Tesis 126

i
VALIDACIN DEL MTODO ANALTICO PARA LA CUANTIFICACIN DE

BACITRACINA EN EL LABORATORIO DE CONTROL DE CALIDAD DE UNA
INDUSTRIA FARMACUTICA VETERINARIA

JOHANNA CAROLINA VELANDIA CASTELLANOS

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C. COLOMBIA
2008

ii

Articulo 23 de la R resolucin N
o
13 de Julio de 1946

La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Solo vela por que no se publique nada contrario al dogma y a la
moral catlica y por que las tesis no contengan ataques contra persona alguna, antes
bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia .

iii



TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
Para adoptar al titulo de

Microbiloga Industrial

DIRECTORA
VIVIANA PEA PEZ

CO-DIRECTORA
JANETH ARIAS PALACIOS
Bacteriloga M.Sc- M.Ed

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
BOGOT D.C. COLOMBIA
2008

iv


AUTOR

APROBADO

Viviana Pea Pez
DIRECTORA

Cindy Fernndez Lpez
JURADO

Janeth Arias Palcios
Bacteriloga M.Sc- M.Ed
CO-DIRECTORA

Jazmn Andra Castellanos
Qumica
JURADO

v


AUTOR

APROBADO

Ingrid Schuler Ph.D
Biloga
Decana Acadmica

Janeth Arias Palacios
Bacteriloga M.Sc - M.Ed
Directora de Carrera

vi

AGRADECIMIENTOS

A mis padres y hermana, gracias por su constante, incondicional e invaluable apoyo
emocional, intelectual y econmico, que me permiti llevar a cabo este proyecto.
Buscando en todos y cada uno de los segundos de mi vida nunca defraudar su
confianza. Gracias por que me han dado todo, desde la vida, educacin, formacin
intelectual, personalidad creativa y competente.

A la Microbiologa Industrial Viviana Pea Pez, por ser una gran directora de tesis.
No me habra sido posible llevar a cabo esta investigacin sin su ayuda, sus
conocimientos, su orientacin, gua, perspicacia, su apoyo, dedicacin y por su gran
amistad.

A la Doctora Janeth Arias Palacios, por sus conocimientos, orientacin, apoyo y
respaldo durante el tiempo de realizacin de este trabajo y por creer en este proyecto.

A los Doctores Sergio Enrique Castro Urea y Sergio Castro Brandon, de la
empresa VICAR FARMACEUTICA S.A., por su incondicional respaldo, apoyo
econmico, por permitirme hacer uso del laboratorio y los implementos en el,
hospitalidad y amabilidad.

A la Qumica Farmacutica Johanna Garcia, por su oportuna e invaluable
colaboracin en textos gua y sus conocimientos, por ser ficha clave y esencial en la
realizacin y conclusin de esta investigacin y por su gran amistad.

A la Qumica Sofa Mariana Riao Torres, por su incondicional apoyo, orientacin y
ayuda. Por su oportuna e invaluable colaboracin, sus conocimientos, siendo ficha clave
y esencial en la realizacin de esta investigacin y por su gran amistad.

vii
TABLA DE CONTENIDO
Pagina

1. RESUMEN 1
ABSTRACT 2
2. INTRODUCCIN 3
3. REVISIN DE LITERATURA 6
3.1 ANTIBITICOS 6
3.1.1 Definicin 6
3.1.2 Clasificacin de los antibiticos 7
3.1.2.1 Espectro de accin 7
3.1.2.2 Mecanismo de accin 7
3.1.2.2.1 Antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular 7
3.1.2.2.2 Antibiticos que actan sobre la membrana celular 8
3.1.2.2.3 Antibiticos que inhiben la sntesis de protenas 9
3.1.2.2.4 Antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos. 9
3.1.2.3 Estructura qumica 10
3.1.2.3.1 Aminoglucosidos 10
3.1.2.3.2 Anfenicoles 10
3.1.2.3.3 Antimicobacterianos 10
3.1.2.3.4 Cefalosporinas y otros B-lactamicos 11
3.1.2.3.5 Glucopeptidos 11
3.1.2.3.6 Lincosaminas 11
3.1.2.3.7 Macrlidos 11
3.1.2.3.8 Penicilinas 11
3.1.2.3.9 Quinolonas 12
3.1.2.3.10 Sulfamidas y diaminopirimidinas 12
3.1.2.3.11 Tetraciclinas 12
viii
3.1.2.3.12 Polipeptidicos 13
3.2 BACITRACINA 13
3.2.1 Descubrimiento 13
3.2.2 Sinnimos 13
3.2.3 Formula emprica 14
3.2.4 Formula estructural 14
3.2.5 Peso molecular 14
3.2.6 Descripcin, Solubilidad, Conservacin, Estabilidad 14
3.2.7 Espectro antimicrobiano de accin 15
3.2.8 Tipo y mecanismo de accin 16
3.2.9 Farmacocintica 16
3.2.10 Indicaciones y administracin 17
3.2.11 Interacciones 17
3.2.12 Efectos adversos 17
3.3 BACITRACINA ZINC 18
3.3.1 Descripcin, solubilidad, conservacin 18
3.3.2 Estabilidad 18
3.3.3 Incompatibilidades 18
3.3.4 Accin farmacolgica 18
3.3.5 Indicaciones de uso, dosis recomendadas, vas de aplicacin 19
3.3.6 Condiciones de almacenamiento 19
3.4 BACITRACINA METILEN DISALICILATO 19
3.4.1 Descripcin, solubilidad, conservacin 19
3.4.2 Indicaciones de uso 19
3.5 Micrococcus luteus 20
3.5.1. Clasificacin cientfica 20
3.5.2 Caractersticas 20
ix
3.5.3 Bioqumica 21
3.5.4 Patognesis 21
3.5.5 Usos industriales 21
3.6 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS 22
3.6.1 Definicin 22
3.6.1.1 Definicin General 22
3.6.1.2 Definicin Analtica 22
3.6.2 Mtodos Susceptibles a ser Validados 22
3.6.3 Entorno Legal 23
.6.3.1 Norma de Correcta Fabricacin de Medicamentos 23
3.6.3.2 Farmacopeas 23
3.6.4 Fases en el desarrollo de un mtodo analtico y criterios de validacin 23
3.6.4.1 Definicin de las caractersticas de practicabilidad 23
3.6.4.2 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para anlisis 24
3.6.4.3 Puesta a punto. Caractersticas de idoneidad 24
3.6.4.4 Caractersticas de fiabilidad 25
3.7 CARACTERSTICAS DEL DESEMPEO ANALTICO 26
3.7.1 SELECTIVIDAD 27
3.7.1.1 Definicin 27
3.7.1.2 mbito de aplicacin 28
3.7.1.2.1 Segn el objetivo de ensayo 28
3.7.1.2.2 Segn la tcnica analtica aplicada 28
3.7.2 LINEALIDAD 29
3.7.3 PRECISION 30
3.7.3.1 Definiciones 30
x
3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisin 31
3.7.3.2.1 Reptibilidad 31
3.7.3.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental 32
3.7.3.2.1.2 Repetibilidad del mtodo 32
3.7.3.2.2 Precisin inmediata 32
3.7.3.2.3 Reproducibilidad 32
3.7.4 EXACTIDUD 33
3.7.4.3 Procedimiento de determinacin de la exactitud 33
3.7.4.4 Determinacin 34
3.7.5 LIMITE DE DETECCION Y LMITE DE CUANTIFICACION 35
3.7.5.3 Procedimientos de determinacin del LD y LQ 36
3.7.6 ROBUSTEZ 36
3.7.7 ESPECIFICIDAD 38
3.7.7.2 Determinacin 38
3.8 VALORACION MICROBIOLOGICA DE ANTIBIOTICOS 39
3.8.1 Generalidades 39
3.8.2 Definiciones 39
3.8.2.1 Valoracin de antibiticos 39
3.8.2.2 Potencia real 40
3.8.2.3 Potencia asignada 40
xi
3.8.2.4 Potencia estimada 40
3.8.2.5 Limites de confianza (Intervalo de confianza) 40
3.8.3 METODO 40
3.8.4 Validacin 41
3.8.4.1 Linealidad 41
3.8.4.2 Repetibilidad (Precisin) 41
3.8.4.3 Exactitud 42
3.8.4.4 Selectividad 42
4. FORMULACIN DEL PROBLEMA 43
5. JUSTIFICACION 45
6. OBJETIVOS 47
7. MATERIALES Y METODOS 48
7.1 Estndar de Referencia 48
7.2 Muestras de estudio 48
7.3 Preparacin y estandarizacin de la suspensin del microorganismo de ensayo 49
7.3.1 Cultivo bacteriano 49
7.3.2 Preparacin del inoculo 49
7.3.3 Determinacin de la cantidad de suspensin madre para inoculo 49
7.4 Preparacin del estndar (Mtodo de la curva patrn) 50
7.4.1 Diluciones del patrn 50
7.4.2 Diluciones finales del patrn 50
7.5 Preparacin de la muestra 51
7.5.1 Dilucin de la muestra 51
7.5.2 Dilucin de prueba de la muestra 51
7.6 Obtencin del placebo 51
7.7 Preparacin de placas de valoracin 52
7.8 Validacin del mtodo de cuantificacin del principio activo (USP, 30) 52
7.8.1 Especificidad 52
xii
7.8.2 Selectividad 53
7.8.3 Linealidad del sistema 54
7.8.4 Linealidad del mtodo 54
7.8.5 Precisin del mtodo 55
7.8.6 Exactitud 55
7.8.7 Limite de deteccin 55
7.8.8 Limite de cuantificacin 56
8. RESULTADOS Y DISCUCION 57
8.1 Especificidad del mtodo 57
8.2 Selectividad del mtodo 57
8.3 Linealidad del sistema 59
8.4 Linealidad del mtodo Bacitracina Zinc 59
8.5 Linealidad del mtodo Bacitracina Metilen Disalicilato 60
8.6 Precisin del mtodo 61
8.7 Exactitud del mtodo 64
8.8 Limite de deteccin 65
8.9 Limite de cuantificacin 65
9. CONCLUIONES 67
10. RECOMENDACIONES 69
11. REFERENCIAS 70
12. ANEXOS 74

xiii
LISTA DE FIGURAS
Pagina
Figura 1. Bacitracina (Segn Maier y Groger, 1972) 14
Figura 2. Diferentes tipos de estudio en la precisin 30

xiv
LISTA DE TABLAS
Pagina
Tabla 1. Espectro de accin de la Bacitracina (Segn Wege, 1969) 16
Tabla 2. Datos Requeridos para la Validacin de Mtodos Analticos (USP 30) 26
Tabla 3. Variacin de factores en el estudio de la precisin 31
Tabla 4. Diluciones de la curva patrn (intervalo de concentraciones 0.1 a 0.25 UI/ml) 50
Tabla 5. Diluciones de la curva patrn (intervalo de concentraciones 0.5 a 2.5 UI/ml) 51
Tabla.6 Diluciones del las muestras para la evaluar la Exactitud 55
Tabla. 7 Diluciones del las muestras para determinar el limite de deteccin 56

xv
LISTA DE ANEXOS
Pagina
ANEXO 1. CALDOS, MEDIOS DE CULTIVO Y BUFFERS 74
ANEXO 2. LINEALIDAD DEL SISTEMA 75
ANEXO 3, LINEALIDAD DEL MTODO BACITRACINA ZINC 80
ANEXO 4. LINEALIDAD DEL MTODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO 85
ANEXO 5. ESPECIFICIDAD BACITRACINA ZINC 90
ANEXO 6. ESPECIFICIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO 91
ANEXO 7. SELECTIVIDAD BACITRACINA ZINC 92
ANEXO 8. SELECTIVIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO 96
ANEXO 9. PRECISIN DEL METODO BACITRACINA ZINC 100
ANEXO 10. PRECISIN DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO 110
ANEXO11. PRECISION DEL SISTEMA 120
ANEXO 12. EXACTITUD METODO BACITRACINA ZINC 121
ANEXO 13. EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO 127
ANEXO 14. LIMITE DE CUANTIFICACION 133
ANEXO 15. LIMITE DE DETECCIN 136

1
1. RESUMEN

Se realizo la validacin del mtodo analtico para la cuantificacin de Bacitracina, para ser
utilizado en el control de calidad de materias primas y en los productos farmacuticos con
este principio activo. En el presente trabajo se describi y desarrollo el proceso de
validacin de la valoracin microbiolgica de antibiticos en cilindro-placa (difusin en
agar), para la determinacin cuantitativa de Bacitracina Zinc al 15% y Bacitracina Metilen
Disalicilato al 11%, que incluye los requisitos exigidos en la determinacin de parmetros
analticos de linealidad del sistema, linealidad del mtodo, especificidad, exactitud,
selectividad, limite de deteccin, limite de cuantificacin y la precisin expresada en sus dos
formas: repetibilidad y reproducibilidad.
Se demostr mediante el diseo experimental, con la evaluacin estadstica de los
resultados experimentales y teniendo como base los criterios de aceptacin permitidos, que
el mtodo analtico es especfico, selectivo, lineal (r
2
0. 993 linealidad del sistema, r
2
0.995
linealidad del mtodo Bacitracina Zinc y r
2
0.99 linealidad del mtodo Bacitracina Metilen
Disalicilato), preciso (CV< 5%), exacto (Sesgo < 3% y t
exp.
<t
tab.
) en el intervalo de
concentraciones estudiadas. Se obtuvo el lmite de cuantificacin en la concentracin 0.02
UI/ml y el lmite de deteccin en la concentracin 0.005 UI/ml.
De esta forma mediante los estudios realizados se establece que las caractersticas de
desempeo analtico cumplen con los requisitos para la aplicacin analtica propuesta
siendo confiable para ser utilizado en la comprobacin de las especificaciones de calidad.

2
ABSTRACT

The validation of the analytical methods method for the quantitative of Bacitracin was carried
out to be used in the quality control in a raw material and the pharmaceutical products
finished with this active principle. In this work was described and developed the validation
process of microbiological cylinder-plate determination method for antibiotics (diffusion in
agar) for the quantitative determination of Bacitracin Zinc 15% and Bacitracin Methylene
Disalicylate 11%, it includes the necessary requirements in the determination of the analytic
parameters: method linearity, system linearity, specificity, exactness, selectiveness,
detection limit, quantification limit and accuracy, which was expressed in its 2 forms:
repeatability and reproducibility.
It was demonstrated by through experimental design, with the statistical evaluation of the
experimental data and having like base the allowed approaches of acceptance that the
analytic method is specific, selective, lineal (r
2
0. 993 system linearity, r
2
0.995 method
linearity of Bacitracin Zinc y r
2
0.99 method linearity Bacitracin Methylene Disalicylate),
precise (CV< 5%), exact (Sesgo < 3% y t
exp.
< t
tab.
) in the interval of studied concentrations.
The quantification limit and detection limit was 0.02 UI/ml and 0.005 UI/ml respectively. For
that reasons, states that the characteristics of analytic acting fulfill the requirements for the
application analytic proposal, therefore, they are reliable and may be used in the checking of
the quality specifications of the raw material and the pharmaceutical products finished with
this active principle.

3
2. INTRODUCCIN

La validacin es el proceso establecido para la obtencin de pruebas documentadas,
mediante estudios sistemticos de laboratorio y demostrativos, de que un mtodo de
anlisis es lo suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado previsto
dentro de intervalos definidos. El proceso de validacin permite el conocimiento de las
caractersticas de funcionamiento del mtodo y proporciona un alto grado de confianza
en el mismo y en los resultados obtenidos al aplicarlo. (AEFI, 2001)
Se define como mtodo analtico a la adaptacin especfica de una tcnica analtica
para un propsito de medicin seleccionado. La validacin de un procedimiento analtico
es un procedimiento para establecer por medio de estudios laboratoriales una base de
datos que demuestren cientficamente que un mtodo analtico tiene las caractersticas
de desempeo (exactitud, precisin, especificidad, lmite de deteccin, lmite de
Cuantificacin, linealidad y intervalo de linealidad) que son adecuadas para cumplir los
requerimientos de las aplicaciones analticas pretendidas. Implica la demostracin de la
determinacin de las fuentes de variabilidad y del error sistemtico y al azar de un
procedimiento, no solo dentro de la calibracin sino en el anlisis de muestras reales.
(USP, 30)
La valoracin microbiolgica de antibiticos es un mtodo analtico que permite bajo las
condiciones adecuadas demostrar la actividad (potencia) de los antibiticos por medio
de su efecto inhibidor sobre los microorganismos. Se utilizan dos mtodos generales: la
valoracin en difusin en gel de agar (cilindro placa) y la valoracin turbidimetrica en
tubo. (USP, 30) bsicamente en los dos mtodos la potencia de un antibitico se estima
mediante la comparacin de la actividad de un producto (problema) y la de un muestra
Estndar de referencia (patrn) en presencia de un microorganismo testigo. (AEFI,
2001)
VICAR FARMACEUTICA S.A. fabrica y comercializa productos farmacuticos
veterinarios, posee una lnea de ms de cuarenta productos en el mercado para la
sanidad animal. Dentro de estos productos se encuentra Bactran, antibitico cuyo
principio activo dependiendo su presentacion es la Bacitracina Zinc o Bacitracina Dimetil
Salicilato.
Posee un espectro antimicrobiano de accin activa frente algunas bacterias Gram
Positivas como estafilococo, estreptococo (particularmente el estreptococo del grupo A)

4
y clostridio. Es tambin activa frente a Actnomyces, Treponema pallidum y algunas
especies Gram negativas, como Neisseria y Haemophilus influenzae; sin embargo, la
mayora de los microorganismos Gram. Negativos son resistentes. (Sweetman, C.
2003). Su espectro de accin abarca tambin, algunos corinebacterias, espiroquetas,
Nocardidia, Entamoeba histolytica. (Trolldenier, 1985). Las salmonellas, E.coli, Proteus,
los hongos y los virus son resistentes. Los grmenes sensibles son inhibidos por una
concentracin comprendida entre 0,005 y 2,0 UI/mg. Los que necesitan 50 UI/mg o mas
se consideran resistentes. (Trolldenier, 1900). La accin de la bacitracina es
bacteriosttica y bactericida. La dosis requerida para que sea bactericida es 5 10
veces mayor. La bacitracina influye sobre importantes sistemas enzimticos. Impide la
construccin de la pared celular bloqueando la desfosforilizacion (Parthier, 1969). La
Bacitracina interfiere en la sntesis de la pared celular bacteriana al bloquear las
funciones de las molculas transportadoras de lpidos que transfieren las subunidades
de la pared celular a travs de la membrana. La Bacitracina se une al undecaprenol-
pirofosfato, bloqueando su desfosforilacin, e impidiendo por lo tanto, la regeneracin
del transportador de membrana.. (Sweetman, C. 2003). En los estafilococos inhibe la
incorporacin del acido glutmico durante la fase de proliferacin. (Trolldenier, 1984)
La Bacitracina y la Bacitracina zinc se aplican por va tpica, a menudo junto con otros
antimicrobianos como la Neomicina o Polimixina B, y algunas veces con
corticosteroides, en el tratamiento de las infecciones locales. La bacitracina se emplea
en infecciones de piel (piodermitis, heridas infectadas, Impetigo contagioso, foliculitis,
furunculosis, ulcera decubitus, dermatitis infecciosa eczematoid, escabiosis, y
dermatofitosis), conjuntivas (causadas por S. aureus, S. pyogenes, entre otros),
sinusitis, faringitis, traqueobronquitis, infecciones mandibulares (actinomicosis),
oculares, entre otros. La bacitracina ha sido efectivamente usada oralmente para el
manejo de amebiasis intestinal, pero se encuentran disponibles otros amebicidas ms
potentes. (Remingtons. 1980)
La misin de VICAR FARMACEUTICA S.A. es contribuir al progreso de la Sanidad
Animal y de la Medicina Veterinaria en los pases hispanoamericanos, suministrando a
los mdicos veterinarios productos farmacuticos de la ms alta calidad en el momento
oportuno. Para alcanzar el propsito de la misin, la validacin de cada uno de los
mtodos analticos (como por ejemplo la valoracin microbiolgica de Bacitracina)
aplicados en un laboratorio especfico, podr demostrar con un alto grado de confianza,
por medio de evidencia documentada que el proceso producir de forma consistente y
permanente productos que poseen las caractersticas de calidad predefinidas,

5
compitiendo y generando valor al cliente. Con mtodos de anlisis validados se
alcanzan las metas de calidad que se haya trazado como parte de los procesos de
mejoramiento contino del sistema de calidad, formando una empresa cada vez ms
lder en la industria farmacutica veterinaria del pas.
El presente trabajo tiene como objetivo describir el proceso de validacin del mtodo
analtico para la cuantificacin de Bacitracina efectuado en el laboratorio de VICAR
FARMACEUTICA S.A. mediante estudios de laboratorio que permitan la determinacin
y el estudio de las caracterstica de desempeo analtico para la validacin del mtodo.

6
3. REVISION DE LITERATURA

3.1. ANTIBITICOS
3.1.1 Definicin
El primero que expres el concepto de antibitico fue Waksman (1942): los antibiticos
son sustancias de accin antimicrobiana producidas por microorganismos o plantas
superiores en el curso de su metabolismo normal, sustancias que inhiben el crecimiento
de otros microorganismos en concentraciones mnimas. Esta definicin ha sido
ampliada posteriormente en virtud de los conocimientos adquiridos sobre su obtencin,
y con objeto de deslindar otros productos metablicos: un antibitico es una sustancia
qumicamente definida, producida en el metabolismo de clulas vivas y aislada de ellas
por primera vez, o uno de sus derivados producidos por mtodos sintticos o
biosintticos, el cual ejerce su accin bacteriosttica o bactericida en pequea
concentracin contra microorganismos vegetales y animales.( Brunner y Machek,
1962).
Algunos de los antibiticos mas empleados son producidos por actinomicetales
(Estreptomicina, Cloranfenicol, Tretraciclinas, Eritromicina), hongos (Penicilina,
Griseofulvina) y bacterias (Polimixinas, Bacitracina). (Trolldenier, 1900)
Bacteriostatico: Inhibicin o interrupcin de la multiplicacin microbiana tras un periodo
variable de latencia, en general reversible Estos antimicrobianos inhiben la
multiplicacin, no destruyen, son antibiticos bacteriostticos de tal manera que cuando
el microorganismo desaparece puede volver a crecer, el fin es que el sistema inmune
acabe con ellos despus de haber tomado el antibitico. (Thrum y Bocker, 1971)
Bactericida: Eliminacin irreversible de los grmenes en periodo de reproduccin o
reposo sin dao para el microorganismo. Las condiciones previas son: dosificacin
ptima, necesaria duracin teraputica, concentracin suficiente donde est localizada
la infeccin.
La accin bactericida in Vitro se desarrolla en tres fases:
1. fase de latencia: generalmente corta, dura unos 5 15 minutos. Es probable que
entonces tenga lugar la penetracin en la clula bacteriana.

7
2. fase de muerte: inhibicin del crecimiento o muerte de los grmenes. El nmero de
bacterias que sobreviven disminuye espontneamente mientras dura la accin letal si la
concentracin es constante.
3. fase tardida: la reduccin de grmenes disminuye, pero sin que ces por completo.
Esta fase tambin se puede llamar persistencia. (Thrum y Bocker, 1971)
3.1.2 Clasificacin de los antibiticos
3.1.2.1 Espectro de accin
Todos los antibiticos poseen un espectro de actividad conocido sobre los grmenes
patgenos en virtud a su mecanismo de accin especfica. Por los microorganismos o
agentes afectados, dividimos los antibiticos en bacteriostticos, bactericidas,
fungistticos, virostticos, rickettsiostticos y citostticos. En cuanto al nmero de
especies o familias sensibles el espectro de los antibiticos puede ser reducido, medio o
amplio. El espectro es muy variable siendo la mayora de tipo amplio el mayor en
cefalosporinas de 4 generacin, carbapenemas y piperacilina-tazobactam, seguido de
cefalosporinas de 3 generacin incluyendo Gram Negativos, Gram Positivos y
espiroquetas. De espectro ms reducido destacan la bencilpenicilina y
fenoximetilpenicilina (estreptococos y Neisseria), cloxacilina (antiestafilococo) y
aztreonam (slo Gram negativos) y los de espectro medio suelen ser activos frente a
grmenes Gram Positivos y Gram negativos y a ellos pertenecen las penicilinas, los
antibiticos macrlidos, algunos polipeptdicos y los aminoglucosdicos, la amoxicilina-
clavulnico y cefalosporinas de 1 y 2 generacin.(Trolldenier, 1900)
3.1.2.2 Mecanismo de accin
Otra forma de agrupar los antibiticos es en funcin de las "dianas" sobre las que
actan y con las que interfieren:
3.1.2.2.1 Antibiticos que interfieren con la biosntesis de la pared celular
Su accin esta limitada a la fase de proliferacin. La mayora de los antibiticos inhibe la
sntesis de diferentes compuestos celulares. Algunos de los frmacos ms empleados
interfieren con la biosntesis de peptidoglicanos (PG), el principal componente de la
pared celular. Ejercen su efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Inhibe
determinados pasos en el ciclo de la sntesis y ensamblaje del PG, provocan la
acumulacin de precursores de PG desencadenando autolisinas de la bacteria, que
degradan el PG provocando la lisis celular por ingreso de agua a la clula. Estos

8
antibiticos no lesionan las clulas humanas ya que stas no poseen pared celular.
(Pareja Iaez, 1998)
En conclusin esta clase de antibiticos, inhiben la sntesis de peptidoglicanos . Una
vez que se inhibe la sntesis de la pared celular puede ocurrir autolisis enzimtica de la
pared celular. Sin la influencia restrictiva de la pared celular, la elevada presin osmtica
dentro de la clula hace estallar a la membrana interna y/o externa de la bacteria. Por lo
tanto estos antibiticos son generalmente bactericidas. (Figueroa , P y Luna Torres, L.
2006).
Algunos antibiticos que presentan esa actividad son:
- Betalactmicos que dependiendo de su estructura qumica, se clasifican en penicilinas,
cefalosporinas o carbapnem. Todos los antibiticos betalactmicos comparten una
estructura qumica similar en forma de anillo. Este anillo impide la unin de los pptidos
a las cadenas laterales en el proceso de formacin de la pared celular. Estos
compuestos inhiben la sntesis de peptidoglicanos pero no interfieren con la sntesis de
componentes intracelulares. De este modo, continan formndose materiales dentro de
la clula que aumentan la presin sobre la membrana hasta el punto en que sta cede,
el contenido celular se libera al exterior, y la bacteria muere. (Pareja Iaez, 1998).
- Fosfomicina: Inhibe el primer estadio de la sntesis de peptidoglicano al competir por
analoga estructural con el PEP. (Pareja Iaez, 1998).
- Cicloserina: Se comporta la D-alanina, inhibiendo la actuacin de la racemasa que
convierte la L-ala a D ala, as como la reaccin de unin de dos D-ala. (Pareja Iaez,
1998).
- Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidacin, es decir la unin de
diversas unidades
disacardicas. (Pareja Iaez, 1998).
- Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilacin, e
impidiendo por lo tanto, la regeneracin del transportador de membrana. (Pareja Iaez,
1998).
3.1.2.2.2 Antibiticos que actan sobre la membrana celular
A diferencia de los antibiticos que actan a nivel de pared, los que interfieren con la
membrana celular ejercen sus efectos independientemente de que el microorganismo

9
est o no creciendo. Suelen carecer de especificidad (afectan a membranas de
procariotas y de organismos superiores), por lo que resultan ms o menos txicos para
los mamferos y, en general, han encontrado escasa aplicacin clnica. Algunos de los
antibiticos que pertenecen a este grupo son: Polienos, Polimixinas, Imidazoles, entre
otros. (Pareja Iaez, 1998). La Estreptomicina, la Polimixina B y la Colistina, perturban
las funciones de la membrana citoplasmtica que regula las condiciones de
permeabilidad, de tal modo que puede producirse la muerte de la clula por
desregulaciones osmticas. Esta accin no exige divisin celular y es posible tambin
en la fase de reposo. (Trolldenier, 1984)
3.1.2.2.3 Antibiticos que inhiben la sntesis de protenas
Los antibiticos que interfieren en la sntesis de protenas son muy variados y
abundantes, y la mayora de ellos funcionan interfiriendo con el ribosoma, sobre todo los
que se unen a protenas ribosmicas y/o a alguno de los ARN ribosmicos. Los ms
tiles son aquellos que tienen efectos selectivos frente a los ribosomas 70S
procariticos, pero no sobre los 80S eucariticos. Dentro de ellos y siguiendo el orden
natural del funcionamiento de la elongacin de la cadena polipeptdica, podemos
agruparlos segn la fase concreta de la elongacin sobre la que actan:
Inhibicin del reconocimiento de un aminoacil-ARNt (aa-ARNt) hacia el sitio A del
ribosoma;
Introduccin de errores en la lectura de los ARNm;
Inhibicin de la reaccin de formacin del enlace peptdico;
Inhibicin de la traslocacin del peptidil-ARNt (pp-ARNt) desde el sitio A al sitio P.
Bloqueo de los factores de elongacin.
Esta accin inhibidora del metabolismo no depende tampoco de la divisin celular, pero
se desarrolla con mayor rapidez y seguridad durante la fase de proliferacin.
(Trolldenier, 1900). Algunos de los antibiticos que pertenecen a este grupo son:
Tetraciclinas, Aminoglucsidos, Anfenicoles, Lincosamidas, Macrlidos, entre otros.
(Pareja Iaez, 1998)
3.1.2.2.4 Antibiticos que actan sobre la sntesis de cidos nucleicos.
Son antibiticos de sntesis qumica, su toxicidad selectiva es baja y son
bacteriostticos. Estos antibioticos operan sobre las enzimas que actan en el proceso.

