PRODUCCIN DE ACIDO ACTICO POR Acetobacter aceti

Lilian Mabel Santamara Rondn

Ana Mara Giraldo Martne
Mabel !"ila Correa
Pro#e$or
Carlo$ Ed%ardo Me&ia
Uni"er$idad de Antio'%ia
E$(%ela de Mi(robiolo)a
Mi(robiolo)a ind%$trial * Ambiental
Medelln
+,-,
.i$toria
La produccin de cido actico a partir de lquidos alcohlicos ha sido conocida desde
hace tanto tiempo como la produccin de vino (unos 10.000 aos). Los romanos y los
griegos que utili!a"an el vinagre diluido como "e"ida re#rescante producan vinagre
de$ando el vino a"ierto al aire. Los primeros vinagres #a"ricados industrialmente eran
producidos en vasi$as planas a"iertas. %ran procesos lentos en los que #lota"a una
pelcula de "acterias so"re la super#icie del vino. %n el siglo &'& se modi#icaron los
procesos en super#icie hacia mtodos ms rpidos. (no de stos el proceso del
generador de goteo se utili!a todava en la actualidad de"ido al me$or sa"or en los
productos que se o"tienen. ())
Acetobacter aceti
*on microorganismos gram+negativos "acilares o pleomr#icas estrictamente aero"ias
siendo el o,igeno su aceptor #inal de electrones. -iden entre 0.. / 0.0 10
+1
2m pueden
encontrarse individualmente en pare$as o en cadenas pueden ser mviles o inmviles
las que poseen movilidad lo hacen por medio de un #lagelo peritrico. 3o son esporulantes
y las colonias son opacas y la gran mayora no produce pigmentos usualmente catalasa
positiva y o,idasa negativa
La me$or #uente de car"ono para su crecimiento es el etanol glicerol y glucosa no
hidroli!an ni lactosa ni almidn. 4uimiorganotro#os con temperatura optima de
crecimiento a los 506 7p8 optimo de crecimiento es de 1.0 / ..0 . *uelen encontrarse
en su"stratos a!ucarados y9o con presencia de alcohol como pueden ser !umos de
#rutas vino cidra cerve!a o vinagre.
:orcenta$e ;+7 en el <3= est entre >0.> / .0.5
%stas "acterias tienes un gran inters para la industria "iotecnolgica ya que de la
"ien conocida produccin de vinagre tam"in se utili!a para la produccin industrial
de sor"osa y celulosa. (1))
Com/o$i(in elemental de la bioma$a0
781.?0@0.>030.)0 (0)
C%lti"o0
-edio ;A7 selectivo de crecimiento y aislacin liquido o solido (>Bd+glucosa 1B
e,tracto de levadura )B 7a7@5 )B agar (p9v). la presencia de 7a7@5 #orma una capa
de precipitado "lanco en la super#icie que da un apariencia opaca al medio de cultivo. La
#ormacin de acido actico por parte de la "acterias resulta en la disolucin del car"onato
de calcio (7a7@5 ) producindose un halo transparente alrededor de la colonia.(1)
-edio -anitol ().>B manitol 0.>B e,tracto de levadura 0.5 pepetona 0.) agar). %n su
#orma lquida es especialmente Ctil para la produccin de "iomasa por ser el que produce
un me$or crecimiento de las "acterias acticas. %ste es un "uen medio para el aislamiento
de "acterias acticas procedentes de muestras vnicas =lgunas no pueden utili!ar el <+
manitol y son cultivadas en medios que contengan glucosa glicerol y etanol. Las que son
mes#ilas crecen a una temperatura optima de )D +5067 las termotolerantes pueden
crecer a 5?67.
Con$er"a(in.
Las cepas de =ceto"acter pueden ser mantenidas por ) semanas a 167 en un medio de
agar usado para cultivo. =dems pueden ser congeladas y mantenidas a / ?167 en
presencia de )1B (v9v) de glicerol.
Medio de A(ti"a(in
%,isten varios medios de activacin pero los ms reportados en la "i"liogra#a sonE 1B
glucosa y 1B e,tracto de levadura 1B glucosa 1B levadura 5B v9v etanol 0)>B cido
actico. *e ha reportado tam"in un medio denominado 7aldo =ceto"acter compuesto
por glucosa (100 g) e,tracto de levadura (10 g ) car"onato de calcio ()0 g) y agua
destilada (D?0 g) regulando p8 a .D. (>)
%,iste otro medio de activacin llamado medio aceti#icante (aceti#ying mdium =- ) que
contieneE e,tracto de levadura 1 g9L glucosa ) g9L -g*@1 1 g9L (381) )8:@1 1 g9L
F8):@1 1 g9L citrate3a5 1 g9L con un p8 en el medio de 1. %thanol ).>B (v9v) y acido
actico 0.>B (v9v) (.).
