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Prof. Dra. Andra E. M.

Stinghen
Disciplina Fundamentos de Microbiologia
Maro 2009


COLORAO DE GRAM
(FONTE: Colorao de Gram: Como fazer, interpretar e padronizar.
STINGHEN, A. E. M.; ALBINI, C. A. ; SOUZA, A. P. H. M, 2002)


1 TCNICA DE CONFECO DOS ESFREGAOS

No cotidiano utilizam-se diferentes formas j consagradas pelo uso para
realizao dos esfregaos, entretanto alguns cuidados bsicos devem ser tomados para
obter-se uma lmina adequada. As figuras a seguir ilustram as diversas maneiras
recomendadas para confeco do esfregao a partir de diferentes amostras clnicas




Figura 1 - Preparao de esfregao a partir de amostras coletadas com
swab.


FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995

O Swab deve ser rolado para frente e para trs, a fim de depositar uma fina camada do
material sobre a lmina.















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Figura 2 Preparao de esfregao a partir de materiais espessos ou
semi-slidos.


FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995


Na preparao de esfregaos de materiais espessos ou semi-slidos, como por exemplo
fezes, pode-se utilizar um swab, para auxiliar para espalhar o material de maneira
homognea sobre a lmina.


Figura 3 Preparo de esfregaos a partir de amostras espessas,
granulares ou mucides



Colocar a amostra sobre a superfcie da lmina






Colocar uma segunda lmina sobre a primeira contendo o material


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Pressionar o material, e rolar as duas lminas uma contra a outra




Puxar as duas lminas para espalhar

FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995




Figura 4 Preparo de esfregaos a partir de amostras lquidas


FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995


Esfregaos de materiais lquidos podem ser preparados depositando-se uma gota do
material ou do sedimento ressuspenso sobre a lmina em um circulo previamente
demarcado. Este procedimento aplica-se a materiais como urina e LCR.



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Figura 5 Esfregaos a partir de amostras concentradas por
citocentrfugao.



FONTE: MAHON e MANUSELIS JR., 1995


Se o depsito for muito espesso na rea delimitada, uma poro do material pode ser
posteriormente espalhado com auxlio de um palito de madeira para obter uma rea
mais delgada.


2 FIXAO DO ESFREGAO

Os esfregaos devem ser fixados ao calor ou com metanol

Fixao pelo calor:

- Secar os esfregaos ao ar em uma superfcie plana ou coloc-los a
60 C em um secador de lminas at que sequem por completo:
- Se o esfregao secar ao ar, passar duas a trs vezes pela chama, tomando cuidado para
evitar distores, pelo superaquecimento;
- Deixar esfriar o esfregao antes de corar.

OBS: Quando amostra muito sanguinolenta, a qualidade dos esfregaos pode ser
melhorada cobrindo-os com gua destilada durante cinco minutos aps secar e fixar
chama. Aps enxaguar e corar pelo mtodo habitual; os eritrcitos sero lisados e
eliminados deixando um fundo mais claro (GARDNER e PROVINE, 1978).



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Fixao pelo Metanol:

A fixao por metanol previne a lise de eritrcitos e resulta em um fundo limpo.
Tambm previne que esfregaos de materiais lquidos lmpidos sejam retirados da
lmina.
- Deixar os esfregaos secarem ao ar em uma superfcie plana;
- Cobrir o material com metanol, por aproximadamente 1 minuto;
- Retirar o excesso de metanol sem lavar a lmina e deixar secar ao ar;
- No usar calor antes de corar.



3 VARIAES DA TCNICA DE COLORAO DE GRAM

Mtodo de Gram clssico

A colorao clssica de Gram foi originalmente desenvolvida por Christian Gram em
1884, conforme consta em anexo. O trabalho original empregava marrom de Bismarck
ou Vesuvina como corante de fundo. Descrevemos a seguir a formulao mais similar
original consagrada em nosso meio conforme BIER (1985).

As solues utilizadas nesta metodologia esto descritas a seguir.