10
Sus mecanismos de accin son: a). Por bloqueo de la trascripcin:- Impide que actu la
ARN polimerasa bacteriana que es la que sintetiza el ARN. - Rifampicina. b). Por
bloqueo de la duplicacin del ADN:- Actan inhibiendo la accin de las enzimas que
enrollan y desenrollan la cadena de ADN, estos antibiticos impiden que la cadena se
desenrolle. - Quinolonas: Oflozacino, cinoxacino, norfloxacino. - Novobiocina:
Benzamida. c) Por interferencia en la sntesis de bases nitrogendas:- Impiden la sntesis
de bases nitrogenadas, Adenina, timina, etc. (mtodo exclusivo de las bacterias). -
Sulfamidas - Diaminopirimidinas. Algunos de los antibiticos que pertenecen a este
grupo son: Quinolonas, Ansamicinas, Sulfonamidas, entre otros. (Pareja Iaez, 1998)
3.1.2.3Estructura qumica
Una forma de estudiarlos es agrupndolos por clases segn su naturaleza qumica.
Desde el punto de vista qumico, se clasifican en grandes familias:
3.1.2.3.1 Aminoglucosidos
Grupo de antibiticos bactericidas estrechamente relacionados, derivados de bacterias
del orden Actinomicetales o, mas concretamente, del genero Streptomyces(
Framicetina, Kanamicina, neomicina, paromomicina, estreptomicina y tobramicina) y del
genero Micromonospora (gentamicina y sisomicina). Los aminoglucosidos poseen un
espectro antimicrobiano similar y actan interfiriendo en la sntesis proteica bacteriana.
Son ms activos frente a bacilos gramnegativos que en los grampositivos. (Sweetman,
2003)
3.1.2.3.2 Anfenicoles
El cloranfenicol (y tianfenicol) son inhibidores de la sntesis proteica por accin en el
ribosoma a nivel de la subunidad 30S y 50S respectivamente. El cloranfenicol por el
contrario est limitado a su uso en preparados tpicos, pero en el pasado fue utilizado
para el tratamiento de mltiples cuadros infecciosos, desde banales hasta muy graves,
pero se ha ido retirando por la potencial toxicidad hematolgica. (Delgado-Iribarren,
2001).
3.1.2.3.3 Antimicobacterianos
Constituyen un grupo variado de antibacterianos cuyo espectro de actividad incluye
Mycobacterium spp. Forman parte del grupo, las rifamicinas, tambin conocidas como
ansamicinas, un grupo de antibiticos aislados a partir de una cepa de Amycolatopsis
mediterranei (Nocardida mediterranei;Streptomyces mediterranei).Estos antibiticos se

11
utilizan para el tratamiento de tuberculosis, la lepra y otras infecciones micobacterianas.
(Sweetman, 2003).
3.1.2.3.4 Cefalosporinas y otros B-lactamicos
Las cefalosporinas son antibacterianos semisinteticos derivados de la cefalosporina C,
un antibitico natural producido por el moho Cephalosporium acremonium. Las
cefalosporinas son bactericidas y actan inhibiendo la sntesis de la pared bacteriana.
Las nuevas generaciones de cefalosporinas generalmente poseen un incremento de
actividad frente a las bacterias gramnegativas y grampositivas.
3.1.2.3.5 Glucopeptidos
Poseen una estructura glucopeptidica. Actan interfiriendo la sntesis de la pared
bacteriana y es activa frente a cocos grampositivos. Algunos antibiticos que pertenecen
a este grupo son: Avoparcina, ramoplanina, teicoplanina, vancomicina, entre otros.
(Sweetman, 2003) Actan sobre la segunda fase de la sntesis de la pared bacteriana
inhibiendo la formacin de peptidoglucano, interfieren en la formacin del precursor D-
alanyl D-alanina, afectan la permeabilidad de la membrana citoplasmtica de los
protoplastos y alteran la sntesis de RNA. (Pareja Iaez, 1998).
3.1.2.3.6 Lincosaminas
Es un antibitico producido por una cepa de Streptomyces lincolnensis. Las
lincosaminas son bacteriostticas o bactericidas, segn la concentracin, y son activas
principalmente frente a bacterias grampositivas y Bacteroides spp. Al parecer tambien
poseen cierta actividad antiprotozoaria. Las lincosamidas poseen una actividad
antimicrobiana actuando sobre el ribosoma bacteriano para suprimir la sntesis proteica.
(Sweetman, 2003).
3.1.2.3.7 Macrlidos
Es un amplio grupo de antibiticos, principalmente producidos por Streptomyces spp.
Los macrlidos pueden ser bacteriostticos o bactericidas, segn su concentracin y el
tipo de microorganismo y se cree que interfiere en la sntesis proteica bacteriana. Son
activos frente a microorganismos como Legionella pneumophila,Micoplasma
pneumoniae y algunas rickettsias y clamidias.
3.1.2.3.8 Penicilinas
La penicilina fue el primer antibitico utilizado teraputicamente y se obtuvo en un

12
principio como una mezcla de penicilinas conocidas como F, G, X y K, a partir del moho
Penicillium notatum. Se obtuvieron mejores rendimientos utilizando P. chrysogenum.
Son bactericidas por medio de su accin inhibitoria sobre la sntesis de la pared
bacteriana. La bencilpenicilina puede considerarse el compuesto original de las
penicilinas y es activa principalmente frente a bacterias grampositivas y Neisseria spp.
Algunas penicilinas son activas frente algunos microorganismos gramnegativos (ejemplo
ampicilina, mecilinam, temocilina, entre otros). (Sweetman, 2003).
3.1.2.3.9 Quinolonas
Inhiben la girasa (topoisomerasa II, genes gyrA y gyrB) y la topoisomerasa IV (genes
parC y Par E, con mayor importancia en gram positivos) por unin al complejo ADN-
girasa. Si bien estos compuestos se obtienen por sntesis qumica su mecanismo de
accin no es nuevo en la naturaleza puesto que existen tambin algunos compuestos
naturales que la presentan como por ejemplo la Novobiocina (producida por
Streptomyces), cumermicinas y ciclotilidina. Las topoisomerasas son enzimas
implicadas en el desarollamiento y decatenacin del ADN lo que es necesario para su
replicacin. El espectro de estos antimicrobianos ha evolucionado desde una limitacin
a infecciones del tracto urinario y actividad limitada a gramnegativos hasta los
compuestos actuales con actividad en grampositivos y anaerobios, menor seleccin de
mutantes y mejora en la farmacocintica. (Delgado-Iribarren, 2001)
3.1.2.3.10 Sulfamidas y Diaminopirimidinas
Son normalmente bacteriostticas e interfieren en la sntesis de cido flico de
microorganismos sensibles. Estos se emplean en el tratamiento de la profilaxis de
algunas infecciones por protozoos. El empleo clnico de las sulfamidas es sumamente
reducido, en general estn indicadas nicamente para el tratamiento de las infecciones
de las vas urinarias y algunos trastornos como la nocardiosis. Las sulfamidas como la
sulfaguanidina, el succinilsulfatiazol y el ftalilsulfatiazol se han utilizado para el
tratamiento de infecciones gastrointestinales. (Sweetman, 2003).
3.1.2.3.11 Tetraciclinas
Son un grupo de antibacterianos, inicialmente derivados de ciertos Streptomyces spp.
Interfieren en la sntesis proteica en organismos sensibles, poseen un amplio espectro
de actividad frente a bacterias grampositivas y gramnegativas, clamidias, rickettsias
(rickettsias tificas y maculosas), micoplasmas (neumona atpica, enfermedad
inflamatoria plvica, la enfermedad de Lyme, la brucelosis, la turalemia, la peste, el

13
colera, acne), espiroquetas, algunas micobacterias y algunos protozoos. (Sweetman,
2003)
3.1.2.3.12 Polipeptidicos
Es un grupo de antibiticos que se diferencia de los dems en cuanto a su mecanismo
de accin y su espectro antibacterial. Son antibiticos producidos por especies de
Bacillus durante las primeras fases de la esporulacin. Se trata de molculas con
aminocidos en configuraciones L y D, y con presencia de ciertos aminocidos "raros"
(no proteinogenticos). Algunos de estos antibiticos son polipptidos cclicos. Su
sntesis no se realiza en los ribosomas, sino que se produce por una secuencia de
reacciones enzimticas que nada tienen que ver con el proceso de traduccin de los
mensajeros genticos. Suelen ser antibiticos de efecto bactericida. Su mecanismo
consiste en que se unen a la cara externa de la membrana citoplsmica y, adems, a la
membrana externa de las bacterias Gram.-negativas, alterando su estructura y su
permeabilidad osmtica; ello condiciona la inhibicin de procesos bsicos de la
membrana, as como la salida de metabolitos del citoplasma. Algunos antibiticos que
pertenecen a este grupo son: polimixina, tirocidina-a y gramicidina-s. (Pareja, 1998)
3.2 BACITRACINA
3.2.1 Descubrimiento
En Junio de 1943, Una nia de 7 aos llamada Margaret Tracy, ingreso a la sala de
urgencias del Hospital Presbiteriano de Columbia de la ciudad de Nueva York, pues la
haba atropellado un coche, ocasionndole una fractura abierta en la tibia. De esta
herida se tomo una muestra y en el anlisis microbiolgico inicial se determino la
presencia de Staphylococus aureus. Sin embargo, a su vez otras muestras fueron
enviadas al laboratorio de bacteriologa, donde su directora, Balbina Jonson, describi
que el Staphylococus aureus visto en el examen inicial microscpico haba
desaparecido de la noche a la maana. Con la ayuda de Fran L. Meleney y H. Anker,
consiguieron aislar a partir de la muestra de la herida una cepa de un bacilo muy activo
frente S. Aureus, al que dominaron Tracy I. Tras filtrar el caldo de cultivo se detecto la
presencia de un potente antibitico a este antibitico le dieron el nombre de Bacitracina,
de la combinacin del termino bacilo y tracy, apellido de esta nia. (Martn, 2005)
3.2.2 Sinnimos
Aifivina, Baxi-max, Penitracina, Zutracina (Negwer, 1971). Asociacin con neomicina:
Nebacetina. (Trolldenier, 1900)

14
3.2.3 Formula emprica
Bacitracina A: C
66
H
103
N
17
O
16
S
Bacitracina B: C
71
H
112
N
18
O
17
S
Bacitracina F: C
66
H
97
N
15
O
17
S
(Trolldenier, 1900)
3.2.4 Formula estructural
Figura 1. Bacitracina (Segn Maier y Groger, 1972)

3.2.5 Peso molecular
Bacitracina (mezcla): 1500 Daltons
Bacitracina A: 1470 Daltons
(Trolldenier, 1900)
3.2.6 Descripcin, Solubilidad, Conservacin, Estabilidad
Segn Farmacopua Europea 2002: la Bacitracina esta compuesta de uno o mas
polipptidos antimicrobianos producidos por ciertas cepas de Bacillus lincheniformis y B.
subtilis var. Tracy. La potencia no es inferior a 60 UI/mg, calculndola con respecto a la
sustancia seca. Segn USP 30 tiene una potencia no inferior a 40 UI/mg.
Es un polvo higroscpico de color blanco a amarrillo plido, inodoro o con ligero olor.
Fcilmente soluble en agua; soluble en alcohol, acido actico glacial y metanol; la
solucin en disolventes orgnicos a menudo presenta un residuo insoluble; insoluble en
acetona cloroformo y ter. Estas soluciones se deterioran fcilmente a temperatura
ambiente. Precipita en estas soluciones y se inactiva por sales de algunos metales

15
pesados. (USP 30). Forma sales estables con el cinc y el manganeso, las cuales son
relativamente insolubles (0,23 0,45 % a 25
o
C). (Trolldenier, 1984)
En solucin de pH 5-7 es estable a 4
o
C durante 4 semanas (Jawets 1956), y a 20
o
C
pierde del 33 al 50% de su actividad en 14 das. (Meyer- Jones. 1956). Posee mxima
estabilidad en medio acido pH 4 5. La actividad biolgica disminuye rpidamente a
pH >9. (Trolldenier, 1984)
De la mezcla se han aislado diversas (5 10) bacitracinas: A, A, B, C, D, E, F
1
, F
2
, F
3
,
G. La conservacin requiere ausencia de aire y oscuridad. La sustancia seca se
conserva durante 1,5 y 2 aos a baja temperatura. (Patsch, 1975). En solucin acuosa
al 1% presenta un pH entre 6 y 7. Conservar a temperatura entre 8 y 15
o
C en envases
hermticos. (F. EUR). El pH en una solucin acuosa que contiene 10.000UI/ml oscila
entre 5,5 y 7,5. (USP 30).
3.2.7 Espectro antimicrobiano de accin
Es activa frente algunas bacterias Gram Positivas como estafilococo, estreptococo
(particularmente el estreptococo del grupo A) y clostridio. Es tambin activa frente a
Actinomyces, Treponema pallidum y algunas especies Gram negativas, como Neisseria
y Haemophilus influenzae; sin embargo, la mayora de los microorganismos Gram
Negativos son resistentes. (Sweetman, C. 2003). Su espectro de accin abarca
tambin, algunos corinebacterias, espiroquetas, Nocardidia, Entamoeba histolytica.
(Trolldenier, 1900) Las salmoneras, E.coli, Proteus, los hongos son resistentes. Los
grmenes sensibles son inhibidos por una concentracin comprendida entre 0,005 y 2,0
UI/mg. Los que necesitan 50 UI/mg o mas se consideran resistentes. (Trolldenier, 1900).
En la tabla 1 se muestra el espectro de accin de la Bacitracina.

16
Tabla 1. Espectro de accin de la Bacitracina (Segn Wege, 1969)
Microorganismo Espectro de
accin
accin
accin
accin
Estreptococos +++ Salmonelas / Clostridios ++ Haemophilus +
Estafilococos +++ E. coli / Pasterelas / Actinomyces
israeli
++
Neumococos ++ Shigelas / Brucelas + Treponemas ++
Corinebacterias ++ Aerobacter
aerogenes
/ Fusobacterium
necrophorum
/ Leptospiras +
Listeria
monocytogenes
/ klebsielas / Vibriones / Toxoplasmas /
Erysipelothrix
insidiosa
/ Proteus / Mycobacterium
tuberculosis
/ Coccidias /
Bac. Anthracis + Pseudomonas
aeruginosa
/ Rickettsias /
+ = Grados de sensibilidad / = Resistencia o inactividad
3.2.8 Tipo y mecanismo de accin
La accin de la Bacitracina es bacteriosttica y bactericida. La dosis requerida para que
sea bactericida es 5 10 veces mayor a la concentracin mnima inhibitoria (la menor
concentracin capaz de inhibir el crecimiento). La Bacitracina influye sobre importantes
sistemas enzimticos. Impide la construccin de la pared celular bloqueando la
desfosforilizacion (Parthier, 1969). La Bacitracina interfiere en la sntesis de la pared
celular bacteriana al bloquear las funciones de las molculas transportadoras de lpidos
que transfieren las subunidades de la pared celular a travs de la membrana la
Bacitracina se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilacin, e
impidiendo por lo tanto, la regeneracin del transportador de membrana.(Sweetman, C.
2003). En los estafilococos inhibe la incorporacin del acido glutmico durante la fase de
proliferacin. (Trolldenier, 1900)
3.2.9 Farmacocintica
La Bacitracina no se absorbe de forma apreciable en el tubo digestivo. Cuando se
administra en inyeccin intramuscular se absorbe rpidamente. Entre el 10 y el 40% de
una dosis nica inyectada se excreta por la orina en 24 horas. La Bacitracina difunde
fcilmente hacia el lquido pleural y asctico, pero pasa en poca cantidad el LCR. Se
ha descrito que la absorcin es despreciable tras la aplicacin tpica, pero puede
producirse despus de un lavado peritoneal. (Sweetman, C. 2003).

17
3.2.10 Indicaciones y administracin
La Bacitracina y la Bacitracina zinc se administra por va tpica, en algunos casos se
combina junto con otros antimicrobianos como la Neomicina o Polimixina B, y con
corticosteroides, para el tratamiento de las infecciones locales. La Bacitracina se utiliza
en infecciones de piel (piodermitis, heridas infectadas, Impetigo contagiosa, foliculitis,
ecthyma, furunculosis, ulcera decubitus, dermatitis infecciosa eczematoid, scabies, y
dermatofitosis), conjuntivas (causadas por S. aureus, S. pyogenes, entre otros),
sinusitis, faringitis, traqueitis, traqueobronquitis, infecciones mandibulares
(actinomicosis), oculares, entre otros. La Bacitracina ha sido administrada efectivamente
de forma oral para el manejo de amebiasis intestinal, pero se encuentran disponibles
otros amebicidas ms potentes. Se pueden presentar o producir efectos adversos a
partir de la absorcin de esta en heridas abiertas y desde la vejiga o la cavidad
peritoneal; sin embargo la toxicidad de la dosis restrictiva de preparaciones combinadas
se considera que es debida a la Neomicina. (Sweetman, 2003)
Bacitracina tambin ha sido usado de forma oral como un antisptico intestinal. Su
administracin oral como suplemento alimenticio en algunas especies animales (pollos,
pavos, cerdos y conejos) acta como promotor del crecimiento y teraputico para
infecciones entricas. La dosis de 2000 U/Kg de p.v. reduce moderadamente la flora
intestinal y una dosis de 10000 U/Kg de p.v. ( peso vivo) la destruye en gran parte. La
Bacitracina se elimina con la heces en el curso de hasta 3 das despus de la ultima
administracin. (Trolldenier, 1900)
3.2.11 Interacciones
Puede producirse nefrotoxicidad adicional si se administra Bacitracina de forma
sistemtica con otros frmacos nefrotoxicos. Se ha descrito que la Bacitracina aumenta
la accin de bloqueo neuromuscular de otros frmacos. (Sweetman, 2003)
3.2.12 Efectos adversos
Cuando se administra Bacitracina de forma sistemtica puede producir nefrotoxicidad
grave. Pueden aparecer repercusiones cutneas, anorexia, nauseas y vmitos, as
como dolores el lugar de inyeccin. Pueden producirse reacciones de hipersensibilidad,
entre ellas exantemas y anafilaxia, tanto con administracin sistmica como con
administracin tpica, aunque esta ultima es excepcionalmente. (Sweetman, 2003)

18
3.3 BACITRACINA ZINC
3.3.1 Descripcin, solubilidad, conservacin
Segn la Farmacopea Europea es un complejo de Bacitracina y zinc. Su potencia no
es inferior a 60UI/mg, calculada con respecto a la sustancia seca. Polvo higroscpico
blanco o ligeramente verde amarillento. Poco soluble en agua o alcohol, muy poco
soluble en ter. El filtrado de una solucin saturada tiene un pH entre 6 y 7.5. Y segn
la USP 30, es una sal de zinc de un tipo de Bacitracina o mezcla de dos o ms sales
similares. Tiene una potencia no inferior a 40UI/mg. Contiene no menos de 2,0 por
ciento y no mas de 10,0 por ciento de zinc. (Zn), calculado con respect a la sustancia
seca. Polvo higroscpico blanco o de ligero color marrn, inodoro o con un ligero olor.
Bastante soluble en agua. El pH en una solucin acuosa saturada oscila entre 6 y 7.5.
Se Conserva en envases hermticos a una temperatura entre 8 y 15
o
C.
3.3.2 Estabilidad
La Bacitracina zinc es ms estable que la Bacitracina y puede conservarse durante 18
meses a una temperatura superior a 40
o
C sin prdidas apreciables. Las tabletas de
Bacitracina zinc, pomadas y comprimidos que contiene Bacitracina zinc con Neomicina
son mas estables que las correspondientes preparaciones de Bacitracina. La Bacitracina
zinc es ms amarga que la Bacitracina y el sabor se enmascara ms fcilmente.
(Sweetman, 2003)
3.3.3 Incompatibilidades
La Bacitracina se inactiva ligeramente en bases que contienen alcohol este arlico,
colesterol, derivados de polioxietileno y laurinsulfato sdico y se inactiva rpidamente en
bases que contienen agua, macrogoles, propilenglicol, glicerol, cloruro de cetilpiridinio,
cloruro de benzalconio, ictamol, fenol y acido tanico. (Sweetman, 2003)
3.3.4 Accin farmacolgica
Antibitico polipeptdico. Inhibe la sntesis del mucopptido que forma la pared celular.
De esta manera, impide la formacin de la pared celular y hace a la bacteria
osmticamente sensible, llevndola a la lisis.
Su accin exige la presencia de cationes bivalentes como el Zinc.

