonas repobladas con Pinus
pinaster Ait. y Eucaliptus camaldulensis Denn., donde el bosque climcico era un robledal de
Quercus pyrenaica Wild. y un alcornocal-encinar, respectivamente. En el primer caso observan
como la especie introducida modifica substancialmente el ciclo del carbono, mientras que en el
segundo caso es el ciclo del nitrgeno el que se altera de forma importante. En la rizosfera se da
una mayor desnitrificacin que en el resto del suelo (Klemedtsson et al., 1987b)(1637). La
rizosfera puede ser un sitio de bajo contenido en oxgeno, las races y los microorganismos
consumen rpidamente el O
2
(Woldendorp, 1962; Klemedtsson et al., 1987a; Hfjberg y
Sfrensen, 1993) (1637). El aporte de C por los exudados radicales y las bajas concentraciones
de O
2
favorecen la sntesis de enzimas desnitrificantes y por lo tanto la actividad y crecimiento
de estas bacterias (Hfjberg et al., 1996)(1637). Los trabajos de Gutirrez Maero y Bermdez
de Castro (1983), Bermdez de Castro y Gutirrez Maero (1987) y Pozuelo Gonzalez et al.
(1992) con Myrica gale (L.) indican que esta especie tiene un efecto beneficioso sobre el suelo
de los lugares en que es autctona, ya que acelera el reciclado de la materia orgnica
nitrogenada, incentivando as la productividad del ecosistema. Llinares (1990) y Pozuelo et al.
(1995) encuentran queEleagnus angustifolia L. y Alnus glutinosa (L.) Gaertn. respectivamente
modifican los componentes biticos y abiticos del suelo, produciendo un incremento de la
materia orgnica y de la velocidad de reciclado del nitrgeno. Los trabajos de Lawley et al.
(1983) y Schmitz et al. (1989) siguen la misma lnea, estudiando en el primer caso los
microorganismos asociados a la rizosfera de varias plantas herbceas, y en el segundo la
variacin de los microorganismos edficos durante la sucesin de un pastizal mediterrneo.
Turner y Frantz (1985) sealan que el efecto de la vegetacin sobre el suelo y las
comunidades microbianas que lo pueblan se verifica principalmente por cuatro vas:
* Aporte de diferentes compuestos por el lavado de las partes areas por la lluvia.



33
* Adicin de materia orgnica al suelo a travs del lecho de hojarasca.
* Efecto de las races a travs de exudados, secreciones etc, en la aireacin y estructura
del suelo as como en la composicin y funcionalidad de microorganismos.
* Formacin de microclimas por efecto dosel.
La lluvia, al lavar las partes areas de la planta (tallos, ramas y hojas) arrastra nutrientes
hacia el suelo. Bollen y Lu (1968) encuentran que el agua de lluvia que ha lavado las partes
areas del aliso, contienen de 2 a 10 veces ms nitrgeno que la cada a cierta distancia de la
betulcea. Este aporte junto con el producido por otras vas provoca un incremento significativo
del nitrgeno en aquellos lugares colonizados por esta planta (Pozuelo et al., 1995), provocando
modificaciones importantes en algunas etapas del ciclo del nitrgeno (Kim et al., 1995).
Muchas plantas excretan en la superficie foliar complejos resinosos de compuestos orgnicos,
formados principalmente por: terpenoides, agliconas, flavonoides y fenoles embebidos en una
matriz acuosa (Wollenneber y Dietz, 1981; Wollenneber et al., 1991)(1505). Estos componentes
pueden ser lavados y afectar al crecimiento y actividad de las poblaciones microbianas del
suelo, actuando como activadores o inhibidores enzimticos.
La materia orgnica condiciona muchas de las propiedades del medio edfico que
influyen en el sistema suelo-planta y por tanto afecta al crecimiento y desarrollo de la microflora
del suelo (Fresquez y Lindemann, 1982 (Marisa); Grayston et al., 1996(Agus). La hojarasca
constituye una de las principales vas de entrada de materia orgnica al suelo (Tiessen et al.,
1984). La estructura y composicin del lecho de hojarasca regula la tasa de mineralizacin, por
lo que incide de forma decisiva en la produccin primaria de los ecosistemas (Hunt et al., 1988).
Los restos vegetales de conferas se descomponen con lentitud, ya que contienen una baja
proporcin en nutrientes con nitrgeno y fsforo(Cowling y Merril, 1966). Sin embargo, la
descomposicin de las hojas de plantas fijadoras de nitrgeno es relativamente rpida debido a
su elevada concentracin en compuestos nitrogenados; estas plantas adems influyen
considerablemente en los microorganismos edficos, principalmente sobre aquellos implicados
en el ciclo del nitrgeno. Rossiter (1966) indica que las estructuras vegetativas de leguminosas
tienen ms del doble de nitrgeno que las gramneas, y lo mismo ocurre con sus semillas y con
los frutos (semillas ms la vaina). Valores parecidos encuentran Gmez Gutirrez y Duque
Macias (1973) y Duque et al. (1973).
Las plantas son capaces de mejorar el estatus de nutrientes de suelos pobres, tanto
absorbiendo los nutrientes de las capas ms profundas y aportndolos de nuevo en las ms
superficiales a travs de la hojarasca como aumentando la retencin de los mismos



34
incrementando la capacidad de intercambio catinico del suelo (Bernhard-Reversat,
1996)(2609).
El crecimiento microbiano est limitado por la disponibilidad de carbono orgnico. Las
races en crecimiento son una fuente vital de carbono para la biomasa microbiana (Whipps y
Lynch, 1983; Helal y Sauerbeck, 1986; Wheatley et al., 1990). Como resultado de todo ello la
rizosfera es rica en microorganismos, Paul y Clark (1989), estiman que la densidad microbiana
es 100 veces mayor abundante que fuera de ella. Pero esta variacin es tambin cualitativa,
como se desprende de los trabajos de Bowen y Foster (1978) en los que comprueban que los
tiempos de generacin de Psedomonas sp. y Bacillus sp., creciendo en la rizosfera, son 5.2 y 39
horas respectivamente, en tanto que fuera de ella hay una generacin cada 77 y 100 horas.
Norton y Firestone (1991) observan que el 57% de las bacterias son activas en la rizosfera del
pino ponderosa, mientras que slo el 41% los son en el suelo libre de la influencia de las races.
Estos autores proponen que nicamente en el ambiente rizosfrico las bacterias encuentran
fuentes de carbono adecuados para mantener sus requisitos metablicos. Por tanto, la liberacin
de compuestos orgnicos por las races tiene una influencia decisiva sobre la disponibilidad de
nutrientes y en consecuencia sobre la actividad microbiana (Bowen y Rovira, 1991). Adems de
sustrato para las bacterias, estos compuestos orgnicos son importantes, dada su capacidad para
quelar cationes (Marschner, 1991; Vaughan et al., 1993) y para formar agregados telricos
(Foster, 1990).
Las rizodeposiciones podramos dividirlas en varios grupos dependiendo de su forma de
liberacin:
* Exudados hidrosolubles. Comprenden sustancias de bajo peso molecular que son
liberadas sin la mediacin de ninguna actividad metablica. Su exudacin se lleva a cabo a
favor de un gradiente de concentracin (Burstrm, 1955; Bowen y Rovira, 1991).
* Secreciones. Comprenden sustancias de mayor peso molecular, requieren de un
proceso metablico para su liberacin. Pueden liberarse en contra de gradientes de potencial
qumico o electroqumico (Hale et al., 1978).
* Lisados que provienen de la autolisis celular y que comprenden el contenido celular y
con el tiempo, toda la raz (Whipps, 1990)
* Gases como etileno, dixido de carbono y cianhdrico. Rovira (1956, 1969, 1973)
considera estos gases como parte de los exudados de bajo peso molecular.
* Muclagos que cubren las races de muchas plantas y estn compuestas principalmente
por polisacridos y cidos poligaracturnicos de alto peso molecular (Marschner, 1986; Watt et