CRISTAL VIOLETA FENICADA
Cristal violeta............................................................1 g
lcool a 95..............................................................10 ml
Fenol fundido............................................................2 g
gua destilada..........................................................100 ml

LUGOL
Iodo metlico............................................................1 g
Iodeto de potssio.....................................................2 g
gua destilada..........................................................300 ml

FUCSINA BSICA
Fucsina bsica..........................................................0,1 ou 0,2 g
gua destilada.........................................................100 ml

a) Cobrir o esfregao por 1 minuto com soluo fenicada de cristal
violeta;
b) Escorrer o corante e cobrir o esfregao, durante 1 minuto com
soluo de lugol fraco;
c) Lavar em gua corrente;
d) Descorar com lcool 95 GL, at o descorante fluir lmpido;
e) Cobrir o esfregao com soluo de fucsina bsica por 30 segundos.

Modificao de Hucker

A colorao de Gram modificado por Hucker em 1921 amplamente utilizada na
rotina, e segundo alguns autores permite uma melhor diferenciao dos microrganismos
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(ISENBERG, 1992). Consiste na utilizao de uma soluo de violeta de metila
acrescida de uma soluo a 1% de oxalato de amnio, com funo de fixao. O
descorante utilizado pode ser etanol 95GL, acetona ou lcool-acetona, e a sua escolha
ir interferir no tempo de descolorao. As solues utilizadas nesta modificao esto
descritas a seguir (MINISTRIO DA SADE, 1997).

CRISTAL VIOLETA:
Soluo A
Violeta de metila...........................................................2 g
lcool etlico (99,5 GL)..............................................100 ml
lcool metlico (99,57 GL)...........................................100 ml

Soluo B
Oxalato de amnio.......................................................4g
gua destilada.............................................................400 ml

Misturar as solues A e B. Deixar em repouso a temperatura ambiente por 24 horas ao
abrigo da luz. Filtrar antes de usar e estocar em frasco escuro.


LUGOL
Iodeto de potssio.........................................................4,5 g
Iodo metlico................................................................3,0 g
gua destilada...............................................................450 ml

Misturas o iodeto na gua at completa dissoluo, acrescentar o iodo metlico e
misturar at dissolver completamente. Antes de usar diluir a 1/20 com gua destilada.

SAFRANINA
Safranina........................................................................2,5 g
gua destilada...............................................................500 ml

Misturar bem at completa dissoluo.

a) Cobrir o esfregao com soluo de violeta de metila por 15
segundos;
b) Adicionar igual quantidade de gua sobre a lmina. Deixar agir por
mais 45 segundos;

CUIDADO: Lavagem excessiva nesta etapa pode carrear o cristal violeta das clulas
gram positivas.
c) Escorrer o corante e lavar em gua corrente;
d) Cobrir a lmina com soluo de lugol diludo (1/20) e deixar agir por
aproximadamente 1 minuto;
e) Escorrer o lugol e lavar em gua corrente;
f) Descorar com lcool, deixando fluir lentamente sobre a
lmina, at o descorante fluir claro.
CUIDADO: Ajuste o tempo de descolorao espessura do esfregao.
g) Lavar em gua corrente
h) Cobrir a lmina com safranina e deixar agir por 30 segundos;
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i) Lavar em gua corrente;
j) Retirar o excesso de gua e deixar a lmina secar ao ar, ou com auxlio de um papel
absorvente;
j. Examinar o esfregao ao microscpio tico em objetiva de imerso
(1000 X).

Contra colorao com carbolfucsina ou fucsina bsica:

Esta modificao recomendada para detectar microrganismos gram negativos
fracamente corados. O procedimento similar ao modificao de Hucker, exceto que
o descorante recomendado etanol a 95% e o corante de fundo a carbolfucsina ou
fucsina bsica a 0,8%, cujas frmulas esto descritas a seguir (ISENBERG, 1992).

CARBOL FUCSINA
Soluo A
Fucsina bsica...............................................................0,3 g
Etanol 95%....................................................................10 ml

Soluo B
Cristais de fenol fundido.................................................5 ml
gua destilada.................................................................95 ml

Dissolver a fucsina em etanol em frasco de vidro mbar (soluo A). Adicionar o fenol
gua destilada em um frasco separado (soluo B). Misturar a soluo B A, filtrar
antes de usar, e estocar em frasco escuro a temperatura ambiente.

FUCSINA BSICA 0,8%
Fucsina bsica..................................................................0,8 g
gua destilada.................................................................100 ml


Colocar a fucsina em um frasco de vidro mbar. Adicionar gua vagarosamente,
misturando bem aps cada adio, para dissolver a fucsina. Estocar a temperatura
ambiente.


