ALAIN PROCHIANTZ COURS DU COLLGE DE FRANCE ANNE ACADMIQUE 2013-2014

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21 octobre 2013
Structure et plasticit de la chromatine
Nous allons dbuter ce cours en revenant sur
certains des aspects dj voqus, travers la
question du rle rgulateur des ARN non codants
(ncRNAs) dans la rparation de lADN. Je le ferai en
insistant plus sur NHEJ puisque la longvit neuro-
nale sadresse dabord aux cellules post-mitotiques
(la HR aura parfois son mot dire cependant). La
DIAIII.2 a simplement pour but de vous remettre en
mmoire les deux voies de rparation des cassures
double brin, la voie NHEJ ( gauche) et la voie HR (
droite). Pour la NHEJ, la squence des vnements
est maintenant familire avec Ku70 et Ku80 qui
viennent couvrir les extrmits libres par la cas-
sure et mobilisent les diffrentes enzymes de phos-
phorylation dont les DNA-PKCs qui elles-mmes
phosphorylent Artmis conduisant la gnration
dextrmits qui se recouvrent puis la rparation
par laction conjugue des DNA-polymerases qui
comblent les trous et des ligases qui lient le tout.
Je nai pas vraiment besoin de mtendre trop sur
les ARN non codants, puisque nous en avons sou-
vent parl au cours des annes prcdentes. Pour
les nouveaux venus cependant, o ceux qui auraient
oubli, je rappellerai que les domaines rgulateurs
(qui ne codent pas pour des protines) comptent
pour environ 98% du gnome et que les ARN non
codants sont les produits les plus nombreux de ces
rgions rgulatrices. Ces ARN sont transcrits partir
de lADN mais ne codent pas pour des protines,
dsobissant donc au schma classique, mais par
trop simplicateur et dogmatique, de la squence
temporelle et unidirectionnelle ADN-ARN-Protine (je
rappelle que lon peut aussi passer de lARN lADN
comme nous lavons vu propos de la rtrotransposi-
tion et comme nous le retrouverons quand nous par-
lerons des tlomres le 4novembre de cette anne.
Ces ARN non codants ont de nombreuses fonctions
biologiques de rgulation de lexpression gntique
qui sexercent tous les niveaux: transcription (ADN
donne ARN), pissage (un mme transcrit primaire
peut donner naissance plusieurs mRNAs distincts),
transport des ARN (la traduction des ARN en pro-
tines peut se faire localement aprs transport de
lARN, cest en particulier le cas des ARN messa-
gers primitochondriaux ou des ARN prsents dans
la synapse et en attente). quoi il faut ajouter
une fonction de rgulation de la stabilit des ARN
messagers et de leur traduction en protines. Ces
fonctions rgulatrices peuvent tre, ou non, associes
des mcanismes de rgulation de la stabilit des
gnomes, comme dans le cas des piRNA qui rpri-
ment la transcription des rtrotransposons. Je ny
reviens pas pour linstant puisque l encore nous en
avons souvent parl et que nous y reviendrons dans
ce mme cours, mais un peu plus tard.
Les microRNAs ou miRNA, constituent une classe
importante dARN non codants. Il sagit de rgula-
teurs post-transcriptionnels et on pense aujourdhui
que plus de 60% des ARN messagers (mRNAs)
sont des cibles des miRNAs, lesquels rgulent leur
stabilit (en fait leur dgradation) et leur traduction
en protines, le plus souvent en sassociant lextr-
mit 3terminale des mRNAs (3UTR). Cela est dcrit
dans la DIAIII.2 en haut droite o lon voit que le
complexe argonaute-miRNA (Argonaute est une
famille de protines) se lie lextrmit3 de lARN
messager et une double action sur lassemblage
des ribosomes (appareil de traduction des mRNA en
protines) en5 (formation du complexe dinitiation
de la traduction) ou leur stabilit pendant la lecture
du message.
Une association parfaite favorise la dgradation
quand une association imparfaite favorise plutt la
rgulation de la traduction mais ne touche pas
la stabile du messager. Connaissant la squence
dun miRNA on peut donc identifier ses cibles
potentielles (ayant une squence complmentaire
dappariement plus ou moins parfait en 3UTR).
Comme lindique la DIAIII.3, les miRNAs sont gn-
rs partir de prcurseurs plus longs les Pri-miRNA
transcrits grce la RNA polymeraseII (ouIII) puis
maturs travers un mcanisme impliquant les
deux RNases III Drosha et Dicer qui agissent pour
la premire au niveau du noyau et pour la seconde
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au niveau du cytoplasme, gnrant un ARN double
brin (dsRNA) de 20 25nuclotides li une pro-
tine de la famille Argonaute.
Incidemment cette gure est prise dun article
portant sur lexistence de miRNA extracellulaires
et suggrant donc la possibilit dune signalisation
intercellulaire par transfert de miRNA. On peut
supposer, si cette hypothse est vrie, quune
rgulation de la longvit pourrait faire intervenir
un mcanisme dpassant le cadre du seul groupe
de cellules o cette rgulation est initialement acti-
ve, une sorte de vieillissement communicatif (ou
de rsistance au vieillissement tout aussi bien). Ce
miRNA est alors incorpor dans le complexe RISC
(RNA-Induced Silencing Complex) qui comprend
des protines Argonautes et catalysent linteraction
entre le miRNA et ses mRNAs cibles.