19
3.3.5 Indicaciones de uso, dosis recomendadas, vas de aplicacin.
La Bacitracina de Zinc es el antibitico ms comnmente utilizado en patologas
digestivas, por ser activa frente a bacterias Gram positivas y por ser escasamente
absorbible en el tracto digestivo. Para su actividad, este antibitico precisa de cationes
bivalentes como el Zinc. (King et al.1980),
Existe la hiptesis de que la Bacitracina no se limita al control de patgenos intestinales,
sino que tambin puede actuar sobre la cintica de absorcin de nutrientes (Abecia et
al. 2004), dado que en otras especies se ha observado que aquellos animales que la
han ingerido presentan un menor grosor de su pared intestinal (King et al.1980), y por
tanto pudieran favorecer la absorcin de nutrientes
Especies a las que se destina (Pollos, pavos, cerdos, conejos, entre otros) se emplea
como promotor de crecimiento y teraputico para infecciones entricas y superficiales.
Para mejorar la produccin de huevo, la eficiencia alimenticia en la gallina y el peso de
la carcasa o canal. (Abecia et al. 2004), (King et al.1980).
Dosis indicativa en especies a las que se destina: 5 a 10 g por tonelada de alimento.
(Abecia et al. 2004),
3.3.6 Condiciones de almacenamiento
En recipientes de cierre perfecto y al abrigo de la luz se mantiene estable. Mantiene su
estabilidad hasta dos aos a temperatura de 25C
3.4 BACITRACINA METILEN DISALICILATO
3.4.1 Descripcin, solubilidad, conservacin
Antibitico polipeptdico producido por ciertas cepas de Bacillus lincheniformis y B.
subtilis var. Tracy.
Es un polvo granular de color amarrillo a caf, olor tenue, de sabor amargo, es insoluble
en agua y soluble en alcohol y metanol. (Tianjin XinXing, 2007). Debe almacenarse en
un lugar fro y seco protegido de la luz solar directa y la humedad. (Alpharma Inc. 2007).
3.4.2 Indicaciones de uso
La Bacitracina Metilen Disalicilato se ha administrado a pollos de engorde, pavos en
crecimiento y cerdos sin presentar efectos adversos. En pollos de engorde para la
prevencin y control de la enteritis necrtica causada por Clostridium perfringens,
agente sensible a la Bacitracina. En pavos se utiliza para el control de la enteritis

20
contagiosa (cresta azul, fiebre del lodo) en pavos, complicada por organismos
susceptibles a la Bacitracina. En cerdos se administra para el tratamiento de la
disentera porcina asociada a Treponema hyodysenteriae. Tambin se est indicado su
uso como mejorador del desempeo y para prevenir o controlar la enteritis necrtica en
pollo de engorde, gallinas de postura y reproductoras, aves de reemplazo y pavos. Es
eficaz en el control de bacterias Gram Positivas y altamente efectivo contra Clostridium
perfringens, causante de enteritis necrtica. (Alpharma Inc. 2007).
Como promotor del crecimiento y para mejorar la conversin alimenticia. Para el
tratamiento de la enteritis necrtica de las aves por clostridios. (Alpharma Inc. 2007).
No se absorbe a partir del tracto intestinal y no desarrolla residuos detectables en los
tejidos. No causa resistencia transferible entre las bacterias contra el medicamento,
Se administra en Broiler y pavos para mejorar la ganancia de peso, la conversin
alimenticia y para el control de enteritis necrtica. En aves de postura: Aumenta la
eficiencia en la produccin de huevos, con un mejoramiento en la conversin alimenticia
y aumenta el nmero de huevos producidos por ave. Se utiliza en cerdos produce un
aumento en la ganancia de peso y mejora la conversin alimenticia, con un aumento en
la uniformidad de los cerdos. Controla cuadros de enteritis producidos por Clostridium
perfringes y en combinacin con clortetraciclina se utiliza para la prevencin y control de
ileitis. En vacunos para aumentar la ganancia de peso diaria y reduccin de abscesos
hepticos. (Farqumica, 2004)
3.5 Micrococcus luteus
3.5.1 Clasificacin cientfica
Dominio: Bacteria
Phylum Actinobacteria
Orden: Actinomycetales
Familia: Micrococcaceae
Genero: Micrococcus
Especie: M. luteus
3.5.2 Caractersticas
Micrococcus luteus es una bactria Gram positiva de forma esfrica, es un
microorganismo saprfito, aerbio obligado. M.luteus se encuentra en ambientes

21
diversos como en el suelo, polvo, agua, aire, como parte de la flora normal de la piel de
mamferos. Esta bacteria tambin coloniza en la boca, mucosa, en la parte superior del
tracto respiratorio de los humanos. Se ha aislado de animales y productos lcteos y de
cerveza. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).
M.luteus tolera ambientes secos y altas concentraciones de sal. M.luteus no puede
sobrevivir mucho tiempo en el suelo. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).
M. luteus es coagulasa negativo, susceptible a la Bacitracina, forma colonias de color
amarillo plido al crecer en medios de cultivos nutritivos. Se a demostrado que M. luteus
sobrevive en ambientes oligotrficos por largos periodos de tiempo. (Sciencenet
Multimedia Publishing, 2003).
3.5.3 Bioqumica
M.luteus produce pigmentos insolubles en agua de amarrillo crema. Puede crecer sobre
agar de nitrgeno inorgnico y pocos pueden reducir nitrato. Son oxidasa positiva.
M.luteus no produce cido a partir de glucosa o glicerina bajo condiciones aerbicas y
no produce arginina hidrolasa o galactosidasa. Los carbohidratos son oxidados a CO2 y
a agua. (Sciencenet Multimedia Publishing, 2003).
3.5.4 Patognesis
Genera Infecciones intestinales e infecciones extraintestinales. M. luteus no se
considera especficamente como un microorganismo patgeno, pero es visto como
patgeno oportunista asociado particularmente con pacientes inmunocomprometidos.
Se han reportado infecciones del tracto unitario. (Sciencenet Multimedia Publishing,
2003).
3.5.5 Usos industriales
Mientras algunas especies son utilizadas para el mejoramiento del sabor y olor de
productos carnicol fermentados M.luteus han sido usado en la produccin econmica de
hidrocarburos alifticos de cadenas largas (C21 - C34). stos podran ser tiles como
aceites de lubricacin y poder ser sustitutos de productos del petrleo. (Sciencenet
Multimedia Publishing, 2003)

22
3.6 VALIDACION DE METODOS ANALITICOS
3.6.1 Definicin
El termino validacin ha sido definido en la literatura, de diversas maneras y por
numerosos autores. Aunque los trminos dados son diferentes el significado de las
mismas es siempre el mismo: a) especificar e implementar, b) aprobar y c) documentar.
(AEFI, 2001)
Definicin General
Segn las Normas de Correcta Fabricacin (edicion 99):
Validacin: obtencin de pruebas con arreglo a las Normas de Correcta Fabricacin, de
que cualquier procedimiento, proceso, equip, material, actividad o sistema produce en
realidad el resultado previsto. (AEFI, 2001)
Definicin Analtica
Validacin: es el establecimiento de la evidencia documental de que un procedimiento
analtico conducir, con un alto grado de seguridad, a la obtencin de resultados
precisos y exactos, dentro de las especificaciones y los atributos de calidad previamente
establecidos. (AEFI, 2001)
3.6.2 Mtodos Susceptibles a ser Validados
Son validables los mtodos analticos clasificados en la siguiente forma (AEFI, 2001):
Ensayos de identificacin
Ensayos para la identificacin del analito de inters de una materia prima o de una
especificidad farmacutica.
Ensayos para la determinacin de caractersticas inherentes. (Ejemplo test de
disolucin).
Ensayos de lmite de impurezas y de cuantificacin de impurezas.
Ensayos para la determinacin de analitos en lquidos biolgicos y en productos
naturales.
Ensayos microbiolgicos.

23
3.6.3 Entorno Legal
3.6.3.1 Norma de Correcta Fabricacin de Medicamentos
Las Norma de Correcta Fabricacin de Medicamentos de la CEE en el capitulo de
Control de Calidad indico que los mtodos de anlisis deben estar validados. De igual
forma las Good Manufacturing Practice de los EEUU indican que deben establecerse y
documentarse la exactitud, sensibilidad, especificidad y reproducibilidad de los mtodos
analticos utilizados. (AEFI, 2001)
3.6.3.2 Farmacopeas
Validacin frente a los Mtodos Oficiales y/o de Farmacopeas:
Se puede diferenciar entre validacin de mtodos de anlisis de principios activos y
especialidades farmacuticas.
Principios activos de sntesis: los mtodos oficiales o de farmacopeas se consideran
validados siempre y cuando se apliquen a principios activos con la misma ruta de
sntesis y por lo tanto el mismo perfil de impurezas que aquellos para los que fuera
redacta la Monografa.
Especialidades: No es recomendable considerar ningn mtodo oficial o de farmacopea
totalmente validado para una especificacin, puesto que difcilmente tendr los mismos
componentes ni la misma proporcin de estos.
No obstante pueden emplearse como punto de partida mtodos desarrollados para
especialidades tipo, como pueden ser los de Farmacopea Europea (EP), Farmacopea
Americana (USP) o Farmacopea Britnica (BP), que permitirn obviar una gran parte del
desarrollo analtico.
3.6.4 Fases en el desarrollo de un mtodo analtico y criterios de validacin
No existe una gua oficial que indique la optima secuencia de experimentos analticos
necesarios para el desarrollo de un mtodo, ya que esto depende del mtodo en si
mismo. No obstante, el desarrollo lgico de un mtodo analtico transcurre en diferentes
fases.
3.6.4.1 Definicin de las caractersticas de practicabilidad
Han de evaluarse parmetros de practicabilidad del mtodo analtico: precisin exigible,
sensibilidad deseable, grado de selectividad, tiempo, coste, tamao de muestra,

24
calificacin del personal, tipo de equipo e instrumentacin, condiciones de seguridad,
entre otras. (AEFI, 2001)
3.6.4.2 Estudios de estabilidad de la muestra preparada para anlisis
La estabilidad de la muestra preparada para analizar se evala durante la fase de
desarrollo del mtodo junto con la robustez. La estabilidad de las disoluciones de la
muestra, despus de su preparacin segn los mtodos de anlisis, debe ser evaluada
de acuerdo al tiempo requerido para su realizacin. Muchos laboratorios utilizan equipos
automticos que procesan muestras durante largos periodos de tiempo, con lo que la
muestra puede permanecer horas preparada antes de ser analizada. De la misma forma
deben demostrarse la estabilidad de las muestras y patrones preparados si se utilizan
durante varios das. (AEFI, 2001)
3.6.4.3 Puesta a punto. Caractersticas de idoneidad
La puesta a punto del mtodo analtico, incluye desde los primeros estudios de tanteo
con patrones, hasta la utilizacin del mtodo en muestras reales que garanticen el buen
funcionamiento del sistema en el momento de anlisis. (AEFI, 2001)
El estudio de robustez se utiliza para optimizar y ver la criticidad del valor de los
parmetros del mtodo antes de validar. A partir de este estudio se definirn las
caractersticas de idoneidad o conjunto de parmetros que garantizan que el sistema
responde, en el momento del anlisis, a los requisitos fijados. Dichas caractersticas se
renen en un ensayo conocidas como ensayo de idoneidad. (System Suitability Test).
(AEFI, 2001)
La comprobacin de la idoneidad forma parte integral del mtodo y debe realizarse
cada da al inicio del anlisis (dependiendo de la duracin de este, ser conveniente
realizarlo a intervalos de tiempo), para comprobar el correcto funcionamiento del
sistema. Los requisitos y parmetros a evaluar en un ensayo de idoneidad dependern
del tipo de mtodo. (AEFI, 2001)
La idoneidad del sistema, es el conjunto de ensayos que permiten comprobar en el
momento de utilizacin del mtodo que el sistema (analista, reactivos, e instrumentos)
es adecuado para llevar a cabo la determinacin para la que se ha establecido y
validado dicho mtodo. (AEFI, 2001)

25
3.6.4.4 Caractersticas de fiabilidad
Esta ltima permitir conocer las caractersticas de fiabilidad del mtodo para su
aplicacin rutinaria. Dichas caractersticas son las que demuestran la capacidad de un
mtodo analtico para mantener a lo largo del tiempo los criterios fundamentales de
validacin. Las caractersticas de fiabilidad comprenden los cinco criterios
fundamentales de validacin. (No necesariamente aplicados a todos los casos) y de los
que derivan en la prctica todos los parmetros de validacin (AEFI, 2001):
Selectividad
Linealidad
Rango
Precisin
Exactitud
Limite de Cuantificacin
Limite de Deteccin
Los requisitos de las pruebas farmacopeicas varan desde valoraciones analticas muy
rigurosas hasta evaluaciones de tributos subjetivos. Considerando esta amplia variedad,
es lgico que diferentes procedimientos de prueba requieran diferentes esquemas de
validacin. A continuacin se indican las categoras de pruebas ms habituales para
las que se exigen datos de validacin segn la USP 30:
Categora I: los procedimientos analticos para la cuantificacin de los componentes
principales de frmacos a granel o ingredientes activos (incluyendo concertantes) en
productos farmacuticos terminados.
Categora II: los procedimientos analticos para la determinacin de impurezas en
frmacos a granel o de productos de degradacin en productos farmacuticos
terminados. En estos anlisis incluyen anlisis cuantitativos y pruebas de lmite.
Categora III: los procedimientos analticos para la determinacin de las caractersticas
de desempeo (por ejemplo, disolucin, liberacin del frmaco).
Categora IV: pruebas de identificacin

26
Para cada categora se requieren diferente informacin analtica. En la Tabla 2 se
indican los elementos de datos que normalmente se requieren para cada una de estas
categoras.
La validez de un procedimiento analtico puede verificarse solo mediante estudios de
laboratorio, por lo tanto, la documentacin de la finalizacin con xitos de dichos
procedimientos constituye un requisito bsico para determinar si un procedimiento es
adecuado para su aplicacin prevista.
Tabla 2. Datos Requeridos para la Validacin de Mtodos Analticos (USP 30)
Categora II

Caractersticas de
Desempeo
Analtico

Categora
I
Pruebas
de Limite
Cuantitati
vas
Pruebas de
Limite
Cualitativas
y Limite

Categora
III

Categora
IV
Exactitud Si Si * * No
Precisin Si Si No Si Si
Repetibilidad Si No Si No
Precisin
Inmediata
Si No Si No
Especificidad Si Si Si * Si
Limite de
Deteccin
No No Si * No
Limite de
Cuantificacin
No Si No * No
Linealidad Ni Si No * No
Intervalo Si Si * * No

* Pueden requerirse, dependiendo de la naturaleza de la prueba especifica.

27
3.7 CARACTERSTICAS DEL DESEMPEO ANALTICO
La validacin de un procedimiento analtico es un proceso que establece, mediante
estudios en el laboratorio, que las caractersticas de desempeo del procedimiento
cumplen con los requisitos para las aplicaciones analticas previstas. Las caractersticas
de desempeo analtico habituales que deben considerarse en la validacin de los tipos
de procedimientos farmacopeicos, se indican y describen a continuacin (USP 30):
3.7.1 SELECTIVIDAD
3.7.1.1 Definicin
La capacidad de un mtodo para determinar el analito sin interferencias de impurezas,
productos de degradacin, excipientes u otras sustancias presentes en la muestra, se
relaciona con el trmino de selectividad. La selectividad es la capacidad de un mtodo
analtico para medir y/o identificar simultnea o separadamente los analitos de inters
de forma inequvoca, en presencia de otras sustancias qumicas que pueden estar
presentes en la muestra. (AEFI, 2001)
Frecuentemente el termino especificidad se utiliza como sinnimo del anterior, aunque
debera reservarse para aquellas situacin donde la respuesta obtenida solo se puede
producir con una nica entidad qumica, algo que no es posible cuando se refiere
procedimientos analticos que emplea instrumentacin no especifica. Como hay pocos
mtodos que den respuesta slo a un nico analito, el termino selectividad es
normalmente mas apropiado. (AEFI, 2001)
La presencia de interferencias puede tener distintos efectos en la determinacin del
analito como:
Imposibilitar su inequvoca identificacin (aparicin de falsos positivos).
Distorsionar la respuesta del analito (afecta normalmente a la pendiente y ordenada en
el origen de la recta de calibrado). Este efecto puede delatar la presencia de
interferencias desconocidas, aunque tambin puede ser consecuencia de
recuperaciones no lineales.
La selectividad de un mtodo analtico se debera determinar antes de iniciar el estudio
de cualquier otro parmetro de validacin, dado que debe conocerse en que grado la
respuesta del mtodo es nicamente proporcionada por el analito, sin interferencia de
otras sustancias relacionadas con l de una u otra forma. (AEFI, 2001)

28
3.7.1.2 mbito de aplicacin
En el anlisis farmacutico la tendencia mayoritaria es la utilizacin de mtodos lo mas
selectivas posibles, en los que la presencia de otros componentes tiene escasa
influencia en los resultados. De hecho es muy difcil declarar que no existe interferencia
en la determinacin de un analito por que siempre existe la posibilidad de encontrar
alguna sustancia, hasta el momento desconocida, que interfiera. Tambin se puede dar
el caso contrario, de hallar alguna posible interferencia que en la prctica diaria sea
improbable que se produzca. (AEFI, 2001)
Para efectuar estudios de selectividad se precisa la mxima informacin sobre
impurezas y productos de degradacin potencialmente presentes en la muestra, as
como posibles interferencias debidas a excipiente u otros componentes. (AEFI, 2001)
Los criterios de selectividad que debe satisfacer un mtodo puede diferir dependiendo
de la finalidad con la que se aplique. El grado de selectividad asociado a un mtodo
adquiere mayor relevancia segn su finalidad. En un mtodo de control de calidad de
rutina la exigencia de alguna interferencia se podra aceptar si esta es conocida y de
magnitud aceptable. En estos casos la selectividad puede entrar en conflicto con el
coste y el tiempo necesario para la determinacin del analito. (AEFI, 2001)
Las conclusiones de los estudios de selectividad estn vinculadas al origen de la
muestra, la optimizacin de la preparacin, la especificidad de la medida y las
condiciones instrumentales. (AEFI, 2001)
3.7.1.2.1 Segn el objetivo de ensayo
El estudio de la selectividad varia segn el objetivo del ensayos; ensayo de
identificacin, ensayos de pureza y/o determinacin cuantitativa de un compuesto o
riqueza de un principio activo.
Cuando el objetivo del ensayo es la determinacin cuantitativa de un compuesto o
riqueza de un principio activo, el mtodo debe evitar la interferencia de excipientes,
productos de degradacin y/o impurezas en la respuesta proporcionada por el
compuesto o el principio activo objeto de la evaluacin analtica. (AEFI, 2001)
3.7.1.2.2 Segn la tcnica analtica aplicada
El estudio de la selectividad vara tambin segn la tcnica analtica aplicada; ensayos
especficos, ensayos absolutos y ensayos separativos. (AEFI, 2001)

29
3.7.2 LINEALIDAD
3.7.2.1 Definicin
La linealidad es la capacidad del mtodo para proporcionar resultados que son
directamente (o promedio de transformaciones matemticas) proporcionales a la
concentracin del analito en la muestra dentro de un rango establecido. Siempre que
sea posible se busca una respuesta de tipo lineal que facilitara su trazado, interpolacin
e interpretacin. (AEFI, 2001) La linealidad en un procedimiento analtico es su
capacidad para obtener resultados de prueba que sean proporcionales ya sea
directamente, o por medio de una transformacin matemtica bien definida, a la
concentracin del analito en muestras en un intervalo dado. La linealidad se refiere a la
relacin entre la concentracin y la medida de valoracin. El objetivo es obtener un
modelo que describa con precisin la relacin de la concentracin versus respuesta, ya
sea lineal o no. (USP 30).
El rango se define como el intervalo entre la concentracin superior e inferior de analito
para el cual se ha demostrado la correcta precisin, exactitud y linealidad del mtodo
descrito. (AEFI, 2001)
Aunque el proceso lgico consistira en evaluar cuales son los limites de concentracin
en los que el mtodo analtico pierde su linealidad, normalmente se toma como punto de
partida un intervalo de concentraciones ya establecido de acuerdo con la experiencia, el
conocimiento analtico de la tcnica empleada y principalmente en funcin de las
especificaciones. (AEFI, 2001)
El intervalo de un procedimiento analtico es la amplitud entre las concentraciones
inferiores y superior de analito en el cual se puede determinar al analito con un nivel
adecuado de precisin, exactitud y linealidad utilizando el procedimiento segn se
describe por escrito. El intervalo normalmente se expresa en las mismas unidades que
los resultados de la prueba obtenidos mediante el procedimiento analtico. (USP 30)
El intervalo del procedimiento se valida verificando que el procedimiento analtico
proporciona precisin, exactitud y linealidad aceptables cuando se aplica a las muestras
que contienen el analito en los extremos del intervalo al igual que dentro del intervalo.
La ICH recomienda que, para establecer la linealidad se utilicen normalmente un mnimo
de cinco concentraciones. Tambin recomienda que se consideren los intervalos
especificados mnimos que se indican a continuacin (USP 30):

30
Valoracin de un frmaco o de un producto terminado: de 80% a 120% de la
concentracin de la prueba.
Determinacin de una impureza: de 50% a 120% del criterio de aceptacin.
Para uniformidad del contenido: un mnimo de 70% a 130% de la concentracin de la
prueba, a no ser que justifique un intervalo mas amplio o mas apropiado, basndose en
la naturaleza de la forma farmacutica.
Segn la gua ICH Q2A se estudia la linealidad en todos los mtodos de tipos
cuantitativo:
Valoracin del contenido de principio activo
En la especialidad farmacutica los lmites de especificaciones suelen establecerse
entre 95 105% a liberacin, 90 110% a caducidad, respecto al valor nominal. En
materia prima los lmites son 98 102% o 99 101%. Debido a esto se suele evaluar la
linealidad de los mtodos en un rango ms amplio, las ICH recomiendan del 80- 120%.
3.7.3 PRECISION
3.7.3.1 Definiciones
La precisin expresa el grado de concordancia (grado de dispersin) entre una serie de
medidas de tomas mltiples a partir de una misma muestra homognea en las
condiciones prescritas. La procedencia de las muestras destinadas al estudio de
precisin puede ser de muestras reales o preparadas en el laboratorio.
El objeto del estudio de la prediccin es conocer la variabilidad o el mas-menos del
mtodo de ensayo. Esta variabilidad es debida a errores aleatorios inherentes a todo
mtodo de ensayo. Como consecuencia de la existencia de estos errores, los anlisis
efectuados sobre muestras idnticas, en las mismas circunstancias, no conducen
generalmente a resultados idnticos. Los factores susceptibles a influir sobre los
resultados de un ensayo no pueden ser siempre controlados (analista, equipo
instrumental, reactivos, tiempo, entre otros.) de aqu la importancia del estudio de la
precisin (AEFI, 2001)

31
3.7.3.2 Diferentes tipos de estudio en la precisin
Figura 2. Diferentes tipos de estudio en la precisin

En la tabla (Huber, 1999) se resumen los factores que pueden o no variar en el estudio
de repetibilidad, precisin intermedia y reproducibilidad.
Tabla 3. Variacin de factores en el estudio de la precisin
Precisin Repetibilidad
Inmediata
Reproducibilidad
Instrumento Igual diferente diferente
DIA de anlisis Igual diferente diferente
Analista Igual diferente diferente
Otros factores
Igual diferente diferente
Laboratorio igual Igual diferente
3.7.3.2.1 Repetibilidad
Estudia la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma
muestra en las mismas condiciones operativas (por un mismo analista, con los mismos
aparatos y reactivos, entre otros), en un mismo laboratorio y en un periodo de tiempo
corto. (AEFI, 2001)
La repetibilidad se expresa matemticamente por el coeficiente de variacin (desviacin
estndar relativa) de una serie de medidas.
Uno de los factores que pueden influir en la repetibilidad del mtodo de anlisis es la
concentracin del analito, ya que la desviacin estndar de las respuestas obtenidas
aumenta al disminuir la concentracin del analito. Por otro lado el valor aceptado del
coeficiente de variacin depende del intervalo de aceptacin especificado en el mtodo
de anlisis. El numero de replicas se deduce a partir del coeficiente de variacin de
repetibilidad del mtodo. (AEFI, 2001)
PRECISION
Repetibilidad
Del Mtodo
Reproducibilidad Precisin inmediata Repetibilidad
Repetibilidad
Instrumental

32
3.7.3.2.1.1 Repetibilidad del sistema instrumental
Este parmetro estudia la variabilidad debida nicamente al instrumento y se determina
analizando repetidamente una misma muestra de forma consecutiva de 6 a 10 veces.
En el caso que se analice el principio activo de una materia prima o de una
especificacin farmacutica se prepara la muestra a la concentracin nominal. (AEFI,
2001)
3.7.3.2.1.2 Repetibilidad del mtodo
El ensayo de repetibilidad del mtodo se efecta sobre una serie de alcuotas de una
muestra homognea que se analiza independientemente desde el principio (preparacin
de la muestra) hasta el final (lectura de resultados) por el mismo instrumento y mismo
analista. Se proponen dos alternativas para realizar este estudio: un mnimo de 6
muestras a la concentracin nominal. (AEFI, 2001)
3.7.3.2.2 Precisin inmediata
Estudia la variabilidad del mtodo efectuado una serie de anlisis sobre la misma
muestra pero en condiciones operativas diferentes (diferentes analistas, aparatos, das,
entre otros) y en un mismo laboratorio. El objeto del estudio de precisin inmediata es
determinar la variabilidad del mtodo efectuando una serie de anlisis sobre la misma
muestra, en un mismo laboratorio pero en condiciones operativas diferentes. (AEFI,
2001)
3.7.3.2.3 Reproducibilidad
Estudia la variedad del mtodo bajo condiciones operativas diferentes y en distintos
laboratorios. La reproducibilidad de dicho mtodo de anlisis se determina analizando
una serie de alcuotas procedentes de lotes homogneos en diferentes laboratorios,
diferentes analistas y utilizando condiciones operativas y ambientales distintas pero
siguiendo el procedimiento descrito en el mtodo. (AEFI, 2001)
La reproducibilidad tambin es definida como la medida de la precisin de los resultados
de ensayos realizados sobre la misma muestra homognea, pero ejecutados por
diferentes analistas en das diferentes. (Calpena AC. et al, 1991)
Segn la ICH Q2B el estudio de precisin se debe realizar nicamente para la
determinacin cuantitativa de principios activos y cuantificacin de impurezas. Por lo

33
tanto la evaluacin de la precisin no es necesaria ni en el ensayo de identificacin ni
en el test limite de impurezas. (AEFI, 2001)
3.7.4 EXACTITUD
3.7.4.1 Definicin
La exactitud de un procedimiento analtico expresa la proximidad entre el valor que es
aceptado convencionalmente como el valor verdadero o un valor referencia y el valor
experimental encontrado. No debe confundirse la exactitud y prediccin, la precisin
esta relacionada con la dispersin de una serie de mediciones, pero no da ninguna
indicacin de lo cerca que esta del valor verdadero. Se puede tener mediciones muy
precisas pero poco exactas; sin embargo, para que un mtodo sea exacto se requiere
un cierto grado de precisin. (AEFI, 2001)
De la definicin de exactitud surge el principal problema: cual es el valor verdadero del
analito en la muestra?, el valor verdadero en muchos casos se desconoce. No obstante,
cuando se dispone de patrones de referencia certificados, el valor de dicho patrn es el
que se acepta como valor verdadero y la exactitud puede evaluarse aplicando el mtodo
sobre dicho patrn, o bien analizando muestras de placebo o de problema a las que se
ha aadido una cantidad conocida de dicho patrn. Tambin se acepta la comparacin
de resultados con un mtodo de referencia validado del que ya se ha demostrado su
exactitud; entonces el valor verdadero es el que se obtiene con dicho mtodo de
referencia y se compara con el valor hallado con el mtodo nuevo que se quiere validar.
(AEFI, 2001)
Segn la gua (ICH, Q2A) debe ensayarse la exactitud en mtodos de anlisis para la
valoracin en materia prima y en producto terminado y en mtodos de anlisis de
cuantificacin de impurezas, segn la USP 30 tambin debe evaluarse en mtodos de
anlisis de estudios de la velocidad de disolucin.
3.7.4.3 Procedimiento de determinacin de la exactitud
La exactitud debe demostrarse en todo el rango especificado para el mtodo analtico
Se recomienda un mnimo de 9 determinaciones sobre 3 niveles de concentracin del
analito que cubran el rango especificado. En funcin del tipo de mtodo a validar y de
cada caso concreto se deber tener en cuenta el rango de concentraciones de trabajo:
Riqueza de un principio activo en materia prima o en producto acabado: 80 120%

34
Impurezas: desde el 50% del nivel de especificacin hasta el 120% de dicho nivel.
La exactitud se expresa como porcentaje de recuperacin en la valoracin de una
cantidad conocida de analito aadida sobre la muestra o como la diferencia entre la
media obtenida y el valor aceptado como verdadero junto con los intervalos de
confianza. (AEFI, 2001)
3.7.4.4 Determinacin
En la valoracin de un frmaco, la exactitud puede determinarse mediante la aplicacin
del procedimiento analtico con respecto a un analito de pureza conocida (por ejemplo
un estndar de referencia), o comparando los resultados del procedimiento con los de
un segundo procedimiento bien caracterizado, cuya exactitud se haya comprobado o
definido. En la valoracin de un frmaco en un producto formulado, la exactitud puede
determinarse mediante la aplicacin del procedimiento analtico a mezclas sintticas de
los componentes del producto farmacutico al que se hayan aadido cantidades
conocidas de analito dentro del intervalo de procedimiento. Si no resulta posible obtener
muestras de todos los componentes del producto farmacutico, se puede aceptar tanto
el agregado de cantidades conocidas del analito al producto farmacutico (Spike)
como la comparacin de los resultados con los de un segundo procedimiento bien
caracterizado, cuya exactitud haya sido comprobada o definida. (USP 30)
En el anlisis cuantitativo de impurezas, la exactitud debe evaluarse en muestras (del
frmaco o producto farmacutico) a las que se les hayan agregado cantidades
conocidas de impurezas. Cuando no sea posible obtener muestras de algunas
impurezas o de productos de degradacin, los resultados deben compararse con los
obtenidos mediante un procedimiento independiente. En ausencia de otra informacin,
puede resultar necesario calcular la cantidad de una impureza basndose en la
comparacin de su respuesta con la del frmaco, pero el cociente entre las respuestas
de cantidades iguales de la impureza y del frmaco (factor de respuesta relativo) debe
ser utilizado siempre que se le conozca. (USP 30)
La exactitud se calcula como el porcentaje de recuperacin de la cantidad valorada con
respecto a la cantidad conocida de analito aadida a la muestra, o como la diferencia
entre la medida de la valoracin y el valor verdadero aceptado, considerando los
intervalos de confianza. (USP 30)
La evaluacin de la exactitud puede efectuarse de varias maneras, incluyendo la
evaluacin de la recuperacin del analito (porcentaje de recuperacin) en todo el