Modificao de KOPELOFF

Esta modificao recomendada para melhor visualizao e diferenciao de bactrias
anaerbias que so facilmente muito descorados. As solues utilizadas esto descritas
a seguir (ISENBERG, 1992).

CRISTAL VIOLETA ALCALINO
Soluo A
Cristal violeta....................................................................10g
gua destilada...................................................................1000 ml

Dissolver em frasco de vidro e estocar em frasco com tampa de vidro temperatura
ambiente.

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Soluo B
Bicarbonato de sdio.........................................................50 g
gua destilada...................................................................1000 ml

Disssolver em frasco de vidro e estocar em temperatura ambiente.

SOLUO DE IODO (Modificao de KOPELOFF)
Hidrxido de sdio............................................................4 g
Cristais de iodo..................................................................20 g
Iodeto de potssio..............................................................1 g
gua destilada...................................................................1000 ml


Dissolver o NaOH em 25 ml de gua destilada em um frasco de vidro mbar. Adicionar
o iodo e o iodeto de potssio e dissolver bem. Gradualmente adicionar o restante da
gua, misturando bem, aps cada adio.

DESCORANTE
lcool 95%........................................................................700 ml
Acetona..............................................................................300 ml

Mistura em frasco de vidro mbar e estocar temperatura ambiente.

SAFRANINA
Safranina O.........................................................................20 g
Etanol 95 %..........................................................................100 ml
gua destilada.....................................................................1000 ml

Em um frasco de vidro adicionar etanol em quantidade suficiente para dissolver a
safranina (aproximadamente 50 ml). Adicionar gua destilada e estocar temperatura
ambiente.

a) Cobrir o esfregao previamente fixado com a soluo A, adicionar
aproximadamente 5 gotas da soluo B. Deixar agir por 2 a 3
minutos, sem deixar a lmina secar;
b) Lavar a lmina delicadamente com o LUGOL

c) Aplicar aps novo LUGOL por 2 minutos;
d) Segurar a lmina em posio inclinada e aplicar o descorante;
e) Enxaguar imediatamente com gua corrente;
f) Contra corar com safranina de Kopeloff por 30 segundos;
g) Retirar o excesso em gua corrente e secar ao ar.
h) Examinar ao microscpio tico em objetiva de imerso.







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4 CONTROLE DE QUALIDADE

O controle de qualidade uma atividade essencial na rotina diria. Para realizar o
controle de qualidade dos corantes e da colorao de Gram, necessrio utilizar cepas
bacterianas padro, gram positivas e gram negativas, alm de observar freqentemente
o aspecto dos reagentes utilizados.


Aspecto dos reagentes

Verificar o aspecto das solues diariamente. Caso haja precipitao de algum dos
reagentes, deve-se proceder a filtrao. A evaporao pode interferir na eficcia dos
reagentes, se no utilizados com freqncia; a troca deve ser efetuada.

Uso de cepas controle
Quando um novo lote de corantes for preparado ou adquirido, realizar esfregaos de
cepas padro como: S. pyogenes (ATCC 19615), E. coli (ATCC 25922). O resultado
esperado :

- Bacilos Gram Negativos - rosa
- Cocos Gram Positivos - violeta escuro

Uma alternativa a este mtodo, quando no se dispe das cepas padro pode ser
realizada corando-se um esfregao de raspado da mucosa bucal, que dever conter
organismos gram positivos e gram negativos, assim como clulas epiteliais
(GARDNER e PROVINE; 1978).
Nos exames bacterioscpicos com material contendo leuccitos e clulas epiteliais,
extremamente importante observar a colorao nuclear e citoplasmatica. A colorao de
Gram adequada resultar na observao dos ncleos corados em vermelho e citoplasma
corado em rseo. Uma tendendo para o violeta indicar que a descolorao no foi
suficiente.