35
al., 1993). Cuando este muclago se forma en condiciones no axnicas, resulta de la actividad de
la planta y de los microorganismos y recibe el nombre de mucigel (J enny y Grossenbancher,
1963; Oades, 1978)(A).
Normalmente es imposible distinguir entre los distintos tipos mencionados, por lo que
Uren y Reisenauer (1988) y Rovira (1969) consideran exudados a todas las sustancias orgnicas
liberadas por la raz. La exudacin radical se produce sobre todo en las uniones longitudinales
de las clulas (Bowen, 1979). Por otra parte los restos de races muertas constituyen un 40% del
total de la materia orgnica que entra en el suelo (Lee y Pankhurst, 1992). Este carbono se libera
en la rizosfera que constituye un 2-3% del total del volumen del suelo (Coleman et al., 1978).
Las races muertas tambin aportan compuestos orgnicos y suministran nutrientes al suelo que
influyen decisivamente sobre la biomasa (J oslin y Henderson, 1987; Whipps, 1990), en la
dinmica del ciclo del nitrgeno (McClaugherty et al., 1984) y la produccin primaria neta de
los ecosistemas forestales (McClaugherty et al., 1982).
La especie, edad de la planta, estado fisiolgico y grado de lignificacin del aparato
radical son caractersticas que afectan decisivamente a la composicin cualitativa y cuantitativa
de los exudados radicales (Hamlen et al., 1972; Lynch, 1990; Gutirrez Maero et al., 1994;
Gutirrez Maero et al., 1995) y por lo tanto son factores que influyen en la magnitud del efecto
rizosfera. El tipo de protenas (J uo y Stotzky, 1970) o de carbohidratos (Hamlen et al., 1972)
exudados por las herbceas depende de la edad de la planta. Los cambios en la exudacin con la
edad tambin se han detectado en leosas, observndose que las plntulas exudan una mayor
cantidad de carbohidratos (cuantitativa y cualitativamente hablando), mientras que las plantas
adultas exudan ms aminocidos, amidas y cidos orgnicos (Smith, 1970). Las plantas
perennes suelen exudar una mayor proporcin de fotosintatos (40-73%) que las anuales (10-
46%) (Marschner, 1986; Helal y Sauerbeck, 1986). Esto puede ser debido a que las plantas
perennes utilizan parte de estos exudados para sobrevivir a lo largo del ao a situaciones de
estrs (Harris et al., 1980). Como regla general, las leguminosas provocan un efecto rizosfera
ms pronunciado que los pastizales o los cultivos de grano y esto se potencia an ms en
leguminosas bienales o perennes (Alexander, 1980).
La intensidad y fotoperiodo de luz, la temperatura y el estrs hdrico influyen del mismo
modo, as este ltimo produce un aumento de materia orgnica por un proceso osmtico y
porque hay races que no son capaces de resistir esas condiciones. Bajo condiciones de estrs la
planta parece ejercer un control completo sobre los patrones de liberacin temporales y
espaciales (Takasi et al., 1984; Pellet et al., 1995; Ryan et al., 1995)(2575).



36
La naturaleza de los exudados ha sido objeto de distintos estudios. Es clsico el trabajo
de Vancura y Hovadik (1965), en el que encuentran que las distintas plantas estudiadas liberan
al exterior aminocidos, cidos orgnicos y azcares de muy diversos tipos. Estos compuestos
son para Kraffczyk et al. (1984) y Sundin et al. (1994) los componentes fundamentales de los
exudados de la mayora de las plantas. Tambin se han detectado esteroles, cidos fenlicos,
cidos grasos, vitaminas, compuestos voltiles, factores de crecimiento, nucletidos, flavonas,
enzimas y hormonas (Curl y Truelove, 1986; Whipps, 1990). Algunos de estos productos
inciden en la microflora rizosfrica alelopticamente como los dos isoflavonoides (cumestrol y
daizeina), que D`Arcy Lameta y J ay (1987) encuentran como inhibidores o estimuladores de
distintos gneros bacterianos.
Smith (1976) observa que a travs de las races se liberan gran cantidad de iones
inorgnicos relacionados con los constituyentes orgnicos. Alrededor de un 71% son cationes
(Ca
2+
, Na
+
, K
+
, NH
4
+
, Mg
2+
) y un 12% de aniones (SO
4
2-
, Cl
-
, PO
4
3-
, NO
3
-
), un 11% de cidos
orgnicos, 5% de carbohidratos y un 1% de aminocidos (Smith, 1976).
La composicin de los exudados vara segn la zona de la raz que estudiemos. Los
azcares se liberan a lo largo de toda la raz mientras que los aminocidos y los cidos orgnicos
parecen exudarse sobre todo en las zonas ms prximas al pice (Hoffland, 1992; J ones y
Darrah, 1994).
Los cidos orgnicos son liberados por las races para mejorar la nutricin de la planta,
ya que facilitan la movilizacin de metales como el manganeso (Godo y Reisenauer, 1980;
Uren, 1982). Pero de un modo indirecto la movilizacin de nutrientes tambin puede afectar a la
actividad microbiana. El cido mlico y el ctrico forman quelatos estables con el Fe
3+
y con
Al
3+
(Vaughan et al., 1993)(A)(J ones y Kochian, 1996)(2574), y por lo tanto aumentan la
disponibilidad de fsforo inorgnico (Otani et al., 1996)(2339). Bajo condiciones de toxicidad
de Al
3+
, se incrementa la liberacin de estos cidos, que forman complejos con el Al
3+
y evitan
as su toxicidad (Delhaize et al., 1993; Ryan et al., 1995)(2575). Las deficiencias de hierro y
fsforo aumentan la cantidad de quelantes en los exudados (Gardner et al., 1983; Takagi et al.,
1984; Hofland et al., 1989; Miyasaka et al., 1991)(1053). La deficiencia en hierro aumenta los
niveles de cido fenlicos que aumentan la movilizacin de Fe
3+
y Mn
2+
y facilitan su transporte
y captacin (Marschner, 1986; J olley y Brown, 1987). Adems el descenso de pH conlleva la
exudacin de estos cidos, y como consecuencia de este descenso, una mayor disponibilidad de
Fe
3+
, Mn
2+
y Zn
2+
y una menor disponibilidad de Mo
2+
(Marschner, 1991).



37
El efecto directo de los exudados radicales no se limita a los compuestos orgnicos de
bajo peso molecular, incluye tambin enzimas como por ejemplo fosfatasas cidas (Chhonkar y
Tarafdar, 1981), muy importantes para la adquisicin de fsforo en suelos cidos (Hassling y
Marschner, 1989).
Las bacterias son ms eficaces que los hongos utilizando los compuestos de peso
molecular bajo. Estas sustancias constituyen una parte importante de los exudados radicales y
son poco abundantes en las primeras etapas descomponedoras de los restos vegetales muertos.
Por el contrario los hongos metabolizan fcilmente los polmeros de peso molecular elevado,
que son ms abundantes en los restos vegetales muertos y por tanto son ms eficaces durante el
comienzo de la descomposicin de las races muertas (Nakas y Klein, 1980). Tales
caractersticas metablicas justifican que las bacterias dependan sobre todo de los exudados
radicales y los hongos de los restos vegetales en descomposicin.
Las diferencias en la composicin de los exudados hacen que vare la composicin de
las poblaciones microbianas rizosfricas (Curl y Truelove, 1986; Bowen y Rovira, 1991). Como
resultado de este hecho, cada especie y genotipo de planta tiene asociada una microflora
especfica (Neal et al., 1970; Neal et al., 1973). Por otro lado, otros compuestos exudados por
las races actan como seales para atraer microorganismos simbiticos, patgenos o
beneficiosos a la rizosfera. La mayora de estos compuestos son cidos fenlicos con actividad
quimiotctica y son activos a bajas concentraciones 10
-6
-10
-12
M (Lopez de Vitoria y Lovell,
1993)(1193). El efecto de quimiotaxis se ha demostrado que no est relacionado con la
capacidad del organismo para metabolizar el sustrato (Reinhold et al., 1985). Estas seales
tambin estimulan la germinacin de esporas y la elongacin de hifas en micorriza arbusculares
(Tsai y Philips, 1991) y en ectomicorrizas (Horan y Chilvers, 1990) y provoca cambios en la
morfologa de las hifas que preceden a la formacin de la micorriza (Giovannetti et al., 1993b).
Los flavonoides tambin inducen la expresin de los genes nod de Rhizobium (Dharmatilake y
Bauer, 1992; Hungria et al., 1992); la de los genes de virulencia (vir) de Agrobacterium
tumefaciens (Winans, 1992)(1193); la de genes responsables de la reaccin de hipersensibilidad
y patogeneidad (hrp) de Erwinia amylovora (Wei et al., 1992)(1193) y de Pseudomonas
solanacearum (Arhat et al., 1992)(1193). Algunos microorganismos tienen quimioreceptores de
alta afinidad por los flavonoides de la planta huesped, dichos quimioreceptores estn ligados a
expresin gnica (Deacon, 1996). La liberacin de estas seales parece ser bastante especfica
(Giovannetti et al., 1993a).