35
intervalo de la valoracin, o evaluando la linealidad de la reaccin entre las
concentraciones estimadas y las reales. El criterio estadstico de preferencia es que el
intervalo de confianza para la pendiente este comprendido dentro de un intervalo
definido al rededor de 1.0; o alternativamente, que el valor de la pendiente sea cercano
a 1.0. En ambos casos, tanto el intervalo como la definicin de cercana deberan
especificarse respectivamente en el protocolo de validacin. El criterio de aceptacin
depender de la valoracin, de su variabilidad y del producto. No es aceptable basar un
criterio de aceptacin basado en la falta de significanca estadstica para la hiptesis
nula de que la pendiente es 1.0. (USP 30)
3.7.5 LIMITE DE DETECCION Y LMITE DE CUANTIFICACION
3.7.5.1 Definicin
Dado un mtodo analtico determinado, se entiende por lmite de cuantificacin (LQ) de
dicho mtodo, la mnima cantidad de analito presente en la muestra que se puede
cuantificar, bajo las condiciones experimentales descritas, con una adecuada prediccin
y exactitud. El lmite de cuantificacin es una caracterstica de las valoraciones
cuantitativas de compuestos que se encuentran en baja concentracin en la matriz de
una muestra. (AEFI, 2001)
El lmite de deteccin (LD) se define como la mnima cantidad de analito en la muestra
que se puede detectar aunque no necesariamente cuantificar bajo dichas condiciones
experimentales. El lmite de deteccin es una caracterstica de las pruebas de lmite. La
cantidad mnima de la muestra que puede detectarse, aunque no necesariamente
cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. Las pruebas de lmite
simplemente comprueban que la cantidad del analito se encuentra por encima o por
debajo de un nivel determinado. El lmite de deteccin se expresa habitualmente en
forma de concentracin de analito (por ejemplo, porcentaje, partes por milln, entre
otras). (AEFI, 2001)
El limite de cuantificacin es por lo tanto un termino cuantitativo mientras que el limite de
deteccin es solo cualitativo, encontrndose en ambos trminos un rango de
concentraciones en el que si bien no se puede cuantificarse el analito en cuestin con
razonable certeza, si puede detectarse su presencia sin incurrir en falsos positivos.
(AEFI, 2001)

36
Se establece necesaria la determinacin del lmite de deteccin en mtodos de anlisis
destinados a la evaluacin de impurezas mediante ensayos lmite. Esto es ensayos en
los que simplemente se determina si la cantidad de impurezas presente en la muestra
es superior o no al lmite establecido en especificaciones, sin dar un valor numrico. Se
trata de demostrar de esta forma que el mtodo es realmente capaz de detectar la
concentracin lmite y superiores. Por el contrario se considera necesario establecer
nicamente el limite de cuantificacin en mtodos destinados a la determinacin
numrica de impurezas; y es aqu donde puede surgir la primera duda, puesto que hoy
en da la pureza de gran parte de los principios activos farmacuticos se define a partir
de una serie de test limites de impurezas conocidas y desconocidas junto, con la suma
total de estas, y parece obvio que si se a de dar finalmente una suma porcentual del
contenido de impurezas, previamente estas se han de haber cuantificado con suficiente
precisin y exactitud; siempre que se deba dar un valor numrico al total de impurezas
se reconoce implcitamente la necesidad de determinar el limite de cuantificacin para
cada una de ellas.
Cuando el mtodo se define como un mtodo de anlisis de valoracin de contenido
en el cual siempre se trabaja en rangos muy alejados de la mnima cantidad detectable
o cuantificable por el equipo, no seria necesaria la determinacin de estos parmetros(
AEFI, 2001)
3.7.5.3 Procedimientos de determinacin del lmite de deteccin (LD) y lmite de
cuantificacin (LQ)
Mtodo basado en el examen visual
Segn ICH Q2B, tanto el LD como el LQ podran determinarse a partir del anlisis de
muestras con concentraciones conocidas y decrecientes del analito, establecindose
visualmente la mnima concentracin detectable como aquella concentracin limite que
permite cuantificar con razonable precisin y exactitud la seal obtenida. (AEFI, 2001)
3.7.6 ROBUSTEZ
3.7.6.1 Definicin
La gua ICH, Q2A define la robustez de un mtodo analtico como la medida de su
capacidad para permanecer inalterado ante pequeas pero deliberadas variaciones en
ciertos parmetros, proporcionando idea de su fiabilidad o estabilidad durante su

37
empleo. Es por lo tanto la capacidad que demuestra el procedimiento de anlisis para
proporcionar resultados validos en presencia en presencia de pequeos cambios
respecto de las condiciones descritas en el mtodo, susceptibles de producirse durante
su utilizacin. (AEFI, 2001)
La robustez de un procedimiento analtico es una medida de su capacidad para no
resultar afectando por variaciones pequeas pero deliberadas en los parmetros
enumerados en la documentacin del procedimiento, y a la vez, da una idea de su
aptitud durante su uso normal. La robustez puede determinarse durante la etapa de
desarrollo del procedimiento analtico. (USP 30)
La robustez (Robustness) no debe confundirse con el termino Ruggedness. Este ultimo
no se menciona en las guas ICH, pero si en la farmacopea USP. Esta define el termino
Ruggedness como el grado de reproducibilidad de los resultados mediante el anlisis
de las mismas muestras bajo una variedad de condiciones tales como diferentes
laboratorios, diferentes analistas, diferentes instrumentos, lotes de reactivos, das,
tiempos diferentes temperaturas, entre otros. (AEFI, 2001)
Aunque la USP define la robustez junto con los parmetros de validacin de un mtodo
analtico, no es considerado, todava, un requisito necesario para registro de
especialidades, sino que se trata de un estudio que sugiri con el fin de resolver los
problemas que se planteaban en la transferencia de mtodos analticos entre
laboratorios. Las guas ICH recomienda incluir la robustez en una fase apropiada del
desarrollo del mtodo y no en la validacin propiamente dicha , dado que si la robustez
del mtodo no se comprueba con anterioridad a iniciar la validacin, puede suceder que
se intente validar un mtodo poco robusto, con lo consiguientes malos resultados y
perdida de tiempo y dinero. Incluso despus de realizar el estudio de robustez podra
concluirse que se debe modificar algn parmetro del mtodo, obligando a la
consiguiente revalidacin de los puntos necesarios. De hecho la consecuencia directa
de los resultados del estudio de robustez ha de ser la definicin razonada del test de
idoneidad del mtodo, que en muchas ocasiones es fijado de una forma arbitraria y sin
saber la ciencia cierta si los requisitos que impone son realmente necesarios o limitan la
realizacin del mtodo a unas condiciones escasamente reproducibles.(USP, 30)
Todos los mtodos, sea cual sea la tcnica empleada, son susceptibles a ser sometidos
a un estudio de robustez. Algunos pueden tener muchos parmetros sobre los que

38
actuar y otros menos. Adems estos no tienen por que ser solo factores relacionados
con la medida final, sino que pueden ser de cualquier etapa del procedimiento analtico,
Por esto la primera etapa del estudio es precisamente analizar todo el mtodo y definir
que factores son los que se espera que influyan mas en el resultado final. (AEFI, 2001)
3.7.7 ESPECIFICIDAD
3.7.7.1 Definicin
Los documentos ICH definen especificidad como la capacidad de evaluar de manera
inequvoca el analito en presencia de aquellos componentes cuya presencia resulta
previsible, como impurezas, productos de degradacin y componentes de la matriz. La
falta de especificidad de un procedimiento analtico individual puede compararse
utilizando otros procedimientos analticos complementarios otras autoridades
internacionales de reconocido prestigio (IUPAC, AOAC-I) han preferido el termino
selectividad reservando especificidad para procedimientos que resulten completamente
selectivos. Para las pruebas que se indican a continuacin, la definicin anterior tiene
las siguientes consecuencias (USP 30):
Pruebas de identificacin: garantiza la identidad del analito.
Pruebas de Pureza: garantiza que todos los procedimientos analticos efectuados
permiten declarar con exactitud el contenido de impurezas de un analito.
Valoraciones: proporcionan un resultado exacto, que permitan una declaracin exacta
del contenido o potencia del contenido en una muestra.
3.7.7.2 Determinacin
En anlisis cualitativos (pruebas de identificacin), debe demostrarse la capacidad de
distinguir compuestos de estructura estrechamente relacionada cuya presencia resulta
probable. Esta capacidad debera confirmarse mediante la obtencin de resultados
positivos a partir de muestras que contengan el analito (quizs mediante comparacin
con un material de referencia conocido), junto con los resultados negativos de dicha
muestra que no contengan dicho analito y mediante la confirmacin que no se obtiene
una respuesta positiva de materiales con estructura similar o estrechamente relacionada
a la del analito. (USP 30)
En un procedimiento analtico para impurezas, la especificidad puede establecerse
mediante la adicin al frmaco o producto farmacutico de una cantidad conocida de

39
impurezas en concentraciones adecuadas y la demostracin de que esas impurezas se
determinan con exactitud y precisin adecuadas. (USP 30)
En una valoracin, la demostracin de especificidad requiere evidencia que el
procedimiento no resulta afectado por la presencia de impurezas o excipientes. En la
prctica esto puede hacerse agregando al frmaco o producto farmacutico una
cantidad conocido de excipientes o de impurezas en concentraciones adecuadas y
demostrando que el resultado del anlisis no resulta afectado por la presencia de estos
materiales extraos. (USP 30)
Si no dispone de estndares de impurezas o de los productos de degradacin, puede
demostrarse la especificidad comprobando los resultados de las muestras que
contengan impurezas o productos de degradacin con los de un segundo procedimiento
bien caracterizado (por ejemplo un procedimiento farmacopeico u otro procedimiento
validado). Estas comparaciones deberan incluir muestras sometidas a condiciones
forzadas relevantes (por ejemplo, luz, calor, humedad, hidrlisis acida, hidrlisis alcalina,
oxidacin, entre otros.) en una valoracin deben comparece los resultados; en pruebas
de impurezas cromatoqraficas, deben compararse los perfiles de impurezas. (USP 30)
3.8 VALORACION MICROBIOLOGICA DE ANTIBIOTICOS
3.8.1 Generalidades
Bajo las condiciones adecuadas, la actividad (potencia) de los antibiticos puede
demostrarse por su efecto inhibidor sobre los microorganismos. En consecuencia las
valoraciones microbiolgicas o biolgicas siguen siendo, por lo general, el estndar para
disipar dudas en cuanto a la posible perdida de la actividad. (USP 30)
La potencia de un antibitico se estima mediante la comparacin de la actividad de un
producto (problema) y la de una muestra de referencia (patrn) en presencia de un
microorganismo testigo. (AEFI, 2001)
3.8.2 Definiciones
3.8.2.1 Valoracin de antibiticos
La valoracin de antibiticos se puede efectuar por difusin en agar o turbimetria,
dependiendo de la naturaleza de la muestra a ensayar. La base de los ensayos por
difusin en agar, es que la respuesta obtenida frente a distintas dosis de antibiticos
son proporcionales a los dimetros de los halos de inhibicin; en los ensayos
turbimetricos la respuesta se mide en forma de turbidez. (AEFI, 2001)

40
Bsicamente la valoracin de antibiticos por difusin en agar se fundamenta en la
difusin del antibitico desde un cilindro vertical (o desde una perforacin circular en el
agar) a travs de una capa de agar solidificada en una placa de petri hasta inhibir
totalmente el crecimiento del microorganismo aadido, en un rea circular o zona de
inhibicin entorno al cilindro que contiene una solucin antibitico. El mtodo
turbidimetrico se basa en la inhibicin del crecimiento de un cultivo microbiano en una
solucin uniforme del antibitico en un medio lquido que promueva su rpido
crecimiento en ausencia del antibitico. (USP 30)
3.8.2.2 Potencia real o verdadera
La potencia de la materia o producto acabado cuando se realiza el ensayo. (AEFI, 2001)
3.8.2.3 Potencia asignada
Es el valor nominal asignado a un producto acabado a partir de la potencia de la
materia prima. (AEFI, 2001)
3.8.2.4 Potencia estimada
Potencia calculada a partir de los datos del ensayo. (AEFI, 2001)
3.8.2.5 Limites de confianza (Intervalo de confianza)
La Farmacopea aplica como intervalo de confianza el que se calcula con probabilidad
de 95% sobre el valor real obtenido, no obstante, se puede calcular con otro nivel de
probabilidad. (AEFI, 2001)
3.8.3 METODO
El diseo mas simple para esta prueba es un ensayo con una curva estndar. Para ello
se prepara el patrn a 5 concentraciones o dosis (A, B, C, D, E) que mantengan entre si
una relacin logartmica, y una solucin de la preparacin a ensayar a una
concentracin terica equivalente a la intermedia del patrn (C). Se considera el ensayo
como preliminar si la potencia de la muestra una vez interpolada en la curva construida
con las respuestas del patrn es inferior al 80% o superior al 120%. En tal caso se
debe preparar la muestra a una concentracin terica mas centrada a la del patrn y
repetir el ensayo. Otro diseo seria del cuadrado latino, en el que la potencia del
problema se determina por comparacin entre una recta constituida por el patrn y otra
constituida por el problema. (AEFI, 2001)

41
Los sistemas biolgicos presentan una variabilidad que obliga a tener diferentes criterios
para verificar y realizar ensayos. Realmente la verdadera potencia se puede encontrar
dentro de un rango de valores que vendr definido por los lmites de confianza de error
calculados para el ensayo, que nos dar los valores de los extremos con una
probabilidad de un 95%.( AEFI, 2001)
El grado de precisin requerido depende de los lmites de aceptacin. Una especialidad
acabada con un intervalo de aceptacin del 95-105% o del 90-110% requiere un numero
de replicas bajo (n= 2-3). Si los limites de aceptacin son mas estrechos (98-102%) el
numero de replicas debe ser mucho mayor (n 6). (AEFI, 2001)
3.8.4 Validacin
El ensayo debe disearse de tal forma que permita examinar la validez del mtodo
matemtico en el que se basa la ecuacin de la potencia. Si se escoge el modelo de
lneas paralelas, las dos lneas de logaritmos de dosis-respuesta deben ser paralelas, y
lineales en el rango de dosis usadas en el clculo. Estas condiciones deben verificarse
por ensayos de validacin con una probabilidad P= 0.05. Pueden usarse otros modelos
matemticos si se demuestra su validez. (AEFI, 2001)
Los pasos a seguir para la validacin de una valoracin de antibiticos son segn la
USP 30
3.8.4.1 Linealidad
Demostrar que la recta de regresin constituida con el logaritmo de la dosis de
antibitico patrn y la respuesta cumple con los parmetros de regresin lineal y anlisis
de la varianza.
Demostrar que la recta de regresin construida con la muestra de producto acabado que
contiene el antibitico a las mismas dosis que la recta patrn, presenta una relacin Log.
Dosis-respuesta que cumple con los parmetros de regresin lineal y anlisis de
varianza.
3.8.4.2 Repetibilidad (Precisin)
Se determina a partir de un blanco de excipientes al que se le aade la cantidad de
antibitico correspondiente al 100% terico. Despus de realizar la valoracin (9
replicas) se obtienen unos resultados con los cuales se calcula:
La media, la desviacin estndar (variabilidad del mtodo), la desviacin estndar de la

42
media, coeficiente de variacin, limites de confianza de la media y la tolerancia, que
expresa la variabilidad del mtodo respecto al intervalo entre las especificaciones
superior e inferior.
3.8.4.3 Exactitud
Para determinar la exactitud se preparan tres alcuotas de un blanco con los excipientes,
se aaden a una de ellas la cantidad de antibitico correspondiente al limite inferior de
aceptacin, en la otra alcuota se aade la cantidad correspondiente al 100% y en la
tercera la cantidad correspondiente al limite superior de aceptacin. Se efectan las
valoraciones de cada una de las alcuotas y con los resultados obtenidos se comprueba
que se cumplan los parmetros estadsticos que definen la exactitud:
Homogeneidad de varianzas, Test t de Student y determinacin del sesgo o error
determinado
3.8.4.4 Selectividad
Se determina analizando por duplicado el blanco de excipientes. Si el resultado no es
cuantificable se demuestra la selectividad del mtodo. Si la respuesta es cuantificable,
se deber tener en cuenta la misma en la obtencin de resultados. En estos casos se
debe determinar cual es el producto que interfiere, y tratar de eliminarlo (por dilucin o
por neutralizacin) o bien aadirlo a los patrones, de forma que tanto los patrones como
los problemas tengan la misma concentracin de sustancia interferente. (AEFI, 2001)

43
4. FORMULACION DEL PROBLEMA

La vocacin de la industria farmacutica permanentemente ha sido producir
medicamentos de calidad y con total garanta de seguridad. La calidad de los
medicamento se logra en todos y cada uno de los pasos de su proceso de produccin,
desde su investigacin hasta el ltimo anlisis sobre el producto final, debido a que al
elaborar un producto destinado a curar la enfermedad, salvar vidas o mejorar la calidad
de vida ya sea humana o animal, no puede haber el mnimo margen para el error (Garca,
M. 2001).
Alcanzar un alto nivel de calidad de los medicamentos requiere garantizar que cada una
de las etapas de la produccin se realice de forma adecuada y cumpliendo aquellos
parmetros de calidad que se han establecido previamente. Con los aos, se han ido
desarrollando recomendaciones e incorporando requerimientos que han evolucionado
hasta una reglamentacin estricta. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos de control y
fabricacin, se exige una mejora continua y mximas garantas de la calidad y este
mximo grado de seguridad tan solo lo proporcionan los procesos de validacin (Garca,
M. 2001).
Para el desarrollo qumico-farmacutico de un medicamento es necesario e indispensable
la utilizacin de un mtodo analtico que permita cuantificar el producto mayoritario en
forma de materia prima o como ingrediente activo de una formulacin. (Rampazoo P,
1990) La valoracin microbiolgica de antibiticos es un mtodo analtico que nos
proporciona informacin del contenido o potencia del analito de inters en una muestra,
su implementacin en el control de calidad de productos farmacuticos terminados
permite cumplir con las exigencias legales, asegurar la calidad y eficacia del producto
para salir al mercado. Razn por la cual se debe asegurar que el mtodos analticos sea
sometido a un proceso de validacin, por medio del cual se compruebe si el mtodo es lo
suficientemente confiable, adecuado para el propsito y aplicacin analtica propuesta y si
los resultados previstos se obtienen dentro de las condiciones prefijadas.
La utilizacin de mtodos analticos, adecuados para el propsito, permite obtener
resultados trazables con un nivel apropiado de incertidumbre; dichos resultados
generalmente son usados como base para la toma de decisiones financieras, regulatorias,
entre otros., relacionadas con el desarrollo y fabricacin de productos, as como con la
prestacin de servicios y otras actividades de importancia en las economas nacionales,
regionales e internacionales.

44
El laboratorio que implementa un mtodo analtico seleccionado para un propsito
determinado, sean stos normalizados, no normalizados o desarrollados por el
laboratorio, es responsable de verificar su desempeo contra las especificaciones de la
validacin, tanto antes de ponerlo en uso como durante su utilizacin rutinaria, para
demostrar que lo domina y usa correctamente.
Para el cumplimiento del Sistema de Garanta de Calidad la validacin es un requisito
imprescindible que est establecido por los entes reguladores

en Colombia (INVIMA e
ICA) y por comisiones de Farmacopeas

(United States Pharmacopeial Convention USP).

45
5. JUSTIFICACION

VICAR FARMACEUTICA S.A. fabrica y comercializa productos farmacuticos
veterinarios, posee una lnea de ms de cuarenta productos en el mercado para la
sanidad animal, dentro de estos productos encontramos antibiticos (Bactran que
poseen como principio activo Bacitracina) a los cuales se les debe garantizar su
efectividad y calidad para lo cual son destinados. La efectividad de estos productos
antimicrobianos, se evala para determinar la capacidad de los mismos de otorgar la
proteccin necesaria o su efecto inhibidor contra cualquier tipo de infeccin, viral o
bacteriana. Para esto se realiza la valoracin microbiolgica de antibiticos que nos
permite cuantificar la concentracin y la potencia de un principio activo en el frmaco
para obtener una medida del efecto de este comparado con la misma dosis de un
estndar y de esta forma salir al mercado con las caractersticas predeterminadas.
En el control de calidad de antibitico se requiere del anlisis especfico por medio de
la valoracin microbiolgica del antibitico, que sometido a un proceso de validacin
garantice de forma consistente y permanente la confiabilidad y validez de los datos
obtenidos y poder as juzgar de la seguridad (calidad) del producto para su
comercializacin.
Al validar este mtodo analtico, se obtendr un procedimiento especfico para el
anlisis en las condiciones descritas. Se crea evidencia documentada de un alto grado
de confianza, que el procedimiento descrito suministra una serie de direcciones precisas
y definitivas del mtodo analtico que deben seguirse al realizarse y efectuarse en el
laboratorio para garantizar y cumplir los requerimientos de la aplicacin analtica
propuesta. La validacin de tcnica permite no solo el conocimiento del mtodo analtico
que proporciona resultados y datos validos sino tambin el cumplir con las exigencias
legales tanto del registro de especialidades farmacuticas como de las Buenas
Prcticas de manufactura de productos farmacuticos vigentes, que garantizan la
calidad y eficacia del producto. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
Se buscara la optimizacin y estandarizacin del procedimiento de proceso de la tcnica,
al estudiar las caractersticas de desempeo analtico y al minimiza el nmero de fallos y
repeticiones permitiendo un importante ahorro de costos. De esta forma se podr prestar
un servicio a terceros como un laboratorio que establece procesos con procedimientos

46
consistentes, que se llevan a cabo por medio de tcnicas y mtodos exactos,
reproducibles y slidos. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
La norma ISO/IEC 17025 no requiere la validacin de los mtodos normalizados
aplicados en un laboratorio especfico, pero s establece que se debern obtener datos
sobre el rendimiento de su propio uso, es decir que siempre resulta apropiado contar
con algn grado de validacin, incluso cuando se utilicen mtodos normalizados.
Normalmente se asume que los mtodos normalizados se pueden aplicar directamente
y que se alcanzarn los niveles de rendimiento publicados por quienquiera que utilice el
mtodo, pero este no es un supuesto seguro. Se debe al menos practicar con el mtodo
a travs de un proceso de capacitacin para alcanzar una competencia aceptable.
Razn por la cual laboratorio de microbiologa de VICAR FARMACEUTICA S.A. debe
establecer el grado de validacin requerido de acuerdo con las necesidades del cliente,
con las polticas de calidad, con la naturaleza de los cambios realizados a un mtodo
previamente validado, o con las metas de calidad que se haya trazado como parte de
los procesos de mejoramiento continuo del sistema de calidad, con la finalidad de ser
competente y lder en la industria farmacutica veterinaria del pas. (Snchez, .2003)
Por otra parte se encuentran las normas ISO 9000 presentes en un manual de calidad
conciso que establece polticas bsicas fundamentadas en la descripcin de
procedimientos de procesos que reflejen en pocas palabras lo que se hace en la
industria. La norma ISO 9000 busca mejorar y certificar las industrias de manufactura en
el mbito nacional e internacional mediante la estandarizacin de cada uno de los
procesos de produccin (Teormina, 1997). Al ir realizando la validacin de cada uno de
los mtodos analticos que se desarrollan en esta industria farmacutica se estan
alcanzando las pautas para la certificacin de la empresa, alcanzando un alto nivel de
calidad que tiene como resultado el desarrollo, crecimiento y alto grado de
competitividad en la industria farmacutica a nivel nacional e internacional, ser lder en
prestacin de servicios de anlisis de laboratorio, tener reconocimiento del alto nivel de
calidad de los productos que ofrece al consumidor, logrando su misin y visin.

47
6. OBJETIVOS

6.1 OBJETIVO GENERAL
Validar el mtodo analtico para la cuantificacin de Bacitracina en el laboratorio de
control de calidad de VICAR FARMACEUTICA S.A.

6.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS
6.2.1 Desarrollar el proceso de validacin del mtodo analtico para la cuantificacin de
Bacitracina Zinc.
6.2.2 Desarrollar el proceso de validacin del mtodo analtico para la cuantificacin de
Bacitracina Metilen Disalicilato.
6.2.3 Evaluar cada una de las caractersticas de desempeo analtico para la validacin
del mtodo.
6.2.4 Crear evidencia documentada de la declaracin de validez de que el mtodo
analtico se ajusta al uso propuesto

48
7. MATERIALES Y METODOS

7.1 Estndar de Referencia
La potencia de los antibiticos en el estudio se estableci en Unidades de actividad.La
Unidad de actividad de Bacitracina que se empleo es la establecida y definida segn
el maestro federal designado para este antibitico. De esta forma para el desarrollo del
estudio se empleo el Estndar de Referencia USP de Bacitracina calibrado segn el
estndar maestro, de Lote N1E200 y potencia de 75.1 UI/mg, obtenido de la U.S.
Pharmacopeial Convention, Inc.
7.2 Muestras de estudio
La primera muestra que se utilizo en el anlisis fue Bacitracina Zinc al 15% como
principio activo, de Lote 20071102-6 y potencia asignada 6006 U/g en base seca
(indicada en el certificado de Anlisis por el fabricante).
La segunda muestra utilizada en el anlisis fue Bacitracina Metilen Disalicilato al 11%
como principio activo, de Lote LO70701 y la potencia asignada 4.49 U/g en base seca.
(Indicada en el certificado de Anlisis por el fabricante).
La planificacin y ejecucin de las valoraciones microbiolgicas de los antibiticos
muestra y la validacin de la tcnica de cuantificacin de Bacitracina se realiz segn lo
establecido en la USP con respecto a las especificaciones para Bacitracina descritos en
la tcnica de valoraciones microbiolgicas de antibiticos y en las especificaciones
descritas para la realizacin de la validacin de los procedimientos farmacopeicos. (USP
30, Antibiticos Valoraciones Microbiolgicas (81) pag.111 y Validacin de
Procedimientos Farmacopeicos (1225) pag. 749) Tambin se realizo segn la
metodologa y parmetros descritos en el Procedimiento Operativo Estndar para
validacin de mtodos analticos empleado por Vicar Farmaceutica
Los anlisis estadsticos para la Validacin del Mtodo Analtico se realizaron utilizando
Statgraphics Plus for Windows 2.0 (1996). Statistical Graphics Corp. Serial Number:
3862216 para la linealidad del sistema y las linealidades del mtodo y se utilizo
Microsoft Office Exel 2007 para el anlisis de datos de la precisin, exactitud,
selectividad, especificidad, limite de cuantificacin, limite de deteccin, linealidad del
sistema y linealidad del mtodo.

