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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

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Apéndice

Guía de trabajos prácticos

CONTENIDO

1. Medios de cultivo y esterilización

2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

3. Fijación simbiótica de N 2 en leguminosas

4. Microorganismos del suelo

5. Inhibidores y desinfectantes

6. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas

7. Morfología microscópica de hongos

8. Identificación de mohos toxigénicos

9. Micorrizas

10. Microorganismos del agua

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TRABAJO Nº 1. Medios de cultivo y esterilización

Objetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composición varia según el tipo de organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio. Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del uso.

Introducción

Nutrición

Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el punto de partida para las reacciones metabólicas que los convierten en constituyentes celulares. Hay nutrientes necesarios sin los cuales una célula no puede crecer, y otros útiles pero no indispensables. La primera división en las categorías nutricionales tiene en cuenta dos parámetros: la naturaleza de la fuente de energía y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los organismos que usan la luz como fuente de energía se denominan fotótrofos y los que utilizan fuentes de energía química se denominan quimiótrofos. Los que emplean CO 2 como principal fuente de carbono se definen como autótrofos, pero los que utilizan compuestos orgánicos para el mismo fin se llaman heterótrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de minerales para su crecimiento, y los más comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy pequeñas cantidades y no puede ser sintetizados por la célula.

Diseño de un medio de cultivo

En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad.

Medio 1 agua

1 L

Medio 2 agua

1 L

Medio 3 agua

1 L

cloruro de amonio

1 g

peptona o triptona

5 g

peptona de soja

10 g

fosfato dipotásico

1 g

extracto de carne

3 g

glucosa

10 g

carbonato de calcio

1 g

agar

15 g

extracto de levadura

2,5 g

sulfato de magnesio

10 mg

agar

15 g

sulfato

ferroso

10 mg

cloruro de calcio sales inorgánicas de Mn, Mo, Cu, Co, Zn

10 mg 0,02 mg de cada uno

Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que proporcione las sales inorgánicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta solución puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energía, una de nitrógeno y algún factor de crecimiento requerido. El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes autótrofas que usan el dióxido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energía. El medio 2 es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias heterótrofas que obtienen energía y también carbono de aminoácidos y péptidos, pero no requieren factores de crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgánicos y factores de crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras. Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo específico es, en cierto modo, selectivo para él. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales

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tales como el suelo, empleando medios selectivos. Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comúnmente el agar que es obtenido de algas pero no es nutriente para la mayoría de los microorganismos. El gel de agar es firme a las temperaturas de incubación pero se convierte en líquido (sol) cuando se calienta a la temperatura de ebullición del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45ºC. Otra manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que están en la superficie. El extracto de carne es un extracto acuoso de músculo de bovino, concentrado hasta una consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como azúcares, aminoácidos y sales. El hidrolizado de proteína se obtiene por digestión de músculo con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de caseína (casitona, tripticase) o de proteina de soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes cuya concentración varía con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH.

Esterilización

Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de diferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtración, como en las cámaras de flujo laminar estéril, y de los líquido a través de membranas fltrantes u otro filtro. La destrucción de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o húmedo para el tratamiento de la mayoría de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones ionizantes para esterilizar plásticos deseartables. El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero no es un método eficaz de calentamiento porque el aire es un mal conductor del calor. En ausencia de humedad las formas más resistentes (endosporos bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160ºC durante una hora y media para morir. El vapor a presión es el procedimiento más efectivo de esterilización por calor húmedo. El vapor a una presión absoluta de 2,066 kg/cm 2 proporciona una temperatura de 120,6ºC que es mortal para los endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el tiempo de aplicación varía según el tiempo necesario para homogeneizar la temperatura en el material tratado.

para homogeneizar la temperatura en el material tratado. La presión absoluta a la que está sometido

La

presión

absoluta a la que está sometido el

material dentro del autoclave es igual a la presión leída en el manómetro sumada a la presión atmosférica del lugar. Como esta última varia con la altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la presión manométrica necesaria para llevar a cabo la esterilización en cada localidad, haciendo caso omiso de las graduaciones en temperaturas adicionadas al manómetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas alcanzadas en función del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volúmenes a 120,6ºC. La temperatura de ebullición del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos que se alterarían a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratado durante 30 minutos el primer día e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30 minutos el segundo día y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el tercer día. El tratamiento durante el primer día destruye las formas vegetativas, el período de

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice incubación germinación de muchos endosporos y las formas

incubación

germinación de muchos endosporos y las formas sensibles originadas mueren con el segundo calentamiento. Los endosporos que persistieron germinarán durante el segundo período de incubación y las células formadas morirán con el tercer calentamiento. Como se ve, la tindalización es efectiva únicamente cuando el medio a esterilizar es favorable para la germinación de los esporos. No destruirá los endosporos de anaerobios si la incubación no se lleva a cabo en condiciones de anaerobisis y tampoco destruirá a los endosporos del grupo termofílico. Teniendo en cuenta la cinética microbiana el fin práctico de la esterilización mediante un agente

la

permite

letal es lograr que la probabilidad de que el material tratado

contenga

tan

sólo

un

superviviente,

sea

muy

pequeña. Los procedimientos habituales de esterilización se proyectan siempre de forma que proporcionen un amplio margen de seguridad.

Filtración

Los microorganismos quedan retenidos por el pequeño tamaño de los poros del filtro y con algunos tipos de materiales filtrantes por adsorción sobre los mismos, además de la influencia del pH del líquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comúnmente en el laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 mm ó 0,2 mm, pero también suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado (sinterizado).

Procedimiento

Preparación del material de vidrio

Obturar con algodón la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzón. Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metálicos, o bien envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada. Tapar los tubos de ensayo con algodón prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el tapón sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete.

Esterilización por aire caliente

El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodón y/o envuelto con papel, se ubica en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura alcance 170ºC y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar según la carga. Se deja enfriar el aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire frío. Al

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terminar la operación, el algodón y/o el papel de diario tendrán un color tostado pálido. Desde los 150ºC ambos comienzan a amarillear, pero a los 180ºC pierden la propiedad de detener las bacterias y se forman residuos carbonosos más o menos antisépticos.

Control de la eficacia de la esterilización

Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos (cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento térmico, se le agrega un medio nutritivo líquido y se incuba a 30ºC durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilización, no habrá desarrollo bacteriano.

Preparación de medios de cultivo

La mayoría de las bacterias heterótrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado " agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un baño de agua hirviente o en el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar próximo a 7. Si se prepara sin agar se obtiene el medio llamado "caldo nutritivo". Los hongos suelen crecer más lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micológico" cuyo pH es aproximadamente 5,6, al que se le añadió extracto de levadura para que desarrollen aun los organismos exigentes en vitaminas. Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando sólo un tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodón, excepto cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se reúnen en cestos y se los cubre con dos o tres hojas de papel poroso donde se escribe con lápiz el nombre del contenido. Se cubren los matraces con un capuchón de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fácilmente. Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave.

Esterilización por vapor de agua a presión

En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullición

(96ºC a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presión, luego de la eliminación del aire por la espita o válvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm 2 por sobre la presión atmosférica promedio local (0,88 kg/cm 2 = 884 HPa), el agua hervirá a 121ºC. Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destrucción de toda forma de vida en volúmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prácticamente en materiales poco contaminados, calentando a 115ºC (0,84 kg/cm 2 de presión manométrica) durante 20 minutos. Los sólidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121ºC durante 30 minutos. Si el autoclave está muy cargado, o los volúmenes son mayores, es necesario prolongar el tiempo de calentamiento.

pueden

termofílicas, pero éstas no crecen a las temperaturas comunes de incubación (25 - 37ºC). Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el mechero. Cerrar la espita, o válvula de purga, recién cuando sale un chorro de vapor continuo pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar la presión, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la esterilización. Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manómetro vuelva a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa. Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresión producirla la ebullición violenta de los líquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre demasido tarde, el vapor se habrá condensado sobre los papeles y algodones, y se habrá acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado.