Medio de ino(%la(in1 * alimenta(in del biorrea(tor0
%s el mismo utili!ado para mantenimiento se de"e tener en cuenta que las
concentraciones cam"ian de acuerdo al volumen deseado.
A(ido a(2ti(o
%l cido actico es un cido de origen natural presente en la mayora de las #rutas y
en muchos otros materiales tales como papel productos #armacuticos e industriales.
%s producido a travs de una #ermentacin "acteriana y por consiguiente est
presente en todos los productos #ermentados. 7omercialmente es ela"orado por
medio de la #ermentacin "acteriana del a!Ccar las mela!as o el alcohol o por
sntesis qumica del acetaldehdo.(5)
%l cido actico es un cido que se encuentra en el vinagre y que es el principal
responsa"le de su sa"or y olor agrios. *u #rmula es 785+7@@8 y constituye el
segundo de los llamados cidos car"o,licos de acuerdo con la '(:=7 se denomina
sistemticamente cido etanoico. %l punto de #usin es 1... G7 y el punto de e"ullicin
es 11?.0 G7.(D)
%n la "oca se perci"e como un sa"or que recuerda el vinagre. %st presente en las
"otellas con el corcho mal colocado o en mal estado. 3ormalmente se considera que
un vino se ha estropeado cuando contiene 11 gramos de cido actico por litro.
%n la industria del vino es uno de los parmetros de calidad mas importante que se
mide durante todo el proceso de vini#icacin y la presencia de este el vino o la sidra
puede de"erse a varios procesos qumicosE
*e produce como un su"producto del #inal de la #ermentacin al trans#ormarse parte
del alcohol etlico de"ido a la accin de las =ceto"acter un gnero de "acterias
aer"icas que trans#orman el etanol primero en acetaldehdo y luego en cido actico.
%n disolucin acuosa el cido actico puede perder el protn del grupo car"o,ilo para
dar su "ase con$ugada el acetato. *u pFa es de 1.D a )>G7 lo cual signi#ica que al
p8 moderadamente cido de 1.D apro,imadamente la mitad de sus molculas se
ha"rn desprendido del protn. %sto hace que sea un cido d"il y que en
concentraciones adecuadas pueda #ormar disoluciones tampn con su "ase
con$ugada. La constante de disociacin a )0G7 es FaH 1.?>,10
+>
. %sta constante nos
permite sa"er si se trata de una acido #uerte o d"il adems muestran el grado en que
dicho acido se disocia en agua los acido #uertes tiene un Fa muy alto como ya se
menciono al acido actico es un acido d"il por lo que su Fa es "a$o (10).
%s de inters para la qumica orgnica como reactivo para la qumica inorgnica como
ligando y para la "ioqumica como meta"olito (activado como acetil+coen!ima =).
Iam"in es utili!ado como sustrato en su #orma activada en reacciones catali!adas
por las en!imas conocidas como acetil trans#erasas y en concreto histona acetil
trans#erasas.(5)
8oy en da la va natural de o"tencin de cido actico es a travs de la car"onilacin
(reaccin con 7@) de metanol. =ntao se produca por o,idacin de etileno en
acetaldehdo y posterior o,idacin de ste a cido actico.
3io$nte$i$ del a(ido a(2ti(o
La produccin de cido actico es una o,idacin incompleta ms que una autntica
#ermentacin de"ido a que el poder reductor que se produce se trans#iere al o,geno.
La primera etapa de o,idacin a partir del etanol conduce a acetaldehdo mediante
una alcohol deshidrogenasa espec#ica de 3=< o 3=<:. Luego e,iste una hidratacin
a acetaldehdo hidrato y una segunda o,idacin con acetaldehdo deshidrogenasa a
cido actico como se ve en la Jigura 1.
<urante la o,idacin se produce 1 mol de cido actico por mol de etanol. = partir de 1
litro de alcohol del 1)B (v9v) se produce 1 litro de cido actico del 1)1B.