Pour en revenir la scrtion possible, probable
de mon point de vue, les auteurs proposent plu-
sieurs mcanismes. Parmi ces mcanismes jen
souligne deux qui sont particulirement intres-
sants, la scrtion atypique du complexe Argonaute/
miRNA (ou de tout autre complexe impliquant des
protines autre que les protines Argonautes clas-
siques et liant des miRNA tout aussi bien) ou lex-
pulsion dun exosome (DIAIII.4). Dans ce cas on
voit quune entit cytoplasmique peut rejoindre le
cytoplasme dune autre cellule aprs fusion de lexo-
some (suivre le trajet du petit bonhomme rouge).
Pour en revenir aux DSB, constatons que de
nombreuses protines impliques dans les DSB
sont directement associes des ncRNAs qui
semblent donc jouer un rle dans la rparation,
mme si ce rle demande tre tudi et compris.
Cest en particulier le cas de p53BP1, du complexe
Ku et de BRCA1 (breast cancer typeI susceptibi-
lity) qui se lient des ARN non codant. Je rappelle
dailleurs que ce nest pas la premire fois que nous
constatons que la liaison lADN peut impliquer un
complexe ARN-protine puisque les complexes
polycomb et trithorax qui rprime ou active pig-
ntiquement la transcription sont structurs par
de tels ARN non codants. Je souligne simplement
que le recrutement dARN non codants au niveau
des sites de coupure influence probablement la
rparation (DIAIII.2). Par ailleurs les DSB eux-
mmes peuvent rguler lexpression de ncRNAs.
Ces nombreux points sont abords, sous la forme
dun article dopinion, par Chowdhury et al., Nature
Reviews MCB, 14: 181-189, 2013. On trouvera des
complments dinformation dans Sharma & Misteli,
FEBS Lett. 587: 1832-1839, 2013 et Wan et al.,
TIBS 36: 478-484, 2011 (les rfrences sont dans
les diapositives). Dans ce contexte, il est bien dmon-
tr que les lsions de lADN induisent lexpression de
miRNAs (une sous classe dARN non codants), mais
ces changements dexpression dpendent du type
de dommage et de lintensit du dommage. Ind-
pendamment de cette variabilit, il semble bien que
linitiation de la DDR est rgule, en partie du moins,
par des modication aprs DD de lexpression en
hausse ou en baisse de miRNAs spciques.
Une liste de protines impliques dans la DDR et
des miRNAs qui rgulent leur expression est montre
dans la DIAIII.5, incluant pour les plus populaires
ATM, H2AX, RAD52, BRCA1 et p53 qui nont plus de
secrets pour nous. ATM joue un rle important dans
cette activation des miRNAs et 71miRNAs dpendent
dATM pour leur expression la hausse aprs DD
(addition de la drogue radiomimtique neocarzinosta-
tin (NCS) des broblastes embryonnaires de souris
(MEF)). Laction dATM nest pas transcriptionnelle,
la protine active par la cassure de lADN venant
phosphoryler KSRP, une protine du complexe Dro-
sha (aussi du complexe Dicer en fait) et augmentant
par l sa capacit de recrutement des prcurseurs de
miRNA (DIAIII.6). On voit dans cette mme gure que
la MAP-kinase ERK est aussi phosphoryle en rponse
DD et phosphoryle TRBP (une RNA-binding protein
de Dicer), contribuant ainsi la gnration de miRNAs
via un processus non transcriptionnel. Il est vident
et nous allons y venir dans un instant que cela na
de sens physiologique que si les miRNA rgulent eux-
mmes lexpression de protines impliques dans la
rparation de lADN ce qui est indiqu par les ches
activatrices et inhibitrices en retour (DIAIII.6).
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Pour la HR, BRAC1 se xe certains prcur-
seur de miRNAs, les pri-miRNAS qui sont les
produits de transcription primaire avant toute
maturation, et interagit avec Drosha et dautres
protines du complexe, ce qui facilite la matu-
ration des miRNAs (DIAIII.6 gauche). BRAC1
a aussi un rle rpresseur de la transcription
de certains miRNAs (dont miR-155), via une
interaction avec HDAC2 et la dactylation des
histones H2A et H3 au niveau du promoteur de
ce miRNA (DIAIII.6, panel de droite). Je vous
rappelle en effet que la dactylation des his-
tones joue un rle rpresseur sur la transcrip-
tion. linverse on peut avoir une activation de
la transcription induite par le DD (mir-21) via
lactivation de NF-kB. Bref, pour les auteurs de
cet article, une part importante de la rponse
DSB pourrait tre prise en charge travers la
rgulation des miRNAs, soit leur augmentation
(rpression des rgulateurs ngatifs de la rpara-
tion) soit par leur diminution (augmentation des
rgulateurs positifs). Cet effet rgulateur impor-
tant sur les deux types de rparation (NHEJ et
HR) est illustr dans la DIAIII.7 o sont lists
certains miRNA qui antagonisent soit la rponse
NHEJ (gauche) soit la HR (droite).