Limitaes da colorao de Gram

inestimvel o auxlio efetivo da colorao de Gram no diagnstico
microbiolgico, entretanto em algumas situaes contra indicada a sua utilizao,
como por exemplo, na pesquisa de estruturas bacterianas como cpsulas e esporos, ou
na pesquisa de micobactrias e fungos filamentosos.
Alguns microrganismos gram positivos em cultivos superiores a vinte e quatro
horas podem se apresentar gram negativos. Microrganismos que sofreram ao de
determinados antimicrobianos podem apresentar-se falsamente gram negativos; a
recproca no verdadeira. Convm lembrar que a maioria das interpretaes equvocas
de esfregaos corados pelo Gram devem-se a falhas na preparao da lmina, como um
esfregao demasiado espesso, excessiva fixao pelo calor, ou descolorao insuficiente
ou prolongada (GARDNER e PROVINE, 1978).
O achado de microrganismos vermelhos prximos a elementos celulares
corados fortemente como gram positivos em uma parte mais espessa do esfregao,
confirma que se tratam de organismos gram negativos e que no so bactrias gram
positivas descoradas em excesso.

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Cuidados
- Inspecionar diariamente os corantes, os quais devem ser estocados a temperatura
ambiente em local sem variaes bruscas de temperatura, a fim de se evitar
precipitao, e ao abrigo da luz;
- Comparar os resultados finais da morfologia pelo Gram com a cultura,
caso resultados diferentes do esperado forem obtidos, revisar tanto a
colorao quanto a cultura.

OBS: Nem todos os microrganismos corados pelo Gram podem ser
cultivveis.
Lminas de referncia so teis para comparao e treinamento.


5 DESCRIO MORFOLGICA

Exemplos de maneiras de caracterizar morfologicamente os microrganismos mais
encontrados:

- Cocos gram positivos
- Cocos gram positivos em cadeias (sugestivos de estreptococos)
- Cocos gram positivos agrupados (sugestivos de estafilococos)
- Cocos gram positivos aos pares
- Diplococos gram positivos lanceolados e/ou capsulados (sugestivos de pneumococos)
- Cocobacilos gram positivos
- Bacilos gram positivos
- Bacilos gram positivos sugestivos de Dderlein
- Bacilos gram positivos esporulados
- Bacilos gram positivos filamentosos
- Bacilos gram positivos corineformes
- Cocobacilos gram variveis (sugestivos de Gardnerella spp.)
- Cocos gram negativos
- Diplococos gram negativos intra e/ou extracelulares (sugestivos de Neisseria spp.)
- Bacilos gram negativos
- Bacilos gram negativos curvos (sugestivos de Mobiluncus spp.)
- Bacilos gram negativos atpicos sugestivos de microbiota anaerbia
- Bacilos gram negativos espiralados
- Bacilos gram negativos pleomrficos (sugestivos de Haemophilus
spp.)
- Cocobacilos gram negativos
- Clulas leveduriformes (com ou sem pseudo-hifas)
- Filamentos ramificados gram positivos (sugestivos de actinomicetos)
- Associao fuso espiralar






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6 ANEXO


Artigo original sobre a colorao de Gram

Considerando a valiosa contribuio ao estudo da Microbiologia mdica humana,
prestada pelo fsico e mdico dinamarqus Hans Christian Joachin Gram (1853-1938),
apresentamos a seguir o artigo original sobre a tcnica de colorao que recebeu seu
nome e at hoje utilizada em grande parte dos laboratrios de Microbiologia.

Gram, C. Ueber die isolirte Farbung der Schizomyceten in Schnitt-und
Trockenprparaten. Fortschritte der Medicin, v. 2, p. 185-189, 1884.

"(I WISH TO THANK HERR DR. RIESS, Director of the General Hospital of Berlin
for the facilities and equipment to perform the following studies).
The differential staining method Koch and Ehrlich for tubercle bacilli gives very
excellent results either with or without counter-staining, since the bacilli stand out very
clearly due to the contrast effect.
It would be very desirable if a similar method for the differential staining of other
Schizomycetes were available which could be used routinely by the microscopist.
My studies-as associate of Herr Dr. Friedlander in the morgue of the city hospital in
Berlin-have attempted to demonstrate cocci m tlssue sections of lungs of those who
have died of pneumonia as well as in experimental animals. As Friedlander has already
mentioned briefly in his paper on the micrococci of pneumonia, I have discovered by
experimentation a procedure for the differential staining of pneumococci. In my
procedure the nucleus and other tissue elements remain unstained, while the cocci are
strongly stained. This makes them much easier to locate than previously, since in
ordinary preparations from pneumonia patients, where such a large amount of exudate
occurs, they are impossible to see.
Further studies on the usefulness of this method for other Schizomycetes has gradually
shown that this method is an almost general method for all tissue sections and dried
preparations....
For staining the ordinary aniline-gentian violet solution of Ehrlich is used. The
appropriate sections must be carried up to absolute alcohol and taken from this directly
into the dye solution. They should remain in the dye for 1-3 minutes (except tubercle