Con

estas

condiciones

de

tratamiento

sobrevivir

los

endosporos

de

bacterias

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Control de la temperatura de esterilización

Si

se alcanza la temperatura de fusión durante el proceso de esterilización, luego del enfriamiento

quedará una masa homogénea de ácido benzoico. También se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartón u otro material, tal como la compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta mezcla vira al gris después de 30 minutos a 100ºC, en 3 ó 4 minutos a 110ºC y en 30 segundos a 121ºC. Toma color negro si está expuesta más de 30 minutos a 110ºC y en 5 minutos a 121ºC.

Se coloca un tubito con ácido benzoico en polvo (p.f. 121ºC) junto al material a esterilizar

en polvo (p.f. 121ºC) junto al material a esterilizar Esterilización por filtración Se eliminan los bacterias

Esterilización por filtración

Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasándolas a través de membranas con poros de 0,2 ó 0,45 mm u otros filtros. La membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rígida, en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de Kitasato (ver figura 3) mediante un tapón de goma, para poder hacer un vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media, donde se coloca algodón. Se envuelve el conjunto con papel y se esteriliza en el autoclave. Después se ubica el disco filtrante en el embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vacío.

Control de la eficiencia de la filtración

Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a recipientes estériles y se incuban, uno a 30ºC y otro a 45ºC, durante 48 horas. Si se logró la esterilización no debe haber desarrollo microbiano.

Bibliografia

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Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998

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Stanier RY et al. Microbiología. Reverté, Barcelona, 1984

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Carpenter P, Microbiología, Interamericana, México, 1979

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TRABAJO N° 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos

Objetivo. Separar por métodos físicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural, de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una población (en el caso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho). Reconocer al microscopio las características generales de los microorganismos mediante preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material.

Introducción

Microbios uni y pluricelulares

Los organismos más sencillos son aquéllos que están constituidos por una sola célula. Como las células se miden en micrómetros (mm) estos organismos unicelulares caen dentro de la categoría general de microbios o microorganismos. La organización unicelular se observa en protozoos, algunas algas, levaduras y la mayoría de las bacterias. Un tipo más complejo de organización biológica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir de una sola célula, en estado maduro constan de varias células permanentemente unidas unas a otras de un modo característico, lo cual le confiere una forma típica al organismo. Así un moho esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de hifas se lo llama micelio.

Aislamiento, cultivo

Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiología clásica son el aislamiento o separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo condiciones de laboratorio. Estas operaciones son básicamente iguales para el estudio de las bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de células vegetales o animales (cultivo de tejidos). Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la superficie de un medio gelificado, todos aquéllos que puedan crecer sobre el mismo producirán colonias. La dispersión de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el mismo ambiente de los que crecen rápidamente. Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubación, poblaciones de bacterias y levaduras e individuos fúngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo.

Ambiente

Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decímetros de espesor. Los microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, están concentrados en la superficie y en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos vivos. Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensión de oxigeno suficiente, la temperatura necesaria y otros factores.

Oxígeno

Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiración aerobia para cubrir sus necesidades energéticas y se los denomina aerobios obligados. Entre éstos,

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algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los conoce como microaerófilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos sólo fermentan y son sensibles al oxigeno.

Crecimiento, colonia

En cualquier sistema biológico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de todos los constituyentes químicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicación celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del número de individuos, mientras que en los multicelulares lleva al aumento del tamaño del individuo. En el aislamiento se tomó una pequeña cantidad de células microbianas y al deslizar el asa sobre el agar se las distribuyó por la superficie. Durante la incubación la célula aislada se dividió repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo. El crecimiento de las poblaciones bacterianas está normalmente limitado por la desaparición de los nutrientes accesibles o por la acumulación de productos metabólicos tóxicos. Al describir una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevación y borde de la misma como se muestra en la figura 4.

Bacterias

La mayoría son organismos unicelulares que se multiplican por escisión binaria transversal. Se distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupación como se esquematiza en la figura 5. Algunas bacterias forman células de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo contenido de agua, son muy refringentes y se tiñen con dificultad.

de agua, son muy refringentes y se tiñen con dificultad. Los endosporos soportan el calor, la
de agua, son muy refringentes y se tiñen con dificultad. Los endosporos soportan el calor, la

Los endosporos soportan el calor, la desecación y algunas substancias químicas, muchos resisten a 100º.C durante unas 20 horas, otros sólo unos minutos a 90ºC Las bacterias móviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio óptico se los debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloración. Suele obs ervarse el movimiento bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio líquido entre cubre y portaobjetos. Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio delgado y en la mayoría de los casos células de multiplicación llamadas esporos.

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Coloraciones

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resulta difícil de ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la célula y el medio que la rodea, y la manera más simple de aumentarlo es utilizando colorantes. Las células generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teñirlas, para coagular el protoplasma en un proceso que se llama fijación. En el caso de las bacterias, la fijación por calor es lo más corriente, aunque también puede emplearse formaldehido, metanol o ácidos. La fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le sigue la tinción. La mayoría de los colorantes usados son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que actúa rápidamente sobre las bacterias y es útil para detectar bacterias en medios naturales, puesto que no tiñe la mayor parte del material extraño.

Tinción de Gram

Es un método diferencial de tinción para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta todas las células están coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el interior de las mismas. Después de añadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran (Gram-negativos) y otros no (Gram-positivos) según la estructura física de la pared, no por los constituyentes químicos pues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared químicamente distinta a las de las bacterias. Para poner de manifiesto las células incoloras se utiliza una coloración de contraste, tal como safranina o fucsina básica que tiñen de rojo a las células gram-negativas mientras las gram- positivas permanecen violetas.

Procedimiento

Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental

La técnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las características de estos últimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en baño da agua hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos. Incubar a 27—30ºC durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a 25-27ºC por 5 días la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo examinar las colonias microbianas presentes.

de ese tiempo examinar las colonias microbianas presentes. Aislamiento de bacterias esporuladas del suelo Calentar una

Aislamiento de bacterias esporuladas del suelo

Calentar una suspensión de suelo por 10 minutos en un baño de agua a 80ºC. Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante y dejar que se enfríe dentro de la zona de convección del mechero. Tomar una gota de la suspensión y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo haciendo las primeras estrías como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estrías con el asa vacía. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30ºC durante 48 horas.

Aislamiento de rizobios de nódulos radicales de leguminosas

Lavar la raíz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamaño, separarlos y colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la

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mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro veces, agitando enérgicamente, en sendos tubos de agua estéril. Para transferir los nodulos de un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada. Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas habían sido

flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estrías sobre la placa

del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30ºC.

El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de calcio 3 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g, rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115ºC durante 20 minutos.

Observación de las placas de aislamiento

El inoculo fue diluido progresivamente en cada estría sucesiva de tal manera que, después de la incubación en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias están bien aisladas a lo largo de las últimas estrías. Observar las características macromorfológicas de las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor, hacer una coloración de Gram para observar las células somáticas o de Wirtz para ver los endosporos.

Tinción de Gram

Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego de 1 minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol 96°. Lavar con agua y cubrir con una solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar el portaobjetos a la platina de un microscopio. Mirar a través del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto

colocar el objetivo de inmersión en aceite (100x) moviendo el revólver. Levantar el condensador pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el enfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma. Las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporción respecto al campo microscópico . La solución de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80

mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solución

de iodo según Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua.