On peut dvelopper en reprenant la distinc-
tion entre sensor (sentinelles) et mediator
(mdiateurs) dune part et effector (effecteurs)
de lautre. Les protines de la premire catgo-
rie sont actives immdiatement par la lsion
de lADN. Parmi elles on range, je le rappelle
(DIAIII.8), les complexes MRN (MRE-11, RAD50,
NBS1) et Ku70-Ku80, plus 53BP1. Les mRNAs
encodant les DSB sensors ont des parties non
codantes 3 terminales trs longues (par exemple
1101 bases pour Ku80 ou 2246 pour NBS1 (sous
unit de MRN) ce qui laisse beaucoup de place
pour lappariement des miRNAs qui induit un blo-
cage de la traduction (parfois une activation) voire
une dgradation de lARN messager (partie droite
de la DIAIII.8). Je rappelle en effet que lactivit
des miRNA exige une hybridation avec la rgion 3
terminale de lARN messager.
Ces considrations doivent attirer notre atten-
tion sur les effets de dose. En effet, des modi-
cations mesures dune protine, ici dun sensor/
mediator, telles quelles peuvent tre induites via
une rgulation post-transcriptionnelle reposant sur
lintervention dun miRNA, peuvent avoir des effets
importants sur la DDR. Cette rgulation a des effets
contradictoires (bnques ou malques) selon les
systmes puisque, pour une tumeur, nous aurons
intrt ce que la rparation ne se fasse pas ou
mal et que la cellule entre en apoptose, alors que
pour un neurone, sa survie est prfrable sauf si son
fonctionnement devient lui-mme par trop dltre,
en tout cas plus dltre que sa disparition, ce qui
peut arriver.
Les mdiateurs (aprs les sentinelles) ont pour
fonction importante la rgulation post-traduction-
nelle (phosphorylation trs certainement) de leurs
effecteurs et leur recrutement sur les sites de rpa-
ration. Les kinases ATM ou DNA-PK qui ont ce type
dactivit sont fortement rgules par les miRNAs
comme cela est illustr sur la DIAIII.7 pour miR-18a,
100, 101 et 421. Sur cette mme DIAIII.7 on voit
aussi que BRAC1 est cible de plusieurs miRNAS et
BRAC2 de miR-1245. On ne voit pas, en revanche
que H2AX est une cible de miR-24 et miR-138.
Nous allons continuer sur le thme des ARN
non codants en faisant limpasse sur nombre
dentre eux et en nous concentrant pour un ins-
tant sur les piRNA dont nous savons depuis les
deux dernires annes quils rgulent lexpres-
sion des rtrotransposons et peuvent donc, de
ce fait, rguler la formation de cassures double
brin. Un bref rappel du cours de lanne 2011
va vous remettre en mmoire ce que sont les
lments transposables. La DIAIII.9 vous rap-
pelle tout dabord que les lments transpo-
sables constituent de lordre de 45% du gnome
humain. Ces squences, distribues en sous-
types distincts, quand elles sont mobilises
peuvent sauter dune rgion du gnome une
autre et induire des modications irrversibles
du gnome. La DIAIII.10 rsume lextrme un
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certain nombre de donnes. Dabord (en haut
gauche) le fait que cette mobilisation, dcou-
verte par Barbara McClintock qui sintressait
la varigation des pigments des grains de lpi
de mas, se produit sous leffet de lenvironne-
ment et quelle conduit des modications irr-
versibles, nous lavons dit, de la structure de la
chromatine.
En bas gauche, il est illustr que les transpo-
sons de la famille des LINEs sont transcrits sous
la forme dun ARN polycistronique qui code pour
deux protines ORF1 et ORF2. ORF1 a une fonc-
tion packaging protgeant le transcrit et permet le
transport de cette particule dans le noyau. ORF2
porte deux fonctions, une fonction de transcription
rverse (je refais un ADN partir de lARN) et une
fonction endonuclase qui coupe un brin dADN.
la suite de ces deux vnements le nouveau
fragment dADN est insr au site de coupure,
ce qui amplie llment transposable et introduit
ventuellement une mutation. En haut droite est
illustr le fait quORF1 et ORF2 peuvent aider la
mobilisation dune autre classe dlments trans-
posables, les SINEs qui quand ils sont transcrits
ont besoin de ORF1 et ORF2 des LINEs pour se
rintgrer dans le gnome, agissant ainsi en para-
sites des LINEs. Pour complter nos informations
sur les LINEs, ils sont pour la plupart fossiliss, ce
qui veut dire que des mutations les empchent de
sauter, mme si leur transcription, sans rinsertion,
peut avoir une action rgulatrice de lexpression
gntique (ils agissent alors comme de longs ARN
non codants, dont nous connaissons la fonction
rgulatrice de la transcription. On estime le nombre
de LINEs sauteurs 100 chez sapiens et3000
chez la souris. Finalement, je rappelle que la trans-
cription des LINEs est sous le contrle rpresseur
du complexe Piwi-piRNA, PIWI tant une protine
qui se xe un petit ARN double brin non codant
piRNA (en bas droite) et rprime la transcrip-
tion des LINEs en se xant HP1 (une protine
de lhtrochromatine rgion peu active de la
chromatine sur laquelle je reviendrai la semaine
prochaine).
