Aportaciones del laboratorio en el

diagnstico y el tratamiento del

paciente intoxicado.
Dra. Ana Mara Lpez Parra
Dpto. Toxicologa y Legislacin Sanitaria, Fac. Medicina
Universidad Complutense de Madrid
Esquema
Introduccin.
Muestras.
Envasado, conservacin y almacenamiento.
Anlisis qumico-toxicolgico.
Mtodos de extraccin.
Deteccin e identificacin del txico:
tcnicas espectrofotomtricas
tcnicas cromatogrficas
tcnicas inmunoqumicas
Introducci
Introducci

n
n
La investigacin toxicolgica es
el conjunto de procesos
analticos que tienen por objeto
el aislamiento, identificacin y
determinacin cuantitativa de
los txicos, tanto en el vivo
como en el cadver, con el fin
de permitir el diagnstico de la
intoxicacin.
Muestras
Muestras
Contenido gstrico
Sangre
Orina
Pelo
Saliva
Meconio
Muestras
Muestras
Contenido gstrico
-Vmito, aspirado gstrico y lavados estomacales.
-En el caso de los lavados estomacales, primer
lavado.
-Un volumen de aproximadamente 20 ml.
-Puede ser necesario procedimientos de
homogenizacin, filtracin y/o centrifugacin.
-No representa grado de intoxicacin.
Muestras
Muestras
Sangre
-Es una de las muestras ms tiles para la identificacin y
especialmente para el anlisis cuantitativo.
-La sangre total y el plasma son las muestras ms
representativas.
-Recoger la muestra en tubos con heparina o EDTA como
anticoagulante.
-Si se sospecha de intoxicacin con etanol, utilizar fluoruro
sdico como conservante. Y la extraccin deber
efectuarse desinfectando la zona con cloruro mercrico.
Muestras
Muestras
Orina
-Ensayos preliminares en el screening de txicos.
-Para drogas de abuso.
-La concentracin de un txico puede llegar a ser
100 veces mayor que en la sangre.
-Se debe de tomar antes del tratamiento.
-Como mnimo 50 ml.
Muestras
Muestras
Pelo
-Txicos minerales
-Deteccin de drogas de abuso.
-Refleja el estado promedio de los elementos
minerales del organismo durante su crecimiento.
Muestras
Muestras
Saliva.
-Correlacin de los anlisis
sricos con drogas de abuso y
psicofrmacos.
Meconio.
-Meconio: lquido amnitico, moco, lanugo, bilis y
clulas que se han desprendido de la piel y del tracto
intestinal.
-Identificacin de drogas durante la gestacin.
Drager DrugCheckKit
Muestras
Muestras
Hgado
-Niveles de txicos superiores
a los de la sangre.
-Especialmente til cuando no
se puede disponer de sangre.
-Evitar contaminacin por bilis.
-Evitar aadir conservantes.
Envasado y conservaci
Envasado y conservaci

n
n
Tapones PTFE
(polytetrafluoroethylene)
Conservantes:
Azida sdica (0,1%, p/v)
Fluoruro sdico (1%, p/v)
Anticoagulante:
- Heparina
- EDTA
- Oxalato potsico (0,5%, p/v).
Almacenamiento
Almacenamiento
Factores que intervienen:
Temperatura
Descomposicin
biolgica
Luz
Hidrlisis
Oxidacin
An
An

lisis
lisis
qu
qu

mico
mico
-
-
toxicol
toxicol

gico
gico
1. Separacin o extraccin del txico de la
muestra.
2. Deteccin e identificacin del txico.
3. Cuantificacin.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n
n
Desde el punto de vista analtico los txicos se
dividen en:
Txicos voltiles
Txicos gaseosos
Txicos orgnicos fijos o extrables
Txicos inorgnicos o minerales
Finalidad:
Aislamiento y purificacin del txico
Concentracin del txico en el extracto obtenido
Parte de la muestra se reserva ntegra
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos vol
xicos vol

tiles
tiles
Aquellos que se volatilizan por debajo de los
100C, por lo cual son arrastrados por el vapor
de agua cuando sta destila (alcohol etlico,
alcohol metlico, benceno, fenoles, ...).
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos vol
xicos vol