:ara la produccin ptima se requiere su#iciente o,geno que se reduce a travs de la
cadena respiratoria. *e producen . =I: por mol de cido actico. *i no e,iste su#iciente
o,geno en presencia de altas concentraciones de cido actico y etanol las clulas
mueren. :or esto tanto el cido actico como el etanol de"en estar presentes para el
ptimo crecimiento de Acetobacter. (15)
A/li(a(ione$ * %$o$
%l cido actico es utili!ado como un conservante previniendo el crecimiento de las
"acterias y los hongos. =s mismo es agregado en la mayonesa para incrementar el
e#ecto de inactivacin contra la *almonella. -uestra su mayor actividad a niveles
"a$os de p8. =dicionalmente puede ser utili!ado como sustancia amortiguadora o
K"u##erL en los alimentos cidos o como un componente aromtico en algunos
productos
%n apicultura es utili!ado para el control de las larvas y huevos de las polillas de la
cera en#ermedad denominada ;alleriosis que destruyen los panales de cera que las
a"e$as mel#eras o"ran para criar o acumular la miel.
*us aplicaciones en la industria qumica van muy ligadas a sus sales aninicas como
son el acetato de vinilo o el acetato de celulosa ("ase para la #a"ricacin de rayn
celo#n entre otros.) Mesultado de la o,idacin del alcohol etlico a cido o
#ermentacin actica. *u #rmula esE 7857@)8.
Nunto con los cidos propinico "utrico y sul#Crico compone la acide! volatil del vino.
3o produce e#ectos colaterales ya que es un compuesto natural de todas las clulas
corporales. *olamente de"e ser evitado por aquellas personas que su#ren de
intolerancia al vinagre (casos muy raros).
Ianto el cido actico como los acetatos pueden ser consumidos por todos los grupos
religiosos as como por los vegetarianos (estrictos y no estrictos). =unque puede ser
producido a partir del alcohol no contiene ninguna tra!a de este compuesto. (11)
Rendimiento m45imo en la /rod%((in de a(ido a(2ti(o a /artir de etanol0
Prod%(to0 7857@@8.
:-H .0 g9mol.
Grado de red%((in0 Op H P1Q()) R 1 S ) )Q ) ( T9)
Op H 1
6ra((in de (arbono0 H P1) Q())T 9 (.0)
H 01.
S%$trato0 7)8.@.
:- H 1. g9mol.
Grado de red%((in0 Os H P1Q ()) R . / ) T 9 )
Os H ..
6ra((in de (arbono0 H P1) Q ()) 9 (1.)
H 0.>)1
(Ap9s )m,. H
M2todo$ de /rod%((in del "ina)reE
6ermenta(in
La operacin semi+continua es el modo ms comCn en la industria del vinagre en el
presente. %ste modo de operacin consiste en el desarrollo de los ciclos sucesivos
discontinuos de aceti#icacin cada uno con la conversin del etanol que contiene en el
medio cido actico. =l #inal de cada ciclo un determinado volumen del reactor se
descarga (producto #inal) y se rellena con medio inicial (vino dulce). = continuacin una
#ermentacin nueva ciclo comien!a. %l porcenta$e de carga 9 descarga es varia"le en
todos los procesos individuales pero los ms comunes en la industria del vinagre es la
eliminacin del >0B del volumen total y el cargo posterior de la misma proporcin de agua
dulce vino. Los productores seala a una descarga rpida de vinagre producido pero la
carga tardia de vino que se recomendada es de lenta y progresiva tratando de evitar la
modi#icacin repentina de las condiciones am"ientales para la "iomasa (etanol y las
concentraciones de cido actico nutrientes temperatura p8 etc) que
implica una nueva #ase de latencia y en consecuencia un perodo de no productividad
(11)
6ermenta(in en (%lti"o $%/er#i(ial (-todo @rleans)
La #ermentacin en cultivo super#icial se caracteri!a porque las "acterias acticas se
encuentran en contacto directo con o,geno gaseoso o situadas en la inter#ase lquido
gas o "ien #i$adas a soportes de materiales tales como virutas de madera. %ste sistema
constituye el primer paso hacia la industriali!acin del proceso de #a"ricacin de vinagre y
es tam"in precursor de las "acterias inmovili!adas. = pesar del avance tecnolgico ste
mtodo presenta desventa$as como la prdida de sustancias voltiles por evaporacinU el
material de soporte como las virutas de madera se contamina #cilmente y es preciso
reempla!arlo cada aoU adems es un proceso lento por lo que se ha optado por el
proceso de #ermentacin sumergida. %n este mtodo se llena la cuarta parte de una
"arrica con vinagre #resco ela"orado recientemente que proporciona el inculo de
Acetobacter y Gluconobacter y a continuacin se aade la "e"ida #ermentada de la que
se desea preparar vinagre. La "arrica se de$a a"ierta para que pueda producirse un
intercam"io de o,geno su#iciente. %l proceso dura varias semanas y la e#iciencia
depende de la disponi"ilidad de o,geno .(.)