38
Las plantas son capaces de limitar la colonizacin de las races por parte de bacterias
patgenas produciendo radicales hidroxil, aniones superxidos y perxido de hidrgeno (Doke,
1983; Klotz et al., 1989; Sutherland, 1991). Del mismo modo, las plantas responden a la
colonizacin por bacterias promotoras del crecimiento, produciendo especies de oxgeno activo
(Katsuwon y Anderson, 1989, 1990). Los fitopatgenos que contienen mayores cantidades de
enzimas capaces de reducir especies de oxgeno activo, como superxido dismutasa, catalasa y
peroxidasa, son ms efectivos como patgenos (Klotz y Hutcheson, 1992)(1141)

1.2.2. Efecto del sustrato y de las comunidades microbianas edficas sobre la planta

Las caractersticas fisicoqumicas de los agregados orgnicos y minerales que
constituyen el suelo son un factor importante que influye en el desarrollo de las races, y en su
capacidad de exudacin, ya que determina caractersticas como la porosidad y por tanto la
aireacin, el potencial hdrico, la transferencia de calor, la disponibilidad de nutrientes y el pH.
En general el efecto rizosfera es ms pronunciado en suelos arenosos que en los arcillosos y
hmicos, alcanzando los valores ms altos en el caso de plantas de dunas de arena y en los
desiertos (Curl y Truelove, 1986; Lynch, 1990). Adems la textura del suelo est ntimamente
relacionada con la nutricin vegetal, los cationes retenidos por el complejo adsorbente,
constituyen la fuente principal de nutrientes para la alimentacin mineral de las plantas
(Duchaufour, 1978). As mismo la biodegradacin de compuestos xenobiticos, est regulada
por factores fiscoqumicos del suelo, regulando por tanto el catabolismo de estos productos por
parte de las bacterias. Los productos qumicos interaccionan con parte de la matriz edfica
aumentando o disminuyendo su biodegradabilidad (Ivarson et al., 1982; Stotzky, 1986; Knaebel
et al., 1996)(2635).
La humedad del suelo influye cualitativa y cuantitativamente en la exudacin radical. El
estrs hdrico es uno de los factores que inducen la exudacin radical (Curl y Truelove, 1986;
Whipps, 1990); el nmero total de bacterias suele ser mayor en suelos que han sufrido un
periodo de estrs, debido a que encuentran en ellos mayor cantidad de materiales orgnicos
solubles en agua procedentes sobre todo de la autolisis celular de los tejidos radicales (Martin,
1977). El estrs hdrico es tambin uno de los factores que afectan decisivamente en la
liberacin de nutrientes asimilables, por procesos puramente fsicos, estimulando la actividad
microbiana, fundamentalmente la mineralizacin (Walworth, 1992), lo que afecta
decisivamente a la planta.



39
Las concentraciones de O
2
y CO
2
varan de un suelo a otro y de una porcin de suelo a
otra, dependiendo de la temperatura, humedad (Yamaguchi et al., 1967)(2198), contenido en
materia orgnica (Abrosimova y Revut, 1964)(2198), profundidad del suelo (Wood et al.,
c1993) y tipo de cultivo (Buyanovsky y Wagner, 1983)(2198). La influencia de las rizobacterias
sobre la planta depende en gran medida de que stas encuentren ptimos de crecimiento en el
medio en el que se desarrollan, por tanto, variaciones en la concentracin de estos gases
afectarn al crecimiento de las poblaciones microbianas y a su capacidad de biocontrol (Kim et
al., 1996)(2198). Pseudomonas fluorescens, por ejemplo, bajo altas concentraciones de CO
2
,
sintetiza menos siderforos (Kim y Misaghi, 1992)(2198).
En el suelo conviven gran cantidad de microorganismos, como bacterias, hongos,
actinomicetos, protozoos y algas (Paul y Clark, 1989)(1141). Las modificaciones en la
abundancia de microorganismos, o en las proporciones relativas de grupos individuales, afectan
a la planta a travs de las transformaciones de la materia orgnica y de los compuestos
minerales que stos sinteticen. De todos estos grupos, el ms abundante es el constituido por las
bacterias, posiblemente por ser capaces de crecer ms rpidamente y por poder utilizar una gran
variedad de compuestos como fuentes de carbono y de nitrgeno. Las bacterias se localizan en
la superficie de las partculas del suelo, pudiendo interaccionar con las races de las plantas. De
hecho, la concentracin de bacterias entorno a las races, es mucho mayor que en el resto del
suelo (Lynch, 1990)(1141). Esto refleja la alta concentracin de nutrientes en esta zona, que
permite un elevado crecimiento y metabolismo bacteriano.
La colonizacin de las races es el primer paso de la interaccin planta-microorganismo.
La accin de las bacterias depende de su capacidad para establecerse en la rizosfera (Simons et
al., 1996)(2360). Estudios sobre la colonizacin microbiana de las races indican que las
bacterias se distribuyen irregularmente en el rizoplano en funcin del tipo de planta, del suelo y
de las especies de microorganismos (Asanuma et al., 1979). La estructura tanto fsica como
biolgica de esta zona y los factores que afecten a su funcionamiento, tienen un efecto decisivo
sobre el desarrollo del vegetal.
Puesto que la microflora est ntimamente relacionada con el sistema radicular,
cubriendo parcialmente su superficie, cualquier sustancia beneficiosa o txica producida puede
causar una respuesta fisiolgica inmediata y profunda. La interaccin entre bacterias y races
puede ser beneficiosa, perjudicial o neutra para la planta, y en ocasiones, como ya hemos
comentado, el efecto de una bacteria determinada vara segn las condiciones del suelo (Lynch,