tiles
tiles
Las tcnicas son:
-Destilacin simple.
-Destilacin fraccionada.
-Destilacin directa al vaco.
-Destilacin por arrastre en corriente de vapor.
-Microdifusin.
-Tcnica de espacio de cabeza(" head space" ).
Destilaci
Destilaci

n simple
n simple
Muestra
problema
Txico
voltil
extrado
Destilaci
Destilaci

n fraccionada
n fraccionada
Separacin segn puntos
de ebullicin
Microdifusi
Microdifusi

n
n
Anlisis Muestra Agente
liberador
Compartimento
interior
Tiempo de
difusin
Acetaldehdo 3 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de
SO
4
H
2
al 10%
3,3 ml de
SO
3
HNa 0,15M
3 horas
Acetona 3 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de
SO
4
H
2
al 10%
3,3 ml de
SO
3
HNa 0,15M
3 horas
Monxido de
carbono
1 ml de sangre 1 ml de SO
4
H
2
al
10%
2 ml de cloruro
de paladio
1 hora
Cianuro 2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de
SO
4
H
2
al 10%
3,3 ml de NaOH
0,1N
3 horas
Etanol 0,8 ml de sangre
4 ml de tejido
1 ml de CO
3
K
2
al
10%
2 ml de
dicromato
potsico
3 horas
Formaldehdo 3 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de
SO
4
H
2
al 10%
3,3 ml de
SO
3
HNa 0,15M
3 horas
Hidrocarburos
halogenados
1-4 ml de sangre
1-4 ml de tejido
- 1 ml de tolueno 3 horas
Isopropanol 2 ml de sangre
5 ml de tejido
1 ml de CO
3
K
2
3,3 ml de SO
4
H
2

al 10%
3 horas
Metanol 2 ml de sangre
5 ml de tejido
1 ml de CO
3
K
2
3,3 ml de
SO
3
HNa 0,15M
3 horas
Fenoles 2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de
SO
4
H
2
al 10%
3,3 ml de NaOH
0,1N
3 horas
Sulfuro 2-4 ml de sangre
5 ml de tejido
3-4 gotas de
SO
4
H
2
al 10%
3,3 ml de NaOH
0,1N
3 horas

Camara
de
Conway
T
T

cnica de espacio de cabeza

cnica de espacio de cabeza
1. La muestra se deposita en un vial
cerrado con tapn perforable, en el
que se deja una cmara de aire.
2. Se calienta a 60C durante 30 min.
3. Se extrae con una jeringa para
gases una muestra de la parte
superior del frasco para inyectarla en
un cromatgrafo de gases.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos gaseosos
xicos gaseosos
Se denominan txicos gaseosos a todas
aquellas sustancias que a temperatura ambiente
se encuentran en estado gaseoso. Por ejemplo:
CO, HCN, SH
2
, AsH
3
, SbH
3
, NH
3
, Cl
2
, Br
2
.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos gaseosos
xicos gaseosos
Las tcnicas son:
-La extraccin de gases en sangre se basa en leyes
fsicas, segn las cuales su solubilidad disminuye
elevando la temperatura o disminuyendo la presin.
-Mediante las mismas tcnicas que para los txicos
voltiles.
-Cromatografa de gases
Cromatografa
de gases (GC)
Tcnica de separacin.
Se basa en la diferente velocidad con que se
mueven los solutos a travs de un medio poroso
arrastrados por un disolvente en movimiento.
T
T

cnicas
cnicas
cromatogr
cromatogr

ficas
ficas
Volatilizacin
Cromatograf
Cromatograf

a de gases
a de gases
*Line Base *Altura del Pico
*Pico Cromatogrfico *Anchura del Pico
*Base del Pico *Anchura del Pico a la mitad de la altura
*rea del Pico
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
Tcnica muy sensible, fiable y rentable para
determinaciones cualitativas (casi la totalidad de
los txicos) y cuantitativas (lmite de sensibilidad
1-5 g/ml.) .
Posibilidad de derivacin (obtener un
compuesto intermedio a partir de una sustancia
no voltil) hace su aplicacin prcticamente
universal.
Cromatograf
Cromatograf

a de gases
a de gases
M
M

todos de
todos de
microextracci
microextracci

n
n
en fase s
en fase s

lida
lida
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos org
xicos org

nicos fijos
nicos fijos
Sustancias orgnicas y no voltiles.
Se incluyen:
*Txicos de origen vegetal (glucsidos,
aceites esenciales, alcaloides, etc)
*Productos de sntesis (medicamentos).
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos org
xicos org