6ermenta(in en (%lti"o $%mer)ido. (-todo de "ur"u$eo)
*e trata de un proceso de #ermentacin sumergida en el que el o,geno se suministra
mediante un proceso de "ur"u$eo de aire. La velocidad de adicin del alcohol se regula de
manera que se permite una conversin muy e#iciente del alcohol al cido (llega a 0DB).
%ste sistema se "asa en ciclos comen!ando con concentraciones de cido actico
iniciales en cada ciclo del orden de ? a 10 B y cerca de >B de etanol. 7uando la
concentracin de etanol est entre un rango de 00>B y 05B se procede a descargar
el #ermentador y comen!ar un nuevo ciclo. %l mtodo Jrings el cual es usado en todo el
mundo para la produccin de vinagre. %l =cetator Jrings consiste en un depsito
provisto de agitacin donde el mismo dispositivo consigue la aireacin y la me!cla de
aire con el lquido. %ste dispositivo es una tur"ina y un esttor. La tur"ina succiona
lquido y lo me!cla con el aire y enva esta me!cla homognea a travs del esttor al
depsito. (0)%l dispositivo logra la aspiracin sin usar aire comprimido. %l =cetator
Jrings es totalmente automati!ado y as garanti!a una aceti#icacin rpida y uni#orme.
La introduccin de una nueva carga y descarga del vinagre terminado del proceso
semicontinuo de aceti#icacin puede ser reali!ada automticamente de acuerdo al
contenido de alcohol residual ya que el =cetator contiene un instrumento automtico
para medir la cantidad de etanol en el lquido #ermentado y el control de la re#rigeracin
y aireacin tam"in son automticos. %ste proceso presenta la desventa$a #rente al
anterior de que es necesario #iltrar el vinagre para eliminar las "acterias.(.)
M2todo de )oteo
%n este mtodo se permite el contacto de las "acterias con el alcohol haciendo circular
ste por una cmara de madera rellena con viruta de madera la,amente empaquetada. %l
proceso se desarrolla en continuo y el aparato se conoce como generador de vinagre. La
aireacin se consigue mediante la entrada de aire por la parte in#erior del generador. La
vida Ctil de un generador de vinagre puede ser muy larga.(11)
%l producto #inal carece de "acterias porque stas quedan #i$adas al lecho de virutas.
S%$trato a %tiliar0
*a"iendo que estos microorganismos son capaces de meta"oli!ar la glucosa etanol y el
glicerol se podra utili!ar cualquiera de estos tres. :ara evitar el gasto innecesario de
energa por parte del microorganismo al reali!ar toda la ruta meta"lica de la glucosa
se utili!ara el etanol ya que este es un producto que se o"tiene en la mayora de los
procesos de #ermentacin y ha"ra menor gasto energtico.(.)
T2(ni(a$ de medi(in del $%$trato * el /rod%(to0
*egCn la "i"liogra#a encontrada la concentracin de etanol (B v9v) se puede medir con
el mtodo de Vit en!imtico (W. (Xoehringer -annheim M+Xiopharm M%J .1)?0).
La concentracin total de acide! (B v9v) del vinagre se puede determinar por titulacin
con 3a@8 0.1 3 usando #enol#talena como indicador de p8 (.).
%n el caso de usar la glucosa como sustrato se puede determinar con un "iosensor en
lnea (XJ+5 F*+systems 'nc. IoVyo) este tam"in sirve para medir la concentracin de
etanol.
La concentracin de acido actico se puede determinar usando cromatogra#a liquida
de alto rendimiento (D).