Coloración de endospor os

Cubrir el extendido con solución de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operación luego de un minuto. Repetir el calentamiento dos veces más. Lavar con agua. Cubrir con solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Los endosporos se verán verdes y las células somáticas de color rojo anaranjado. Dibujar lo observado. La solución de verde de malaquita contiene 2 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80 mL de agua.

colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80 mL de agua. Selección y transplantes

Selección y transplantes de colonias

Elegir colonias de bacterias y hongos en las placas anteriores y repicarlas como se muestra

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en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35°C en la obscuridad, si se trata de hongos colocarlos a 25-27°C preferentemente donde reciban una iluminación diurna difusa para favorecer la esporulación.

a) cultivo de bacterias en aerobiosis

sobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con la mano izquierda. Quitar el tapón de algodón sosteniéndolo con el dedo meñique de la mano derecha. Pasar la boca del tubo por la llama del mechero. Introducir el asa, estéril y fría, en el tubo y extraer un poco de material microbiano. Volver a flamear la boca del tubo y colocar el tapón. Tomar el tubo con medio estéril, destapar y flamear como el anterior. Introducir el asa y depositar los microorganismos rayando en zig-zag la superficie del medio gelificado, con mucha suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del tubo y tapar. Flamear el asa. en medios líquidos. Proceder igual que en el caso anterior y depositar los organismos dentro del medio líquido.

y depositar los organismos dentro del medio líquido. b) cultivo de hongos El procedimiento para sembrar
y depositar los organismos dentro del medio líquido. b) cultivo de hongos El procedimiento para sembrar
y depositar los organismos dentro del medio líquido. b) cultivo de hongos El procedimiento para sembrar

b) cultivo de hongos

El procedimiento para sembrar levaduras es similar al empleado para bacterias. Para cultivar hongos se emplea un gancho, inserto en el mango de Kolle, que permite tomar los filamentos para transferirlos al nuevo medio. microcultivo. Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar en los bordes libres del trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un cubreobjetos, también flameado y enfriado. Incubar los microcultivos en una cámara húmeda, lograda poniendo algodón mojado bajo el soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado.

Observación de los cultivos en tubos macroscópica

Después de la incubación observar los cultivos a simple vista o con ayuda de la lupa y registrar en el informe las características morfológicas (ver figura 9). Evitar la agitación del medio líquido pues si ha crecido una película superficial, esta puede caer confundiéndose con el sedimento.

microscópica

Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en la llama o microondas, y colorearlo según el método de Gram. Suspender los hongos en agua, líquido de Patterson o colorante de Gueguén al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas separar los filamentos.

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El colorante de Gueguén contiene 0,1 g de azul de algodón y 0,1 g de Sudán III en 100 g de ácido láctico, además de 10 gotas de tintura de iodo. El líquido de Patterson se prepara mezclando 50 mL de solución acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30 mL de etanol 96º Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podrá utilizar el siguiente objetivo.

Medida del tamaño de los microorganismos

El método más práctico usa un ocular autoenfocable, con una escala arbitraria dividida en cien pequeñas partes iguales, a veces numeradas, la que debe calibrarse con la escala de 1 mm con cien divisiones de diez micrómetros cada una, grabada en un portaobjetos llamado micro-métrico (ver figura 11). Enfocar al portaobjetos y mover éste de modo que su escala quede paralela a la del ocular. Observar cual número de las pequeñas divisiones de 10 mm grabadas en el portaobjetos coincide con un número entero de las contenidas en el ocular. Calcular el valor en micrómetros correspondiente a una división pequeña de la escala del ocular mediante la regla de tres simple. Calibrar la escala del ocular para cada aumento del microscopio. Tener en cuenta que las rayas del ocular siempre tendrán el mismo espesor mientras que las del portaobjetos irán engrosándose al cambiar los objetivos.

portaobjetos irán engrosándose al cambiar los objetivos. Bibliografia o Hall GS et al. Methods for the

Bibliografia

o

Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International, Wallingford, 1996

o

Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Acción. Blume, Madrid, 1973

o

Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

13

TRABAJO Nº 3. Fijación simbiótica de N 2 en leguminosas

Objetivo. Observar las características macro y micromorfológicas de los nódulos radicales de leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada.

Introducción

Fijación simbiótica del nitrógeno molecular

Figura 12
Figura 12

Una de las simbiosis más importantes es la que se da entre leguminosas y bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium.

La infección de las raíces con una cepa adecuada de la bacteria (hay especificidad de huésped) conduce a la formación de nódulos radicales que tienen distinta forma según la planta hospedadora (figura 12). Los rizobios específicos entran en la raíz por el extremo de los pelos absorbentes que se retuercen en forma de báculo. Se forma en el pelo uno o varios tubos de infección dentro de los cuales los rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infección penetra en las células del córtex de la raíz. Algunas células de la raíz se dividen activamente produciendo un meristema. Los rizobios contenidos en el tubo de infección son liberados en el citoplasma de estas células meristemáticas donde adquieren una forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides. éstos son capaces de fijar el nitrógeno molecular. En los nódulos la presión parcial de oxígeno es muy baja, si se eleva la enzima nitrogenasa quedaría inhibida y no se produciría la fijación. Sin embargo el nódulo consume oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molécula transportadora de O 2 que contiene grupo hemo y da a los nódulos color rojizo.

Nodulación de leguminosas

Nódulos efectivos

o

pocos y situados sobretodo en la raíz primaria

o

voluminosos, con superficie lisa o rugosa

o

actividad meristematica y nodular prolongada

o

infección generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides

o

interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina.

Nodulos inefectivos

o

numerosos y repartidos en todo el sistema radicular

o

pequeños con superficie lisa

o

actividad meristematica y nodular corta

o

pocas células infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidón

o

interior no coloreado de rojo.

Inoculante para leguminosas

La búsqueda y selección de buenas cepas de rizobios puede resultar inútil si las leguminosas nodulan eficientemente con las cepas nativas, situación frecuente en especies tropicales. Pero, en muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la nodulación y la fijación de nitrógeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del cultivo. La inoculación artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrógeno limita

14

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

el desarrollo vegetal. El método y las condiciones de inoculación deben permitir la supervivencia de los rizobios, además la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio adecuada y en número suficiente. Las condiciones del suelo próximo a la semilla deben favorecer la colonización de la rizósfera por la bacteria para lograr la formación de los nodulos y su funcionamiento efectivo.

Para determinar la necesidad de inoculación se suele emplear un ensayo simple de tres tratamientos:

- la inoculación con una cepa de rizobio

Figura 13 Ensayo Testigo
Figura 13
Ensayo
Testigo

conocida para saber si es efectiva en el hospedador,

- la fertilización para asegurar un buen

desarrollo del hospedador si no hay inhibidores en el suelo,

- el control no inoculado para observar la

presencia o ausencia de rizobios nativos y su efectividad. Las cepas usadas en los inoculantes deben ser cuidadosamente seleccionadas

y mantenidas, y probarse anualmente

para minimizar la posibilidad de cambio

en las propiedades simbióticas.

La eficencia de la fijación se evalúa por

el número de nódulos, la masa nodular,

el peso seco de la planta y el contenido de nitrógeno de la parte aérea. Son bacterias eficaces las

que, por intermedio de los nódulos radicales, aportan nitrógeno reducido a la planta hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma.

Procedimiento

Examen de los nódulos y bacteroides

Tomar un nódulo de la raíz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y observar el color. Si la fijación de nitrógeno era efectiva se lo verá rosado o rojo, a veces pardo. Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua, haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el portaobjetos por dentro de la llama. Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la solución colorante (fucsina básica 0,3 g, etanol 96º 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL). Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de inmersión, apoyar un cubreobjetos y sobre éste poner otra gota de ese aceite. Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la proporción respecto al campo microscópico. Anotar el aumento.

Germinación de semillas de leguminosas

Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y añadir agua lavandina al 10% v/v, agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estéril. Depositarlas sobre agar-agua estéril y dejar germinar.

Preparación del inoculante

Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de nódulos durante el

desarrollo del trabajo nº2. El medio de cultivo

contiene: fosfato monopotásico 0,5 g, fosfato

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

15

dipotásico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g, extracto de levadura 4 g, fosfato diamónico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 121ºC durante 15 minutos.

Inoculación de leguminosas

Escoger de las placas de germinación las dieciseis plántulas de mejor aspecto y trasladarlas al medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos días después verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radícula de ocho plántulas cultivadas. El medio mineral contiene: fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro férrico 0,01 g, fosfato tricálcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos.