49
7.3 Preparacin y estandarizacin de la suspensin del microorganismo de
ensayo
Basados en la tcnica de valoraciones microbiolgicas descrita en la USP 30, se
determino:
Microorganismo de prueba para el antibitico Bacitracina: Micrococcus luteus ATCC
10240
Medio de cultivo (Agar) a emplear para los repiques: tripticasa soya
Mtodo de valoracin: difusin en placa
7.3.1 Cultivo bacteriano: la cepa de Micrococcus luteus liofilizada se obtuvo de las
colecciones estandarizadas de la American Type Culture Collection (ATCC). Se
reconstituyo el vial liofilizado y a partir de este cultivo de origen se sembr por
agotamiento en placas con agar tripticasa soya (TSA) (Anexo 1) y en caldo BHI (Anexo
1.) para su recuperacin, los medios se incubaron de 32 a 35
o
C durante 24 horas.
A partir de los aislamientos del cultivo primario se realizo su identificacin a travs de
mtodos microscpicos mediante tincin de Gram y macroscpicos mediante la
observacin de las caractersticas de las colonias. Para mantener la viabilidad del
microorganismo durante la validacin a partir del cultivo primario se realizaron
subcultivos en placas con TSA cada 3 dias.
7.3.2 Preparacin del inoculo: Se preparo una suspensin madre en la que se
adiciono con un asa estril colonias del microorganismo provenientes de un subcultivo
de Micrococcus luteus ATCC 10240 en 10 ml de solucin salina 0.9% estril utilizando
vortex para homogenizar la muestra hasta que se obtuvo una suspensin con una
turbidez igual al patron de MacFarland con valor de trasmitanca de 25%.Para facilitar la
comparacin del patrn de MacFarland y la suspensin de microorganismo se trazo una
lnea negra gruesa sobre una hoja de papel y sobre esta se colocaron simultneamente
los dos tubos, para observar la lnea con la misma nitidez en los dos tubos. La poblacin
bacteriana se estim comparando el grado de turbidez de la solucin madre de
Micrococcus luteus ATCC 10240, con el patrn de turbidez de la escala de MacFarland
que presento trasmitanca de 25%.
7.3.3 Determinacin de la cantidad de suspensin madre para inoculo: la cantidad
de suspensin madre del microorganismo que se utilizo como inoculo se determino
inoculando diferentes volmenes de la suspensin madre, comenzando con el volumen

50
sugerido (0.3ml / 100ml medio) para inoculo por la USP 30. Los volmenes de prueba
que se utilizaron de suspensin madre fueron: 0.3, 0.5, 1.0 y 2.0 ml por cada 100 ml de
medio antibitico No 1 (Anexo 1). Cada volumen de prueba se hizo por triplicado. Se
agrego 6ml de inoculo sobre cada una de las cajas petri con capa de agar base. Se
dejaron las cajas 45 minutos sobre una superficie plana hasta que el inoculo se
solidificara para perforarlas con el sacabocados de 6 perforaciones y se retiro el residuo
de agar de cada uno de los pozos, en cada pozo se sembr 100 microlitros del la
dilucin media del estndar de referencia en una concentracin de 1.0 UI/ml. Se
incubaron las placas de 32 a 35
o
C durante 18 horas. Despus del periodo de
incubacin se determino la cantidad de suspensin madre para el inoculo que mostr
una demarcacin satisfactoria de las zonas de inhibicin obtenida por la relacin dosis-
respuesta optima a partir de la cantidad de cultivo del microorganismo en las placas.
(USP, 30)
7.4 Preparacin del estndar (Mtodo de la curva patrn)
7.4.1 Diluciones del patrn: La preparacin de la solucin madre y diluciones de
prueba del estndar se realizaron segn lo establecido por la USP 30 en la valoracin
microbiolgica de antibiticos. Se tomo una muestra del estndar de Bacitracina y se
someti a secado a 60
o
C durante 3 horas en horno. Para la solucin madre del patrn
se utilizo acido clorhdrico 0.01N como solvente inicial. Se disolvi una cantidad de
16.66mg de Bacitracina seca equivalente 1250UI (Estndar de Referencia USP) en
acido clorhdrico 0.01N en baln aforado de 25ml. La solucin se someti durante 15
minutos a ultrasonido
7.4.2 Diluciones finales del patrn: la valoracin se realizo con 10 niveles (desde A
hasta J) del Estndar. Se preparo a partir de la solucin madre 10 diluciones en
concentraciones de: 0.05 UI/ml , 0.1 UI/ml , 0.15 UI /ml , 0.20 UI/ml , 0.25 UI/ml , 0.50
UI/ml , 1.0 UI/ml, 1.5 UI/ml, 2.0 UI/ml y 2.5 UI/ml utilizando solucin amortiguadora No 1,
1%, pH 6 (Anexo 1) como diluyente ( tabla.4 y 5). La dilucin media utilizada fue de 1.0
UI por ml segn lo especificado en la USP 30.
Tabla 4. Diluciones de la curva patrn (intervalo de concentraciones 0.1 a 0.25
UI/ml)
Volumen de 0.5 UI/ml (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)
2 8 0.1
3 7 0.15
4 6 0.2
5 5 0.25

51
Tabla 5. Diluciones de la curva patrn (intervalo de concentraciones 0.5 a 2.5
UI/ml)
Volumen de Solucion Madre (ml) Volumen de Diluyente (ml) Concentracion Final (UI/ml)
1 99 0.5
1 49 1.0
3 97 1.5
2 48 2.0
2.5 47.5 2.5

7.5 Preparacin de la muestra
7.5.1 Dilucin de la muestra: se determino la cantidad de muestra a pesar para la
valoracin del antibitico presente en el producto a partir de informacin que
proporciono el fabricante de la potencia asignada al producto en el certificado de
anlisis. La primera muestra contiene Bacitracina Zinc al 15% como principio activo, la
potencia calculada es de 5.753 UI/g en base hmeda. La potencia de la muestra se
dividi en el equivalente del estndar para obtener la cantidad de 0.21g de muestra a
pesar para preparar la solucin madre. Se disolvi los 0.21g en acido clorhdrico 0.01N
en baln aforado de 25ml. La segunda muestra contiene Bacitracina Metilen Disalicilato
al 11% como principio activo, la potencia calculada es de 4.283 UI/g en base hmeda.
Se determino la cantidad de 0.29g de muestra a pesar para preparar la solucin madre.
Se disolvi la cantidad de 0.29g de muestra en acido clorhdrico 0.01N en baln aforado
de 25ml. Las diluciones madre de las muestras se sometieron por 15 minutos a
ultrasonido. Terminado los 15 minutos las soluciones se utilizaron para preparar la
dilucin de prueba de la muestra.
7.5.2 Dilucin de prueba de la muestra: La valoracin se realizo con 10 niveles del
estndar requiriendo un solo nivel de la muestra. De esta forma se diluyo la solucin
de la muestra para obtener una concentracin igual al nivel medio del estndar (dilucin
G de concentracin 1.0 UI/ml). La dilucin de prueba de la muestra se preparo con 1ml
de solucin madre de muestra que se preparo anteriormente aforando en baln de 50 ml
con el mismo diluyente final utilizado para el Estndar de Referencia (solucin
amortiguadora No 1, 1%, pH 6). La dilucin de prueba de cada una de las muestras se
trabaj en concentracin de 1.0 UI/ml igual al nivel medio del estndar.
7.6 Obtencin del placebo
Para el estudio no fue posible obtener el placebo de cada uno de los productos a
analizar de esta forma se realizo la inactivacin del principio activo para poder analizar
los excipientes presentes en la muestra. Para la desactivar el principio activo se

52
realizaron diluciones madres de cada una de las muestras y se les adiciono 5ml de HCl
1N posteriormente se sometieron 60 minutos a 90
0
C en bao de termostatado. Pasado
el periodo de tiempo se adiciono 5 ml de NaOH 1N con el fin de neutralizar la muestra.
Finalmente se afora el balon de 50ml con Buffer 1 al 1% pH6. Se realizaron estudios
para la confirmacin de que no existiera actividad ni presencia de la molcula del
principio activo.
7.7 Preparacin de placas de valoracin
Se prepararon placas de valoracin utilizando cajas petri de 90 x 15 mm a las que se
les adiciono 20ml de medio antibitico No 1.(Anexo 1) se dejo solidificar el medio
durante 40 minutos para formar una capa de agar base lisa. Se agrego 6 ml de inoculo
como capa de siembra, sobre la superficie de la capa de agar base. El inoculo se
preparo adicionando un volumen de 0.5 ml de suspensin madre del microorganismo
Micrococcus luteus ATCC 10240 por cada 100 ml de medio agar antibitico No 1
fundido a una temperatura de 45 a 50
o
C. Se dejo solidificar durante 1 hora. Pasado el
tiempo se perforaron las placas con el sacabocados de 6 perforaciones equidistantes
entre ellas. El residuo de agar en cada perforacin fue retirado con pinzas dejando el
pozo disponible para la siembra de muestras a analizar. Las placas de valoracin se
rotularon de tal forma que 3 pozos alternos de los seis fueran para la muestra de la
concentracin de referencia del patrn del estndar (serie de concentracin 1.0 UI/ml) y
los tres pozos restantes se rotularon como muestra. Las placas de valoracin una vez
sembradas con la muestra se incubaron de 32-35
o
C durante 18 horas para realizar la
lectura del dimetro que presento la zona de inhibicin con un calibrador.
7.8 Validacin del mtodo de cuantificacin del principio activo (USP, 30)
Todos los parmetros y caractersticas del desempeo analtico de la validacin se
evaluaron para cada tipo de Bacitracina (Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen
Disalicilato)
7.8.1 Especificidad: se verific la especificidad del mtodo analtico observando la
capacidad de este, de detectar el analito de forma inequvoca sin interferencias de otro
compuesto y/o sustancias qumicas diferentes que pueden estar presentes en una
misma muestra. Se prepararon diluciones de las muestras y del estndar de referencia
hasta obtener una concentracin de 1.0 UI/ml. Se sembr por separado 100 microlitros
de las muestras, el estndar, el placebo y el diluyente en cajas de valoracin. El anlisis

53
se realizo con 3 replicas para cada uno. Se observo si existi o no la formacin de halo
de inhibicin.
7.8.2 Selectividad: se verifico la selectividad del mtodo analtico preparando muestras
al 100% del estndar de referencia y de las muestras. Se prepararon 3 replicas
independientes para el estndar y las muestras. A cada una de ellas se le verifico los
posibles interferencias de metabolitos de degradacin sometiendo la molcula a
condiciones externas de temperatura, condiciones acidas, condiciones alcalinas y a
fotolisis por luz UV. Las muestras y el estndar a una concentracin del 100% se
sometieron a condiciones acidas para esto se adiciono 1ml de cada una de las muestras
y el estndar (concentracin al 100%) en baln de 50 ml. Se preparo una muestra para
hidrlisis acida empleando HCL 1N, se adiciono 5ml a cada una de las muestras en el
baln de 50ml, posteriormente se sometieron por una hora a 90
o
C en bao termostatado
finalizado el tiempo se adiciono 5ml de NaOH 1N a cada una de las muestras en el
mismo baln de 50ml para neutralizar la muestra y se aforo con Buffer 1 al 1% pH6.
Para someter las muestras a condiciones bsicas se adiciono 1ml de cada una de las
muestras y el estndar (concentracin al 100%) en baln de 50 ml. Se preparo muestra
para hidrlisis bsica empleando NaOH 1N, se adiciono 5ml a cada una de las
muestras en el baln de 50ml posteriormente se sometieron por una hora a 90
o
C en
bao termostatado finalizado el tiempo se adiciono 5ml de HCl 1N a cada una de las
muestras en el mismo baln de 50ml para neutralizar la muestra y se aforo con Buffer 1
al 1% pH6.
Para evaluar las muestras en condiciones externas de temperatura se adiciono 1ml de
cada una de las muestras y el estndar (concentracin al 100%) en baln de 50 ml
posteriormente se sometieron a 90
o
C en bao termostatado durante una hora.
Transcurrido el periodo de tiempo se realizaron diluciones para obtener una
concentracin de 1.0 UI/ml.
Para observar la degradacin por accin de la luz las muestras se colocaron bajo luz
UV por un tiempo de 8 das a luz solar, transcurrido el periodo de tiempo se realizaron
diluciones para obtener una concentracin de 1.0 UI/ml. Una vez que se obtuvieron los
datos de la valoracin de cada una de las condiciones a las que se sometieron las
muestras, se realizo una segunda prueba en la que se llev acabo los mismos
procedimientos solo que el periodo de exposicin a la temperatura cambio siendo de 30
minutos a 90
o
C, en las condiciones acidas y bsicas nicamente. Se realizo esta
segunda prueba ya que los resultados que se obtuvieron mostraron una degradacin

54
total de la molcula del principio activo al ser sometidas a 90
o
C en bao de mara
durante 1 hora en las diferentes condiciones, por esta razn se analizo en un periodo de
tiempo mas corto para determinar si la respuesta de la molcula era la misma en un
periodo de tiempo mas corto en las mismas condiciones de prueba.
Se determin por medio de un estudio estadstico, el porcentaje de degradacin de cada
una de las molculas sometidas a las diferentes condiciones de estrs.
7.8.3 Linealidad del sistema: Para el estudio de la linealidad del sistema se prepar
una curva de calibracin en un intervalo de concentracin desde 0.05 hasta 2.5 UI/ml,
que incluy 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 0.5,
1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estndar de Referencia USP Bacitracina (Ver Tabla. 6). El
anlisis se realiz por triplicado en cada concentracin. Los niveles de concentracin se
encuentran dentro de los intervalos establecidos para el tipo de anlisis (80% 100%
120% 140%).
A partir de los datos obtenidos de la prueba, se realizo un anlisis estadstico
determinando las siguientes especificaciones: ecuacin de la recta de regresin,
representacin grafica de la recta de regresin, coeficiente de correlacin, coeficiente de
determinacin y anlisis de variancia para la regresin lineal.
7.8.4 Linealidad del mtodo: para esta determinacin se analizo el mtodo preparando
10 muestras de diferentes niveles de concentracin de analito de muestra. Las
concentraciones verificadas previamente, son las mismas que se utilizaron en la
linealidad del sistema. El intervalo de concentraciones se utilizo desde 0.05 hasta 2.5
UI/ml que incluy 10 niveles de concentraciones diferentes (0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25,
0.5, 1.0, 1.5, 2.0 y 2.5 UI /ml) del Estndar de Bacitracina mas placebo. De cada una de
las concentraciones se realizaron 3 replicas. A cada una de las diluciones se le adiciono
1ml de placebo antes de aforar los balones con Buffer 1 al 1% pH6. El placebo se
obtuvo sometiendo una solucin madre de muestra a una hidrlisis acida con 5ml de
HCl 1N posteriormente se someti a 60 minutos a una temperatura de 90
o
C en bao
termostatado transcurrido el tiempo se neutralizo con 5ml de NaOH 1.0N. De esta
forma se inactivo el principio activo y la muestra represento el placebo.
A partir de los datos obtenidos de la prueba, se realizo un anlisis estadstico
determinando las siguientes especificaciones: ecuacin de la recta de regresin,
representacin grafica de la recta de regresin, coeficiente de correlacin, coeficiente de
determinacin y anlisis de variancia para la regresin lineal.

55
7.8.5 Precisin del mtodo: a una muestra de concentracin nica que represent el
100,0% de la cantidad terica declarada se le realizo dilucin hasta obtener una
concentracin de 1.0 UI/ml; se efectuaron las valoraciones por 2 analistas en 2 das
diferentes en la que cada analista realizo diluciones para obtener muestras de
concentracin de 1.0UI/ml del estndar y las muestras para ser analizadas. Para su
evaluacin se realiz un anlisis de varianza. De la muestra se realizaron 3 replicas por
analista y para cada da de anlisis.
En el caso de la precisin del sistema se determino 10 lecturas de la concentracin
central del estndar.
Los datos obtenidos se estudiaron introducindolos en el programa de validacin
determinando las siguientes especificaciones: media, desviacin estndar, coeficiente
de variacin, intervalo de confianza y los lmites de confianza de la media.
7.8.6 Exactitud: Para establecer la exactitud del mtodo analtico se prepararon 3
soluciones de cada muestra mas placebo a concentraciones de 80, 100,120% (Tabla 6)
para cada nivel de concentracin se prepararon tres muestras independientes. Los
datos obtenidos se analizaron introducindolos en el programa de validacin
determinando las siguientes especificaciones: el porcentaje de recuperacin,
homogeneidad de variancias (Test Cochran), determinacin del sesgo y test de t
Student.
Tabla.6 Diluciones del las muestras para la evaluar la Exactitud
Muestra %
Exactitud
Cantidad
a Pesar (g)
Volumen de
Diluyente (ml)
Volumen de
Solucion Madre
(ml)
Volumen de
Diluyente (ml)
Bacitracina Zinc 80 0.17 25 1 49
Bacitracina Metilen 80 0.22 25 1 49
DILUCION FINAL SOLUCION MADRE

7.8.7 Limite de deteccin: se determino el limite de deteccin preparando diluciones de
estndar de referencia en un intervalo de concentraciones de 0.005, 0.01, 0.015 y 0.025
UI/ml. (Tabla 7) Cada concentracin se realizo por triplicado para su valoracin. En la
valoracin de las muestras se determino cual era la concentracin en la que no se
observo halo de inhibicin que correspondi al lmite de deteccin ya que es el nivel
mnimo del analito que puede detectarse confiablemente.

56
Tabla. 7 Diluciones del las muestras para determinar el limite de deteccin
Volumen de Solucin
Madre (ml)
Volumen de
Diluyente Buffer 1%
ph 6 (ml)
Concentracin
Final (UI/ml)
Volumen de Solucin
Madre (ml)
Volumen de Diluyente
Buffer 1% ph 6 (ml)
Concentracin
Final (UI/ml)
1 99 12.76 1 49 0.01
1 99 12.76 1.5 48.5 0.015
1 99 12.76 2.5 47.5 0.025
PRIMERA DILUCION SEGUNDA DILUCION

7.8.8 Lmite de cuantificacin: el lmite cuantitativo se determino preparando una
dilucin que represento ms o menos tres o cuatro veces el lmite de deteccin. Se
estableci como concentracin de trabajo 0.02 UI/ml preparando seis replicas
independientes a esta concentracin para ser valoradas. Con los datos obtenidos se
estableci el lmite mnimo del analito que se puede determinar con exactitud y precisin
aceptables.

Una vez finalizado el anlisis se genero informe de validacin y de acuerdo con los
resultados obtenidos se concluyo y se demostr estadsticamente que el mtodo es
adecuado para el propsito determinado, es decir que posee un alto grado de
confiabilidad que puede ser aplicado a un amplio numero de muestras y matrices que
es practico con respecto al costo y el tiempo requerido en el anlisis.

57
8. RESULTADOS Y DISCUSIN

Validacin del Mtodo Analtico para de Cuantificacin de Bacitracina Zinc y
Bacitracina Metilen Disalicilato

8.1 ESPECIFICIDAD
El mtodo tiene la capacidad de diferenciar precisa y especficamente el principio activo
de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato, en presencia de los dems
componentes como lo son el diluyente utilizado y el placebo, que se espera estn
presentes en la matriz de la muestra. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992)
A partir de los resultados obtenidos de la especificidad presentados en el Anexo 5 y 6
se muestra evidencia de que el procedimiento no resulta afectado por la presencia del
diluyente o excipientes, ya que al sembrar el placebo y el diluyente en las placas de
valoracin no se observo formacin de halo lo que demuestra que estos no intervienen
en la formacin de halo al cuantificar el principio activo. Al sembrar la concentracin
central del principio activo en las placas de valoracin se observo la formacin de halos
de inhibicin en de Bacitracina Zinc y en Bacitracina Metilen Disalicilato.

8.2 SELECTIVIDAD
En el Anexo 8 y 7 se presentan los porcentajes de degradacin de cada una de las
muestras (M1 estndar, M2 muestra y M3 placebo) en los tratamientos con Bacitracina
Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato sometidas a condiciones externas de temperatura,
radiacin UV, condiciones acidas y condiciones alcalinas. .
Se observo una degradacin qumica apreciable en medio acido y bsico ya que al
termino de una hora a 90
o
C con tratamiento con HCl 1N y con NaOH 1N
respectivamente se obtuvo un porcentaje de degradacin del principio activo de: en el
Estndar Bacitracina (M1) un 99.9% de degradacin en condiciones acidas y bsicas,
en la muestra Bacitracina Zinc (M2) y muestra Bacitracina Metilen Disalicilato (M2)
mostraron una degradacin un poco mas acentuada presentando un 100% de
degradacin en condiciones acidas y bsica. De esta forma se determina que el
principio activo es susceptible a la degradacin en medio acido y bsico siendo un
interferente que hay que tener en cuenta a la hora de su fabricacin, almacenamiento y
en realizacin de pruebas en los anlisis de calidad (prueba de potencia).

58
A partir de los porcentajes de degradacin se observa como la molcula al ser expuesta
a condiciones acidas y bsicas presenta degradacin coincidiendo con la informacin
obtenida en cuanto a la estabilidad de la Bacitracina, determinando que esta es
rpidamente inactivada en soluciones que tienen un pH mayor a 9 y menores de 4.
(McEvoy, G.K., 1993)
Se observo una degradacin apreciable al someter las muestras durante ocho das a
radicacin solar directa, el Estndar Bacitracina (M1) presento un porcentaje de
degradacin de 18.4%, a partir de este se determina que el principio activo es afectado
por la radiacin UV. La muestra Bacitracina Zinc (M2) y muestra Bacitracina Metilen
Disalicilato (M2) mostraron una degradacin mucho mas acentuada presentando un
82.6% y 76.6% de degradacin correspondientemente siendo mas sensibles a la
exposicin de luz solar durante un periodo mayor o igual a 8 das. Al someter las
muestras a una temperatura de 90
o
C durante un periodo de una hora se obtuvo un
porcentaje de recuperacin de: 22.1% en el Estndar Bacitracina (M1), 75.5% en
Bacitracina Zinc (M2) y 73.0% en Bacitracina Metilen Disalicilato (M2). Se determino
que los principios activos son susceptibles o pierden su estabilidad al someterlos a altas
temperaturas, aunque el Estndar de Bacitracina presento un porcentaje de
degradacin mas bajo es afectada igualmente. Los dos tipos de Bacitracina tuvieron un
porcentaje de degradacin muy cercano lo cual nos muestra que las dos se ven aun
mas afectadas al someterlas a altas temperaturas y que las dos responden de igual
manera al someterlas a 90
o
C por una hora.
A partir de los datos anteriores se determina que el principio activo es susceptible a la
degradacin cuando se somete o se encuentra expuesto a radiacin UV y a
temperaturas iguales o mayores de 90
o
C durante un periodo de tiempo. Estas
condiciones resultan siendo un interferente que hay que tener en cuenta a la hora de su
fabricacin, almacenamiento y en realizacin de pruebas en los anlisis de calidad
(prueba de potencia). Por esta razn el principio activo debe almacenarse a temperatura
ambiente y protegido de la luz solar para evitar la perdida de la potencia del antibitico.
Muestra evidencia de que el procedimiento resultara afectado por la presencia de
productos y condiciones drsticas de degradacin del principio activo, en este caso cada
una de las Basitracinas muestra degradacin si se trabaja en presencia de condiciones
acidas, bsicas, radiacin UV y altas temperaturas siendo estos los productos que
interfieren al querer cuantificar nuestro principio activo. Se observo mayor degradacin
en Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato que en la Bacitracina Estndar,

59
esto puede deberse a la presencia de una sustancia de degradacin en los excipientes
del producto farmacutico, que hace que la muestra genere un mayor halo de inhibicin
y por lo tanto un porcentaje mayor de degradacin.

8.3 LINEALIDAD DEL SISTEMA
Al realizar el estudio estadstico de los datos obtenidos se obtuvo los siguientes
resultados:
La curva de calibracin realizada entre el logaritmo de la concentracin en la variable
dependiente (Y) y el dimetro del halo (mm) en la variable independiente (X) result ser
lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/ml. Al
aplicar la regresin lineal a los datos se obtuvo la ecuacin de la recta que se expres
segn y = 0,127843 x 3,13256 (LogConc = -3,13256 + 0,127843*Diametro). El
coeficiente de correlacin fue de 0,996924. (R-squared = 99,3857 percent). (Anexo2)
La regresin lineal obtenida es el diseo del modelo matemtico, representado como
una ecuacin, que permite establecer o simular el comportamiento de la variable
dependiente con respecto a la variable independiente. En el Anexo 2. se muestra la
cuerva de calibracin para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresin lineal y un
coeficiente de correlacin de 0.996924 hasta una concentracin de 2.55 UI/ml arriba de
esta concentracin el sistema puede perder su respuesta lineal (Reyes Aguero C.,
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 mg/ml se puede construir
una curva de calibracin lineal es el rango lineal.
El coeficiente de correlacin obtenido es nuestro ndice estadstico que mide la relacin
lineal entre las dos variables cuantitativas (log de concentracin y dimetro). Este mide
la correlacin entre la variable dependiente xi (Dimetro halo) y una variable
independiente yi (Log de concentracin), El coeficiente de correlacin obtenido es muy
cercano a 1 existiendo una correlacin positiva casi perfecta. El ndice indica que existe
una dependencia total entre las dos variables denominada relacin directa: cuando el
halo tiene un mayor dimetro (mm) la concentracin (UI/ml) del principio activo es
mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra tambin lo hace en
idntica proporcin, es decir hay una relacin directamente proporcional.(Reyes Aguero
C., 2007).

8.4 LINEALIDAD DEL METODO BACITRACINA ZINC
resultados:

60
lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/mL. Al
segn y = 0.168504x 4.19447 (LogConc= -4.19447 + 0.168504*Dimetro). El
coeficiente de correlacin fue de 0,997576. (R-squared = 99.5158 percent). (Anexo 3)
curva de calibracin para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresin lineal y un
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una
curva de calibracin lineal en el rango lineal.
independiente yi (Log de concentracin), El coeficiente de correlacin obtenido es muy
cercano a 1 existiendo una correlacin positiva casi perfecta. El ndice indica que existe
una dependencia total entre las dos variables denominada relacin directa: cuando el
halo tiene un mayor dimetro (mm) la concentracin (UI/ml) del principio activo es
mayor, es decir cuando una de las variables aumenta, la otra tambin lo hace en
idntica proporcin. (Reyes Aguero C., 2007).