Enn en bas droite nous avons les informations
les plus importantes agrandies dans la DIAIII.11:
(i)le complexe Piwi-piRNA qui est maintenu actif via
une phosphorylation par la prsence de la protine
de choc thermique HSP90 a une activit cytoplas-
mique de type dgradation de lARN et inhibition de
la traduction, exactement comme un miRNA,
(ii)ce mme complexe dans le noyau interagit avec
des protines de la chromatine (HP1 en particulier)
et exerce un effet rpresseur, tout particulirement
sur lexpression des LINEs (je viens de le rappeler),
rpression qui passe par la mthylation de lhistone
H3 (sur la lysine en position 9 de sa queue C-termi-
nale) et celle des CpG dans lADN. Cette liaison
HP1 est particulirement intressante car HP1 fait
le lien entre un rcepteur de la lamine B et lADN
de lhtrochromatine. Je ne vous demande pas
de comprendre pour linstant, mais de garder dans
un coin de votre mmoire jusqu la semaine pro-
chaine, que les LINEs sont normalement silencieux
du fait de leur localisation dans lhtrochromatine,
rgion peu active sur le plan transcriptionnel et
localise sur les pourtour du noyau essentiellement,
donc proximit des lamines. De nouveau, cest du
chinois aujourdhui mais la semaine prochaine nous
aurons appris le chinois.
Pour ce dernier point essentiel pour notre rexion
sur la longvit crbrale (mme si vous ne voyez
peut-tre pas le lien ce stade), cela signifie que
les piRNAs lis PIWI (famille Argonaute) empche
la transposition, mais surtout, et linverse, quune
inactivation du complexe PIWI/piRNA libre lexpres-
sion des LINEs au niveau de lhtrochromatine avec
toutes les consquences que cela peut avoir sur lex-
pression gntique (les ARN des LINEs rgulent les
mthylations du gnome) et la stabilit des gnomes,
cause des insertions qui accompagnent la rtro-
transposition. Je ne reviens pas ici sur les effets posi-
tifs sur le plan adaptatif et volutif car nous en avons
parl abondamment il y a deux ans. Nous allons
plutt discuter des effets ngatifs en rappelant que
linactivation de Piwi et donc la drpression de la
transcription des lments mobiles est induite par les
stress, en particulier par le stress oxydatif.
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Dans leur revue rcente, Peng & Lin (Current
opinion in Cell Biology, 25:190-194, 2013) rap-
pellent que de nombreux travaux, sur le modle
de la Drosophile essentiellement, ont tabli que
des mutations de gnes impliqus dans la biog-
nse des piRNA conduisent une augmentation
de la transposition et des lsions de lADN dans
les cellules germinales (il y a seulement deux ou
trois ans, tous les travaux sur la rtrotransposition
taient concentrs sur les cellules germinales et il
paraissait impossible que les LINEs soient exprims
dans les cellules somatiques). Mais il est aussi bien
dmontr que Piwi et son homologue Aubergine ont
un rle important dans la rgulation pigntique et
que les complexes Piwi-piRNA jouent un rle dans
le silencing transcriptionnel et sont requis pour
la formation de lhtrochromatine (interaction non
seulement avec HP1 mais aussi avec Polycomb qui
est un rpresseur pigntique). Par ailleurs, Les
orthologues de Piwi chez la souris (Mili et Miwi2)
rgulent la mthylation de lADN. Bref, les donnes
convergent pour suggrer une rpression de la
transcription et un maintien dune htrochroma-
tine silencieuse dans la ligne germinale (mais pas
seulement comme vous lavez sans doute compris).
Comme neurobiologistes nous interrogeant sur
la longvit crbrale, nous sommes plus intres-
ss ici par cette rgulation somatique rcemment
dcouverte que par ce qui se passe dans les cellules
germinales. Des donnes rcentes suggrent que
les piRNAs rgulent lexpression de CREB2 dans
les neurones dAplysie avec un effet sur la mmoire
long terme, dcouverte du groupe dEric Kandel
que je vais dtailler dans un instant. Ces donnes
sont mettre en regard de la forte concentration du
systme nerveux (par exemple 75 000 squences
dans lhippocampe) en structure piRNA-like (une
uridine en 5 et une adnosine en position 10,
plus une mthylation en position 3). Mme si ce
nombre global est de 10 100fois infrieur celui
des transcrits piRNA dans les gonades, cela nem-
pche pas de nombreux auteurs de sintresser au
lien possible entre LINEs, cassures de lADN et vieil-
lissement du systme nerveux.
Je ne vais pas me lancer dans la description
dtaille des articles qui sont parus sur ce thme au
cours des dernires annes et dont un chantillon
reprsentatif est rappel sur la DIAIII.12. Les trois
couleurs soulignent trois aspects diffrents, mme
sils se recouvrent. Un cadre rouge indique que
les lments transposables ne sont pas exprims
seulement dans les lignes germinales mais aussi
dans la ligne somatique et quils y jouent proba-
blement un rle physiologique. En vert est indiqu
laspect dltre de lexpression incontrle de ces
lments, tout particulirement linduction de cas-
sures double brin. Enn en bleu nous avons trois
articles qui indiquent que des agents dltres, dont
les superoxydes, induisent la rtrotransposition.