Control de las leguminosas inoculadas

Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicación, tamaño y forma de los nódulos. Controlar la humedad del substrato.

Bibliografía

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Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and Management. Kingraf, La Plata, 1996

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Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990

o

Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

16

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

TRABAJO Nº 4. Microorganismos del suelo

Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiológicos de microorganismos del suelo mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de nutrientes adecuadas.

Introducción

Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayoría de los procesos naturales que afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijación del nitrógeno molecular por los organismos de vida libre y los simbióticos, otro es el reciclado de materiales orgánicos. La materia orgánica que llega al suelo a través de residuos de cosechas, la caída del follaje, las raíces y sus productos de descamación y exudación, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de degradación que asegura la continuidad de los ciclos biogeoquímicos. Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con una característica fisiológica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrógeno soluble sólo crecerán las bacterias capaces de reducir el nitrógeno gaseoso disuelto, procedente de la atmósfera.

Amonificación

El nitrógeno orgánico de los productos de hidrólisis de proteínas y polinucleótidos, se convierte en amoníaco por el proceso de desaminación. La urea se hidroliza rápidamente a amoníaco y dióxido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos. La evolución de la microbiota varía según la materia nitrogenada transformada. En general, primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Después se observan actinomicetos y más tarde mohos. La demostración de la amonificación se basa en investigar amoníaco mediante el reactivo de Nessler en el medio acuoso con aminoácidos (peptona, etc). La solución de yodo-mercuriato potásico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo según la cantidad de amoniaco presente. El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser convertido en nitrato por las bacterias específicas. Si se añade a un suelo materiales tales como estiércol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificación.

Nitrificación

El nitrógeno tiene tres formas estables de oxidación en la naturaleza (nitrógeno molecular, amoníaco, nitrato) cuya interconversión está dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminoácidos y otras moléculas nitrogenadas de la célula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La oxidación del amonio a nitrato se denomina nitrificación y unas bacterias autótrofas aerobias las llevan a cabo en dos etapas:

1) oxidación del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus 2) oxidación del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus Tanto la formación de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioautótrofos constituyen procesos metabólicos aeróbicos generadores de energía. Ocurre rápidamente en suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fácilmente asimilado por las plantas, como es muy soluble en agua resulta rápidamente lavado de los suelos que reciben una gran cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas.

Desnitrificación

Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de electrones durante la respiración anaeróbica producen moléculas reducidas gaseosas (óxido de dinitrógeno, nitrógeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

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microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrógeno en el ecosistema (reducción asimilatoria del nitrato). Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaeróbicas y ocurre la desnitrificación, principalmente si es rico en materia orgánica. También sucede cuando se originan puntos de anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificación son gaseosos se escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrógeno del mismo. En el laboratorio tales gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo.

Fijación de nitrógeno molecular

La utilización de este como fuente de nitrógeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias y cianobacterías. A continuación se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrógeno de vida libre.

Algunos géneros de bacterias con especies fijadoras de nitrógeno

Aerobios

Anaerobios

Heterotróficos

Fotosintetizadores

Heterotróficos

Fotosintetizadores

Azotobacter

cianobacterias

Clostridium

Chromatium

Klebsiella

Chlorobium

Beijerinckia

Rhodospirillum

Bacillus Azomonas Azospirillum (microaerófilo)

Heliobacterium

El nitrógeno es reducido a amonio en el proceso de fijación catalizado por el complejo nitrogenasa, uno de cuyos componentes proteínicos contiene molibdeno, los otros hierro. La enzima es inactivada por el oxígeno. El nitrógeno molecular es muy inerte y su reducción requiere mucha energía. Azotobacter crece en un medio liquido sin agitación, en forma de una película superficial. Es bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 mm de largo, acompañados de células de mayor tamaño con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno, para proveer la energía requerida por la fijación. Los clostridios fijadores no sólo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que generalmente son muertos por el oxígeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos, pero pueden crecer por debajo de la película de Azotobacter, generando burbujas de gas por la fermentación de azúcares.

Sulfo-oxidación

El sulfuro de hidrógeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables importantes del azufre. El sulfuro de hidrógeno es tóxico para la mayoría de los organismos y los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del género Thiobacillus y azufre elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuáticos, el que se acumula en la célula, sufriendo una posterior oxidación en algunos casos. La mayoría de los microorganismos oxidantes del azufre son autótrofos obligados.

Sulfato-reducción

El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de hidrógeno por bacterias heterotróficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o ácidos orgánicos como fuente de carbono, pero algunas especies crecen autotróficamente con hidrógeno molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio.

18

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

Celulolisis, amilolisis

El almidón y la celulosa están compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de diferente manera: uniones 1,4 a- y 1,4 b-glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidón soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolíticos, pero entre las bacterias esta propiedad está restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos. El almidón, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias. Las bacterias celulolíticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental que ocurre durante el compostaje de residuos agrícolas, donde predominan los microorganismos termófilos.

Solubilización de fosfatos

Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un décimo de las bacterias del suelo también los solubilizan. La solubilización de fosfato de calcio se aprecia como zonas claras que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman ácidos orgánicos tales como ácido 2-ceto-glucónico (bacterias), ác. citrico u oxálico (hongos), pero éstos son rápidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio pueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrógeno.

Procedimiento

Fijación de nitrógeno molecular

El medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solución salina 50 mL, solución de oíigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unos granulos de suelo e incubar a 25-27°C durante 7 días. La solución salina contiene: fosfato dipotásico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g, cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5. La solución de oíigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio, borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato de manganeso, cloruro férrico. Hacia el tercer día el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisáceo. Los días siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia cada vez más y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observación microscópica del velo muestra células bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esféricos, mientras que el material tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable. Medio para Azotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotásico 0,05 g, fosfato monopotásico 0,15 g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g, cloruro férrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidón o glucosa y omitir el carbonato de calcio. Medio para Azospirillum: ácido málico 5 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g, sulfato de manganeso 0,01 g, etilén -diamino-tetra-acetato férrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8. Medio para Clostridium pasteurianum : glucosa 10 g, fosfato monopotásico 0,75 g, solución

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

19

salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estéril.

Desnitrificación

El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una campanita de vidrio y se esterilizan a 110ºC durante 20 minutos. Inocular unos gránulos de suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27ºC. Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitritos se comprueba agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay nitritos. Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las soluciones siguientes:

o

Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua.

o

Disolver 0,32 g de ácido sulfanilico en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua.

Nitrificación

El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato de calcio 1 g, solución salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250

mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno.

El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de amonio. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unos gránulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27ºC durante dos semanas. Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del reactivo de Griess recien preparado. Aparecerá un color rosado si se han formado nitritos por acción microbiana.

Formadores de nitratos. Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL

del reactivo de Griess. Si esta reacción da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos

a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de

acido sulfúrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego añadir 1 mL de reactivo difenilamina

por

las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados

por

acción microbiana.

El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, ácido sulfúrico 100 mL. Colocar en frasco obscuro.

Amonificación

El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110ºC durante 20

minutos. Sembrar unos gránulos de suelo e incubar una semana a 25-27ºC. Después agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparición de un color ladrillo indica la presencia de amoniaco. El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el momento de usar.

o

Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercúrico y 3,65 g de ioduro de potasio, añadir un poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua.

o

Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada.

Celulolisis

El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza

a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensión de suelo, que haya sido

abonado con estiércol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C.

20

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

Donde el papel sobresale del líquido se acumulan las bacterias celulolíticas aerobias y suelen colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las fibras bajo la lupa. Comp robar si se disgrega con facilidad al tocarla con el asa. Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotásico 0,7

g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g,

carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15

g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de

cisteína (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estéril fundido, sembrar de inmediato con unas gotas de la suspensión de suelo y colocar en agua fría para una rápida gelificación.