8.5 LINEALIDAD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
resultados:
lineal en el intervalo de concentraciones comprendidas entre 0,05 y 2,55 UI/mL. Al
segn y = 0.187593x 4.52561 (LogConc= -4.52561 + 0.187593*Dimetro). El
coeficiente de correlacin fue de 0,980127. (R-squared = 96.0649 percent). (Anexo 4)

61
curva de calibracin para Bacitracina (Estandar) teniendo una regresin lineal y un
2007). Dentro del intervalo de concentraciones 0.05 y 2.55 UI/ml se puede construir una
curva de calibracin lineal en el rango lineal.
independiente yi (Log de concentracin), El coeficiente de correlacin obtenido es
cercano a 1 existiendo una correlacin positiva. El ndice indica que existe una
dependencia total entre las dos variables denominada relacin directa: cuando el halo
tiene un mayor dimetro (mm) la concentracin (UI/ml) del principio activo es mayor, es
decir cuando una de las variables aumenta, la otra tambin lo hace en idntica
proporcin. (Reyes Aguero C., 2007).
Se observo como la recta de la regresin constituida con el dimetro del halo y su
respuesta en la concentracin cumple con los parmetros establecidos del coeficiente
de correlacin. En los resultados obtenidos (Anexo 2, 3 y 4) del coeficiente de
correlacin ninguno fue menor o igual a 0.95, de esta forma se encuentra en los criterios
de aceptacin.
Los valores obtenidos en el P-value en los anlisis de varianza (ANOVA) (Anexo 2, 3 y
4) realizados a cada una de las Bacitracinas es menor a 0.01, lo que muestra evidencia
estadsticamente significativa de la relacin entre el logaritmo de la concentracin y el
dimetro del halo con un nivel de confianza del 99%. De esta forma cumple con los
criterios de aceptacin.
En el Anexo 2, 3 y 4 se muestra el anlisis de la varianza de cada una de las
Bacitracinas, a partir de estos resultados se puedo concluir que existen diferencias
significativas entre las concentraciones establecidas dentro de un intervalo de 0.05
hasta 2.55. Es decir que las concentraciones que se trabajaron presentaron diferencia
en sus halos y de esta forma se puede establecer diferencia entre las concentraciones
para as poder realizar una cuantificacin del principio activo.
8.6 PRECISIN
La precisin obtenida expresa la cercana de coincidencia (grado de dispersin) entre
los datos de las mediciones de halos (mm) de los mltiples muestreos de una misma
muestra homognea bajo condiciones establecidas. Se evalu la precisin por medio de

62
la repetibilidad que es la precisin obtenida bajo las mismas condiciones de operacin
en un intervalo de tiempo (mismo da), por un mismo analista, en la misma muestra
homognea y con los mismos eguitos (Taylor, 1993). La repetibilidad se evalu en los
Grupos 1, 2, 3 y 4 que se muestran en el Anexo 9 y 10. Y la reproducibilidad que es la
precisin obtenida dentro del laboratorio por diferentes analistas, diferentes equipos,
das distintos con la misma muestra homognea. (Calpena AC. et al, 1991) La precisin
inmediata se evalu en el Grupos 5 que se muestran en el Anexo 9 y 10.
La desviacin estndar obtenida en cada uno de los Grupos nos muestra la medida del
grado de dispersin de los datos del valor promedio o media. Valores grandes de la
desviacin estndar indican que los datos (puntos) estn lejos de la media y valores de
la desviacin estndar pequeos indica que los datos estn agrupados cerca de la
media. (AEFI, 2001) En todos los grupos la desviacin estndar obtenida es
relativamente pequea indicando que existe una agrupacin de datos muy cercanos
alrededor de la media. La desviacin estndar de cada uno de los grupos de medidas
nos indican la precisin de estas, ya que se muestra que tan lejos estn estas del valor
real o media al ser realizado en diferentes condiciones (da, analista, equip) pero con
una misma muestra. Las desviaciones estndar que se obtuvieron fueron de valores
pequeos lo que indico que no se observo una diferencia significativa entre los datos de
los grupos siendo un mtodo preciso.
El coeficiente de variacin (CV) en cada una de los grupos de datos para la repetibilidad
y para la reproducibilidad no fue mayor al 5% mostrando que el mtodo cumple con los
parmetros establecidos, siendo el ensay repetitivo.
El coeficiente de variacin (CV) nos indica la relacin existente entre la desviacin de
una muestra y su media. Al dividir la desviacin tpica por la media se convierte en un
valor de unidad de medida. Si comparamos la dispersin en varios Grupos de
mediciones, tendr menor dispersin aquella que tenga menor coeficiente de variacin.
(AEFI, 2001) En los Anexos 9 y 10 se muestran los valores obtenidos de los coeficientes
de variacin de cada uno de los Grupos. En el anlisis con Bacitracina Zinc el analista
1 en el da 1 obtuvo el valor mas bajo del coeficiente de variacin CV= 0.127 y CV=
0.911 teniendo la menor dispersin entre los valores del dimetro del halo de inhibicin
y en el porcentaje de recuperacin respectivamente, por otro lado se observo el valor
mas alto del coeficiente de variacin CV= 0.389 y CV= 2.72 en el Grupo 5 (Analista 1 y 2
Das 1 y 2) presentando la mayor dispersin entre sus datos, pero aun as no se
encuentran por fuera de los criterios de aceptacin.

63
En el anlisis con Bacitracina Metilen Disalicilato el analista 2 en el da 1 obtuvo el valor
mas bajo del coeficiente de variacin CV= 0.055 Y CV= 0.261 teniendo la menor
dispersin entre los valores del dimetro del halo de inhibicin y en el porcentaje de
recuperacin respectivamente, por otro lado se observo el valor mas alto del coeficiente
de variacin CV= 0.464 y CV= 3.421 en el Grupo 4 (Analista 2 Das 2) presentando la
mayor dispersin entre sus datos, pero aun as no se encuentran por fuera de los
criterios de aceptacin.
Las medias de cada uno de los analistas en dos das, de cada uno del analista en un
mismo da, los dos analistas en un mismo da, o presentaron diferencias significativas lo
cual muestra la buena repetitibilidad del mtodo y reproducibilidad. No se observaron
diferencias significativas entre las medias de ambos analistas, por tanto el mtodo
analtico fue reproducible por ambos analistas, de igual forma no se detectaron
diferencias significativas entre las medias de ambos das siendo el mtodo analtico
reproducible en diferentes das. De esta forma el mtodo analtico posee repetibilidad
en diferentes das y por diferentes analistas, al igual que diferentes das por el mismo
analista.
Con un nivel de confianza de 95% que se corresponde con valores de 0.05 informa
con un 95% de seguridad que nuestro valor estimado se encuentra en un intervalo de
confianza. Los valores obtenidos de los intervalos de confianza (Anexo 9 y 10),
muestran los valores que componen el intervalo dentro de la cual se considera que se
encuentra el verdadero valor de aquella caracterstica que se esta estimando, el
dimetro del halo en mililitros con respecto a la concentracin del principio activo.(AEFI,
2001)
El coeficiente de variacin obtenido en la precisin del sistema fue menor al 5%, de esta
forma se encuentra dentro del criterio de aceptacin establecido. La desviacin estndar
obtenida muestra la dispersin de los 10 datos obtenidos con respecto a su media.
(Anexo 11).
La precisin del mtodo en Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato cumple
con los parmetros establecidos de esta forma el ensayo es repetitivo y reproducible.

64
8.7 EXACTITUD
Como forma de medir la dispersin de los datos hemos determinado la homogeneidad
de variancias. La varianza es una medida de dispersin que nos permite conocer que
tanto se dispersan los datos alrededor de su promedio o media. Los valores obtenidos
de la variancia de cada uno de los tratamientos con Bacitracina se muestran en los
Anexos 12 y 13, estos valores nos permiten identificar la diferencia promedio que hay
entre cada uno de los valores respecto a su punto central (la media). En el tratamiento
con Bacitracina Zinc los datos que presentaron la menor dispersin alrededor de su
media fue la concentracin 120% con una variancia de 0.311 y en el tratamiento con
Bacitracina Metilen Disalicilato los datos que presentaron la menor dispersin alrededor
de su media fue la concentracin 120% con una variancia de 0.062.
A partir del estudio de la homogeneidad de variancias por medio del test de Cochran, se
obtuvo el Valor G
exp
=0.682 en Bacitracina Zinc y G
exp
=0.790 en Bacitracina Metilen
Disalicilato que son inferiores al G
3-.2-.0.05
(0.8709) (Anexos 12 y 13). Se acepta la
hiptesis de homogeneidad (igualdad) de variancias de las 3 poblaciones de origen, ya
que G
exp
=0.682 en Bacitracina Zinc y G
exp
=0.790 en Bacitracina Metilen Disalicilato es
inferior a G
3-.2-.0.05
( 0.8709).es decir que las variancias son homogneas. La hiptesis de
igualdad de variancias no se rechaza por que el valor G obtenido no es superior al
correspondiente valor G
(K,v,)
dado por la tabla e la prueba de COCHRAN. Los valores
optenidos de G
exp
son mayores a 0.05 lo que indica que no hay diferencias significativas
en las variancias por lo que hay homogeneidad de variancias.
Los valores obtenidos del sesgo (e%) en cada uno de los tratamientos con Bacitracina
se muestran en los Anexos 12 y 13. Los valores obtenidos del sesgo es el error
sistemtico, que se produce de igual modo en todas las mediciones que se realizan de
la magnitud. Este puede estar originado en un defecto del instrumento, en una
particularidad del operador o del proceso de medicin, entre otros. (Vaqu. J, 2007).
Ninguno de los valores que se obtuvieron del e% fue mayor al 3% lo que nos indico que
se encuentran dentro de los criterios de aceptacin. El tratamiento que presento menor
error sistemtico fue el tratamiento de Bacitracina Zinc con un e%=1.24, el tratamiento
con Bacitracina Metilen Disalicilato presento un e%= 2.2 tambin entra en los criterios
de aceptacin pero con un mayor error sistemtico que el tratamiento con Bacitracina
Zinc.
De acuerdo con la prueba t de Student se obtuvo un Valor t
exp
1.208 para Bacitracina
Metielen Disalicilato y un Valor t
exp
0.39 para Bacitracina Zinc valores son menores a lo
que indica para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa

65
entre la recuperacin de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es
conforme.
La exactitud es la capacidad que tiene el mtodo para generar mediciones que se
acerquen al valor verdadero (USP, 30), por esta razn se analizan tres concentraciones
diferentes del analito para observar su porcentaje (%) de recuperacin en cada una de
ellas. El porcentaje de recuperacin esperado de acuerdo con la experiencia
experimental debe encontrarse entre un 90% - 110%, con un error relativo de 10%. En
cada uno de los tratamientos con Bacitracina los porcentajes de recuperacin (Anexos
12 y 13). Se encuentran dentro del rango establecido, ninguno es mayor a 110% o
menor de 90%, en cada una de las concentraciones.
La Exactitud de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato cumplen con los
parmetros establecidos. En los dos casos concentraciones extremas de problema
(principio activo) se detectan como tales.
8.8 LIMITE DE DETECCION
A partir del anlisis cualitativo se determino el limite de deteccin en la concentracin de
0.005 UI/ml de Bacitracina, en esta concentracin no se detecto la formacin de halo. Es
la cantidad mnima de Bacitracina en una muestra que puede detectarse, aunque no
necesariamente cuantificarse, en las condiciones experimentales indicadas. (USP,30)
De esta forma; en la concentracin de 0.005 UI/ml se observo el nivel mas bajo de la
concentracin de Bacitracina que pudo determinarse como estadsticamente diferente
del blanco analtico. (WHO Technical Report Series, No 823, 1992) Se determina que el
mtodo es capas de detectar cantidades mnimas de Bacitracina en una muestra,
siempre que estn por encima de la concentracin de 0.005 UI/ml.
Los resultados obtenidos del anlisis estadstico se muestran con ms detalles en el
Anexo 15.
8.9 LIMITE DE CUANTIFICACIN
La concentracin mnima de Bacitracina (analito), que puede ser determinada
cuantitativamente con precisin y exactitud aceptables en condiciones experimentales
indicadas es de 0.02 UI/ml. (Anexo 14)
A partir del anlisis cuantitativo se determino el limite de cuantificacin en la
concentracin de 0.02 UI/ml de Bacitracina, en esta concentracin se detecto y
cuantifico la formacin de halo de inhibicin. Es la cantidad mnima de Bacitracina en

66
una muestra que puede cuantificarse en las condiciones experimentales indicadas. De
esta forma; se determina que el mtodo es capaz de cuantificar en forma confiable
cantidades mnimas de Bacitracina en una muestra, siempre que tengan una
concentracin igual o mayor a 0.02 UI/ml .
En la Tabla 18 se muestran los datos obtenidos del anlisis estadstico. La desviacin
estndar obtenida de 0.223 muestra el nivel de dispersin de los resultados con
respecto a la media obtenida , esta refleja que los resultados obtenidos de los dimetros
de los halos de inhibicin son similares o homogneos ya que es un valor bajo cercano
a cero. El coeficiente de variacin (CV) obtenido es de 1.272% este es menor a 5%
(porcentaje del CV que se acepta en la precisin del mtodo). Este valor pequeo del
CV obtenido muestra que la distribucin de la variable medida es muy homognea. Con
un nivel de confianza del 95% se defini los limites de confianza 17.33 -17.68 (Anexo
14) que determinan el intervalo dentro del cual se considera que se encuentra el
verdadero valor de medida para el halo de inhibicin de principio activo en la
concentracin que se trabajo 0.02 UI/ml. (AEFI, 2001)
Los resultados obtenidos del anlisis estadstico se muestran con ms detalles en el
Anexo 14.

67
9. CONCLUSIONES

9.1 Se comprob el cumplimiento de la linealidad del sistema y la linealidad del mtodo
en el intervalo de concentraciones que se estudiaron por su elevado valor del coeficiente
de correlacin alcanzado que es muy cercano a 1.
9.2 Se debe tener presente a la hora de realizar el mtodo analtico para la
cuantificacin de Bacitracina que no debe realizarse en condiciones que exista la
presencia de soluciones acidas o bsicas este seria un interferente a la hora de realizar
la cuantificacin de principio activo.
9.3 La molcula de Bacitracina Zinc y Bacitracina Metilen Disalicilato en soluciones
acidas y bsicas es inestable perdiendo su potencia.
9.4 Las molculas del principio activo disminuyen su actividad al someterlas a una
temperatura de 90
o
C por periodos mayores o iguales a una hora y al someterlas a
radicacin solar UV durante un periodo de ocho das, por esta razn se debe mantener
el principio activo a temperatura ambiente y protegido de la luz solar.
9.5 La exactitud del mtodo analtico cumple con los parmetros y/o criterios de
aceptacin, concluyendo que los resultados de la prueba obtenidos mediante el
procedimiento establecido bajo condiciones descritas posee una proximidad al valor
verdadero.
9.6 El mtodo analtico para la cuantificacin de Bacitracina es preciso dentro del
ensayo al ser efectuado cualquier da, por cualquier analista y cualquier muestra. Es un
procedimiento analtico preciso ya que posee un grado de concordancia entre los
resultados de las pruebas individuales cuando se aplica el procedimiento repetidamente
en el laboratorio.
9.7 Los resultados en la precisin mostraron que los coeficientes de variacin son
aprobados, si el valor aceptable debe ser menor o igual que 5%, los coeficientes de
variacin resultaron ser menores que 5%, lo cual demuestra la buena repetibilidad del
mtodo de cuantificacin..
9.8 No se observaron diferencias significativas entre las medias de ambos analistas y
ambos das por lo tanto el mtodo analtico fue reproducible por ambos analistas.

68
9.9 A partir del anlisis cuantitativo se determino el limite de cuantificacin en la
concentracin de 0.02 UI/ml de Bacitracina, esta concentracin corresponde a la mas
baja cantidad de Bacitracina que puede determinarse cuantitativamente con precisin y
exactitud aceptables observando claramente la formacin de halo.
9.10 Los resultados permiten concluir que el mtodo analtico para la cuantificacin de
Bacitracina presenta resultados de linealidad, especificidad, precisin y exactitud
satisfactorios que permiten obtener resultados seguros y confiables en la deteccin y
cuantificacin de Bacitracina en las muestras al 15% y 11%.

69
10. RECOMENDACIONES

Para la correcta cuantificacin del analito de inters se requiere que la seal producida se
deba inequvocamente a su presencia y que no existan interferencias de sustancias y/o
compuestos de degradacin cidos o bsicos que puedan estar presentes en la muestra, su
preparacin, condiciones instrumentales y/o material de trabajo. Es importante verificar que
estas sustancias interferentes y compuestos de degradacin estn ausentes para no generar
interferencia significativa en el resultado.
El estudio de muestras de principio activo a condiciones de estrs, tales como exposicin a
altas temperaturas y radiacin UV, permiti identificar la presencia de compuestos de
degradacin potencialmente interferentes, razn por la cual es importante que durante los
procesos de fabricacin, empaque, almacenamiento y en los anlisis de control de calidad
no se exponga el producto a ambientes con temperaturas superiores a 90C y a radiaciones
UV.
Si se desarrolla el mtodo analtico dentro del rango de concentraciones 0.05 UI/ml hasta
2.55UI/ml se obtendr una respuesta de tipo lineal, obteniendo resultados que son
directamente proporcionales a la concentracin del analito dentro de la muestra.
Por medio de este mtodo analtico bajo las condiciones experimentarles descritas, la
mnima cantidad de analito presente en una muestra que se puede cuantificar con razonable
certeza, precisin y exactitud es de 0.02 UI/ml. Y la mnima cantidad de analito en una
muestra que se puede detectar pero no cuantificar es de 0.005 UI/ml, razn por la cual se
sugiere realizar la cuantificacin del analito en muestras que contienen concentraciones
iguales o mayores a 0.02 UI/ml evitando as falsos positivos.

Para las posteriores validaciones en la prueba de exactitud tener en cuenta para la
preparacin y montaje de las muestras a valorar, el volumen de placebo que debe
adicionarse en las muestras con el analito a concentraciones coincidas sean iguales a los
porcentajes en los cuales este se encuentra en la formulacin del producto acabado. Con el
fin de optimizar la preparacin de la muestra para mejorar el factor de recuperacin.

70
11. REFERENCIAS

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74
11. ANEXOS
ANEXO 1. CALDOS, MEDIOS DE CULTIVO Y BUFFERS
CALDO BRAIN HEART BROTH (BHI)
Substrato alimenticio ( extracto de cerebro, estracto de corazon) 27.5g/L
Peptona 27.5 g/L
D-glucosa 2.0 G/L
Cloruro sdico 5.0 g/L
Agar-agar 15.0 g/L
AGAR TRIPTICASA SOYA (TSA)
Peptona de casena
Peptona de arina de soja
Cloruro sdio
Agar-agar
MEDIO ANTIBIOTICO No1.
Peptona 6.0 g/L
Digerido pancretico de casena 4.0 g/L
Extracto levadura 3.0 g/L
Extracto de carne 1.5 g/L
Dextrosa1.0 g/L
Agar 15.0 g/L
pH despues de la esterilizacio 6.6 +/- 0.1
SOLUCION AMORTIGUADORA DE FOSFATO No 1. POR CIENTO, Ph 6.0
2.0 g/L fosfato dibasico de potasio
8.0 g/L fosfato monobasico de potasio
Ajustar pH com acido fosfrico 18N o hidrxido de potasio 10N a 6.0 +/-0.05
75
ANEXO 2. LINEALIDAD DEL SISTEMA

Regresin lineal de la linealidad del sistema generado por el programa
Statgraphics Plus for Windows 2.0

Regression Analysis - Linear model: Y = a + b*X
-----------------------------------------------------------------------------
Dependent variable: LogConc
Independent variable: Diametro
-----------------------------------------------------------------------------

The linearity of the method is tested with the following data :
Puntos Dimetro Concentracin Log (Conc.)
(mm) (UI/ml)
S1 14,75 0,05 -1,2919
S2 16,13 0,10 -0,9908
S3 17,73 0,15 -0,8147
S4 19,50 0,20 -0,6898
S5 20,24 0,26 -0,5929
S6 24,90 1,02 0,0092
S7 25,96 1,53 0,1853
S8 26,68 2,04 0,3102
S9 27,51 2,55 0,4071

------------------------------------------------------------------------------
Standard T
Parameter Estimate Error Statistic P-Value
-----------------------------------------------------------------------------
Intercept -3,13256 0,0834659 -37,5311 0,0000
Slope 0,127843 0,0037989 33,6526 0,0000
----------------------------------------------------------------------------------------------------

76
Analysis of Variance
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Model 3,08248 1 3,08248 1132,49 0,0000
Residual 0,0190529 7 0,00272185
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 3,10153 8

Correlation Coefficient = 0,996924
R-squared = 99,3857 percent
Standard Error of Est. = 0,0521713
The StatAdvisor
---------------
The output shows the results of fitting a linear model to describe
the relationship between LogConc and Diametro. The equation of the
fitted model is
LogConc = -3,13256 + 0,127843*Diametro
Since the P-value in the ANOVA table is less than 0.01, there is a
statistically significant relationship between LogConc and Diametro at
the 99% confidence level.
The R-Squared statistic indicates that the model as fitted explains
99,3857% of the variability in LogConc. The correlation coefficient
equals 0,996924, indicating a relatively strong relationship between
the variables. The standard error of the estimate shows the standard
deviation of the residuals to be 0,0521713. This value can be used to
construct prediction limits for new observations by selecting the
Forecasts option from the text menu.
77

-----------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
Dimetro
L
o
g

c
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n
0 2 4 6 8 10
-0,09
-0,06
-0,03
0
0,03
0,06
0,09

-----------------------------------------------------------------------------
Test for the existence of a significant slope (F
1
)

Confidence level 95.00
Degrees of freedom (1,2) 8
F table 113.49
78
BACTRAN
LINEALIDAD DEL SISTEMA BACITRACINA
ACTIVO: BACITRACINA ZINC
Concentracion: 15g/100g LOTE N1E200
Curva Estandar
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Total Promedio Promedio corr.
S
7
-
G
25,17 24,84 25,12 24,52 25,16 25,63 25,84 25,85 26,08 228,21 25,36
S
1-A
15,07 15,49 15,20 14,54 15,23 14,69 15,17 14,84 16,59 136,82 15,20 14,75
S
7
-
G
26,31 26,33 26,46 26,71 25,50 26,00 26,08 26,10 26,06 235,55 26,17
S
2-B
17,93 16,78 18,01 17,22 17,33 18,00 16,80 17,06 17,46 156,59 17,40 16,13
S
7
-
G
26,23 26,00 26,12 25,12 25,62 25,33 25,89 26,01 25,23 231,55 25,73
S
3-C
20,01 19,22 18,12 18,63 18,80 17,52 17,75 18,07 18,86 166,98 18,55 17,73
S
7
-
G
25,34 26,27 25,81 24,89 25,12 24,56 26,18 25,47 26,24 229,88 25,54
S
4-D
20,87 21,01 20,87 20,58 19,14 19,36 19,67 19,43 20,38 181,31 20,15 19,50
S
7
-
G
23,78 25,14 24,64 24,49 23,93 24,07 24,26 24,13 23,99 218,43 24,27
S
5-E
19,72 19,98 18,92 20,10 19,15 20,17 18,75 20,00 19,78 176,57 19,62 20,25
S
7
-
G
23,03 24,79 24,14 24,21 23,11 24,44 24,84 23,81 24,55 216,92 24,10
S
6-F
21,66 23,75 23,64 23,50 23,78 23,73 23,62 24,00 23,46 211,14 23,46 24,26
S
7
-
G
24,81 24,07 23,72 24,29 24,65 23,40 24,62 23,96 24,85 218,37 24,26
S
8-H
25,53 24,61 25,36 25,67 25,97 25,10 25,27 24,65 25,70 227,86 25,32 25,96
S
7
-
G
23,68 24,60 23,76 25,07 24,26 25,15 23,69 24,22 24,09 218,52 24,28
S
9-I
26,14 25,98 25,11 26,25 26,33 27,00 25,60 26,38 25,72 234,51 26,06 26,68
S
7
-
G
25,17 24,80 24,79 24,12 24,57 24,37 23,29 24,74 23,75 219,60 24,40
S
10-J 27,19 27,21 26,93 26,54 27,25 27,19 26,71 27,55 26,51 243,08 27,01 27,51
XS7 24,90
CURVA ESTANDAR
Puntos Diametro Concentracio Log ( Conc.)
(mm) (mg/ml) DATOS ESTANDAR
S1 14,75 0,05 -1,2919 Peso (mg) 17
S2 16,13 0,10 -0,9908 Potencia (P) UI/mg 75,1
S3 17,73 0,15 -0,8147 Fecha de Vencimiento N.A
S4 19,50 0,20 -0,6898 Lote N1E200
S5 20,25 0,26 -0,5929 DATOS
S6 24,26 0,51 -0,2919 Pendiente 0,1278 Pr T (X S
3
)es mayor que Pr R= Suma
S7 24,90 1,02 0,0092 Intercepto -3,1322 Pr T (X S
3
)es menor que Pr R= Resta
S8 25,96 1,53 0,1853 Factor de Dilucion (D) 1250
S9 26,68 2,04 0,3102 Promedio General
S10 27,51 2,55 0,4071 Concentracion Central 24,90

79
Anlisis de la Varianza de la Linealidad del Sistema

Shapiro Wilk Ho: Si hay normalidad
si p<0.05 rechazo la Ho
si p>0.05 acepto la Ho
Levene Ho: Si hay homogeneidad de varianzas
Si p< 0.05 rechazo la Ho
Si p >0.05 acepto la Ho
ANOVA Ho: No hay diferencias significativas
Si p<0.05 rechazo la Ho
Si p > 0.05 acepto la Ho
KruskalWallis Ho: No hay diferencias significativas
Si p>0.05 acepto la Ho
Bartlett Ho: Si hay homogeneidad de varianzas
------------------------------------------------------------------------------------------
Shapiro-Wilk normality test
data: resultado$residuals
W = 0.9845, p-value = 0.3839
Bartlett test of homogeneity of variances
data: values by ind
Bartlett's K-squared = 20.5401, df = 9, p-value = 0.01486
Si hay normalidad, No hay homogeneidad de varianzas
Kruskal-Wallis rank sum test
data: values by ind
Kruskal-Wallis chi-squared = 83.1197, df = 9, p-value = 3.87e-14
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con el estandar (Kruskal-
Wallis p< 0.05)
80
ANEXO 3. LINEALIDAD DEL MTODO BACITRACINA ZINC

Regresin lineal de la linealidad del mtodo Bacitracina Zinc generado por
el programa Statgraphics Plus for Windows 2.0

-----------------------------------------------------------------------------
Dependent variable: LogConc
-----------------------------------------------------------------------------