Je vais insister un peu en partant de la revue
de St. LaurentIII et al. (Mechanisms of Ageing and
Development, 131: 299-305, 2010) qui replace
la question des lments transposables dans le
contexte de la longvit. Les auteurs rappellent que
le vieillissement constitue un facteur de risque pour
les maladies les plus graves et que cela est en partie
du laccumulation des lsions de lADN et, aussi,
des altrations plus globales de la structure de la
chromatine, les deux choses tant probablement
lies puisque quune altration globale de la chro-
matine induit des transcriptions illgitimes, dont trs
probablement, celle des rtrotransposons.
Cest particulirement intressant quand on
considre, et jaurais sans doute d le prciser plus
tt, que nombre des maladies neurodgnratives,
Alzheimer, Parkinson ou Huntington, mme quand
elles sont dorigine gntique pure (ce qui est tou-
jours vrai pour la maladie de Huntington, mais
reconnu pour 5% seulement des cas dAlzheimer
et de Parkinson), ne se dclare pas avant un ge
relativement avanc, ce qui conrme que le vieil-
lissement est un vritable facteur de risque. Ces
maladies, je lai souvent dit ici, nexistent pas dans
les pays o lesprance de vie nexcde pas 50ans,
ce quon eut considr comme une esprance nor-
male dans nos pays dvelopps, il y a seulement
une centaine dannes.
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Comme nous lavons entraperu au dbut du
cours (DIAIII.13), plusieurs causes de lsions ont t
identies, comme lexcs calorique ou le stress oxy-
datif. Mais ce qui semble acquis est que toutes ces
causes, aussi diverses soient-elles, convergent vers
une altration de lADN et un affaiblissement des
systmes de rparation, ce qui au passage justie
le temps que nous y passons. Parmi les lments
endognes qui altrent lintgrit des gnomes,
pouvons-nous inclure les rtrolments? Telle est
la question pose par ces auteurs. Les SINEs sont
mobiliss par les LINEs, ou plutt je viens de le rap-
peler en sont les parasites puisquils utilisent ORF1
en ORF2 encods par les LINEs. De ce fait, je tache-
rai de men tenir aux LINEs tout en vous demandant
de garder en tte que LINEs et SINEs sont lis. Pour
ce qui est des humains, on a dnombr environ
500000lments LINEs dans le gnome mais, je
le rpte, la plupart sont fossiliss et seule une cen-
taine sont encore actifs (3000 chez la souris).
La DIAIII.14 dans sa partie gauche dcrit assez
bien le mcanisme de rtrotransposition. Il y a
dabord une reconnaissance du site dinsertion par
le transcrit LINE et nous ne savons pas ce jour
quels sont les facteurs qui dterminent ce site sinon
la squence 5TTTTAA3 (en vert dans la gure), ou
mme sil y a des sites prfrentiels dinsertion (des
hots spots). Puis lendonuclase encode par ORF2
fait une premire coupure entre leT et leA et lARN
du LINE (L1) shybride par sa queue 3AAA la
squence TTTT ainsi dgage. La reverse transcrip-
tase de ORF2 permet alors une longation de lADN
qui copie le brin ARN de L1 (rverse transcription,
en bleu dans la gure). Le DNA nosynthtis est
alors copi (formation dun brin complmentaire,
donc dun double brin) et linsertion de ce double
brin ncessite une deuxime cassure et une ligation.
Le schma de droite sur la mme DIAIII.14
montre que peut tre transcrit soit le full length (FL)
messager bicistronique encodant ORF1 et ORF2,
soit seulement ORF2. Dans les deux cas, la trans-
cription de ORF2 est sufsante pour gnrer des
cassures double brin (ORF2 est une endonuclase)
qui saccumulent dans le gnome, sauf rparation.
Dans les deux cas, cela peut induire des modica-
tions de la chromatine et des changements dex-
pression gntique, mais aussi des mutations asso-
cies la rparation des DSB induits par linsertion
en particulier si cest le systme NHEJ (indle) qui
est utilis ce qui est toujours le cas dans les cellules
post-mitotiques et parfois le cas dans les cellules en
division. Et mme sil y a moins derreurs quand les
cellules en division utilisent la recombinaison homo-
logue, le fait davoir des squences identiques rp-
tes dans le gnome induit des appariements ill-
gitimes entre rgions distance (le gnome est trs
mobile, rappelez-vous) et introduit des variations
en nombre de copies de certains gnes (dltions
ou copies supplmentaires), source importante de
dsordres physiologiques comme sen souviennent
sans doute ceux qui ont assist aux cours des deux
annes prcdentes.
Dans ces conditions, on comprend labondance
des mcanismes qui ont t slectionns et ont
pour effet de contrler lexpression des lments
transposables (DIAIII.15). Tout dabord la rgulation
pigntique de leur expression et la formation de
lhtrochromatine. La mthylation de lADN joue
un rle important et la mesure de cette mthyla-
tion au niveau des promoteurs de L1 rvle entre
20et 100% de mthylation sur des CpG. De faon
attendue, cette rgulation pigntique peut saf-
faiblir avec lge, par exemple travers loxydation
des CpG. Un autre mcanisme de rgulation est
la polyadnylation prmature lintrieur dun
transcrit codant (ORF2 pour le cas prsent dans
la DIAIII.15). Cette polyadnylation prmature fait
que les enzymes encodes par ORF2 (endonu-
clase et rverse transcriptase) ne sont pas fonc-
tionnelles empchant la prolifration du transpo-
son (mais la partie transcrite peut avoir une activit
rgulatrice de lexpression gntique, je le rappelle).