Amilolisis

El medio de cultivo contiene: almidón soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos gránulos de suelo e incubar a 25-27ºC. Cubrir la superficie con solución acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de hidrólisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul.

Sulfato-reducción

El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al 60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar con unos gránulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27ºC. Ver si el clavo se ha ennegrecido por la formación de sulfuro de hierro debido a los microorganismos.

Sulfo-oxidación

El medio de cultivo contiene: fosfato dipotásico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de

sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos a razón de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110ºC. Agregar a cada tubo 1 mL de una solución a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos gránulos de suelo. Incubar a 25-27ºC durante dos a tres semanas. Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de ácido clorhídrico concentrado

y añadir 5 gotas de solución acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparición de una

opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana.

Solubilización de fosfatos

El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L, fosfato tricálcico 2 g. Se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri. Sembrar unos gránulos e incubar a 25-27ºC. Observar la formación de una zona transparente alrededor de las colonias.

Bibliografía

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Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego,

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

21

TRABAJO Nº 5. Inhibidores y desinfectantes

Objetivo. Determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración letal mínima de productos comerciales usados en el campo.

Introducción

Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibición sin acción mortal inmediata. Los bacteriostáticos actúan sobre las bacterias y los fungistáticos sobre los hongos. Los compuestos de acción irreversible causan la muerte rápida. Los bactericidas y fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14). La diferencia es cuantitativa más que cualitativa. La adición de 0,3% de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata las células en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos (figura 15).

La palabra desinfección se empleó para expresar la eliminación de cualquier agente que pudiera causar infección o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilización. Las células activas jóvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La desinfección es más rápida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la desinfección, por combinación del material orgánico con el agente activo. También el pH modifica los mecanismos de desinfección. Los endosporos bacterianos son más difíciles de destruir que las células vegetativas. También presentan cierta resistencia los organismos encapsulados. Otro factor que posibilita la desinfección es un contacto eficaz. La humedad es esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto. Las pruebas de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración letal mínima (CLM) son útiles para comparar la eficacia de diversos productos químicos contra un organismo determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto. Los microorganismos comúnmente usados son cepas de colección de Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la acción frente a organismos coliformes, seudomónadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente. El tamaño del inóculo suele ser de 10 4 a 10 6 /mL, según el microorganismo y la substancia estudiada.

Figura 14
Figura 14

Figura 15

y la substancia estudiada. Figura 14 Figura 15 Procedimiento Concentración inhibitoria mínima Preparar

Procedimiento

Concentración inhibitoria mínima

Preparar una solución al 1/10 p/v ó v/v del compuesto en agua destilada estéril. Si se trata de un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta primera dilución. Poner 1 mL de la solución 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estériles. Añadir al primer tubo 1 mL de agua destilada estéril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y así

sucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL,

1/100.

obteniendo diluciones que van desde 1/20 a

Transferir 1 mL de la dilución original al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estéril (en caso

del curasemillas), comenzando por la más diluida

Las diluciones obtenidas van de 1/100 a

1/1000.

22

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

Bacterias

Añadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensión de turbiedad poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensión bacteriana a cada uno de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35°C durante 48 hs.

Hongos

Agregar agua estéril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 días a 25°C en medio de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporium cladosporioides, agitando para suspender los esporos. Añadir 0,5 a 1 mL de la suspensión de esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50°C. Mezclar y volcar en cuatro cajas de Petri estériles. Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de diámetro previamente humedecidos con las diluciones del producto, a razón de tres discos por placa. Se incuba a 25- 28°C durante 5 días.

Concentración letal mínima

Preparar, como se indicó arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones del compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estéril en lugar de caldo. Adicionar a cada dilución 0,2 mL de una suspensión bacteriana preparada como se describió arriba. Anotar la hora a la cual se agregó al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos cargar un asa (con un diámetro interno de 4 mm) de cada dilución y llevar a un tubo de caldo nutritivo que contiene 0,1 % p/v de ácido tioglicólico para neutralizar la acción del desinfectante remanente. Incubar a 35°C durante 48 hs.

Bibliografía

o

Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lyne’s Microbiological Methods. 7º ed. Butterworth Heinemann, Oxford, 1999

o

Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

23

TRABAJO Nº 6. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas

Objetivo. Transformar los residuos agrícolas en biogas y un lodo útil como fertilizante.

Introducción

Se emplea estiércol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la fermentación metanica es una mezcla de metano y dióxido de carbono. Las denominadas bacterias metánicas implicadas pertenecen a los géneros Methanococcus, Methanobacterium, Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composición del material de partida, se puede producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y reducen al dióxido de carbono. Las bacterias metánicas se diferencian de las demás debido a su peculiar estructura de la pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termófilas y las halófilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de las depuradoras de aguas residuales. Las metanobacterias sólo podrán desarrollarse cuando por acción de las bacterias facultativas se haya consumido todo el oxígeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dióxido de carbono e hidrógeno a partir de almidón, celulosa o aminoácidos. Las bacterias metánicas son sensibles al descenso del pH producido por los ácidos orgánicos formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los ácidos a medida que aparecen manteniendo un ambiente neutro. Las instalaciones pequeñas de biogás permiten la obtención de energía en zonas rurales.

Procedimiento

Figura 16
Figura 16

Equipo de digestión: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitación con varilla, 3 material a fermentar, 4 baño de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulación, 7 termómetro y termostato, 8 depósito de gas (neumático de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO 2 ), 10 frasco lavador abierto (para equilibrar la presión), 11 llave de triple vía, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro (arrestallamas), 13 mechero.

Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estiércol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en trozos pequeños y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapón atravesado por un agitador y un tubo para la salida de los gases. Instalar el fermentador en un baño de agua a 37ºC. Unir la salida a un frasco lavador y éste a otro frasco abierto para equilibrar la presión, y a una llave de triple via que está conectada al

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

depósito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad de todos los cierres. Agitar diariamente la mezcla en descomposición. Luego de uno o dos días vaciar la cámara para eliminar la mezcla explosiva de biogás y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el depósito y comprobar cómo arde el biogás a la salida del mechero. Controlar diariamente el nivel de agua del baño, la temperatura y la cantidad de gas.

Bibliografía

o

Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998

o

Jagnow G, Dawid W. Biotecnología. Acribia, Zaragoza, 1991

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

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TRABAJO Nº 7. Morfología microscópica de hongos

Objetivo. Conocer las estructuras microscópicas de mohos, levaduras y setas.

Introducción

Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las

hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está tabicado. Si los tabiques están ausentes es un micelio contínuo. Rizoides son las hifas de succión que penetran en el substrato. Apresorios son unas hifas achatadas de sostén que se adhieren al hospedador o substrato. Cuando el cuerpo del hongo es una sola célula se lo llama levadura. Los cortos filamentos formados por las células brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio. Plecténquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plecténquima generalmente macroscópico que puede permanecer largo tiempo con vida latente. Clamidospora es una célula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicación de los hongos. De acuerdo a su forma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 . Anamorfo es el hongo con reproducción asexuada o mitospórica. Los conidios son mitosporas que se hallan sésiles o sobre un conidióforo (simple o ramificado), o dentro del plecténquima de un picnidio. Un esporangio contiene numerosos mitosporas dentro de una membrana peridial simple. Teleomorfo es el hongo con reproducción sexuada o meiospórica. Las ascosporas son meiosporas que se encuentran dentro de los ascos libres de las levaduras, o los ascos encerrados en el plecténquima de un ascoma o sobre el mismo. Las basidiosporas surgen de los esterigmas del basidio donde ocurrió la meiosis. Los basidios generalmente se encuentran sobre laminillas, tubos o espinas del basidioma. Las figuras 17 y 18a muestran

esquemas de diversas estructuras fúngicas. Los conidióforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen terminar en ramas con forma de botellón (fiálides) de donde surgen los conidios. Algunas estructuras son típicas de géneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio. También los conidióforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un fósforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plecténquima con forma de pera). Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo sólo contiene tres o cuatro y se encuentra en el ápice de una rama lateral del esporangióforo. La columela es la punta dilatada del esporangióforo y está dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos, unas pocas esporas están reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se asientan sobre la columela. Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas, peritecio (forma de pera) con abertura u ostíolo por donde salen las esporas maduras, apotecio (forma de copa) con los ascos expuestos.