40
1990). Por ejemplo, una bacteria fijadora de nitrgeno, resulta beneficiosa bajo condiciones de
escasa disponibilidad de este elemento, pero no en suelos abonados.
Las bacterias que favorecen el crecimiento de las plantas se pueden clasificar en dos
tipos, aquellas que establecen simbiosis con determinadas especies de planta (de las que ya
hemos hablado en el apartado 1.1.1.2) y las edficas de vida libre (Kloepper et al., 1988;
vanPeer y Schipers, 1989; Fremmel et al., 1991)(1141). A las bacterias beneficiosas de vida
libre se las denomina PGPRs (Plant Growth Promoting Rhizobacteria)(Kloepper et al.,
1989)(1141) o YIB (Yield Increasing Bacteria)(Piao et al., 1992; Tang, 1994)(1141). Dentro de
las PGPRs encontramos bacterias pertenecientes a distintos gneros bacterianos como
Azotobacter, Acetobacter, Azospirillum, Burkholderia, Pseudomonas y Bacillus (Brown, 1974;
Elmerich, 1984; Kloepper et al., 1988, 1989; Bashan y Levanony, 1990; Tang, 1994; Okon y
Labandera-Gonzlez, 1994; Probanza et al., 1996)(1141). Al tratar la planta con la PGPR, sta
crece mejor, tiene un mejor aparato radical y en general es una planta ms sana. Generalmente
se asume que para que una bacteria tenga un efecto sobre una planta, debe estar ntimamente
ligada a su raz de la planta (Wiehe y Hflich, 1995)(1422). Esta afirmacin, aunque en la
mayora de los casos es cierta, no resulta un requisito indispensable (Murty y Ladha, 1988;
Hong et al., 1991b)(1141).
Las PGPRs pueden afectar al crecimiento de la planta de forma directa o indirecta:
indirecta, evitando o previniendo el ataque de organismos patgenos y directamente a travs de
la sntesis de distintos compuestos. Los mecanismos de estimulacin del crecimiento vegetal
por parte de estas bacterias son: la mobilizacin de nutrientes (Lifshitz et al., 1987; Zhoinska et
al., 1992)(989), estimulacin del crecimiento de races mediante la produccin de fitohormonas
(Mller et al., 1988; Bothe et al., 1992)(989) o la produccin de siderforos (Kloepper et al.,
1980; Leong, 1986) y antibiticos (Haas et al., 1992)(989). La produccin de siderforos y
antibiticos permite adems a las PGPRs competir satisfactoriamente con patgenos y otras
bacterias saprofticas (Weller, 1988)(989).
Las molculas de siderforos secretadas por las PGPRs quelan la mayor parte del Fe
3+

presente en el suelo, y esto evita que los patgenos proliferen debido a la carencia de este
nutriente (OSullivan y OGara, 1992)(1141). La bacteria que sintetiza el siderforo, toma el
complejo hierro-siderforo mediante un receptor especfico localizado en la membrana
bacteriana (OSullivan y OGara, 1992)(1141). Las plantas no se ven afectadas por el secuestro
de hierro por parte de las bacterias, ya que la mayora de las plantas son capaces de crecer en
medios con concentraciones de Fe
3+
mucho ms bajas que los microorganismos (incluso 1000



41
veces menores) (OSullivan y OGara, 1992)(1141). Adems, algunas plantas son capaces de
capturar el complejo siderforo-hierro (Crowley et al., 1988; Bar-Ness et al., 1991, 1992; Wang
et al., 1993)(1141). La capacidad de los siderforos para actuar como supresores de patgenos
depende de la planta, el fitopatgeno a eliminar, la composicin del suelo, la bacteria PGPR y la
afinidad del siderforo por el hierro (Glick, 1995)(1141).
Si el efecto de la PGPR fuese nicamente suministrar Fe
3+
a la planta, su efecto positivo
en el crecimiento de la misma variara segn las concentraciones de hierro presente en el suelo.
Sin embargo, no es as, por tanto el siderforo bacteriano debe contribuir a la nutricin de la
planta, aumentando su crecimiento, aunque en la mayora de los casos este efecto sea pequeo
(Glick, 1995)(1141). Estos fitosiderforos son tiles tambin en casos de dficit de aluminio o
intoxicacin por aluminio (Gardner et al., 1983; Hoffland et al., 1989; Miyasaka et al., 1991;
Takagi et al., 1984). La unin de estos fitoquelantes (como cidos orgnicos) con cationes es lo
suficientemente eficaz como para formar complejos que puedan ser luego reabsorbidos por la
raz (Mori et al., 1991); se liberan malato y citrato en grandes cantidades y forman quelatos con
metales en suelos calizos, que puede ser un mecanismo para proporcionar nutrientes a la raz en
casos de deficiencia o toxicidad. Se ha comprobado que los cidos orgnicos son capaces de
movilizar manganeso (Godo y Reisencuer, 1980; Uren, 1982)(PUBL LU), fsforo, y hierro,
siendo los dos cidos grasos mencionados ms eficientes a la hora de movilizar este ltimo
nutriente (Strom et al., 1994)(lu). En suelos calcreos se observan sntomas causados por la falta
de nutrientes, debido a la baja solubilidad de xidos e hidrxidos en solucin, la liberacin de
quelantes puede jugar un importante papel en el aumento de la disponibilidad de nutrientes. En
este sentido, las bacterias capaces de liberar cidos orgnicos parecen tener una importancia
decisiva, ya que las plantas no son capaces de liberar va exudacin este tipo de compuestos en
estos suelos (Strom et al., 1994)(lu).
Otra propiedad de algunas bacterias, es la capacidad de controlar patgenos mediante
antagonismos o competencia (Burr y Caesar, 1984; Schroth et al., 1984; Gaskins et al., 1985;
Davison, 1988). Muchas bacterias y en particular Pseudomonas y Bacillus son capaces de
controlar patgenos, sobre todo hongos, sintetizando pequeas molculas que son antifngicos
como la pirrolnitrina, pioluteorina, tropolona, etc. (Howell y Stipanovic, 1979; Howell y
Stipanovic, 1980; Lindbergh, 1981). Sin embargo, algunas bacterias del gnero Pseudomonas
son capaces de inducir resistencia por parte de la planta, incrementando la velocidad y los
niveles de sntesis de compuestos fenlicos en el tallo, llamados fitoalexinas (Lemanceau y
Alabouvette, 1993)(653). La seal responsable de la induccin de resistencia y del aumento de



42
acumulacin de fitoalexinas est inducida por los lipopolisacridos de la bacteria (Lemanceau y
Alabouvette, 1993)(653). Otro posible mecanismo de accin para reducir la actividad patgena
de hongos es la detoxificacin del cido fusrico (Harbone, 1983)(653)
Otros mecanismos empleados por las PGPRs para controlar la actividad de los
fitopatgenos son: la sntesis de antibiticos (Schnider et al., 1994)(1141); la sntesis de
cianhdrico (Voisard et al., 1989)(1141); la capacidad de hidrolizar cido fusrico (Toyoda y
Utsumi, 1991)(1141); la produccin de enzimas capaces de hidrolizar la pared de los
fitopatgenos (Lim et al., 1991)(1141); la competencia con los patgenos por nutrientes y
nichos ecolgicos (Kloepper et al., 1988; OSullivan y OGara, 1992)(1141)(Devliegher et al.,
1995)(1927); la induccin de resistencia a patgenos tras tratar la planta o la semilla con la
PGPR (van Peer et al., 1991; Tuzun y Kloepper, 1994)(1141)(Tuzun y Kloepper, 1995)(1798);
Liu et al., 1995)(1350).
Por otro lado las PGPRs utilizan distintas vas para facilitar de modo directo el
crecimiento de la planta. Entre estos mecanismos podemos citar: la fijacin de nitrgeno;
produccin de siderforos que proporcionan hierro a la planta; la sntesis de hormonas que
favorecen el crecimiento de la planta; solubilizacin de minerales como el fsforo y sntesis de
compuestos de bajo peso molecular, enzimas y moduladores del crecimiento vegetal (Brown,
1974; Kloepper et al., 1986, 1989; Davison, 1988; Lambert y J oos, 1989; Glick et al., 1994a,
1994b)(Noel et al., 1996)(1945). Cada bacteria en particular puede afectar al crecimiento de la
planta utilizando uno o varios de estos mecanismos. Por ejemplo, Azospirillum incrementa le
crecimiento de leguminosas, produciendo hormonas, aumentando la capacidad de la planta para
asimilar agua y nutrientes y favoreciendo la actividad de Rhizobium, es decir, incrementando la
cantidad de ndulos por planta (Okon y Itzigsohn, 1995)(1541).
La existencia de bacterias capaces de fijar nitrgeno tanto de vida libre como
estableciendo simbiosis con la planta se ha argumentado en puntos anteriores, as como la
existencia de plantas capaces de utilizar los complejos hierro-siderforo de la bacteria (Crowley
et al., 1988; Bar-Ness et al., 1991, 1992; Wang et al., 1993)(1141).
El mecanismo de accin de las PGPRs ms directo es la produccin de fitohormonas.
(Brown, 1974; Tien et al., 1979)(1141). Algunas especies de los gneros Pseudomonas,
Azospirillum, Azotobacter y Bacillus favorecen el crecimiento de la planta mediante la
produccin de cido indol-actico (AIA), giberelinas o citoquininas en la rizosfera de las plantas
cuando stas estn en estado de plntula (Brown, 1974; Nieto y Frankenberger, 1989; Lebuhn et
al., 1994). Probanza et al.(1996), encuentra que entre las rizobacterias de aliso hay algunas del