ces deux mcanismes de contrle on peut ajou-
ter les antisens endognes et linterfrence ARN. La
mme DIAIII.15 illustre comment lhybridation entre
le sens et lantisens gnre des ARN interfrentiels,
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des miRNA et des piRNA qui ont une activit rpres-
sive dont une des modalits, reprsente ici par la
che verticale en retour, est de renforcer la mthyla-
tion des promoteurs des LINEs. Ces diffrents mca-
nismes sont particulirement actifs dans les cellules
adultes. Dailleurs, comme je lai indiqu plus haut, le
consensus prvalait dune rtrotransposition essen-
tiellement active au cours de lembryogense, vision
qui a peu peu volu puisque lexpression de L1 est
admise chez ladulte, y compris dans des tissus post-
mitotiques (en G0). Mais il reste que cette expression
se fait en rponse au stress cellulaire, en particulier
en rponse lexposition de nombreux agents qui
provoquent des lsions de lADN. Une explication
possible ce phnomne paradoxal est que la fonc-
tion initiale de la transposition serait dinventer des
solutions gntiques une situation qui met lorga-
nisme ou la cellule en danger. Je vous renvoie une
fois de plus aux cours des annes prcdentes, mis
nous pouvons en discuter si vous vous dcidez
poser des questions.
Il existe donc une contradiction apparente entre
ladaptabilit que permettent les lments transpo-
sables pour lespce et le danger quils reprsentent
pour la survie des individus. On ne peut donc enti-
rement liminer lhypothse que la longvit humaine
est le rsultat dune rpression de la transposition
(100LINEs actifs contre 3000chez la souris) et la
fossilisation progressive des lments transposables.
Un schma amusant est propos droite dans la
DIAIII.15 o il est illustr (hypothtiquement) que le
stress induit lexpression de L1 avec un choix entre
ladaptation par variation gntique (au niveau des
cellules germinales ou des cellules souches soma-
tiques) et snescence aprs lsion de lADN. En tout
cas, il est certain que, chez sapiens, une longvit
prolonge est incompatible avec une forte expression
des rtrotransposons, tout particulirement dans des
cellules adultes, voire en G0.
Avant de clore sur cette histoire de transposi-
tion, je voudrais vous dcrire le contenu de deux
articles. Le premier article, du groupe de Kandel
(Rajasethupathy et al., Cell 149: 693-707, 2012),
dmontre une activit physiologique de la trans-
position et celui de Li et al. (Nature Neurosci. 16:
529-532, 2013) dmontre, linverse, une activit
pathologique de cette mme transposition. Larticle
de Kandel (qui donnera une confrence ici mme
le 18 dcembre 2013) part dune question que
nous ne cessons de nous poser depuis louverture
de la chaire des Processus morphogntiques qui
est celle de la contradiction, forcment apparente
mme si non rsolue, entre le turnover rapide des
structures biologiques, en particulier les ARN et
les protines, et une certaine forme de stabilit au
niveau de notre mmoire. Les auteurs rappellent
trois hypothses, celle des prions, ces protines
dont le changement de conformation infectieux
transfert une information aux nouvelles protines
en leur imposant ce changement de forme, celle
des boucles enzymatiques de feedback positif qui
modient les nouvelles protines et reproduisent les
modications acquises (phosphorylation, ubiquitina-
tion, etc.) et enn les modications pigntiques
qui, au niveau du gnome, permettent de stabiliser
une information, par exemple sous la forme dune
mthylation de lADN.
Cest ce dernier mcanisme qui nous intresse
ici (nous oublierons les deux autres) puisquil sagit
de mmoire stable et de lien entre ce qui se passe
la synapse et ce qui se passe dans le noyau au
niveau de modications pigntiques plus stables,
voire irrversibles qui permettent de rendre compte
dune mmorisation de longue dure. Il me faut
dabord vous dcrire brivement le modle qui est
celui de lapprentissage de la rtraction des bran-
chies. La DIAIII.16 (o nous dcouvrons ce modle
de mollusque marin) vous rsume rapidement le
fait que la libration de srotonine (5HT) par un
interneurone facilitateur facilite lapprentissage
du rexe de rtraction des branchies driv par le
motoneurone. Ce modle a t la base des nom-
breux travaux de lquipe qui ont valu Eric Kan-
del de recevoir le prix Nobel de Mdecine ou Phy-
siologie. Ce nest cependant que plus rcemment
que les auteurs de larticle en question ont observ
la prsence de piRNA dans le neurone sensoriel
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qui tablit un contact avec le motoneurone. Nous
verrons que le complexe Piwi/piRNA conduit la
mthylation du promoteur de CREB2, un facteur
de transcription rpresseur de la mmorisation
long terme et le fait en shybridant avec le transcrit
naissant.