Figura 17
Figura 17

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice Figura 18a Los basidiomas más conocidos son: el champiñón

Figura 18a

Los basidiomas más conocidos son: el champiñón con laminillas en la parte inferior del sombrero donde se originan las esporas, el boleto con poros en vez de laminillas, la bola de nieve que al romperse libera las esporas maduras (figura 18b). Hay otras formas como el basidioma excéntrico de los pleurotos, los estantes rígidos que crecen sobre troncos, las formas gelatinosas.

rígidos que crecen sobre troncos, las formas gelatinosas. Procedimiento Microcultivos Observar los microcultivos con

Procedimiento

Microcultivos

Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura próxima al cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite.

Preparaciones

Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o colorante de Gueguén, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos . Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas. El lactofenol contiene: ácido láctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL.

Bibliografía

o

Deacon JW . Introducción a la Micología Moderna. Limusa-Noriega, México, 1993

o

Alexopoulos CJ. Introducción a la Micología. EUDEBA, Buenos Aires, 1966

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

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TRABAJO Nº 8. Mohos toxigénicos

Objetivo. Reconocer los mohos comunes que deterioran los granos y forrajes almacenados pues suelen producir toxinas que afectan al hombre y los animales.

Introducción

Los problemas causados por los hongos en alimentos y forrajes son numerosos. Los causados por micotoxinas son, con frecuencia, costosos debido a que se descubren muy tarde para prevenir las pérdidas económicas. Una herramienta importante en el control micológico de cereales y especias, es el uso de métodos simples de identificación específica que se realiza en base al aspecto de las colonias y la micromorfología en varios medios de cultivo a distintas condiciones de incubación.

medios de cultivo a distintas condiciones de incubación. Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en
medios de cultivo a distintas condiciones de incubación. Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en
medios de cultivo a distintas condiciones de incubación. Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en
medios de cultivo a distintas condiciones de incubación. Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en
medios de cultivo a distintas condiciones de incubación. Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en
medios de cultivo a distintas condiciones de incubación. Procedimiento Hacer repiques de un cultivo puro en

Procedimiento

Hacer repiques de un cultivo puro en tres puntos equidistantes de cada placa con los medios:

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

dias. Además repicar en estrías sobre dos tubos de agar malta o Czapeck e incubar uno a 5ºC y el otro a 37ºC. El cultivo en agar papa sacarosa se incuba a la temperatura ambiente con luz solar indirecta. La composición de los medios de cultivo es la siguiente:

Agar malta: extracto de malta 20 g, peptona 1 g, glucosa 20 g, agar 20 g, agua destilada 1 litro; esterilzar a 121ºC durante 15 minutos. Solución concentrada de Czapeck: nitrato de sodio 30 g, cloruro de potasio 5 g, sulfato de magnesio 5 g, sulfato ferroso 0 , l g, agua destilada 100 mL; mantener a la temperatura ambiente. Agar Czapeck: fosfato dipotasico 1 g, solución de Czapeck 10 mL, extracto de levadura 5 g, sacarosa 30 g, agar 15 g, agua destilada 1 litro; esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Agar Czapeck glicerol: disolver las sales y extracto, como el anterior, en una mezcla de 250 mL de glicerol y 750 mL de agua destilada; esterilizar de igual manera. Agar papa sacarosa: hervir 200g de papa rallada en 1 L de agua, durante media hora, y completar el volumen a un litro, añadir 10 g de sacarosa y 15 g de agar, esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Observar y registrar el aspecto macromorfológico de las colonias. Hacer preparaciones en fresco con líquido de Patterson o colorante de Gueguén. Observar al microscopio y dibujar las estructuras. Si es necesario prolongar la incubación. Consultar las claves de la bibliografía para identificar el género (si es posible la especie) y cuáles son las micotoxinas que producen.

Bibliografía

o

Pitt JI, Hocking AD. Fungi and food spoilage. Blackie A&P, London, 1997

 

o

Carrillo

L.

Los

hongos

de

los

Alimentos

y

Forrajes.

2002

http://www.unsa.edu.ar

(material

bibliográfico)

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

29

TRABAJO Nº 9. Micorrizas

Objetivo. Observar los hongos asociados con plantas herbáceas y árboles constituyendo las micorrizas. Preparar un inoculante para ectomicorrizas.

Introducción

Las plantas parecen totalmente autónomas, pero la mayoría están asociadas con hongos, en sus raíces formando micorrizas o, endófitos dentro del tallo.

Endomicorrizas

Cuando el hongo penetra en el interior de las células de la raíz, formando minúsculas

arborescencia y vesículas, se las llama endomicorrizas vesículo - arbusculares. Los arbúsculos suelen tener una vida efímera, de algunos días a pocas semanas, siendo luego digeridos por el hospedador. Los hongos de este tipo de micorrizas, generalmente presente en la vegetación herbácea, pertenecen a la familia de la endogonáceas. Hay otros tipos de endomicorrizas como las que forman ovillos intracelulares en las orquídeas Cada una de las diferentes especies de orquídeas tiene una alta especificidad por un hongo particular que generalmente es un zigomiceto. El grado de interdependencia es tal que en muchos casos ninguno de los asociados puede ser cultivado sin el otro, pues forman una verdadera simbiosis.

hifas

desarrolladas a partir de propágulos presentes en el suelo, los estructuras de resistencia presentes en las raíces muertas.

Ectomicorrizas

En ellas el hongo rodea la raíz con un manto de filamentos y una red miceliar penetra entre las células radicales pero no dentro de ellas. Los hongos que forman ectomicorrizas en árboles son macrocárpicos y típicamente basidiomicetos superiores, por ejemplo Amanita, Boletus, Pisolithus,

Suillus. Más raramente los ascomicetos forman micorrizas, por ejemplo

especificidad de estas asociaciones ya que varios árboles pueden formar micorrizas con un hongo dado y viceversa. Algunas especies de árboles, por ej. los eucaliptos, poseen a la vez ecto- y endo-micorrizas.

Inoculación

La falta de micorrización acarrea problemas en el transplante de las plántulas de árboles y plantas ornamentales, excepto en los casos en que el suelo contenga especies fúngicas. Para inocular con cultivos puros, el substrato (suelo, turba) debe ser previamente pasterizado con el fin de disminuir la población fúngica nativa competitiva. Los hongos son incorporados al substrato de siembra como trozos de raíces micorrizadas, pedazos de ascoma o basidioma, o micelio obtenido in vitro. El agregado de micelio ofrece mayores garantías en el caso de hongos que se desarrollan bien en cultivo axénico. El primer paso de toda inoculación consiste en la selección del hongo. Los siguientes obtener el cultivo y multiplicarlo para añadirlo al suelo donde se coloca la plántula crecida en condiciones asépticas.

Las raíces se infectan con hongos de las micorrizas vesículo-arbusculares

por

las

que pueden ser esporos o

Tuber. Es poca la

Procedimiento

Observación de micorrizas

Lavar la raíz con agua corriente. Observar su aspecto y seleccionar un trozo. Cortar en porciones de un centímetro de largo y colocarlos en solución de hidróxido de sodio o potasio al 10% p/v. Calentar a 90ºC durante 30 minutos o más si es necesario. Cuando el material es obscuro sumergirlo en agua oxigenada de 10 volúmenes durante 15 minutos, sino omitir este paso. Lavar 4 veces con agua corriente. Poner los trozos en solución de ácido clorhídrico 0,1 N

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

durante 10 minutos. Colorear con azul-lactofenol a 90ºC por 5 minutos. Pasar a lactofenol. Colocar un trozo de la raíz tratada entre dos portaobjetos y aplastarla. Observar al microscopio entre porta y cubreobjetos. El lactofenol contiene: ácido láctico 100 ml, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 ml. La solución colorante se prepara mezclando 5 mL de solución acuosa de azul de algodón o azul tripán o azul de metilo al 1% p/v, con 95 mL de lactofenol.