nicos fijos
nicos fijos
Las tcnicas son:
-Con disolvente polar (etanol): tcnica de Stas-Otto.
- Con disolventes apolar: los ms frecuentes son: ter etlico,
cloroformo y diclorometano. Puede ser:
*Directa: slo aplicable a muestras biolgicas limpias
como la orina
*Previa purificacin de la muestra (eliminacin de
protenas).
Fraccionamiento del extracto antes de su anlisis:
Debido a la gran variedad de txicos orgnicos conocidos es
necesario un fraccionamiento del extracto.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos org
xicos org

nicos fijos
nicos fijos
Clasificacin de txicos orgnicos en:
1. cidos: dbiles (por ejemplo barbitricos) o fuertes (por
ejemplo salicilatos), unos y otros extrables con disolventes
orgnicos en medio cido.
2. Bsicos: extrables con disolventes orgnicos en medio bsico
(alcaloides, antidepresivos tricclicos, etc.)
3. Neutros: extrables con disolventes orgnicos en medio cido
o bsico.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos org
xicos org

nicos fijos
nicos fijos
Las tcnicas son:
-Mtodo de electrodilisis: se basa en la propiedad que
tiene la corriente elctrica de descomponer las sales de
los txicos orgnicos, yendo la base hacia el polo
negativo y el resto al polo positivo.
-Columnas con rellenos de resinas: las drogas orgnicas
son absorbidas por la resina y luego son eluidos con
solventes apropiados.
Extraccin en fase slida
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos org
xicos org

nicos fijos
nicos fijos
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de
n de
t
t

xicos minerales o
xicos minerales o
inorg
inorg

nicos
nicos
Estos txicos se encuentran en el organismo
firmemente unidos a albmina, lpidos o glcidos,
siendo requisito la destruccin de la materia
orgnica para poder realizar su anlisis.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de t
n de t

xicos
xicos
minerales o inorg
minerales o inorg

nicos
nicos
1. Mineralizacin: proceso por el cual se produce la destruccin
de la materia orgnica y la consiguiente liberacin del txico.
a) Destruccin oxidativa por va hmeda de la materia orgnica empleando
cido ntrico o mezclas de c. ntrico-agua oxigenada, etc.
b) Destruccin de materia orgnica por va seca (calcinacin).
c) Formacin de complejos y posteriormente se separa con disolventes
orgnicos.
Se pueden efectuarse combinaciones entre los distintos
mtodos, para obtener una muestra ms apropiada.
M
M

todos de extracci
todos de extracci

n de t
n de t

xicos
xicos
minerales o inorg
minerales o inorg

nicos
nicos
Existen mtodos que no precisan la destruccin de la
materia orgnica como:
*Dilisis.
*Ultrafiltracin.
*Electrodilisis.
*Desproteinizacin.
2. Marcha posterior de extraccin
Detecci
Detecci

n e identificaci
n e identificaci

n
n
del t
del t

xico
xico
Dos etapas:
1. Rastreo o deteccin rpida:
-Tcnicas de inmunoensayo
-Cromatografa en capa fina
2. Tcnicas de confirmacin:
-Tcnicas espectrofotomtricas.
-Tcnicas cromatogrficas.
T
T

cnicas
cnicas
inmunoensayo
inmunoensayo
Fundamento:
Reacciones antgeno-anticuerpo.
Se aplica especialmente para drogas de abuso y
psicofrmacos.
Txico libre
T T xico marcado xico marcado
+ AC
Txico libre-AC
T T xico marcado xico marcado
T
T

cnicas
cnicas
inmunoensayo
inmunoensayo
1. Radioinmunoensayo (RIA): istopo radioactivo.
2. Enzimoinmunoensayo: enzima.
-ELISA: ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzimas
-EMIT: inmunoensayo multiplicado por enzimas
3. Fluorescencia polarizada (FPIA): fluorforo.
4. Inmunoanlisis por interaccin cintica de partculas
(KIMS): competencia por unirse al Ab y evitar formar
agregados de micropartculas.
T
T

cnicas
cnicas
inmunoensayo
inmunoensayo
Su aplicacin es cualitativa y cuantitativa (con patrones de
concentracin).
Tcnicas rpidas, y sensibles.
Posibilidad de reacciones cruzadas.
T
T