Mais reprenons les choses leur dbut. Dans
leur recherche (initialement de miRNA dAplysie) les
auteurs tombent sur des ARN un peu plus grands
que prvu (28nt au lieu des 22 attendus pour des
miRNA) avec unU en 5 pour 60% dentre eux. Si
la plupart de ces piRNA sont, cest normal, enrichis
dans les gonades, plusieurs sont prsents dans le
systme nerveux. La vrication de la mthylation
en 3 caractristique des piRNA permet de sassu-
rer quil ne sagit pas dun artefact. La DIAIII.17
dmontre que les deux protines qui lient respecti-
vement les piRNA et le miRNA (gel dimmunopreci-
pitation) appartiennent bien aux familles argonautes
et Piwi. Sur cette mme DIAIII.17 on constate que
Piwi est fortement exprim dans le noyau de la cel-
lule sensorielle, la fois par immunocytochimie et
par fractionnement subcellulaire.
Pour tudier si ces piRNAs ont une rle rgula-
teur de la mmoire synaptique, les auteurs ont cribl
ceux dont la concentration tait modie en pr-
sence de srotonine, un neuromdiateur libr par
linterneurone facilitateur qui dans ce systme
module de faon importante lapprentissage et la
mmoire. Lexpression de plusieurs piRNA, dont
piR-4 et surtout piR-15, est fortement augmente
(DIAIII.18) et le rle de ces piRNA a t test par
une stratgie antisens anti-Piwi driv par la penetra-
tin). On doit comprendre que dans cette stratgie
comme Piwi se xe tous les piRNA, ce sont tous
les piRNA qui sont touchs et pas seulement ceux
dont lexpression est augmente. Le signal de sortie
est la facilitation long terme induite par la sroto-
nine (5pulses de 5HT). Je rappelle que la facilita-
tion long terme signie que la mme rponse peut
tre obtenue avec un signal plus faible. La DIAIII.18
qui rappelle le schma dinnervation donne aussi
les rsultats de la perte ou du gain de fonction PIWI
dans la LTP. Clairement un antisens (rouge) et non
un brouill (vert) diminue considrablement la
mmorisation quand le gain de fonction par expres-
sion de Piwi-GFP (jaune) laugmente.
Cette exprience a t suivie du criblage de nom-
breux gnes de plasticit (DIAIII.19) pour aboutir
la dmonstration (en haut gauche) que la perte
de Piwi est suivie dune forte augmentation de la
transcription et de la traduction de CREB2 (cyclic
AMP responsive element binding protein 2 qui se
xe sur certains promoteurs de gnes rguls par
lAMPc) dont on connat, des travaux antrieurs, le
rle inhibiteur sur la mise en place de la LTP dans
ce modle (CREB2 bloque la mmorisation). lin-
verse (en bas gauche et en jaune) la surexpression
de PIWI rend le systme sensible un seul pulse de
5HT quand 5 pulses sont normalement demands
pour induire la mmorisation.
Du fait de la fonction connue du systme PIWI/
pi sur la mthylation (rappel tout en haut droite),
les auteurs ont utilis RG108, un inhibiteur de la
DNA mthyltransfrase (DNMT) et effectivement
observ que cet inhibiteur a un fort effet antago-
niste sur la rpression de lexpression de CREB2
par la 5HT (Fen haut droite). Cet effet antagoniste
de la rpression est corrobor avec une perte de la
facilitation (en bas droite, rouge).
Do ltape suivante: la recherche des promo-
teurs du gne cible (CREB2) et des CpG qui sont
modis dans cette rgion et la dmonstration dune
inhibition de la transcription probablement lie
une mthylation dun site promoteur proximal. En
effet comme lillustre la DIAIII.20, la prsence de
5HT hypermthyle le promoteur proximal et cette
mthylation (MSP pour Methy Specific Primers)
est augmente en prsence de 5HT et perdue si
linhibiteur des mthyltransfrases est ajout, avec
mme une identication des quatre sites principaux
qui prsentent 100% de mthylation en prsence
de 5HT. La suite de larticle consiste dmontrer
que cest bien le complexe PIWI/Pi qui rgule la
mthylation et quil le fait en shybridant au mRNA
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naissant selon le schma de droite sur cette mme
DIAIII 20. Jattire ici votre attention, celle de certains
dentre vous tout particulirement, sur le fait que la
squence du piRNA peut nous donner une informa-
tion sur le gne dont lexpression est rgule.
Ce qui ressort de cette lecture est trs intressant
car larticle donne au complexe PIWI/piRNA une
fonction plus large que celle de la seule rpression
de la transcription des LINEs, pour laisser entre-
voir la possibilit dune action rgulatrice dont une
modalit serait la complmentarit entre le piRNA
et le transcrit du gne rprim par le complexe. Cela
ouvre des perspectives intressantes et suggre de
partir des piRNA exprims dans une cellule donne
pour identier des cibles pigntiques de PIWI, ou
(pourquoi pas?) dautres facteurs susceptibles de
lier les piRNA et de les transporter au noyau.
Je ne crois pas que nous nous soyons gars
puisquil sagit, aprs tout, de mmoire pigntique
et de la faon dont lexprience laisse sa trace dans
les neurones, donc de la faon dont cette trace sef-
face ou se perd, ce qui peut tre bon ou mauvais,
cest selon. Mais pour revenir plus directement sur le
dsastre je vais maintenant commenter un autre
article, celui de Li et al. (Nature Neurosci. 16: 529-
532, 2013) dont le titre est particulirement voca-
teur: Activation of transposable elements during
aging and neuronal decline in Drosophila. Les
auteurs ont examin lexpression des transposons
chez la drosophile par RT-PCR dans la tte (le cer-
veau et tout particulirement les mushroom bodies)
au cours du vieillissement normal entre des adultes
de 2 4jours, 14, 21et 28jours. Je rappelle que les
mushroom bodies (DIAIII.21), identis en 1850 par
Flix Dujardin sont impliqus dans lapprentissage et
la mmoire chez les insectes, tout particulirement,
mais pas seulement, la mmoire des odeurs.