Preparación del inoculante para ectomicorrizas

Cortar el basidioma con un instrumento previamente mojado en alcohol y encendido. Con un gancho o pinza estéril tomar porciones del interior del sombrero y depositarlas sobre la superficie de una placa de agar malta levadura. Incubar a 25-27ºC, dos o más semanas en la obscuridad. El agar malta levadura contiene: extracto de malta 20 g, extracto de levadura 2 g, agar 20 g, agua 1 L. Se esteriliza a 121ºC durante 15 minutos. Repicar en 50 ml de medio líquido de Melin Norkrins modificado en un matraz de Erlenmeyer de 250 mL e incubar a 25-27ºC con una agitación de 100 rpm y en la obscuridad, el tiempo requerido para un buen crecimiento. El medio líquido de Melin Norkins modificado contiene cloruro de calcio 0,05 g, cloruro de sodio 0,025 g, fosfato monopotásico 0,5 g, fosfato diamónico 0,25 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,15 g, cloruro férrico (al 1% p/v) 1,2 mL, extracto de malta 1,5 g, sacarosa 10 g, agua 1 litro. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Homogeinizar el cultivo, mezclar con suelo pasterizado previamente con vapor de agua a 60ºC. Llenar unas macetas pequeñas y colocar los plantines. Llevarlos al invernáculo.

Bibliografía

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Deacon JW Introducción a la Micología Moderna. Limusa-Noriega, México, 1993

o

Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

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TRABAJO Nº 10. Microorganismos del agua

Objetivo. Conocer la probable contaminación del agua con patógenos, a través de la búsqueda de microorganismos indicadores y otros.

Introducción

El agua es un sistema ecológico en equilibrio que constituye la base de todas las comunidades vivas. Como es indispensable se procura aumentar sus recursos, especialmente almacenándola,

y mejorar su calidad mediante purificación. El análisis biológico del agua para determinar la

calidad sanitaria utiliza métodos que indican el grado de contaminación con excrementos. Se emplean técnicas para la detección y recuento de organismos indicadores, porque principalmente interesa conocer el peligro potencial de la transmisión de patógenos a través del agua, antes que la búsqueda de éstos.

Coliformes

Los coliformes son bacterias de origen entérico que son capaces de fermentar la lactosa con producción de gas. Los géneros de enterobacterias incluidos en el grupo de los coliformes a efectos de análisis de aguas son Citrobacter, Enterobacter, Escherichia y Klebsiella. Este grupo es el principal indicador de la conveniencia del agua para uso doméstico, industrial u otro. La prueba de fermentación en una serie de tubos (caldo bilis lactosa verde brillante, caldo McConkey, etc.) con determinación del número más probable (NMP) fue la primera usada, luego se incorporó la técnica de filtración por membrana que, con algunas limitaciones, es comparable a la anterior, y finalmente se introdujo el substrato cromogénico ONPG (o- nitrofenil-b-D- galactopiranósido) al medio liquido para NMP. Comúnmente para determinar el NMP se realiza una prueba presuntiva basada en la fermentación de la lactosa con producción de gas que queda atrapado en la campanita. La ausencia de gas se interpreta como ausencia de coliformes, pero su presencia es una posibilidad de presunción pero no de seguridad puesto que algunas bacterias lácticas suelen producir gas. El medio de cultivo liquido lleva un indicador de pH para facilitar la lectura y sales biliares para inhibir el desarrollo de las bacterias no entéricas. Los coliformes presentes en el intestino y las heces de animales de sangre caliente, incluido el hombre, son capaces de producir gas al fermentar lactosa a 44,5ºC.

Más especifica es la búsqueda de

Escherichia coli por cultivo sobre placas de medios que

permiten la detección en 7 horas (m-7hFC) o en 24—48 horas (EMB, Endo y otros), o bien un medio liquido con el substrato fluorogénico MUG (4-metilumberiferil-b-D -glucurónido) especifico para bacterias con la enzima b-glucuronidasa (24 hs a 44,5ºC). En los casos que se requiere confirmar la presencia de E. coli se emplean las pruebas de: fermentación de lactosa, sorbitol y celobiosa, hidrólisis de ONPG, producción de indol, viraje del rojo de metilo,

producción de acetoína, uso del citrato, motilidad, descarboxilación de lisina y ornitina, oxidasa

y formación de pigmento amarillo; las que permiten clasificar las especies de enterobacterias

presentes en aguas. El significado de estos análisis se basa en que la falta de coliformes implica una ausencia de contaminación fecal próxima o remota,mientras que su presencia no certifica una contaminación de aguas con materias fecales. En cambio, la presencia de Escherichia coli demuestra una contaminación fecal reciente.

Enterococos

Constituyen un grupo de estreptococos fecales que incluye S. faecalis, S. faecium, S. gallinarum y S. avium. Se diferencian de los otros estreptococos por su capacidad para crecer en presencia de 6,5% cloruro de sodio, a pH 9,6, entre 10 y 45ºC. Son bacterias esféricas, gram positivas, fisiológicamente relacionadas con las bacterias lácticas que dan negativa la prueba de catalasa. Como tienen requerimientos nutricionales más complejos que otras bacterias difícilmente se

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Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

multiplican en el agua aunque resisten mejor la cloración que Escherichia coli. Los enterococos también son indicadores fecales, y para su análisis se emplean pruebas de

cultivo en una serie de tubos de medio selectivo (caldo glucosa azida) para determinar el NMP

y la filtración por membrana (agar mE, etc), siendo confirmado por repiques en agar bilis

esculina u otro medio especial, además de la prueba de catalasa y la coloración de Gram. Los enterococos son indicadores que permiten determinar el grado de la contaminación fecal. Una relación entre el número de coliformes fecales al número de enterococos, mayor que cuatro

indica contaminación fecal humana, mientras que si es menor que uno sugiere otra fuente.

Clostridios

Clostridium perfringens tiene el mismo significado que los enterococos y una supervivencia mucho mayor que cualquier otro indicador bacteriano de polución fecal, debido a su capacidad formadora de endosporos. En aguas naturales superficiales, no contaminadas, no se suele

detectar la presencia de estos microorganismos ni en grandes volúmenes de muestra, aunque se

lo pueda observar en agua profundas.

La proporción de clostridios frente a otros indicadores fecales es muy reducida. La detección simultánea de Cl. perfringens y coliformes o E. coli constituye una clara evidencia del origen fecal de la contaminación. En cambio la presencia exclusiva de los clostridios debe interpretarse como un indicio de contaminación fecal remota. La existencia de endosporos de clostridios en aguas tratadas carece de significado. El ensayo se funda en el sistema enzimático de la sulfito-reductasa que en el caso de Cl. perfringens es estrictamente endocelular, y la reducción de sulfito a ácido sulfhídrico solo tiene lugar en contacto con la colonia y el ennegrecimiento en una zona muy próxima ella, si en el medio existen sales solubles de hierro. Otros esporulados también suelen reducir el sulfito.

Pseudomonas spp.