cnicas
cnicas
cromatogr
cromatogr

ficas
ficas
Cromatografa en capa fina (CCF)
Fase movil Fase estacionaria Aplicaciones
Cloroformo/acetona
80:20
Silica gel G activada a 120C/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Todos los tipos
Isopropanol/cloroformo Silica gel G activada a 120C/30 min
Desarrollo: 30 min/10 cm
Barbitricos
Cloroformo/acetona
90:10
Silica gel G activada a 120C/30 min
Desarrollo: 30-45 min
Anticonvulsionantes
Sedantes no
babitricos
Detecci
Detecci

n e identificaci
n e identificaci

n
n
del t
del t

xico
xico
2. Tcnicas de confirmacin:
-Tcnicas espectrofotomtricas.
-Tcnicas cromatogrficas.
T
T

cnicas
cnicas
espectrofotom
espectrofotom

tricas
tricas
Fundamento: capacidad que tienen las molculas y los
tomos de absorber radiaciones de diferente longitud de onda
utilizando la energa de dichas radiaciones para producir cambios
energticos en su estructura (en los tomos transiciones
electrnicas y en las molculas movimientos electrnicos)
Aplicaciones Tcnicas
Compuestos Anlisis
Espectrofotometra UV visible Orgnicos Cuali/cuantitativo
Espectrofluorimetra Orgnicos Cuali/cuantitativo
Espectrofotometra infrarroja Orgnicos Cualitativo
Espectrofotometra de absorcin atmica Metales Cuali/cuantitativo
Espectrometra de masas Orgnicos Cualitativo
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de absorci
a de absorci

n
n
at
at

mica (EAA)
mica (EAA)
E*
E
Luz
incidente
Fluorescencia
emitida
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de
a de
absorci
absorci

n at
n at

mica
mica
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de
a de
absorci
absorci

n at
n at

mica
mica
Sistema
detector
Lmpara de
ctodo hueco
Sistema
atomizador
Sistema
monocromador
Sistema
detector
La emisin de una energa electromagntica de longitud de onda determinada,
se hace incidir sobre un tomo libre en estado fundamental, este tomo
absorbe la energa y con lo que pasa a un estado excitado.
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
En la interpretacin de resultados considerar:
contaminacin en la toma y mantenimiento de
las muestras, etc.
Personal especializado.
Tcnica muy sensible, fiable y rentable. Su
sensibilidad permite identificar y cuantificar
metales en niveles de traza.
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de absorci
a de absorci

n
n
at
at

mica
mica
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de
a de
emsi
emsi

n
n
at
at

mica (EEA)
mica (EEA)
E*
E
Luz emitida
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a
a
de masas (EM)
de masas (EM)
Tcnica cualitativa y cuantitativa.
Separa partculas moleculares o atmicas segn su masa.
Volatilizacin
Ionizacin
2.Aceleracin
iones
3. Separacin
4. Deteccin
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de masas
a de masas
Tcnica cualitativa y cuantitativa.
Anlisis de fragmentos moleculares. Determinacin de la estructura
molecular.
Su principal aplicacin es la identificacin de sustancias desconocidas
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
Acoplamiento a GC (o HPLC): mtodo
ms efectivo para la identificacin de
txicos y sus metabolitos.
ICP-MASAS
Espectrofotometr
Espectrofotometr

a de masas
a de masas
ICP
ICP
-
-
Masas
Masas
ICP: Plasma de
acoplamiento inducido
T
T

cnicas
cnicas
cromatogr
cromatogr

ficas
ficas
Cromatografa de lquidos
Cromatografa de gases
T
T

cnicas
cnicas
cromatogr
cromatogr

ficas
ficas
Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)
Ventajas e inconvenientes
Costoso.
Personal especializado.
No destruye la muestra, lo que permite la deteccin por
distintos sistemas en serie.
Requiere mnima preparacin y pequeas cantidades.
Mayor precisin que GC. En general se aplica a
compuestos de alto peso molecular y polar mientras que
GLC se aplica a gases permanentes y sustancias
voltiles.
Mejor resolucin y menor tiempo de anlisis.
Cromatograf
Cromatograf

a l
a l

quida de alta
quida de alta
resoluci
resoluci

n (HPLC)
n (HPLC)
Gracias por su atenci
Gracias por su atenci

n
n