bacilli, which should remain as usual 12-24 hours). Then they are placed in a solution of
iodine-potassium iodide in water (iodine 1.0 part, potassium iodide 2.0 parts, water
300.0 parts) with or without a light rinse with alcohol and allowed to remain there for 1-
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3 minutes. During this time, a precipitate forms, and the previously dark blue-violet
sections now become dark purple-red. (Footnote: This purple-red color is not soluble in
water but dissolves very easily in alcohol. The chemical studies will be continued at a
later time.) They are then placed in absolute alcohol until they are completely
decolorized. It is well to change the alcohol once or twice during this step. Then the
sections are cleared as usual in clove oil, in which the rest of the dye is dissolved. The
nucleus and fundamental tissue is stained only a light yellow (from the iodine) while the
Schizomycetes, if any are present in the preparation, are an intense blue (often almost
black). The intensity of the staining has not been equaled by any of the current staining
methods. This presents another great advantage of our method. It is possible after the
decolorization in alcohol to place the sections for a moment in a weak solution of
bismarck brown or vesunne, and then dehydrate again with alcohol, in order to achieve
a counterstain. The nucleus will appear brown, while the Schizomycetes will remain
blue.
In this way it is possible to prepare doubly-stained preparations that are just as excellent
as those of the tubercle bacillus made after the method of Koch and Ehrlich. Permanent
preparations in Canada balsam-xylene or gelatine-glycerol ren~ain unchanged after 4
months.
This method is very quick and easy. The whole procedure takes only a quarter-hour, and
the preparations can remain many days in clove oil without the Schizomycete cells
becoming decolorized.
It is also useful for dried preparations. It is performed exactly as for tissue sections,
except that one treats the cover slip just like a section.
I have tried many times different aniline dyes (rubine-aniline, fuchsinaniline and simple
gentian violet solution), but without success. In addition, tincture of iodine or potassium
iodide solution, as opposed to iodinepotassium iodide solution, are also ineffective,
since the Schizomycetes then are also decolorized. When the sections are treated with
water or dilute alcohol, the results are variable
I. After iodine treatment, the following forms of Schizomycetes are not decolorized by
alcohol.
(a) The coccus of bronchial pneumonia ( 19 cases).
(b) Pyogenic Schizomycetes (9 cases)
(c) Cocci of a liver abscess . . . (1 case)
(d) Cocci and small bacilli in circumscriptive infiltration of the lungs ( 1 case). . . .
(e) Cocci of osteomyelitis (2 cases).
(f) Cocci of suppurative arthritis following scarlet fever ( 1 case)

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(g) Cocci of suppurative nephritis following cystitis (3 cases)
(h) Cocci of multiple brain abscesses following empyema (2 cases)
i. Cocci of erysipelas ( 1 case)
(k) Tubercle bacilli (5 cases)
(1) Anthrax bacilli (3 cases) (in mice ) .
(m) Putrefactive Schizomycetes (bacilli and cocci)....
II. The following forms of Schizomycetes are decolorized in alcohol after iodine
treatment.
(a) 1 case of bronchial pneumonia with cocci that formed cap
(b) 1 case of bronchial pneumonia with cocci that did not form capsules.
(c) Typhoid bacilli (5 cases) are decolorizcd either with or without iodine treatment very
easily by alcohol. I have attempted to leave the sections in the dye for as long as 24
hours but without any better results.
Iwould like to make one closing remark. The behavior of the cell nucleus and the
Schizomycetes to aniline dyes in other methods are almost identical, whereas with the
present staining method a very distinct difference IS visible.
Studies- on Schizomycetes have been significantly improved by the use of this method.
It is because of this that I publish my results, although I am well aware that they are
brief and with many gaps. It is to be hoped that this method will also be useful in the
hands of other workers.
Editor's note. I would like to testify that I have found the Gram method to be one of the
best and for many cases the best method which I have ever used for staining
Schizomycetes."











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