43
gnero Bacillus que estimulan claramente la germinacin y el crecimiento vegetal.
Posteriormente se comprob que el efecto puede deberse, entre otros factores, a la produccin
de auxinas de Bacillus (Gutierrez Maero et al., 1996)
Otra hormona implicada en la accin de las PGPRs es el etileno. Se ha demostrado, que
Pseudomonas putida es capaz de sintetizar la 1-aminociclopropano-1-carboxilato (ACC)
deaminasa (J acobson,1993; J acobson et al., 1994)(1141). Esta enzima hidroliza el ACC,
precursor inmediato de la biosntesis del etileno en plantas. El etileno, estimula la germinacin,
rompe la dormicin de las semillas (Esashi, 1991)(1141) y actua sinrgicamente con otros
microorganismos como las bacterias fijadoras simbiticas (DeFreitas et al., 1993)(617) .
Existe una alta especificidad entre el genotipo de la planta y el de la bacteria con
respecto a la capacidad de la bacteria para estimular el crecimiento de la planta (Provorov et al.,
1994(1737); Garca de Salomone y Dbereiner, 1996)(1902).
La actividad y la supervivencia de las bacterias PGPR en la rizosfera depende de
factores fsicos como pH, textura, estatus de nutrientes, humedad y temperatura, contenido en
materia orgnica y de interacciones biolgicas en la rizosfera. Por este motivo, la inoculacin de
PGPR en la rizosfera de diversas plantas en ocasiones, resulta errtica (Germida y Walley,
1996)(2498). Sin embargo, este hecho no es del todo negativo, puesto que pequeas cantidades
de estas bacterias pueden afectar positivamente a la planta, y adems interaccionan
sinrgicamente con otros microorganismos que tambin promueven el crecimiento vegetal
como las micorrizas o fijadoras simbiticas.
La mayora de las plantas se encuentran micorrizadas y el trmino micorrizosfera
(Rambelli, 1973)(A) se ha utilizado para describir la porcin de suelo bajo la influencia de las
races micorrizadas. La presencia de micorrizas altera significativamente la composicin fsica,
qumica y microbiolgica de la rizosfera (Katznelson et al., 1962; Oswald y Ferchau, 1968;
Rambelli, 1973; Linderman, 1988), mejorando el crecimiento de la planta. Las micorrizas
benefician a la planta aumentando su resistencia a patgenos, mejorando su nutricin (sobre
todo la captacin de fsforo) y protegindola de diversas toxinas (Harley y Smith, 1983)(A).
Algunas bacterias rizosfricas afectan al crecimiento de la planta de forma negativa, bien
causando daos en los tejidos radicales, o bien produciendo metabolitos txicos que inhiben el
crecimiento y desarrollo del sistema radical (Brian et al., 1951; Sarathchandra et al.,
1996)(2115). Este tipo de bacterias deletreas denominadas DRBs (Deleterious rhizobacteria),
pertenecen mayoritariamente al gnero Pseudomonas (Elliott y Lynch, 1984) y han sido aisladas
de gran cantidad de ecosistemas (Woltz, 1978; Suslow y Schroth, 1982)(2115). Estas bacterias



44
inhiben el crecimiento de races, mediante la produccin de metabolitos extracelulares txicos
(Woltz, 1978; Fredrickson y Elliot, 1985)(2115), aunque tambin pueden reducir los ndices de
germinacin (Probanza et al., 1996), provocar lesiones en las races, aumentar la sensibilidad de
la planta al ataque de patgenos, y reducir la formacin de pelos radicales (Elliott y Lynch,
1985)(2115). La mayora de las toxinas producidas por las DRB son metabolitos secundarios de
bajo peso molecular (Durbin, 1983; Bolten et al., 1989)(2115). Sin embargo Bolten y Elliott
(1989) sugieren que los metabolitos producidos por diversas Pseudomonas, que inhiben el
crecimiento de las races, no estn bajo el mismo control que el resto de los metabolitos
secundarios. Estos metabolitos suelen ser compuestos de bajo peso molecular (Bolten et al.,
1989)(2115). El efecto de estas bacterias en condiciones de campo, no suele detectarse, ya que
no provocan sntomas identificables en las plantas, pero sin embargo reducen
considerablemente la produccin vegetal (Sarathchandra et al., 1996)(2115).
Por otro lado, aunque en el suelo existen bacterias patgenas para las plantas, los
patgenos ms importantes desde un punto de vista agrcola son hongos, como los
pertenecientes a los gneros Fusrium, Pythium y Rhzoctonia (Glick, 1995)(1141).

1.3. Vicia villosa Roth.
El Gnero Vicia est encuadrado taxonmicamente en el Orden Fabales, dentro de la
Familia Fabaceae. Este Gnero comprende cerca de 140 especies, que se distribuyen en Europa,
Asia, NorteAmrica, Sudamrica y este de frica (Kupicha, 1981)(1238). Las relaciones
infragenricas se han estudiado clasificndose en dos Subgneros: Vicilla y Vicia, y cada
Subgnero se divide en 17 y 5 secciones respectivamente (Kupicha, 1976, 1981)(1238).
Vicia villosa es una planta herbcea de duracin anual o bienal, y en raras ocasiones
perenne o vivaz. Posee indumento desde densamente peloso hasta casi lampio. Los tallos son
angulosos, poco consistentes, ramosos y trepadores, pueden alcanzar hasta 1.5 m de longitud.
Las hojas llevan entre 5 y 10 pares de foliolos y terminan en zarcillos ramosos que
utilizan para apoyarse en soportes. Los foliolos son desde linear-lanceolados hasta aovado-
alargados y miden entre 15 y 25 mm. Las hojas poseen estpulas pequeas, las superiores
lanceoladas y enteras y las inferiores semisagitadas y ms o menos desgarradas.
Las flores se agrupan en racimos laxos y unilaterales y llevan entre 3 y 30 flores, estas
miden entre 12 y 20 mm, abrindose todas casi a la vez. Los estilos son dorsalmente
comprimidos y en manojos abaxiales (Endo y Ohashi, 1995)(1237). El cliz tiene los dientes
muy desiguales, los inferiores son mucho mas largos que los superiores. La corola es lampia



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tres veces ms larga que el cliz y con los ptalos provistos de largas uas de tonalidad
blanquecina; el limbo del estandarte es marcadamente ms corto que la ua y por lo comn
teido de violeta; las alas son casi de igual longitud que el estandarte, pero su tonalidad es ms
clara.
La legumbre est pediculada y en su pice tiene un pico bien marcado procedente de los
restos del estilo agrandado y endurecido. Tiene forma linear-oblonga, con una longitud de entre
20 y 40 mm y una anchura de 5 a 9 mm, es aplanada, lampia y oscuramente reticulada, de
coloracin marrn; contiene de 2 a 8 semillas que vienen a medir entre 3 y 4 mm de dimetro.
Florece de abril a septiembre, siendo una planta de polinizacin cruzada (Zhang y
Mosjidis, 1995)(2327). Una floracin temprana es una caracterstica importante para la
produccin de cultivos en los ambientes mediterrneos (Siddique et al., 1993; Loss y Siddique,
1994)(2327). En condiciones naturales se encuentra en campos de cereales o en estaciones
ruderales, aunque tambin se cultiva artificialmente.
Se considera especie endmica de la regin mediterrnea y tal vez de la Europa
suboriental, pero en la actualidad se ha difundido por gran parte de Europa alcanzando la mitad
meridional de la Pennsula escandinava y tambin las zonas ms extremas del Africa
septentrional y del Asia occidental (Guinea, 1953).
V. villosa presenta diversas ventajas frente a otras especies de leguminosas como:
producir gran cantidad de biomasa y soportar mejor el fro intenso y otras condiciones de estrs
que otras leguminosas como Trifolium hirtum (Volseky et al., 1996).(2477); estar adaptadas a
un alto rango de pH desde 5 a 8 (Siddique y Loss, 1996)(2327); ser ms tolerante a
enfermedades producidas por caros del suelo, bastante frecuentes en continentes como
Australia, que otras especies de Vicia (Siddique y Loss, 1996). (2327).

