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155 PRODUCCION DE ANIMALES TRANSGENICOS
G. Brem, U. Berg & H.D. Reichenbach
Introduccin
En gentica molecular moderna se desarrollaron mtodos adecuados que permiten trabajar especfica- y repetidamente con ADN, como portador de la informacin gentica. Esas tcnicas de gentica molecular abren en la produccin animal nuevas perspectivas, dado que es posible por primera vez trabajar directamente a nivel gnico, ello significa la posibilidad de aislar, secuenciar, recombinar y transferir genes individuales. El espectro de aplicaciones de esas tcnicas no est desarrollado ampliamente. Sin embargo es posible pronosticar que el futuro de la produccin animal ser afectado directamente y que los mtodos de la produccin animal convencional sern complementados y posiblemente tambin parcialmente reemplazados (ver captulo XIX).
Transferencia de genes significa transferencia e integracin del ADN recombinado in vitro y su estructura acoplada al genoma del receptor. Si la estructura de ADN se integra en el genoma del receptor, ste se denomina transgnico. El producto de ese transgen, una protena codificada por el ADN transferido, es el producto transgnico. Con la ayuda de la transferencia de genes se pretende lograr que una determinada cualidad en el organismo receptor sea modificada o una nueva sea incorporada. Adems se espera que el transgen integrado en el genoma sea transmitido a la herencia a fin de establecer una lnea transgnica.
En la extensa definicin original slo se habla de animales transgnicos cuando se comprueba que el transgen se hereda en forma estable y se exprime. Pero en la actualidad se ha establecido en el lenguaje cotidiano emplear el trmino: animal transgnico a partir del momento en el cual se puede comprobar la presencia del nuevo gen en un individuo, al cual se ha practicado la transferencia gnica. Por otra parte en produccin animal la transferencia de genes es slo interesante cuando la estructura gnica es transmitida a la descendencia, de forma tal de establecer lneas transgnicas en la poblacin.
El ADN recombinado en las estructuras gnicas puede tener origen en los ms variados organismos donantes, debido a la uniformidad en la estructura bsica de la doble cadena de ADN. J unto con el ADN procaritico de origen viral o bacteriano el ADN de los organismos eucariticos representa una fuente inagotable para la transferencia gnica.
No debe olvidarse, sin embargo, que especialmente para la expresin de transgnicos pueden establecerse fuertes interacciones dependientes del origen y del receptor del ADN. Fue observado, por ejemplo, que la expresin de las estructuras gnicas que contienen an componentes procariticos, puede ser reducida o incluso suprimida en animales mamferos. Adems se ha observado que es de gran importancia para la expresin si los componentes estructurales del gen son de origen genmico o provienen del ADNc. De esa forma puede observarse que de los trangenes que contienen intrones se produce en promedio 10-100 veces ms ARNm que de transgenes que contienen solamente ADNc (BRINSTER y col., 1988).
A continuacin se har referencia exclusivamente a la produccin de bovinos y otros animales transgnicos de inters productivo y no a la transformacin gentica de clulas procariticas o eucariticas. Con la produccin de un organismo transgnico se pretende que el transgen est presente en todas las clulas somticas y sobre todo tambin en las clulas reproductivas del animal. Dado que no existe hasta el momento mtodo alguno que permita transformar en forma completa un organismo ya formado genticamente, se practica la transferencia gnica tan temprano en el desarrollo del animal como es posible. El momento ms apropiado es el estado embrionario temprano, es decir el estadio unicelular (ovocito fecundado =cigoto), con poco nmero de clulas (blastmeros) o en los estadios de mrula o blastocisto como mximo. Ello significa que los mtodos de obtencin, manipulacin y Brem & col. Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 156 transferencia de esos estadios tempranos deben estar establecidos y disponibles en las especies mamferas.
Se disponen en la actualidad de varios mtodos prometedores de transferencia gnica. Los tres ms importantes son:
- La microinyeccin de ADN en el proncleo del cigoto - La transferencia de ADN a travs de vectores retrovirales - Produccin de quimeras transgnicas a partir de clulas y embriones transformadas genticamente.
La tcnica ms empleada en la actualidad es sin dudas la microinyeccin de ADN. a pesar de que las otras dos cuentan, junto a algunas limitaciones, con una serie de ventajas no despreciables. Lamentablemente la tcnica que emplea clulas embrionales primordiales no fue desarrollada an y la aplicacin de vectores retrovirales lo es en forma muy incompleta como para ser utilizadas en los animales domsticos.
El camino ms prximo para la transferencia de ADN en el ncleo celular es la microinyeccin directa de una solucin de ADN en el citoplasma del ncleo o en el proncleo (foto 1). GORDON y col. (1980) indicaron por primera vez que la microinyeccin de una solucin de ADN en el proncleo es un camino practicable para la transferencia gnica en mamferos. Despus de la microinyeccin de ADN clonado en el proncleo de ovocitos fertilizados de ratn fue posible encontrar esas secuencias virales en partes desarrolladas de los fetos. Poco tiempo despus se indic, en otros trabajos, que genes eucariticos intactos podan incorporarse a los fetos. Fue posible establecer tambin la presencia del transgen en animales adultos como as tambin la transmisin a la descendencia.