En las aguas se suele buscar Pseudomonas aeruginosa, un organismo asociado al tracto

respiratorio superior o la piel, que se comporta como patógeno oportunista. Su presencia es

poco favorable para la calidad del agua

desinfección, mientras que los coliformes son indicadores de la contaminación de las superficies. Se emplea tanto el método de siembra en una serie de tubos de medio líquido (caldo asparagina u otro) para determinar el NMP, como la técnica de filtración por membrana (agar M-PA). Para la confirmación se suele usar caldo acetamida, agar leche, agar King A y B, agar King A- cetrimida. El bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio (Cetrimide) es un agente antibacteriano de amplio espectro que no afecta a la especie citada por lo que se adiciona en cantidades de 0,1 - 0,3 g/L de medio King A para el aislamiento. Las colonias típicas de estos bacilos Gram negativos son de bordes generalmente irregulares que tiene tendencia a difundirse, las cepas no pigmentadas dan colonias translúcidas, las otras pueden estar teñidas de verde o parduzco. El pigmento colorea a la porción del medio que rodea a la colonia. Pseudomonas aeruginosa forma piocianina que tiene un color azul-verdoso y difunde en el medio cuya producción se ve favorecida en un medio (King A) que contiene sulfato de potasio, cloruro de magnesio y glicerol y no incluye nitratos ni sales de sodio pues actúan como inhibidores. Este pigmento es soluble en agua y cloroformo. La solución azulada se colorea de rojo por el agregado de ácidos. La producción de un compuesto fluorescente por especies de Pseudomonas se favorece en un medio que contiene fosfatos y sulfatos (King B). Es soluble en agua y ácido acético e insoluble en cloroformo. La solución acida es incolora y no fluorescente; la neutra ó alcalina es amarillenta a parda y fluorescente.

Otros microorganismos

Es un indicador primario de la eficiencia de la

En las aguas industriales suele ser conveniente conoer la incidencia de bacterias del azufre y el

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

33

hierro, debido a que intervienen en los procesos de corrosión. Los olores desagradables, como a moho, que ocasionalmente suelen presentarse en aguas potabilizadas pueden deberse a la presencia de geosmina y 2-metilisoborneol producidos por actinomicetos en aguas superficiales. Suele hacerse un recuento de estas bacterias ramificadas en agar almidón caseína con cicloheximida. Los protozoos patógenos de importancia transmitidos por las aguas son quistes de Entamoeba histolytica y Giardia lamblia, así como ooquistes de Cryptosporidium parvum. Este último puede encontrarse en aguas cloradas.

Procedimiento

Figura 19
Figura 19

Número más probable de coliformes

doble

concentración con 10 mL de muestra, tres tubos de medio simple con 1 mL y los tres restantes con 0,1 mL cada uno. Incubar a 35ºC durante 24-48 hs. Para coliformes fecales usar el medio EC e incubar a 44,5ºC. El caldo-lactosa simple contiene: extracto de carne 3 g, peptona 5 g, lactosa 5 g, púrpura de bromocresol (al 0,5%) 4 mL, agua 1 L, pH 7,2. Repartir en tubos con

campanita. El medio doble concentración contiene los mismos ingredientes en 500 mL de agua. El medio EC simple contiene: peptona 20 g, lactosa 5 g, sales biliares 1,5 g, fosfato dipotasico 4 g, fosfato monopotásico 1,5 g, cloruro de sodio 5 g, agua destilada 1 L. Para el medio doble concentración se disuelven los sólidos en 500 mL de agua. Se reparte en tubos con una campanita (ver figura 19). Observar los tubos que presentan gas en cada una de las series. Obtener el número característico donde la

primera

sembrados con 10 mL de muestra, la segunda a los positivos que recibieron 1 mL y la tercera a los positivos con 0, 1 mL de agua. Consultar la tabla para obtener el número más probable de coliformes o coliformes fecales en 100 mL de la muestra.

Escherichia coli

Sembrar

tres

tubos

de

caldo -lactosa

cifra

corresponde a los tubos de positivos

Sembrar 1 asa de cada uno de los tubos positivos para coliformes fecales en sectores de las placas de agar Levine (EMB). Este medio contiene peptona 10 g, lactosa 5 g, sacarosa 5 g, fosfato dipotásio 2 g, agar 15 g, eosina 0,4 g, azul de metileno 0,065 g, agua 1 L, pH 7,2. Incubar a 35°C durante 48 horas. En este medio las colonias son negras con brillo metálico.

Número más probable de enterococos

Sembrar cada uno de los tres tubos de caldo-azida doble concentración con 10 mL de muestra. Agregar 1 mL a cada uno de tres tubos de caldo-azida simple y 0,1 mL a los tres restantes. Se incuban a 35º.C y se observan a las 24 y 48 horas. El caldo-azida simple contiene peptona 15 g, extracto de carne 4,5 g, glucosa 7,5 g, cloruro de sodio 7,5 g, azida de sodio 0,2 g, agua destilada 1 L. El medio doble concentración se prepara agregando la misma cantidad de sólidos a 500 mL de agua. Se reparten a razón de 10 mL en cada tubo. Se consideran positivos los tubos que presentan turbiedad debido al crecimiento microbiano.

34

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

Consultar la tabla para obtener el número más probable de enterococos en 100 mL de muestra.

Número más probable por mL de muestra, utilizando series de tres tubos inoculados con 10 mL, 1 mL y 0,1 mL

Número

Índice

Número

Índice

característico

NMP

característico

NMP

0

0

1

3

2

0

0

9

0

0

2

6

2

0

1

14

0

0

3

9

2

0

2

20

0

1

0

3

2

0

3

26

0

1

1

6,1

2

1

0

15

0

1

2

3,2

2

1

1

20

0

1

3

12

2

1

2

27

0

2

0

6,2

2

1

3

34

0

2

1

9,3

2

2

0

21

0

2

2

12

2

2

1

28

0

2

3

16

2

2

2

35

0

3

0

9,4

2

2

3

42

0

3

1

13

2

3

0

29

0

3

2

16

2

3

1

36

0

3

3

19

2

3

2

44

1

0

0

3,6

2

3

3

53

1

0

1

7,2

3

0

0

23

1

0

2

11

3

0

1

39

1

0

3

15

3

0

2

64

1

1

0

7,3

3

0

3

95

1

1

1

11

3

1

0

43

1

1

2

15

3

1

1

75

1

1

3

19

3

1

2

120

1

2

0

11

3

1

3

160

1

2

1

15

3

2

0

93

1

2

2

20

3

2

1

150

1

2

3

24

3

2

2

210

1

3

0

16

3

2

3

290

1

3

1

20

3

3

0

240

1

3

2

24

3

3

1

460

1

3

3

29

3

3

2

1100

Clostridios sulfito-reductores

Repartir, a razón de 20 mL por tubo, un medio que contine caldo nutritivo 1 L, glucosa 20 g, agar 30 g y esterilizar 30 minutos a 110ºC. Preparar una solución de 1 g sulfito de sodio y 4 gotas de alumbre férrico (al 5%) en 10 mL de agua destilada estéril. Calentar a ebullición 25 mL de muestra. En el momento de usar fundir cinco tubos de medio en baño de agua hirviente, agregar 1 mL de la solución de sulfito y 5 mL de la muestra tratada, evitando la incorporación de aire. Enfriar bajo chorro de agua e incubar a 35ºC durante 48 horas. Contar las colonias negras en cada tubo sembrado con 5 mL de muestra, sumar y calcular el número de organismos presentes en 100 mL de muestra

Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice

35

Pseudomonas spp.

diluciones de la misma (1/10 ó 1/100 en agua estéril) en

sendas placas de los medios King A y King B. Incubar el medio A durante 48 hs a 37ºC y el medio B durante 24 hs a 37ºC y luego 3-4 días a temperatura ambiente. El medio King A, que exalta la producción de piocianina, contiene: peptona 20 g, glicerina 10 mL, cloruro de magnesio 1,4 g, sulfato de potasio 10 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2. El medio King B, que favorece la producción del pigmento fluorescente, contiene: proteosa- peptona 20 g, glicerina 10 mL, fosfato monopotásico 1,5 g, sulfato de magnesio 1,5 g, agar 15 g, agua 1 L, pH 7,2. Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos. Observar las colonias con pigmentos solubles y/o fluorescentes bajo luz visible y ultravioleta.

Sembrar 0,1 mL de la muestra o

Bibliografía

o

Eaton AD, Clesceri LS, Greenberg AE. Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 19º ed. parte 9000: Microbiological Examination. APHA, Washington, 1995

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Guinea J, Sancho J, Parés R. Análisis Microbiológico de Aguas. Omega, Barcelona, 1979