(mm) (UI/ml)
S1 16,91 0,05 -1,3010
S2 19,32 0,10 -1,0000
S3 19,87 0,15 -0,8239
S4 20,69 0,20 -0,6990
S5 21,41 0,25 -0,6021
S6 23,50 0,51 -0,2924
S7 24,66 1,02 0,0086
S8 26,23 1,53 0,1847
S9 26,52 2,04 0,3096
S10 27,21 2,55 0,4065

Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
Intercept -4,19447 0,0950577 -44,1255 0,0000
Slope 0,168504 0,00415557 40,5489 0,0000
---------------------------------------------------------------------------------------------------

81
----------------------------------------------------------------------------------------------------
---------------------------------------------------------------------------------------------------
Model 3,13721 1 3,13721 1644,21 0,0000
Residual 0,0152642 8 0,00190803
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 3,15247 9

The StatAdvisor
---------------
the relationship between LogConc and Diametro. The equation of the
fitted model is
LogConc = -4,19447 + 0,168504*Diametro
statistically significant relationship between LogConc and Diametro at
99,5158% of the variability in LogConc. The correlation coefficient
82

---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
Dimetro (mm)
L
o
g

c
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n
0 2 4 6 8 10
-0,07
-0,04
-0,01
0,02
0,05
0,08
0,11

-----------------------------------------------------------------------------
1
)

Confidence level 95
F table 1644.21
83
ACTIVO Bacitracina Zinc
Concentracin 15g/100g Lote 200711026
Curva Estndar
Total Promedio Promedio corr.
S
7
-
G
24,86 24,61 24,39 24,12 24,74 24,81 24,22 25,07 24,47 221,29 24,59
S
1-A
16,01 16,49 16,48 15,70 17,41 6.38 16,77 17,02 16,90 132,78 16,60 16,91
S
7
-
G
24,80 24,91 24,85 24,56 25,30 24,16 14,72 25,06 24,75 213,11 23,68
S
2-B
19,10 18,94 18,59 17,81 17,06 18,22 18,29 16,83 18,04 162,88 18,10 19,32
S
7
-
G
24,53 24,63 24,77 24,74 24,41 24,34 24,65 24,33 24,69 221,09 24,57
S
3-C
19,98 19,28 20,27 18,45 18,61 19,37 19,70 20,40 19,79 175,85 19,54 19,87
S
7
-
G
24,89 24,85 24,89 25,65 25,81 24,98 25,00 25,10 24,90 226,07 25,12
S
4-D
21,26 21,47 20,27 20,59 21,28 20,66 21,39 20,78 20,49 188,19 20,91 20,69
S
7
-
G
24,77 24,95 24,92 25,30 24,63 25,05 25,02 24,81 24,49 223,94 24,88
S
5-E
21,50 21,35 21,01 21,03 21,66 21,15 21,69 21,42 21,73 192,54 21,39 21,41
S
7
-
G
24,70 25,19 25,23 24,49 24,31 24,27 24,59 25,02 25,30 223,10 24,79
S
6-F
24,69 24,16 24,18 23,10 22,49 22,29 22,84 22,94 23,78 210,47 23,39 23,50
S
7
-
G
25,19 24,72 24,78 24,97 24,87 24,46 24,42 24,36 24,98 222,75 24,75
S
8-H
25,60 25,89 25,54 26,30 26,55 26,33 26,24 26,45 25,86 234,76 26,08 26,23
S
7
-
G
25,08 24,49 24,83 24,80 24,88 24,75 24,83 25,20 24,59 223,45 24,83
S
9-I
26,52 26,33 26,19 26,54 25,72 26,95 26,63 26,52 26,62 238,02 26,45 26,52
S
7
-
G
25,00 25,20 25,04 24,20 24,66 24,40 25,26 24,32 24,88 222,96 24,77
S
10-J 28,41 27,57 27,60 26,90 26,79 26,43 26,50 27,24 26,30 243,74 27,08 27,21
24.9024.9
DATOS 24
Puntos Dimetro Concentracin Log (Conc.) Peso (mg) 17,0
(mm) (mg/ml) Potencia (P) UI/mg 75,1
S1 16,91 0,05 -1,3010 Fecha de Vencimiento N.A
S2 19,32 0,10 -1,0000 Lote N1E200
S3 19,87 0,15 -0,8239 DATOS
S4 20,69 0,20 -0,6990 Pendiente 0,1278
S5 21,41 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322
S6 23,50 0,51 -0,2924 Factor de Dilucion (D) 1250
S9 26,52 2,04 0,3096
S10 27,21 2,55 0,4065 Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
CURVA ESTANDAR ESTANDAR
BACTRAN 15%
LINEALIDAD METODO BACITRACINA
Caja 1 Caja 2 Caja 3
84
Anlisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Zinc

--------------------------------------------------------------------------------------------
W = 0.9903, p-value = 0.7595
data: values by ind
Si hay normalidad, No hay homogeneidad de varianzas
Kruskal-Wallis rank sum test
data: values by ind
Kruskal-Wallis chi-squared = 86.2592, df = 9, p-value = 9.14e-15
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con zinc (Kruskal-Wallis p< 0.05)
(k=86.25 GL=9 N=90 p<0.05)

85
ANEXO 4. LINEALIDAD DEL MTODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO

Regresin lineal de Linealidad del mtodo Bacitracina Metilen Disalicilato
generado por el programa Statgraphics Plus for Windows 2.0

-----------------------------------------------------------------------------
Dependent variable: LogCon
-----------------------------------------------------------------------------

(mm) (UI/ml)
S1 18,65 0,05 -1,3010
S2 18,74 0,10 -1,0000
S3 19,19 0,15 -0,8239
S4 20,03 0,20 -0,6990
S5 20,50 0,25 -0,6021
S6 22,66 0,51 -0,2924
S7 23,42 1,02 0,0086
S8 25,09 1,53 0,1847
S9 26,08 2,04 0,3096
S10 26,63 2,55 0,4065

------------------------------------------------------------------------------
Standard T
-----------------------------------------------------------------------------
Intercept -4,52561 0,299245 -15,1234 0,0000
Slope 0,187593 0,0134235 13,9749 0,0000

86
----------------------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------------------
Model 3,02528 1 3,02528 195,30 0,0000
Residual 0,123924 8 0,0154905
-----------------------------------------------------------------------------
Total (Corr.) 3,1492 9

The StatAdvisor
---------------
the relationship between LogCon and Diametro. The equation of the
fitted model is
LogCon = -4,52561 + 0,187593*Diametro
statistically significant relationship between LogCon and Diametro at
96,0649% of the variability in LogCon. The correlation coefficient
87
Dimetro (mm)
L
o
g

c
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n
18 20 22 24 26 28
-1,4
-1
-0,6
-0,2
0,2
0,6
LogCon = 4,52561 + 0,187593*Diametro

---------------------------------------------------------------------------Plot of the residuals
Dimetro
L
o
g

c
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i
n
0 2 4 6 8 10
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
0,15

-----------------------------------------------------------------------------
1
)

Confidence level 95
F table 195.30
88
ACTIVO Bacitracina Metilen Disalicilato
Concentracin 11g/100g Lote LO70701
Curva Estndar
Total Promedio Promedio corr
S
7
-
G
23,58 23,66 23,76 22,98 23,80 23,66 24,18 23,50 23,57 212,69 23,63
S
1-A
17,09 17,91 17,37 17,70 16,91 17,40 17,14 17,80 17,09 156,41 17,38 18,65
S
7
-
G
22,80 23,54 23,23 24,03 24,33 24,29 23,63 24,50 23,80 214,15 23,79
S
2-B
16,99 17,30 17,37 18,42 18,10 18,66 16,61 17,68 16,52 141,04 17,63 18,74
S
7
-
G
24,04 23,41 23,35 23,19 23,70 23,58 23,60 23,12 23,22 211,21 23,47
S
3-C
16,98 18,20 18,42 17,50 17,06 17,94 17,87 18,23 17,58 159,78 17,75 19,19
S
7
-
G
23,02 23,51 22,82 23,99 23,64 23,46 23,57 22,66 22,40 209,07 23,23
S
4-D
18,36 18,82 18,22 19,38 18,37 18,26 17,16 17,90 18,81 165,28 18,36 20,03
S
7
-
G
23,10 23,18 24,15 23,41 23,82 24,02 23,44 23,20 23,67 211,99 23,55
S
5-E
18,73 18,87 19,14 18,77 19,41 19,42 18,73 19,70 19,63 172,40 19,16 20,50
S
7
-
G
23,20 20,09 23,01 23,77 23,25 24,43 23,26 23,18 23,33 207,52 23,06
S
6-F
20,84 20,54 21,90 20,11 20,86 21,04 20,54 20,45 21,07 187,35 20,82 22,66
S
7
-
G
23,90 23,32 23,68 22,94 23,24 23,20 23,92 23,75 23,54 211,49 23,50
S
8-H
24,57 23,53 23,03 23,93 23,95 23,58 23,17 23,72 23,72 213,20 23,69 25,09
S
7
-
G
24,80 23,62 23,38 23,31 23,60 23,22 23,58 23,06 23,22 211,79 23,53
S
9-I
24,13 25,01 25,60 24,21 24,18 24,19 24,68 25,50 24,93 222,43 24,71 26,08
S
7
-
G
23,29 23,03 22,86 23,21 23,03 23,05 23,13 23,00 22,60 207,20 23,02
S
10-J 24,79 25,22 24,80 24,60 25,11 24,04 24,90 24,83 24,52 222,81 24,76 26,63
S7-G 23,42 24.9024.9
DATOS 24
Puntos Dimetro Concentracin Log (Conc.) Peso (mg) 17,0
(mm) (mg/ml) Potencia (P) UI/mg 75,1
S1 18,65 0,05 -1,3010 Fecha de Vencimiento
S2 18,74 0,10 -1,0000 Lote N1E200
S3 19,19 0,15 -0,8239 DATOS
S4 20,03 0,20 -0,6990 Pendiente 0,1278 Pr T (X S
3
S5 20,50 0,25 -0,6021 Intercepto -3,1322 Pr T (X S
3
S6 22,66 0,51 -0,2924 Factor de Dilucion (D) 1250
S9 26,08 2,04 0,3096
S10 26,63 2,55 0,4065
CURVA ESTANDAR ESTANDAR
BACTRAN 11%
LINEALIDAD METODO BACITRACINA

89
Anlisis de la Varianza de la Linealidad Bacitracina Metilen Disalicilato

W = 0.9903, p-value = 0.7595
data: values by ind
Si Hay normalidad, Si hay homogeneidad de varianzas
ANOVA
Df Sum Sq Mean Sq F value Pr(>F)
ind 9 759.33 84.37 347.35 < 2.2e-16 ***
Residuals 79 19.19 0.24
Signif. codes: 0 '***' 0.001 '**' 0.01 '*' 0.05 '.' 0.1 ' ' 1 1 observation deleted due to missingness
Si hay diferencias significativas entre los tratamientos con metilen (ANOVA de una via p<
0.05)
90
ANEXO 5 ESPECIFICIDAD BACITRACINA ZINC
Concentracin 15g / 100g Lote 200711026
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 217.2 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S
3
22,81 22,49 22,82 22,29 23,21 23,05 23,11 23,09 23,06 22,88
MUESTRA 23,05 23,36 22,89 22,86 23,1 23,21 22,98 23,01 23,09 23,06 25,08

Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio
S
3
23,48 22,99 23,76 23,47 23,11 23,29 22,49 22,99 22,76 23,15
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
S
3
24,67 24,68 24,28 24,42 24,35 24,21 24,52 24,34 23,84 24,37
DILUENTE --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
MUESTRA PLACEBO DILUENTE Peso (mg) 17,0
25,08 0,00 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) 1,183 Fecha de vencimiento N.A.
Log (Concentracin) 0,073 N1E200
217,1 217,1
6,8 --- --- Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Promedio General Concentracion Central 24,90
RESULTADO
M1 MUESTRA 6,8 g / 100g
M2 PLACEBO NO PRODUCE HALO
M3 DILUENTE NO PRODUCE HALO Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 15%
ESPECIFICIDAD
MUESTRAS DATOS ESTANDAR
Dimetro
Lote
Cantidad Muestra (mg) DATOS
g Bacitracina /100 g
Factor de Dilucin (D)

91
ANEXO 6 ESPECIFICIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO
Concentracin 11g / 100g Lote LO70701
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 292 mg 25 HCl 0,01N 1.0 UI/mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Caja 1 Caja 2 Caja 3 Promedio Promedio corr
S
3
24,13 24,99 24,78 24,63 24,69 25,09 25,20 24,53 24,59 24,74
MUESTRA 24,66 24,80 24,84 25,50 24,92 24,52 25,62 24,37 24,74 24,89 25,05

S
3
22,73 23,21 22,91 23,01 23,35 22,38 23,12 22,84 22,17 22,86
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
S
3
24,67 24,68 24,28 24,42 24,35 24,21 24,52 24,34 23,84 24,37
DILUENTE --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
MUESTRA PLACEBO DILUENTE Peso (mg) 17,0
25,05 0,00 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) 1,17 Fecha de vencimiento N.A.
Log (Concentracin) 0,07 N1E200
292,30 292,3
5,01 --- --- Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
RESULTADO
M1 MUESTRA 5,0 g / 100g
M2 PLACEBO NO PRODUCE HALO
M3 DILUENTE NO PRODUCE HALO Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
ESPECIFICIDAD
Dimetro
Lote
Cantidad Muestra (mg) DATOS
g Bacitracina /100 g

92
ANEXO 7. SELECTIVIDAD BACITRACINA ZINC
Concentracin 15 g / 100g Lote 200711026
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
Promedio Promedio corr
S
3
22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio
S
3
22,06 21,51 22,90 22,27 22,83 22,57 22,63 23,16 23,34 22,59
MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
Promedio
S
3
23,78 25,14 24,64 24,49 23,93 24,07 24,26 24,13 23,99 24,27
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
ESTANDAR MUESTRA PLACEBO Peso (mg) 17,0
0,000 0,000 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) recupe 0,001 0,001 Fecha de vencimiento N.A.
Log (Concentracin) -3,132 -3,132 N1E200
17,00 217,20 217,20
1,021 0,004 Pendiente 0,1278
0,072 0,028 --- Intercepto -3,1322
1250
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 99,9
M2 MUESTRA 100,0
M3 PLACEBO ---- Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION ACIDA
Dimetro
Lote
Cantidad Muestra mg DATOS
UI reales / mg
Porcentaje %

93
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio
S
3
23,42 23,38 21,86 22,82 21,50 21,94 22,70 22,29 22,71 22,51
MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
Promedio
S
3
23,04 24,31 23,37 24,15 23,55 24,08 23,77 23,36 23,73 23,71
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
0,000 0,000 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) recuperada 0,001 0,001 Fecha de vencimiento N.A.
17,00 217,20 217,20
1,021 0,004 Pendiente 0,1278
0,072 0,028 --- Intercepto -3,1322
1250
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 99,9 Pr T (X S
3
M2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S
3
M3 PLACEBO ----
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION BASICA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje

94
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62
ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73

Promedio
S
3
23,98 23,42 23,83 23,43 24,50 24,42 24,17 23,54 24,82 24,01
MUESTRA 22,48 22,76 22,32 21,21 21,34 21,44 22,16 22,88 22,32 22,10 22,99
Promedio
S
3
23,48 22,99 23,76 23,47 23,11 23,29 22,49 22,99 22,76 23,15
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
23,73 22,99 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) recuperada 0,795 0,639 0,001 Fecha de vencimiento N.A.
Log (Concentracin) -0,099 -0,194 -3,132 N1E200
17,0 217,2 217,2
1,021 3,680 0,000 Pendiente 0,1278
77,886 24,532 --- Intercepto -3,1322
1250
MUESTRA DEGRADACION Pr T (X S
3
3
M2 MUESTRA 75,5
M3 PLACEBO ---
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje %

95
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66
ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97

Promedio
S
3
24,14 23,76 24,22 23,26 24,88 23,88 23,94 24,66 24,58 24,15
MUESTRA 23,94 23,90 24,84 23,76 23,84 23,84 24,61 23,47 24,32 24,06 24,81
Promedio
S
3
23,48 22,99 23,76 23,47 23,11 23,29 22,49 22,99 22,76 23,15
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
23,968 24,811 0,000 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) recuperada 0,853 1,093 0,001 Fecha de vencimiento N.A.
Log (Concentracin) -0,069 0,039 -3,132 N1E200
17,40 217,90 217,20
1,045 6,271 Pendiente 0,1278
81,584 17,432 --- Intercepto -3,1322
1250
3
3
M2 MUESTRA 82,6
M3 PLACEBO ----
BACTRAN 15%
SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje %

96
ANEXO 8. SELECTIVIDAD BACITRACINA METILEN DISALICILATO
Concentracin 11 g / 100g Lote LO70701
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,23 21,94 22,01 23,39 22,91 21,52 22,24 23,84 23,80 22,65
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio
S
3
22,72 21,94 22,64 22,29 22,73 22,58 23,07 21,89 21,86 22,41
MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
Promedio
S
3
23,49 23,32 23,59 23,56 23,71 24,05 24,35 23,55 23,93 23,73
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
0,0 0,0 0,0 Potencia (P) UI/mg 75,1
17,0 293,1 293,1
1,021 0,003 Pendiente 0,1278
0,072 0,029 --- Intercepto -3,1322
1250
MUESTRA DEGRADACION
M1 ESTNDAR 99,9
M2 MUESTRA 100,0
M3 PLACEBO ---- Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION ACIDA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje %

97
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,42 22,62 22,90 22,60 21,83 22,72 21,87 22,86 21,92 22,42
ESTANDAR --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---

Promedio
S
3
23,67 22,38 23,03 23,31 22,53 23,28 23,34 22,15 22,52 22,91
MUESTRA --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
Promedio
S
3
24,43 24,70 24,36 23,85 23,84 23,33 24,92 24,26 24,08 24,20
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
0,0 0,0 0,0 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) recuperada 0,001 0,001 Fecha de vencimiento N.A
17,0 293,1 239,1
1,021 0,003 Pendiente 0,1278
0,072 0,029 --- Intercepto -3,1322
1250
MUESTRA DEGRADACION
3
M2 MUESTRA 100,0 Pr T (X S
3
M3 PLACEBO ----
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION BASICA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje

98
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
24,11 23,53 23,97 23,50 23,52 23,77 23,67 23,27 23,20 23,62
ESTANDAR 22,09 22,96 22,47 22,80 22,49 22,36 22,34 22,30 22,21 22,45 23,73

Promedio
S
3
22,58 22,40 22,71 22,66 23,14 22,52 21,70 22,36 21,80 22,43
MUESTRA 20,62 21,49 21,45 21,46 20,53 21,12 19,36 20,91 20,30 20,80 23,27
Promedio
S
3
22,73 23,21 22,91 23,01 23,35 22,38 23,12 22,84 22,17 22,86
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
23,73 23,27 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
17,0 293,1 293,1
1,021 2,966 Pendiente 0,1278
77,886 26,963 --- Intercepto -3,1322
1250
3
3
M2 MUESTRA 73,0
M3 PLACEBO ----
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION TERMICA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje %

99
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,01 24,38 23,91 24,06 23,76 23,18 24,25 23,40 23,03 23,66
ESTANDAR 23,14 22,92 23,40 23,10 22,83 22,24 22,33 22,27 22,36 22,73 23,97

Promedio
S
3
23,95 25,30 24,18 23,83 24,93 24,18 24,18 23,44 23,55 24,17
MUESTRA 24,10 24,48 24,40 24,41 24,80 24,44 23,83 23,43 23,50 24,15 24,88
Promedio
S
3
22,73 23,21 22,91 23,01 23,35 22,38 23,12 22,84 22,17 22,86
PLACEBO --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
23,97 24,88 0,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
Log (Concentracin) -0,069 0,048 N1E200
17,4 292,5 293,1
1,0 4,77 Pendiente 0,1278
82 23 --- Intercepto -3,1322
1250
3
3
M2 MUESTRA 76,6
M3 PLACEBO ----
BACTRAN 11%
SELECTIVIDAD CONDICION ULTRAVIOLETA
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje %

100
ANEXO 9. PRECISIN DEL METODO BACITRACINA ZINC
PRECISION DE METODO BACITRACINA ZINC
La precisin del mtodo es evaluado con los siguientes datos:
DATOS DEL GRUPO 1 - PRECISION DIA 1 ANALISTA 1
Muestra Concentracin (UI/ml) Dimetro (mm)
% Recuperacin
1 1,0 24.90
107.64
2 1,0 24.85
106.00
3 1,0 24.91
107.73

Media 24.886 107.123 Tendencia central

Desviacin Estndar

0.032

0.976

Expresa la variabilidad
del mtodo

Coeficiente de variacin

0.001
(0.127%)

0.009
(0.911%)

Debe ser inferior al 5%

Desviacin estndar de la
media

0.096

2.829

del mtodo
IC 95% para la media
(IC= X t * s/n)
IC = 24.8864.303* 0.032/3
IC= 107.12 4.303*0.976/3
24.80-24.96

104.6-109.5

Limites de confianza de
la media

Nmeros de datos 3
Nmeros de datos usados en el
calculo
3
Nivel de confianza 95%
Varianza del grupo Dimetro (mm)
Varianza del grupo % Recuperacin
0.001
0.95
101

%
Recuperacin
1 1,0 24,82
105.12
2 1,0 24.94
108.83
3 1,0 24.90
107.18


Desviacin Estndar

0.060

1.857

del mtodo


0.002
(0.241%)

0.017
(1.735%)


media

0.096

2.829

del mtodo

(IC= X t * s/n)
IC = 24.8874.303* 0.060/3
IC = 107.04 4.303 *1.857/3

24.73-25.03

102.4-111.6

Limites de confianza
de la media

Nmeros de datos 3
calculo
3
0.004
3.45
102

% Recuperacin
1 1,0 24.71
101.79
2 1,0 24.65
99.84
3 1,0 24.77
103.43


Desviacin Estndar

0.060

1.797

del mtodo


0.002
(0.243%)

0.018
(1.767%)


media

0.096

2.829

del mtodo

(IC= X t * s/n)
IC = 24.7114.303* 0.06/3
IC = 101.64.303 *1.797/3

24.56-24.86

97.13-106.0

de la media

Nmeros de datos 3
calculo
3
0.004
3.23

103

% Recuperacin
1 1,0 24.96
103.32
2 1,0 24.91
106.56
3 1,0 24.91
107.44


Desviacin Estndar

0.031

1.410

del mtodo


0.001
(0.124%)

0.013
(1.308%)


media

0.096

2.829

del mtodo

(IC= X t * s/n)
IC = 24.9254.303* 1.410/3
IC = 107.7 4.303 * 1.41/3

21.42-28.42

104.2-111.2

de la media
Nmeros de datos 3
calculo
3
0.001
1.99
104
DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS

% Recuperacin
1 1,0 24.90
107.64
2 1,0 24.85
106.00
3 1,0 24.91
107.73
4 1,0 24,82
105.12
5 1,0 24.94
108.83
6 1,0 24.90
107.18
7 1,0 24.71
101.79
8 1,0 24.65
99.84
9 1,0 24.77
103.43
10 1,0 24.96
103.32
11 1,0 24.91
106.56
12 1,0 24.91
107.44


Desviacin Estndar

0.097

2.880

del mtodo


0.004
(0.389%)

0.027
(2.720%)


(IC= X t * s/n)
IC = 24.852.201* 0.097/12
IC= 105.92.201* 2.88/11

24.78-24.91

103.9-107.8

la media

105

# Dimetro % Recuperacin Sesgo (b)
1 24,886 107,123 7,123
2 24,887 107,043 7,043
3 24,711 101,692 -1,692
4 24,925 107,772 7,772
Varianza 0,009 8,005
Media 24,852 105,908 5,062
Desviacin estndar 0,096 2,829 4,514
Coeficiente de
variacin 0,004 0,027 0,892
% Coeficiente de
variacin 0,386 2,671 89,186
t de Student
t
exp
= (100 ) n / CV%
t
exp
= (100 105.908) 4 / 2.671 = 4.423
Para p= 0.05/2 y v= 4 t
Tablas
tiene un valor de 3.182:
X= X t S/n X= X t S/n
X= 24.852 0.1527 X= 105.908 4.5009
X
1
= 24.699 X
2
= 25.004 X
1
= 101.407 X
2
= 110.408

Nmeros de datos 12
calculo
11
Varianza del grupo
0.009
8.296
Numero de datos totales para el calculo 12
Nivel de confianza (1-/2) 95.00
Grados de libertad 11
t (table) ( Test T Student) 3.182
106
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,81 22,49 22,82 22,29 23,21 23,05 23,11 23,09 23,06 23,02
M1 23,05 23,36 22,89 22,86 23,10 23,21 22,98 23,01 23,09 23,02 24,90

Promedio
S
3
23,19 23,06 24,50 24,20 23,31 23,19 23,81 24,00 23,57 23,72
M2 23,10 23,04 24,25 23,57 23,63 24,23 23,65 24,09 24,06 23,67 24,85
Promedio
S
3
23,82 24,58 23,82 23,14 23,74 23,84 23,19 24,46 23,78 23,82
M3 23,51 24,17 23,95 23,80 23,60 24,17 23,46 24,27 23,50 23,83 24,91
M1 M2 M3 Peso (mg) 17,0
24,90 24,85 24,91 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) 1,122 1,106 1,124 Fecha de vencimiento N.A.
Log (Concentracin) 0,050 0,044 0,051 N1E200
0,2171 0,2171 0,2172
6.461 6366 6470 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
Potencia Promedio 6432
% 107,1
Lote
Cantidad Muestra (g) DATOS
g Bacitracina Zinc /100 g
Dimetro
BACTRAN 15%
PRECISION DIA 1 ANALISTA 1

107
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,03 24,01 23,27 23,49 23,31 24,76 23,19 23,59 23,83 23,61
M1 23,26 23,20 23,09 23,52 23,80 24,45 23,87 23,08 23,52 23,53 24,82

Promedio
S
3
24,36 24,40 23,50 24,77 23,64 24,26 24,05 23,81 23,81 24,21
M2 24,50 24,15 24,22 24,71 24,41 24,70 24,15 24,23 23,65 24,25 24,94
Promedio
S
3
24,15 23,55 24,24 23,33 23,89 24,01 23,75 24,21 24,19 23,92
M3 24,40 23,31 23,91 23,00 24,11 24,22 23,88 23,96 24,49 23,92 24,90
M1 M2 M3 Peso (mg) 17
24,82 24,94 24,90 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) 1,097 1,135 1,121 Fecha de vencimiento N.A.
0,2172 0,2173 0,2176
6314 6531 6437 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
Potencia Promedio 6.427
% 107,0
Lote
g Bacitracina Zinc/100 g
Dimetro
BACTRAN 15%

108
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
25,34 23,98 24,57 25,58 24,65 25,20 24,95 25,30 25,41 24,93
M1 24,65 23,83 24,51 24,86 23,63 24,13 25,68 25,24 25,00 24,74 24,71