En la actualidad la tcnica de produccin de ratones transgnicos fue introducida con xito en muchos laboratorios y se pusieron en prctica estudios para determinar la regulacin de la expresin gnica y el efecto biolgico del gen. Como ya fue mencionado, la microinyeccin de ADN en el proncleo de cigotos o en los ncleos de embriones bicelulares es el mtodo de eleccin para la transferencia gnica en los animales domsticos. La amplia experiencia obtenida en experimentos con ratones constituy sin duda una base adecuada para el desarrollo de la tcnica en los animales de inters zootcnico. Debe aclararse, sin embargo, que debido al desigual desarrollo embrionario temprano y especialmente a la diferente morfologa de los embriones de animales domsticos se produjeron algunos problemas. Por ejemplo, las estructuras nucleares de las especies bovina, porcina y hasta cierto grado de la ovina y caprina no pueden ser observadas con el microscopio o slo con dificultad debido a los grnulos citoplasmticos oscuros. Para la observacin del ncleo los embriones ovinos requieren un microscopio de interferencia segn NOMARSKI, los embriones bovinos y porcinos deben ser centrifugados para exponer el ncleo. Tampoco se contaba con suficientes conocimientos prcticos sobre como se deba establecer el tiempo ptimo para la obtencin, microinyeccin y transferencia de los embriones para contar con las mejores posibilidades en el xito de la transferencia gnica.
La produccin de mamferos transgnicos puede dividirse bsicamente en 6 fases:
1. Clonado de las estructuras gnicas y produccin de la solucin inyectable de ADN. 2. Preparacin de los animales donantes y obtencin de los ovocitos o embriones. 3. Exposicin de los proncleos y microinyeccin del ADN. 4. Transferencia de los embriones inyectados al oviducto o, despus de un cultivo temporal, al tero de receptoras. 5. Comprobacin de la integracin en los animales nacidos y, si es posible, primeras evaluaciones de la expresin del transgen en los niveles de trascripcin (ARN) y translacin (protena). 6. Produccin de descendencia transgnica por medio de mtodos convencionales y evaluacin de eventuales mutaciones presentes a travs de la formacin de lneas homocigotas (test de homocigosis). Animales transgnicos Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 157
Hasta el momento se sabe que, en principio, toda molcula de ADN puede microinyectarse en el genoma de un mamfero. El largo del fragmento de ADN a introducir por medio de los vectores de clonado no debe superar el lmite mximo de 50 kb (clones cosmidios). En otros numerosos experimentos de transferencia gnica se demostr que es posible alcanzar fragmentos mucho ms largos. De esta forma no es raro observar, en animales transgnicos, fragmentos de varios 100 kb o an ms de 1 000 kb de largo, como consecuencia de la concatemerizacin de los fragmentos inyectados.
Evidentemente la inyeccin de ADN lineal conduce a tasas superiores de integracin. En cambio molculas con forma de espiral o "supercoiled" parecen integrarse con una frecuencia significativamente menor (BRINSTER y col., 1985). Tambin es mejor cuando los fragmentos de ADN no son cortados romos ("blunt") sino cuando conservan terminales sobresalientes.
Las soluciones de ADN para microinyeccin deben estar absolutamente libre de partculas contaminantes, para evitar el taponado de la pipeta de microinyeccin o la lesin de los cigotos inyectados. Ello establece que todas las soluciones deben ser filtradas (filtros de 0,2 m) y que todos los recipientes, con los cuales el ADN toma contacto deben ser enjuagados previamente con agua filtrada. Slo en casos aislados se inyecta la totalidad del vector, dado que ADN procaritico puede provocar problemas de expresin. Despus de la restriccin el vector y el ADN de insercin son separados, en la regla, por medio de electroforesis. El fragmento deseado es aislado del gel, lavado y colocado en una solucin buffer. Inmediatamente despus se establece la concentracin de ADN de tal manera que por cada pl (10 -12 ) estn contenidos, segn la aplicacin, varios cientos de copias de la estructura gnica. En fragmentos de ADN un largo de 5-8 kb corresponde a una concentracin de 1-2 g de ADN/ml. No fue encontrada una correlacin entre cantidad del ADN inyectado y el nmero de copias integradas. La solucin preparada de ADN se fracciona y conserva por medio de congelacin (BRENIG, 1987).
La frecuencia de integracin en la produccin de mamferos transgnicos es influenciada por: la pureza, la forma, el tipo de terminales, la concentracin y la solucin buffer del ADN. De ello se concluye que ya durante la preparacin de la solucin de inyeccin del gen, se establecen importantes condiciones para el xito de la transferencia gnica.