1.3.1. Caractersticas nutritivas de V. villosa

Muchas especies del gnero Vicia se han utilizado para consumo animal desde
tiempos remotos debido a su elevado poder nutritivo y a su resistencia en condiciones
extremas. Sin embargo, su uso se ha visto restringido en alimentacin animal debido a la
presencia de alcaloides txicos. Existe variacin gentica en la concentracin de compuestos
txicos en las vezas (Siddique y Loss, 1996)(2327).
Los efectos txicos de los alcaloides no son acumulativos, y stos son rpidamente
excretados por el rin. Por lo tanto se pueden consumir grandes cantidades de Vicia siempre



46
que la cantidad de alcaloides no exceda un nivel determinado. Las semillas deV. villosa son
aptas para la alimentacin de ganado, ya que contienen menos de un 2% de canavinina
(Enneking, 1995)(2327).
Los alcaloides juegan un papel muy importante para las plantas, ya que estos actan
como defensas contra la infeccin por bacterias, hongos y contra la predacin por herbvoros
(Wink, 1992; Wink et al., 1995). La gran diversidad estructural de los alcaloides, reduce las
posibilidades de que los herbvoros creen resistencia a todos ellos aumentando de este modo
su toxicidad (Wink, 1993; Schmeller, et al., 1994).
Las leguminosas tienen un alto contenido en azcares (ms de un 50%) y la energa
por unidad de peso es parecida a la de los cereales (Ranalli, 1995)(1449).
Uno de los factores que limita el consumo de leguminosas, es su capacidad para
producir gas en el tracto gastrointestinal. Trabajos antiguos (Lienner, 1980) muestran que
tanto en animales como en el hombre, la ingesta de leguminosas produce grandes cantidades
de gas en el intestino, compuesto en proporciones variables de anhdrido carbnico,
hidrgeno y metano en menor cuanta. De estos estudios se concluye que los causantes de la
flatulencia son los -galactsidos: rafinosa, estaquiosa, verbascosa y ajucosa, que se
acumulan en el intestino grueso, donde son utilizados por las bacterias anaerobias en su
metabolismo, dado que por la ausencia de enzimas hidrolizantes no pueden ser degradados en
el tracto intestinal. Son estos gases los responsables de la flatulencia que se manifiesta en
forma de nauseas, contracciones musculares, diarreas y malestar general.
Parece que existen otros compuestos que pueden tener un efecto sinrgico. As,
pectinas, glucanas, hemicelulosa, celulosa y ligninas aunque no son digeribles, pueden ser
utilizadas por microorganismos en el intestino grueso produciendo gases al fermentar
(Fleming, 1981).
Las semillas de leguminosas normalmente contienen carbohidratos de bajo peso
molecular, como oligosacridos de rafinosa y sacarosa. Estos compuestos son metablicamente
importantes como reservas de energa y su sntesis y acumulacin vara con las condiciones
ambientales. Sin embargo, se han descrito pequeas diferencias en el tipo de carbohidratos y en
su estabilidad (Hymowitz et al., 1972; Yasui et al., 1985). En todas las especies de Vicia
aparecen: sacarosa, almidn, verbascosa y galactosa, siendo la sacarosa el azcar que predomina
en las semillas de V. villosa. Derivados galactosil y pinitol se encuentran en bajas cantidades en
V. villosa (Yasui et al., 1987)(1238)



47
La fibra est constituida por celulosa, hemicelulosa, lignina y pectinas (Selvendran y
Robertson, 1990). El anlisis de este parmetro es necesario en cuanto que refleja la porcin
de Vicia que no es digerida, y desde un punto de vista nutricional tambin da una idea de la
calidad del mismo (J ung y Allen, 1995). Existen distintos trabajos donde se indica que un
elevado contenido de fibra en la dieta disminuye la digestibilidad de la materia orgnica
(Loewe y Meyer, 1974; Smolders et al., 1990; Olsson y Ruudvere, 1995), por lo tanto es un
aspecto econmico importante puesto que incide en el gasto en pienso para el ganadero y en
la productividad animal (J ung y Allen, 1995). La digestibilidad de la materia orgnica est
relacionada positivamente con el contenido citoplasmtico celular y negativamente con los
constituyentes de la pared celular, principalmente lignina (Demarquilly y J orriege, 1981). Es
precisamente la lignina la que limita la digestibilidad de la pared celular, protegiendo a los
polisacridos de la accin enzimtica (J ung y Deetz, 1993). Una alternativa para aumentar la
digestibilidad de la dieta es tratarla previamente con enzimas tipo celulasa, hemicelulasa o
pectinasa que disminuyan el contenido en fibra (Muck, 1993; Weinberg et al., 1995). Van
Soest (1994) concluye que el contenido en fibra de la planta aumenta con el desarrollo de la
misma al mismo tiempo que su digestibilidad va disminuyendo.

1.3.2. Usos de V. villosa

Ms de 20 cultivos de grano se cultivan en el mundo como fuentes de protenas; estos
cultivos corresponden con 8 familias incluyendo mono y dicotiledneas. Se encuentran especies
en distintas reas geogrficas y climticas incluyendo zonas templadas, tropicales hmedas,
ridas, tierras altas, sabana y tierras bajas (Ranalli, 1994). 1449.
Los cultivos ricos en protenas se dividen en dos: semillas oleaginosas, que
proporcionan alimento rico en protenas tras la extraccin del aceite y semillas de leguminosas
que se consumen enteras o molidas. Las leguminosas de grano contienen un 25-30% de
protenas y normalmente menos de un 2% de aceite (Ranalli, 1994). 1449
Por otro lado, a partir de la reforma de la PAC aprobada en Consejo de Mayo 1992, la
gestin del mercado de proteaginosos entre las que se encuentra la veza, ha sufrido una fuerte
transformacin pasando al rgimen de apoyo en la produccin de cultivos herbceos. As la
produccin de proteaginosas ha pasado de 2.9 millones de toneladas en 1987-88 a 5.6 millones
de toneladas en 1993-94 y pese a todo, en 1992 la CE import casi un milln de toneladas. El
92% de la produccin de leguminosas de la CE se obtiene de Espaa. En el marco de las