P%ri#i(a(in del a(ido a(2ti(o
La presente invencin se re#iere a me$oras en procedimiento para la puri#icacin de cido
actico particularmente Ctil para la separacin y recuperacin de componentes que
contienen yodo y el secado de cido actico caracteri!ado por los pasos deE introducir una
corriente de cido actico que contiene agua yoduro de metilo y cido yodhdrico a una
primera !ona de destilacin mantenida a una temperatura de #ondos comprendida entre el
punto de e"ullicin de la me!cla alimentada de cido actico y agua y una temperatura de
apro,imadamente 1>.G7 y una temperatura de domos comprendida entre el punto de
e"ullicin del cido actico y una temperatura de apro,imadamente 100G7 en un punto
intermedio a sus e,tremosU separar por la parte superior de dicha primera !ona de
destilacin de mayor proporcin de yoduro de metilo y una porcin del aguaU separar del
#ondo de dicha primera !ona de destilacin la mayor proporcin del cido yodhdricoU
e,traer una corriente de la seccin media de dicha primera !ona de destilacin e introducir
por lo menos una porcin de dicha corriente a la seccin superior de una segunda !ona
de destilacin mantenida a temperaturas ligeramente superiores a las de la primera !ona
pero dentro de las mismas escalas descritas anteriormente introducir una corriente de
metanol a la seccin superior de la segunda !ona de destilacin una corriente que
contiene el resto del agua y yoduro de metilo presentes $unto con cualquier acetato de
metilo generado por la adicin del e,ceso de metanol a dicha !ona y separar en o cerca
del #ondo de dicha segunda !ona de destilacin una corriente de producto de cido
actico esencialmente seca y su"stancialmente li"re de cido yodhdrico y yoduro de
metilo.(11)
Cin2ti(a
= partir de los estudio reali!ados o"teniendo acido actico a partir del almidn de yuca
por #ermentacin continua se pudo determinar ciertos parmetros cinticos. %l almidn de
yuca se someti a hidrolisis en!imtica o"teniendo un rendimiento del D).D1 por ciento.
%l anlisis estadstico de la hidrolisis permiti plantear un modelo lineal que representa
matemticamente este proceso con las varia"les que resultaron signi#icativas al nivel del
0> por ciento. La hidrolisis sigue el modelo cintico propuesto por -ichaelis+ -enten. . =
las 50 horas de #ermentacin se o"servo la mayor velocidad de crecimiento celular (?.5? ,
10(.) -o9ml.h.). La #ormacin del producto llega a su mayor velocidad a las 5D horas. %l
sustrato proveniente de la #ermentacin alcohlica se someti a la accin "iocatalitica del
Acetobacter aceti para o"tener acido actico en #orma continua a nivel de la"oratorio. *e
o"servo que la m,ima velocidad de crecimiento celular es de 1.)1)1 , 10(D) -o9ml.h. la
cual se o"tiene a las 10 horas de proceso y la velocidad especi#ica de crecimiento celular
es de 0.0>0 h(+1). %l ciclo de tiempo optimo es de 1? horas al ca"o de las cuales se retira
acido y se renueva el sustrato para o"tener una productividad de 0.0D5 g9l.h. de acido
con una concentracin de ?.1 g9100 ml. (1>)
3iblio)ra#a
1. :arant 3. %la"oracin de gel celulsico (nata)producido por Acetobacter
xylinum so"re $ugo de arandano. Waldivia+ chile. )00>.
). Nara c. <esarrollo de mtodos de "iloga molecular para el anlisis directo de
"acterias acticas de vinagre. Iarragona+ %spaa. )000
5. Momero L. et al. @ptimi!ation o# inmovili!ation conditions #or vinegar
production. *iran Yood chips and polyurethane #oam as carriers #or
Acatobacter aceti. :rocess "iochemistry 50()001) >1?+>>>.
1. 4uintero A et al. =plicacion de la :7M cuantitativa papa aplicar la e,presin de
la alcohol deshidrogenasa en "acterias acticas. :rocces "iochemistry
51()000) )15+)>0.
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:henotypic traits relevant #or starter culture selection. 'nternational $ournal o#
#ood micro"iology 1)>()00D) 1.+>5.
.. 3doye X et al. = neY pilot plant scale aceti#ier designied #or vinegar production
in *u"+ *aharan =#rica. :rocess "iochemistry 1)()00?) 1>.1+1>.>.
?. 'Veda I et al. %lectrocatalytic properties o# Acetobacter aceti cells inmovili!ed
on electrodes #or the quinine+ mediated o,idation o# ethanol. Nournal o#
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D. Fondo I. %##icient :roduction o# =cetic =cid #rom ;lucose in a -i,ed 7ulture o#
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carrera ingeniera qumica. )00?.
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\illiams ] \ilVins.0
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almidn de yuca. Nournal articles.1)(1000)E 51+1?