Les lments choisis sont R1 et R2 qui appar-
tiennent la famille des LINEs et gipsy, de la famille
des transposons LTR (des rtrovirus domestiqus
qui constituent chez sapiens 8% du gnome, contre
17% pour les LINEs, DIAIII.21). Je ne mtends
pas sur cette distinction discute au cours des
annes prcdentes, mais dans le deux cas, il sagit
de rtrotransposition, donc dlments mobiles).
Le rsultat de cette tude est quon observe une
augmentation notable de ces transcrits (DIAIII.21a)
au cours du vieillissement et de lexpression de la
protine ENV (glycoprotine denveloppe) encode
par gipsy (DIAIII.20b). Cette expression tardive
saccompagne dune capacit de rintgration dans
les mushroom bodies qui peut tre suivie par
lexpression de la GFP (DIAIII.20, en bas). Donc la
rtrotransposition augmente avec lge.
Ago2 (Argonaute2) est la protine de la famille
PIWI qui rprime la rtrotransposition dans les tissus
adultes. Do lutilisation de mutants de Ago2 pour
comprendre le rle ventuel de ces transpositions
dans le processus de vieillissement. La premire
observation est que R1, R2 et gypsy augmentent
avec lge et que la mutation 51B dans Ago2 aug-
mente la transcription de R2 (pas de R1) et de gypsy,
la mutation 414 ayant un effet faible sur R2 mais fort
sur gypsy (voir pour lexpression de ENV en uo et en
western blot) (DIAIII.22). Sur le plan comportemental
une mesure de la mmoire long terme a t faite
chez les diffrents phnotypes. On remarque une
absence de dclin comportemental entre le jeune
et lg dans la situation WT (enn une bonne nou-
velle), avec une forte diminution chez les deux dans
le mutant 414 (diminution encore plus forte chez les
animaux gs, ce qui est intressant). Quant la sur-
vie de la Drosophile, elle diminue signicativement
chez les deux mutants. Ces expriences suggrent
que la drpression de la rtrotransposition pourrait
avoir un effet dltre sur les performances cognitives
des vieilles mouches.
Mais videmment ce ne sont que des mouches
et je vais clore cette section avec un travail du
mme groupe sur les humains et les souris (Li et
al., PLOS One 7, 9, e4409, 2012). Partant de la
constatation que lexpression dlments trans-
posables (TE) spcifiques a t observe dans
plusieurs dsordres de type neurodgnratif, les
auteurs ont dmontr que nombre des transcrits
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de TE se lient une RNA-binding protein appele
TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) qui joue un
rle dans la sclrose latrale amyotrophique (SLA)
et les dgnrescence fronto-temporales (FTLD).
Do les expriences et hypothse qui suivent sur
le rle des TE et de leur rpression dans la rgu-
lation de la neurodgnrescence et du vieillisse-
ment chez les mammifres.
Laccumulation dinclusions cytoplasmiques
contenant TDP-43 est une caractristique de plu-
sieurs maladies neurodgnratives dont lALS, la
FTLD et lAD. Des mutations dans cette protine
sont lorigine de quelques cas de formes familiales
ou sporadiques dALS. Les auteurs ont donc repris
les donnes dj publies sur les ARN immunopr-
cipits avec un anti TDP-43 (rat et humain) et trouv
un enrichissement spectaculaire en squences dri-
ves de chaque classe de TE (DIAIII.23, en haut
gauche). En comparant entre humains sains et
humains avec une dgnrescence fronto-tem-
porale (FTLD), les auteurs constatent un enrichis-
sement presque gnral chez les individus sains
(DIAIII. 23 en haut droite). Ces rsultats pouvaient
suggrer chez les patients une diminution de la
rgulation des TE. Cette hypothse a t teste de
deux faons diffrentes.
Dans un premier temps les auteurs ont ana-
lys le nombre de reads de squences rp-
titives (les TE sont des squences rptitives)
dans des donnes de squenage dARN partir
de modles murins de pathologie TDP-43. Deux
modles ont t utiliss, un de gain de fonction
de TDP-43 humaine dans une souris transgnique
et lautre de perte de fonction (oligonuclotides
antisens) dans le striatum de souris. Le gain de
fonction de cette protine qui sagrge est cens
avoir un effet dominant ngatif sur la fonction
normale de TDP-43 et donc ne pas diffrer, par
ses effets, dune perte de fonction. Dans les deux
modles (DIAIII.23, en bas) on constate en effet
une forte augmentation de 86 (gain de fonction) et
223 (perte de fonction) de lexpression des TE de
toutes les familles.
Pour conclure ce cours, le message est trs
simple. Avec le temps, la modication globale de
la structure de la chromatine est lorigine dune
drgulation de lexpression gntique qui aug-
mente le nombre des cassures de lADN en mme
temps quelle diminue lefcacit de la rparation.
Cest pout cette raison que le cours suivant sera
consacr au rapport entre architecture du noyau
et instabilit gntique.