48
modificaciones introducidas por el Consejo de Ministros en los actuales regmenes de apoyo a
los productores para lograr el objetivo de que a medio plazo se cultiven en Espaa 280.000 ha
ms de estos productos.
Las vezas tienen un considerable potencial como leguminosas de forraje y como cultivo
de grano (Siddique y Loss, 1996).2327.
Por todos estos motivos V. villosa es una de las plantas ms utilizadas en Estados
Unidos en los llamados cultivos de invierno (Guinea, 1953). Namoi es una variedad de floracin
tarda y produce pocas semillas y un bajo ndice de cosechado, y sin embargo es ms apropiada
para el pastoreo y la produccin de heno.
Esta planta se usa para la nutricin del ganado, como suplemento de otras leguminosas
de grano para el pastoreo de rumiantes y ovejas y comida para cerdos sustituyendo a otras
leguminosas de grano en un porcentaje de 10-20%.
Debido a un aumento en el uso de fertilizantes qumicos, en la actualidad existen
excelentes razones para incrementar la produccin de leguminosas fijadoras de nitrgeno, ya
que la fertilidad residual de un cultivo de leguminosas es de entre 40-50kg N ha
-1
(Ranalli,
1994). 1449. La rotacin de cultivos con leguminosas anuales proporciona nitrgeno a los
cultivos de cereal creciendo en rotacin con ellos debido a la fijacin de nitrgeno (Wright,
1990; Green y Biederbeck, 1995)2079. El manejo de sistemas agrcolas intensivos depende de
la adicin de fertilizantes agrcolas para mantener las cosechas. Con estos sistemas de
produccin, las capacidad del suelo para retener nitrgeno disminuye con la disminucin de
carbono orgnico como resultado de menores entradas de restos vegetales y la aceleracin de la
descomposicin de los restos provenientes de la siega. El nitrgeno residual de los fertilizantes
puede pasar a xidos de nitrgeno por desnitrificacin y al lavado de nitratos con la
contaminacin de aguas que esto conlleva. Por tanto, para reducir la erosin, mejorar la
estructura del suelo, los ciclos de nutrientes, los procesos microbiolgicos y reducir las
contaminaciones, se estn buscando otros sistemas alternativos como los cultivos mixtos y
cultivos de cobertura que aportan cantidades significativas de nitrgeno al cultivo principal
(Vigil et al., 1991) y reducen las prdidas de este nutriente por lavado (McKenney et al.,
1993).615.
Como resultado de su capacidad para fijar nitrgeno en simbiosis con Rhizobium y su
alto valor nutritivo V. villosa suele utilizarse en rotacin de cultivos (Holderbaum, 1990;
Wagger, 1989b; Blevins, 1990). El cultivo de maz con V. villosa, aumenta el cultivo en un
123%. En suelos con textura media con alto contenido en materia orgnica, la rotacin de



49
cultivos contribuye substancialmente al efecto positivo de un cultivo previo de leguminosas en
el cultivo de maz (Stute y Posner, 1995)(1356)(papel aparte).
Un inconveniente de la rotacin de cultivos es que los frutos de esta planta se abren y la
semilla germina en el cultivo siguiente. Este problema puede ser solventado con el uso de
herbicidas. Sin embargo si el cultivo siguiente es de leguminosas, no existen herbicidas
especficos para eliminar solo a la veza. (2327).
Uno de los usos ms extendido de esta especie es la de cultivo mixto con cereal
(Anderson, 1975; Bull y Mayfield, 1992)2327. Varios cultivos anuales se han evaluado en
cultivos mixtos (Creamer, 1994), as como en monocultivos (Abdul-baki y Teasdale, 1993b;
Stivers y Shennan, 1991). Se ha observado que el cultivo mixto deV. villosa con tomate tiene
un efecto beneficioso sobre ste ltimo. Las cosechas eran superiores y la calidad del fruto era
superior que en cultivos convencionales, lo que supone en una mayor ganancia econmica
(Kelley et al., 1995). Reynolds et al. (1994) comprueban cmo en cultivos mixtos de cereales
con leguminosas, en lugares con contenidos en nitrgeno bajos en el suelo, la produccin de
cereal no se vea afectada por la presencia de la leguminosa; sin embargo, se demuestra que el
transporte de nitrgeno hasta el cereal es ms eficaz en presencia de la leguminosa que si se
fertiliza el cultivo con fertilizantes qumicos. Esto se debe a la conexin directa que existe entre
la raz de la leguminosa y la del cereal a travs de las micorrizas fngicas. Este dato se refleja en
la cantidad de protenas que se encuentra en los granos del cereal en cultivos con leguminosas y
sin ellas.
Otro sistema alternativo, es el uso de cubiertas orgnicas. Este sistema consiste en
sembrar una leguminosa de cobertura y una vez florecida, segarla dejando el residuo sobre el
suelo, residuo que formar una cubierta orgnica. La cobertura orgnica reduce la erosin del
suelo, la necesidad de fertilizantes, aumenta la cantidad de materia orgnica, incrementa la
capacidad de retencin hdrica y reduce la competencia por malas hierbas y la necesidad de usar
herbicidas (Abdul-Baki y Teasdale, 1993). El uso de cobertura orgnica en lugar de polietileno
negro, generalmente proporciona mejores cosechas y retrasa la produccin, con lo cual sta
coincide con los precios ms altos de la temporada. Las Vicias, al fijar nitrgeno proporcionan
este elemento a los cultivos siguientes, con lo cual se puede reducir e incluso eliminar el uso de
fertilizantes. Adems el uso de polietileno es caro y presenta la desventaja de su eliminacin
(Servis, 1992). La combinacin de mejoras ambientales as como econmicas hacen de la
cobertura con V. villosa un sistema alternativo atractivo para el cultivo de otras plantas como el
tomate (Kelly et al., 1995). (1571).



50
V. villosa se ha usado como cobertura en cultivos de tomate aumentando
significativamente la produccin y por tanto los beneficios econmicos. Los costes de
produccin de este tipo de cultivo son mayores puesto que hay que pagar la semilla y su
cosechado. Sin embargo, los beneficios debidos a una mayor cosecha de tomate, as como la
reduccin de la fertilizacin nitrogenada compensan los costes de produccin. En un suelo sin
Vicia, usando fertilizantes podramos conseguir producciones parecidas y a un coste similar, sin
embargo los niveles de fertilizantes excederan los recomendables y aumentaran la
contaminacin. V. villosa, aparte de introducir nitrgeno en el sistema, acta de forma
beneficiosa mejorando la estructura del suelo y la eficiencia en el uso del agua (Decker et al.,
1994). Los resultados eran mejores que en cultivos bajo cobertura de polietileno negro (Abdul-
Baki y Teasdale, 1993a). Con los sistemas de cobertura de V. villosa la necrosis foliar era
menor, lo que permite a las plantas mantener ms tiempo su rea foliar y sintetizar ms
fotosintatos durante un periodo de tiempo ms largo, lo que incrementa la produccin (Abdul-
Baki et al., 1996). (2120).
Adems de influir en la fertilidad del suelo, los residuos de leguminosas de invierno
influyen en las poblaciones de malas hierbas en tierras sin labrar por su proximidad a la
superficie del suelo, zona donde germinan las semillas. La cobertura orgnica reduce la cantidad
de radiacin que llega al superficie del suelo, baja la temperatura mxima del mismo pero tiene
poco efecto en la temperatura mnima (Hoyt y Hargrove, 1986; Bristow, 1988; Fortin y Pierce,
1991). Adems la cubierta mantiene la humedad del suelo en niveles ms altos que el suelo
desnudo (Hoyt y Hargrove, 1986; Bristow, 1988). La humedad del suelo y la temperatura son
parmetros relacionados, ya que la radiacin recibida por el suelo, no empieza a calentar hasta
que la demanda de evaporacin no se satisface (Bristow, 1988). La germinacin de las semillas
de malas hierbas esta afectada por la magnitud y las fluctuaciones de temperatura y humedad
(Egley, 1986). Por lo tanto los cultivos de cobertura influyen en la germinacin de malas hierbas
a travs de la temperatura y la humedad del suelo, as como a travs de la luz (Teasdale y
Mohler, 1993). (682). Las temperaturas del suelo bajo V. villosa no se reducen lo suficiente
como para evitar la germinacin de las semillas de malas hierbas, como mucho retrasan la
germinacin. Esta planta tiene una mayor influencia en la germinacin de malas hierbas a travs
de la reduccin de la amplitud entre la temperatura mxima y mnima diaria. Algunas semillas
necesitan una amplitud de por lo menos 10C para germinar. (601). Estas plantas tambin
reducen, retardan o en ocasiones favorecen la emergencia de malas hierbas ya que alteran las