Promedio
S
3
25,53 25,32 25,37 25,63 25,20 25,60 25,89 25,68 24,77 25,39
M2 25,52 25,32 25,01 25,25 25,07 24,96 25,24 24,87 24,73 25,14 24,65
Promedio
S
3
24,53 24,19 24,33 24,66 24,93 24,77 25,10 25,88 25,50 24,88
M3 24,33 24,39 25,04 24,54 24,57 24,65 25,52 25,05 24,63 24,75 24,77
M1 M2 M3 Peso (mg) 17,0
24,71 24,65 24,77 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) 1,061 1,042 1,080 Fecha de vencimiento N.A
0,2171 0,2173 0,2173
6.109,3 5.996,8 6.212,4 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
% 101,7
Lote
Dimetro
BACTRAN 15%

109
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
25,43 24,54 24,54 25,57 25,38 24,89 24,80 25,62 24,89 25,07
M1 25,18 24,20 25,42 25,73 25,11 25,63 25,01 25,58 24,35 25,13 24,96

Promedio
S
3
24,48 24,74 25,34 24,96 25,12 25,33 24,53 25,28 24,12 24,88
M2 24,57 25,61 24,97 24,96 25,47 25,34 24,33 24,67 24,07 24,89 24,91
Promedio
S
3
25,21 26,11 25,24 25,01 24,56 26,18 25,31 25,57 24,80 25,52
M3 24,46 25,66 25,80 25,90 26,13 25,83 25,47 25,28 25,79 25,52 24,91
24,96 24,91 24,91 Potencia (P) UI/mg 75,1
0,2175 0,2198 0,2177
6.566 6.400 6.462 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
% 107,8
Lote
Dimetro
BACTRAN 15%

110
ANEXO 10. PRECISIN DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
PRECISION DE METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
% Recuperacin
1 1,0 24.88
106.28
2 1,0 24.87
105.93
3 1,0 24.84
104.90


Desviacin Estndar

0.024

0.720

del mtodo


0.001
(0.097%)

0.007
(0.681%)


media

0.078

2.368

del mtodo
(IC= X t * s/n)
IC = 24.864.303* 0.024/3
IC = 105.7 4.303 * 0.720/3

24.80-24.91

103.9-107.4

de la media
Nmeros de datos 3
calculo
3
0.001
0.517
111


% Recuperacin
1 1,0 24,91
106.90
2 1,0 24,97
109.39
3 1,0 25,00
109.98


Desviacin Estndar

0.049

1.638

del mtodo


0.002
(0.194%)

0.015
(1.50%)


media

0.11

2.368

del mtodo

(IC= X t * s/n)
IC = 24.964.303* 0.049/3
IC = 108.75 4.303*1.638/3

24.83-25.08

104.6-112.8

de la media

Nmeros de datos 3
calculo
3
0.002
2.682
112
% Recuperacin
1 1,0 24.92
107.64
2 1,0 24.93
108.0
3 1,0 24.95
108.20


Desviacin Estndar

0.014

0.282

del mtodo


0.001
(0.055%)

0.003
(0.261%)


media

0.078

2.368

del mtodo

(IC= X t * s/n)
IC = 24.9354.303* 0.014/3
IC = 107.9 4.303 * 0.282/3

24.90-24.96

107.2-108.6

de la media
Nmeros de datos 3
calculo
3
0.0002
0.080
113

% Recuperacin
1 1,0 24.73
101.86
2 1,0 24.71
101.10
3 1,0 24.92
107.58


Desviacin Estndar

0.115

3.542

del mtodo


0.005
(0.464%)

0.034
(3.421%)


media

0.078

2.368

del mtodo

(IC= X t * s/n)
IC = 24.784.303* 0.115/3
IC = 103.51 4.303*3.542/3

24.49-25.06

94.71-112.3

de la media
Nmeros de datos 3
calculo
3
0.01
12.54
114
DATOS DEL GRUPO 5 - PRECISIONES ANALISTAS
% Recuperacin
1 1,0 24.88
106.28
2 1,0 24.87
105.93
3 1,0 24.84
104.90
4 1,0 24,91
106.90
5 1,0 24,97
109.39
6 1,0 25,00
109.98
7 1,0 24.92
107.64
8 1,0 24.93
108.0
9 1,0 24.95
108.20
10 1,0 24.73
101.86
11 1,0 24.71
101.10
12 1,0 24.92
107.58


Desviacin Estndar

0.089

2.728

del mtodo


0.004
(0.357%)

0.025
(2.561%)

(IC= X t * s/n)
IC = 24.882.201* 0.089/12
IC= 106.482.201*2.728/12

24.82-24.94

104.7-108.2

la media

Nmeros de datos 12
calculo
12
0.008
7.441
115
# Dimetro
%
Recuperacin Sesgo (b)
1 24,86 105,704 5,704
2 24,96 108,775 8,775
3 24,94 107,947 7,947
4 24,786 103,512 3,512
Varianza 0,006 5,610
Media 24,886 106,485 6,485
Desviacin estndar 0,078 2,369 2,369
Coeficiente de variacin 0,003 0,022 0,365
% Coeficiente de
variacin 0,315 2,224 36,526

t de Student
t
exp
= (100 ) n / CV%
t
exp
= (100 106.485)4 / 2.224 = 5.83
Para p= 0.05/2 y v= 3 t
Tablas
tiene un valor de 3.182:
X= X t S/n X= X t S/n
X= 24.886 0.1240 X= 106.485 3.769
X
1
= 24..761 X
2
= 25.010 X
1
= 1102.715 X
2
= 110.254

Numero de datos totales para el calculo 12
Nivel de confianza (1-/2) 95.00
t (table) ( Test T Student) 3.182

116
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
24,13 24,99 24,78 24,63 24,69 25,09 25,20 24,53 24,59 24,81
M1 24,66 24,80 24,84 25,50 24,92 24,52 25,62 24,37 24,74 24,79 24,88

Promedio
S
3
25,13 24,12 24,84 24,94 24,47 24,48 25,36 24,56 25,17 24,87
M2 24,30 24,83 24,85 24,80 24,68 24,80 25,12 25,34 25,50 24,84 24,87
Promedio
S
3
25,10 25,45 25,20 24,75 24,54 25,20 25,62 24,83 24,80 25,05
M3 25,20 25,20 25,16 24,71 25,22 24,50 25,04 24,88 25,00 24,99 24,84
M1 M2 M3 Peso (mg) 17,0
24,88 24,87 24,84 Potencia (P) UI/mg 75,1
0,2923 0,2924 0,2922
4770 4755 4710 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
% Factor de Dilucin (D) 105,7
Dimetro
Lote
4745,0
g Bacitracina Metilen Disalicilato /10
Potencia Promedio

117
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
25,72 25,75 25,33 25,19 25,03 25,11 25,10 25,51 25,51 25,36
M1 25,82 25,60 25,27 25,04 25,46 24,54 25,41 25,69 25,49 25,37 24,91

Promedio
S
3
24,52 25,23 24,82 25,08 24,99 24,66 24,59 24,49 24,81 24,80
M2 24,57 25,55 24,71 24,76 24,90 25,20 24,56 24,45 25,16 24,87 24,97
Promedio
S
3
24,74 24,89 25,00 25,28 24,70 25,05 24,96 24,84 25,01 24,94
M3 24,97 24,80 25,16 25,48 24,85 25,25 25,30 24,08 25,50 25,04 25,00
M1 M2 M3 Peso (mg) 17,0
24,91 24,97 25,00 Potencia (P) UI/mg 75,1
0,2929 0,2919 0,2927
4800 4911 4938 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
Dimetro
Lote
g BacitracinaMetilen Disalicilato /100
% 108,8 Factor de Dilucin (D)

118
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,14 21,99 21,76 23,05 22,09 22,41 21,54 22,49 23,05 22,28
M1 22,67 22,17 21,84 21,93 22,07 23,20 22,76 22,20 21,89 22,30 24,92
Promedio
S
3
21,83 22,63 23,03 22,91 21,90 21,65 21,97 22,32 22,76 22,33
M2 22,67 22,78 22,92 22,39 22,15 22,29 21,14 22,54 22,41 22,37 24,93
Promedio
S
3
21,58 22,53 21,61 21,37 21,84 23,01 23,08 21,99 21,78 22,26
M3 22,96 22,10 21,80 21,33 22,78 23,23 22,56 22,72 22,22 22,31 24,95
M1 M2 M3 Peso (mg) 17,0
24,92 24,93 24,95 Potencia (P) UI/mg 75,1
0,2922 0,2920 0,2930
4.833 4.849 4.858 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
Dimetro
Lote
g Bacitracina Metilen Disalicilato/100
% 107,9 Factor de Dilucin (D)

119
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
21,25 23,45 23,20 23,51 23,70 23,30 23,21 23,60 22,48 23,08
M1 21,85 22,70 22,17 23,76 23,12 22,20 23,83 23,03 23,52 22,91 24,73

Promedio
S
3
23,18 23,26 23,09 22,23 23,89 22,65 22,92 23,67 23,18 23,05
M2 22,95 23,52 23,32 22,35 22,20 22,07 22,78 23,12 23,41 22,86 24,71
Promedio
S
3
23,62 22,70 23,60 22,79 22,59 22,67 22,07 23,08 22,94 22,90
M3 22,50 22,93 22,86 22,41 23,55 23,02 23,33 22,57 23,05 22,91 24,92
M1 M2 M3 Peso (mg) 17,0
24,73 24,71 24,92 Potencia (P) UI/mg 75,1
0,2918 0,2920 0,2919
4.574 4.539 4.830 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
1250
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
Dimetro
Lote
g Bacitracina Metilen Disalicilato /10
% 103,5

120
ANEXO11. PRECISION DEL SISTEMA
PRECISION DEL SISTEMA BACITRACINA
%
Recuperacin
1 1.0 24.84 107.79
2 1.0 24.89 109.58
3 1.0 24.76 105.50
4 1.0 24.82 107.44
5 1.0 24.66 102.30
6 1.0 24.77 105.80
7 1.0 24.81 107.10
8 1.0 24.77 105.85
9 1.0 24.83 107.46
10 1.0 24.83 107.55

Desviacin Estndar

0.062

1.938

del mtodo


0.003
(0.251%)

0.018
(1.817%)


(IC= X t * s/n)
IC = 24.7982.262* 0.062/10
IC = 106.64 2.262 * 1.938/10

24.75-24.84

105.25-108.02

la media

Nmeros de datos 10
calculo
10
Varianza del grupo %
Recuperacin
0.004
3.755
121
ANEXO 12. EXACTITUD METODO BACITRACINA ZINC
EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA ZINC
La exactitud del mtodo es evaluado con los siguientes datos:
Concentracin Concentracin Concentracin
L. inferior 80%
%
recuperacin Terico 100%
%
recuperacin L. superior120%
%
recuperacin
23,766 100,230 24,893 111,790 24,862 92,410
23,878 103,710 24,888 111,660 24,830 91,430
23,231 85,690 24,530 100,450 24,830 91,460
variancia 91.374 42.379 0.311

Homogeneidad de variancias (Test Cochran)

G
exp
= S
2
max
/ S
2
li
+S
2
t
+S
2
is

G
exp
= 91.374/ 91.374+42.379+0.311 = 0.682
Determinacin del sesgo o error determinado
#
%
recuperacion Sesgo (b)
1 100,230 -0,230
2 103,710 -3,710
3 85,690 14,310
4 111,790 -11,790
5 111,660 -11,660
6 100,450 -0,450
7 92,410 7,590
8 91,430 8,570
9 91,460 8,540
Promedio 98,759 1,241
Desvest 9,246
Media 98,759
CV 0,094
CV% 9,362
Variancia 85.485
e% 1,24
Valor de referencia 100,00

e [%]= ( / valor de referencia ) * 100
e [%]= (1.241/100)*100= 1.24
122
t de Student
t
exp
= (100 ) n / CV%
t
exp
= (100 98,759) 9 / 9,362 = 0.39
para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa entre la
recuperacin de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es conforme.
# halos
1 23,766
2 23,878
3 23,231
4 24,893
5 24,888
6 24,530
7 24,862
8 24,830
9 24,830
Varianza 0,390
Media 24,412
IC 0,408
Desvest 0,625
n 9
CV 0,026
CV% 2,559

Determinacin

resultados Criterios de aceptacin
Homogeneidad de
variancias
P Valor G
exp
= 0.682 P >0.005 (no significativo)
Sesgo

e%

1.24 Inferior al 3%
T de Student P Valor t
exp
= 0.39 P > 0.05 ( no significativo)

123

Area
Confidence level (1- /2) 95.00
Variance 0.390
Mean 24.41
Confidence interval 0.408
Coefficient of variation of repeatability 2.55%

Recovery
Variance 85.485
Degrees of freedom 8
Mean recovery 98.759
Interval confianza(+-) 6.040
124

ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 173.8 mg 25 HCl 0,01N 0,8 UI / mL
1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,36 24,41 23,29 23,34 23,03 23,23 23,30 23,10 23,24 23,37
M1 22,64 23,01 22,53 22,17 22,01 22,26 21,68 21,75 22,04 22,23 23,77

Promedio
S
3
23,54 23,34 23,92 23,91 24,00 24,04 23,60 23,35 22,95 23,63
M2 23,36 22,88 23,06 22,33 22,40 22,39 22,41 22,17 22,45 22,61 23,88
Promedio
S
3
23,36 24,64 23,59 24,30 24,08 24,49 24,42 23,66 24,03 24,06
M3 21,28 22,97 22,45 22,27 22,86 23,59 21,99 22,69 21,45 22,39 23,23
23,766 23,878 23,231 Potencia (P) UI/mg 5,76
Concentracin (UI/ml) recup 0,804 0,831 0,687 Fecha de vencimiento N.A
174,0 173,8 173,9
0,802 0,801 0,801 Pendiente 0,1278
100,23 103,71 85,69 Intercepto -3,1322
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 80%
Dimetro
Lote
UI reales / mg
Porcentaje Recuperado%
Porcentaje % 96,5 Factor de Dilucin (D)

125

1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,51 22,20 23,73 23,83 23,73 23,37 23,87 23,27 23,34 23,43
M1 22,12 23,36 24,10 23,56 23,82 23,34 23,76 23,45 23,28 23,42 24,89

Promedio
S
3
23,34 22,92 23,16 22,96 22,25 23,13 23,19 24,02 24,13 23,23
M2 23,33 23,83 22,24 22,92 22,95 23,43 23,23 23,22 23,84 23,22 24,89
Promedio
S
3
24,31 24,11 23,94 23,57 29,07 23,68 24,43 23,36 23,88 24,48
M3 24,50 23,21 24,21 23,62 23,84 24,34 24,39 24,60 24,31 24,11 24,53
24,89 24,89 24,53 Potencia (P) UI/mg 5,76
217,4 217,3 217,4
1,00 1,00 1,00 Pendiente 0,1278
111,79 111,66 100,45 Intercepto -3,1322
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 100%
Dimetro
Lote
UI reales / mg

126

1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,44 23,60 23,67 23,46 23,53 23,01 23,96 23,88 23,95 23,61
M1 23,57 23,63 23,52 23,20 23,23 23,95 23,78 23,67 23,61 23,57 24,86

Promedio
S
3
24,26 23,50 24,38 23,27 23,64 23,47 23,38 23,63 23,65 23,69
M2 24,13 24,46 24,06 23,61 23,63 23,76 23,70 23,48 23,61 23,83 24,83
Promedio
S
3
23,44 23,96 23,72 24,38 24,09 23,82 24,19 24,62 24,02 24,03
M3 23,93 24,02 23,86 24,21 23,59 23,84 24,50 24,39 23,27 23,96 24,83
24,86 24,83 24,83 Potencia (P) UI/mg 5,76
260,6 260,9 260,8
1,20 1,20 1,20 Pendiente 0,1278
92,41 91,43 91,46 Intercepto -3,1322
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 15%
EXACTITUD AL 120%
Dimetro
Lote
UI reales / mg

127
ANEXO 13. EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
EXACTITUD DEL METODO BACITRACINA METILEN DISALICILATO
La exactitud del mtodo es evaluado con los siguientes datos:

Homogeneidad de variancias (Test Cochran)
G
exp
= S
2
max
/ S
2
li
+S
2
t
+S
2
is

G
exp
= 8.012/ 2.537+8.012+0.068 = 0.754

Determinacion del sesgo o error determinado
# % recuperacion Sesgo (b)
1 98,663 1,337
2 95,477 4,523
3 97,071 2,929
4 105,449 5,449
5 105,449 5,449
6 100,547 0,547
7 101,256 1,256
8 101,654 1,654
9 101,745 1,745
Promedio 100,812 2,766
Desvest 3,390
Media 100,812
CV 0,034
CV% 3,363
Variancia 11,492
e% 2,766
Valor de referencia 100,000

e [%]= ( / valor de referencia ) * 100
e [%]= (2.766/100)*100= 2.76

Concentracin Concentracin Concentracin
L. inferior 80%
%
recuperacin Terico 100%
%
recuperacin L. superior120%
%
recuperacin
23.54 98.66 24.52 105.44 25.01 101.26
23.43 95.48 24.52 105.44 25.02 101.65
23.49 97.07 24.36 100.54 25.02 101.75
variancia 2.537 8.012 0.068

128
t de Student
t
exp
= (100 ) n / CV%
t
exp
= (100 100.812) 9 / 3.363 = 0.724
Para p= 0.05/2 y v= 8 tiene un valor de 2.306: no hay diferencia significativa entre la
recuperacin de la media obtenida y el 100% por lo que la exactitud es conforme.
# halos
1 23,540
2 23,430
3 23,488
4 24,526
5 24,526
6 24,369
7 25,011
8 25,024
9 25,024
Variancia 0,456
Media 24,327
Desvest 0,675
n 9,000
CV 0,028
CV% 2,776

Determinacin

resultados Criterios de aceptacin
Homogenidad de
variancias
P Valor G
exp
= 0.754 P >0.005 (no significativo)
Sesgo e% 2.7 Inferior al 3%
T de Student O Valor t
exp
= 0.724 P > 0.05 ( no significativo)

129

Area
Variance 0.479
Mean 24.32

Recovery
Variance 11.49
Degrees of freedom 8
Mean recovery 100.81

130

1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,91 23,21 23,62 22,90 23,47 23,11 23,09 23,63 22,80 23,09
M1 21,04 22,17 20,92 21,86 21,56 20,29 21,98 21,76 20,63 21,73 23,54

Promedio
S
3
23,58 23,97 23,64 24,44 24,15 23,30 23,97 23,43 23,48 23,69
M2 21,42 21,33 22,18 23,00 22,50 21,73 22,38 21,74 22,01 22,22 23,43
Promedio
S
3
23,58 22,94 23,00 23,59 23,64 24,12 23,09 23,01 23,39 23,37
M3 22,79 21,67 21,79 24,12 21,09 22,51 20,97 21,80 20,91 21,96 23,49
23,54 23,43 23,49 Potencia (P) UI/mg 4,28
222,6 222,7 222,8
0,76 0,76 0,76 Pendiente 0,1278
98,7 95,5 97,1 Intercepto -3,1322
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 80%
Dimetro
Lote
Cantidad Muestra g DATOS
UI reales / mg

131

1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
22,62 22,84 23,30 22,84 23,04 23,00 23,75 23,30 23,99 23,40
M1 23,06 23,10 23,42 23,19 23,11 22,90 23,39 22,80 23,00 23,02 24,53

Promedio
S
3
23,25 22,77 23,60 23,41 22,69 23,78 23,77 23,41 22,61 23,54
M2 23,28 23,44 23,52 23,56 22,08 23,69 23,70 22,87 23,39 23,16 24,53
Promedio
S
3
23,24 23,94 23,86 24,25 23,24 24,07 24,73 24,38 24,29 24,10
M3 23,48 23,77 23,13 23,08 24,52 23,69 23,53 24,20 23,52 23,56 24,37
24,526 24,526 24,369 Potencia (P) UI/mg 4,28
Concentracin (UI/ml) recuperada 1,01 1,01 0,96 Fecha de vencimiento N.A
Log (Concentracin) 0,00 0,00 -0,02 M1E200
278,40 278,40 278,80
0,95 0,95 0,95 Pendiente 0,1278
105,449 105,449 100,547 Intercepto -3,1322
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 100%
Dimetro
Lote
UI reales / mg

132

1 50 BPH6 1 50 BPH6
Muestras
S
3
23,63 24,53 23,51 22,65 23,53 23,63 24,04 24,64 24,04 23,80
M1 24,05 24,55 23,75 23,88 23,87 24,56 23,62 23,19 23,73 23,91 25,01

Promedio
S
3
24,14 23,77 24,40 23,43 23,94 23,38 24,00 24,01 23,85 23,88
M2 24,65 23,20 23,44 23,81 23,47 23,07 24,48 23,85 23,71 23,74 25,02
Promedio
S
3
24,64 23,66 23,09 23,84 23,76 24,41 23,63 23,69 23,41 23,79
M3 24,04 23,85 24,01 24,50 23,20 24,49 24,09 23,70 23,37 23,92 25,02
25,01 25,02 25,02 Potencia (P) UI/mg 4,28
334,4 334,4 334,1
1,14 1,14 1,14 Pendiente 0,1278
101,26 101,65 101,75 Intercepto -3,1322
---
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
Lote
UI reales / mg
Dimetro
BACTRAN 11%
EXACTITUD AL 120%

133
ANEXO 14. LIMITE DE CUANTIFICACION
LIMITE DE CUANTIFICACION DEL METODO BACITRACINA ESTANDAR
El mtodo es evaluado con los siguientes datos:
#
Concentracin
(UI/ml) Dimetro (mm)
% recuperacin
1 0,02 17,82
669.00
2 0,02 17,55
616.90
3 0,02 17,57
620.60
4 0,02 17,55
617.30
5 0,02 17,15
548.20
6 0,02 17,40
591.30
Varianza 0.050
1572.275


Desviacin Estndar

0.223

39.65
Expresa la
variabilidad del
mtodo

0.013
(1.272%)
0.065
(6.49%)
Debe ser inferior al
5%

Desviacin estndar de la media

0.100

----------
Expresa la
variabilidad del
mtodo
(IC= X t * s/n)
IC = 17.512.571* 0.233/6
IC= 610.55 2.571*39.65/6

17.26-17.75

568.93-652.16

de la media
Nmeros de datos 6
Nmeros de datos utilizados en el
calculo
6

134

LOTE N1E200
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL
1 50 BPH6 1 100 BPH6
2 50 BPH6
Muestras
S
3
23,27 23,15 24,00 23,41 23,52 23,24 23,42 23,38 24,07 23,50
M1 16,63 17,67 16,61 16,34 16,66 16,31 15,66 16,60 15,30 16,42 17,82

Promedio
S
3
22,99 23,13 23,33 22,74 23,53 23,65 23,30 22,94 23,23 23,20
M2 15,79 16,20 16,83 16,60 15,32 15,02 15,16 15,76 16,00 15,85 17,55
Promedio
S
3
23,17 24,56 23,36 23,35 23,65 23,83 22,89 23,67 23,70 23,58
M3 16,07 16,36 16,71 14,68 15,47 16,65 16,20 17,44 16,62 16,24 17,57
17,824 17,549 17,569 Potencia (P) UI/mg 75,1
17,400 17,400 17,400
0,021 0,021 0,021 Pendiente 0,1278
669,044 616,934 620,576 Intercepto -3,1322
---
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
Lote
UI reales / mg
Dimetro
BACITRACINA
LIMITE DE CUANTIFICACION

135

LOTE N1E200
ESTANDAR 1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL MUESTRA 17 mg 25 HCl 0,01N 0,02 UI/mL
1 50 BPH6 1 100 BPH6
2 50 BPH6
Muestras
S
3
23,36 22,69 23,36 24,12 23,73 23,77 23,60 23,27 23,52 23,49
M1 16,33 15,74 15,80 15,65 15,90 16,00 16,16 16,89 16,81 16,14 17,55

Promedio
S
3
23,27 23,45 23,85 23,26 23,17 24,54 23,30 23,27 23,61 23,52
M2 15,82 16,07 15,82 16,10 14,83 15,42 15,77 16,40 15,72 15,77 17,15
Promedio
S
3
23,73 23,70 23,90 23,44 23,69 23,47 24,03 23,65 23,57 23,69
M3 15,63 16,36 15,92 16,55 16,16 16,68 16,76 16,01 15,65 16,19 17,40
17,551 17,148 17,404 Potencia (P) UI/mg 75,1
17,400 17,400 17,400
0,021 0,021 0,021 Pendiente 0,1278
617,338 548,248 591,260 Intercepto -3,1322
---
Pr T (X S
3
Pr T (X S
3
Lote
UI reales / mg
Dimetro
BACITRACINA
LIMITE DE CUANTIFICACION

136
ANEXO 15. LIMITE DE DETECCIN
ACTIVO Bacitracina Zinc BACITRACINA
Lote M1E200
ESTANDAR MUESTRA 1250 25 HCl 0,01N
1250 25 HCl 0,01N 1.0 UI / mL 1 100 BPH6
1 50 BPH6
0,5 1 1,5 2,5
50 50 50 50 BPH6
0,005 0,01 0,015 0,025 UI/ml
Muestras
S
3 23,65 24,46 23,70 24,16 23,59 25,17 24,43 23,94 23,30 24,04
0,005 UI/ml --- --- --- --- --- --- --- --- --- 0,00 ---
S
3 23,73 23,67 23,39 24,23 24,53 23,77 22,84 23,39 23,73 23,63
0,01 UI / mL 11,54 11,04 11,74 10,00 11,45 11,05 11,21 11,01 11,70 11,19 12,46

Promedio
S
3 23,62 23,62 23,25 23,48 23,70 23,11 23,22 23,66 23,94 23,51
0,015 UI / mL 15,66 15,21 15,14 14,14 14,72 14,44 14,47 13,47 14,18 14,60 15,99
Promedio
S
3 23,51 23,41 24,76 23,67 24,05 23,26 23,38 23,64 23,72 23,71
0,025 UI / mL 16,77 17,18 16,69 16,23 16,86 16,56 15,59 15,64 16,30 16,42 17,61
0,005 0,01 0,015 0,025 Peso (mg) 17
0,0 12,46 15,99 17,61 Potencia (P) UI/mg 75,1
Concentracin (UI/ml) recuperacin 0,001 0,029 0,082 0,131 Fecha de vencimiento N.A
Log (Concentracin) -3,1322 -1,540 -1,088 -0,881 N1E200
16,90 16,90 16,90 16,90
0,005 0,010 0,015 0,025 Pendiente 0,1278
Intercepto -3,1322
CONCENTRACIN RESULTADO
M1
ST 0,005 UI/ml No se detecta halo de inhibicin Pr T (X S
3
M2 ST 0.01 UI / Ml Se detecta halo de inhibicin Pr T (X S
3
M3 ST 0.015UI / mL Se detecta halo de inhibicin
M4 ST 0.025UI / mL Se detecta halo de inhibicin
UI reales / mg
Dimetro
Lote

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