51
condiciones fsicas y por tanto los micrositios de la germinacin de semillas (Teasdale y
Mohler, 1993). (682)
La produccin de biomasa de esta planta oscila entre 2140 y 9010 kg ha
-1
en la
primavera, indicando la potencialidad de esta leguminosa para suprimir malas hierbas a travs
de la competencia durante el crecimiento en primavera y a travs de la cobertura que ofrece tras
la senescencia (Holderbaum et al., 1990; McVay et al., 1989). Adems sustancias producidas
por los residuos de V. villosa parecen producir procesos alelopticos que interfieren en la
germinacin de las semillas de malas hierbas (White et al., 1989; Bradow y Connick,
1990).(662). En estos sistemas aparecen gran cantidad de insectos, babosas y culebras que se
alimentan de parte de las plntulas de las malas hierbas. 648
V. villosa viva elimina ms malas hierbas que cuando se usa residuo seco (Teasdale y
Daughtry, 1993). Sin embargo, esta planta se descompone relativamente rpido, por lo que
permite que emerjan, ms tarde, muchas de estas plantas. Teasdale et al. (1991) observan que al
aumentar los niveles deV. villosa reducen linealmente la densidad de malas hierbas. (684).
La utilizacin de leguminosas como abono verde proporciona al suelo ganancias de
nitrgeno(por fijacin), mejora su conservacin y disponibilidad y supone una cubierta contra la
erosin del agua y del viento. Este abono puede sustituir a los fertilizantes comerciales en los
sistemas agrcolas (Welty et al., 1988; Andrn et al., 1990; Follett et al., 1991; Hargrove, 1991)
y se ha propuesto como estrategia de manejo para sistemas con bajas entradas de nutrientes y
para tierras marginales (Vlek et al., 1981; Biederbeck, 1990).2079. El uso de cultivos de grano
de leguminosas como abono verde es un modo de reducir la cantidad de fertilizantes
nitrogenados en la produccin de maz (Stute y Posner, 1995)(1356)(papel aparte). Cerca de un
20% del nitrgeno de las leguminosas es captado por el primer cultivo, tras el abonado, pero los
beneficios persisten en cultivos posteriores (Ladd et al., 1983; Ladd y Amato, 1986; J anzen et
al., 1990). Adems el abono verde va hacindose disponible gradualmente para cultivos
posteriores, lo que contrasta con la disponibilidad del nitrgeno comercial (Groffman et al.,
1987; J ans-Hammermeister et al., 1994b).2079. Estudios que comparan la respuesta de un
cultivo de no leguminosa que sigue a uno de leguminosa con la respuesta a distintas
concentraciones de nitrgeno comercial indican que los beneficios del abono verde con
leguminosas es mayor que el predicho por las estimas de
15
N (Welty et al., 1988; Badaruddin y
Meyer, 1990; Blevins et al., 1990; Utomo et al., 1990)(2079).

1.4. Plan de trabajo y objetivos



52

Las modificaciones de distintas caractersticas edficas (fisicoqumicas y
microbiolgicas) que se dan en torno a plantas diazotrofas han sido objeto de distintos estudios
previos (Gutirrez Maero, 1987; Llinares, 1990; Probanza, 1991 y Pozuelo, 1991; Probanza,
1994). La mayor parte de estos estudios se han centrado en los efectos de la planta sobre el suelo
circundante a diferentes distancias y profundidades de la misma, estudiando los
microorganismos de los grupos funcionales del ciclo del nitrgeno y sus actividades potenciales.
En la presente memoria se estudia el efecto de V. villosa sobre su rizosfera, las
caractersticas biticas y abiticas de la misma y el efecto de bacterias rizosfricas de
poblaciones naturales de V. villosa sobre la germinacin y crecimiento de dos variedades
comerciales de esta especie.
El objetivo fundamental de este estudio sobre el que convergen todos los que a
continuacin se desglosan, es el poder ofrecer un plan de manejo que optimice la produccin
aprovechando las caractersticas productivas de la planta y su influencia sobre el sustrato
edfico. Al mismo tiempo el estudio del sistema rizosfrico pretende aprovechar la posible
adaptacin de las bacterias rizosfricas de V. villosa al sistema rizosfrico de esta,
previsiblemente resultado de procesos de coevolucin, para seleccionar cepas PGPRs con futura
aplicacin biotecnolgica que permiten mejorar las tcnicas de produccin. Este ltimo aspecto
enlaza con el anterior conduciendo a un estudio integral de la planta con su medio para
desarrollar tcnicas dirigidas hacia una agricultura sostenible.
Por todo ello el trabajo est estructurado en dos partes diferenciales.

Direccin suelo-planta:
1. Estudio de las bacterias asociadas a la rizosfera de V. villosa, creciendo en
poblaciones naturales. Se estudi su composicin taxonmica a nivel de gnero y grupos
fisiolgicos del ciclo del nitrgeno a los que pertenecen y la variacin a lo largo del ciclo
fenolgico de la planta.
2. Estudio de la diversidad gentica de las bacterias pertenecientes a los gneros
bacterianos mayoritarios de cada momento de muestreo.
3. Efecto de los metabolitos producidos por las bacterias mayoritarias sobre la velocidad
y tasa de germinacin.



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4. Efecto de los metabolitos producidos por las bacterias mayoritarias sobre el
crecimiento de la veza. Efectos sobre plantas pertenecientes a la variedad Namoi y Ltigo
(nitrgeno total y distintos parmetros biomtricos de la parte area y radical de las plantas).

Direccin planta suelo:
1. Estudios en condiciones de laboratorio para conocer el efecto que dos variedades
comerciales de Vicia villosa tienen sobre los grupos funcionales del ciclo del nitrgeno y sobre
parmetros fIsicoqumicos edficos relacionados con dicho ciclo. Paralelamente tambin se
controlan parmetros biomtricos de las plantas. Para todo ello se hace un seguimiento durante
todo el ciclo vital de la planta, haciendo los correspondientes anlisis en tres estados de sta,
vegetativo, floracin y fructificacin, coincidiendo los tres con actividades agrcolas
tradicionales llevados a cabo con esta planta.
La seleccin de las dos variedades (Namoi y Ltigo) se realiz teniendo en cuenta sus
caractersticas de crecimiento y aprovechamiento diferencial de las mismas, para lo cual se
realizaron las pruebas biomtricas oportunas. La hiptesis de trabajo es que dos variedades con
caractersticas en su crecimiento bien distintas demandarn nutrientes y exudarn productos
orgnicos a travs de su aparato radical siguiendo patrones diferentes, lo cual podra tener su
efecto correspondiente sobre la dinmica del ciclo del nitrgeno y por lo tanto sobre la
productividad del suelo y de la planta. Estos factores junto con la variable "momento de
muestreo" en funcin de la etapa del ciclo vital de las plantas, suponemos que interaccionan de
manera decisiva, por lo que habra que tener en cuenta todos los factores mencionados a la hora
de hacer un balance cuyo objetivo sea decidir el momento adecuado para cosechar en funcin de
la variedad seleccionada.
2. Estudios en condiciones de campo para conocer el efecto que las dos variedades
comerciales de V. villosa tienen sobre los grupos funcionales del ciclo del nitrgeno y sobre
parmetros fIsicoqumicos edficos relacionados con dicho ciclo.
3. Paralelamente tambin se controlan parmetros biomtricos y bioqumicos de las
plantas, para conocer las ventajas nutricionales y de produccin de una y otra variedad. Para
todo ello se hace un seguimiento durante todo el ciclo vital de la planta, haciendo los
correspondientes anlisis en tres estados de sta, vegetativo, floracin y fructificacin,
coincidiendo los tres con actividades agrcolas tradicionales llevados a cabo con esta planta.





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