Recoleccin de los embriones
Los animales donantes son tratados con gonadotrofinas, con diferentes programas de superovulacin segn la especie, inseminados o servidos dos veces. La obtencin de los cigotos se lleva a cabo a travs del lavaje del oviducto en un lapso de 12-24h despus de la inseminacin. El lavaje de oviducto puede llevarse a cabo mediante ciruga con el animal en narcosis o despus del sacrificio. Debe tenerse especial cuidado, que el oviducto sea seccionado del cuerpo del animal dentro de los 15 min de desangrado. Los oviductos son lavados con una solucin de PBS. Con ayuda de una lupa estereoscpica se aslan los ovocitos o embriones de la solucin obtenida del lavaje y se colocan en medio fresco. Las clulas del cumulus, que eventualmente pudiesen quedar adheridas, pueden eliminarse con un tratamiento de hialuronidasa o por medio de pipeteo. Los embriones son cultivados in vitro hasta el momento de la inyeccin.
La eficacia de los programas de transferencia gnica con animales domsticos es, en promedio, claramente menor que con el ratn. Como se puede observar en la tabla 1 ello se debe al bajo nmero de cigotos que pueden inyectarse por donante, a las bajas tasas de preez y sobrevivencia embrionaria y a la menor frecuencia de integracin. Para la produccin de un animal transgnico se deben emplear, en general, ms donantes y receptoras de animales de inters zootcnico que con ratones o conejos.
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Microinyeccin de ADN
Para la microinyeccin es necesario contar con una mesa de trabajo estable. El lugar de trabajo comprende un microscopio invertido, dos micromanipuladores para las pipetas de sostn y de inyeccin y un aparato de inyeccin. La presin de inyeccin puede ser regulada con ayuda del aparato de inyeccin accionado por medio de un pedal. Sobre la platina del microscopio se encuentra una cmara de inyeccin que contiene el medio y los embriones a tratar. Los embriones bovinos y porcinos son centrifugados 3 min a 15 000 g (WALL y col., 1985). A travs de la centrifugacin se desplazan los grnulos citoplasmticos oscuros hacia un polo, los ncleos y proncleos se hacen visibles en el medio del embrin.
Tabla 1: tasas de xito en programas de transferencia gnica en diferentes animales de experimentacin e inters productivo
Especie murina leporina porcina ovina bovina Embriones inyectados por donante (S)
10 % de integracin (animales transgnicos/ animales nacidos)
15
10
10-15
5-10
5-10 % Animales transgnicos/embriones inyecta-dos y transferidos
2
1
0,5
0,5-1
0,5 Nmero de animales necesarios (S+E) por c/animal transgnico
10
15
20
40
40
A pesar de ese tratamiento la inyeccin de esos embriones es ms difcil que la de embriones de ratn o conejo.
Para la inyeccin se fija el embrin mediante vaco a la pipeta de sostn de tal forma que el (pro-) ncleo se haga bien visible. La pipeta de inyeccin tiene un dimetro de 1 a 2 m y es llenada con la solucin de ADN. Para la inyeccin, la pipeta es introducida por medio del micromanipulador a travs de la zona pelcida, la membrana celular y (pro-) nuclear. La inyeccin con un volumen de 1-2 pl de la solucin de ADN aumenta el volumen del ncleo ms del 50%.
Transferencia de los embriones
Despus de un cultivo temporal, los embriones inyectados son transferidos mediante ciruga a oviductos de receptoras sincronizadas. La sincronizacin de las receptoras se lleva a cabo a travs de un Animales transgnicos Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 159 tratamiento hormonal especfico de especie. Antes de la transferencia de los embriones tratados se controla la reaccin ovrica de la hembra receptora. Slo son empleadas aquellas receptoras que respondieron al tratamiento hormonal con el nmero adecuado de folculos, que depende de la especie tratada.
En la especie bovina se procede a cultivar los embriones in vivo o in vitro durante varios das, a fin de evitar la trabajosa intervencin de la transferencia al oviducto (BERG y BREM, 1989). La finalidad es cultivar los embriones de una o dos clulas hasta el estadio de mrula y transferir stas directamente en el tero de las receptoras. Para el conejo, cerdo, oveja y cabra el cultivo intermedio no es necesario, dado que en esas especies incluso la transferencia uterina se lleva a cabo mediante ciruga.
Comprobacin de la integracin y la expresin
Despus de la transferencia gnica slo es posible en casos aislados determinar la integracin del gen a travs de cambios de fenotipo en los animales nacidos. Incluso an cuando la estructura gnica empleada permita esperar algn efecto, debe llevarse a cabo la comprobacin de la integracin del gen presente independientemente del fenotipo. Ello se debe a que la estructura gnica integrada no siempre se exprime en los animales positivos. Para la comprobacin de la integracin gnica se disponen de varios mtodos. El material de evaluacin lo constituyen clulas con ncleo, que se toman de los rganos o fluidos corporales. Normalmente se toman las pruebas del tejido de la punta de la cola o de la sangre. De ellas se aisla el ADN, que no requiere que sea especialmente de alto peso molecular, como lo es en el caso de los bancos de reservas genmicas.
La lisis completa del tejido se logra a travs de un tratamiento con proteinasa K-buffer a 55 C. La extraccin se logra con cloroformo fenolado. Con acetato de Na y etanol se provoca la precipitacin que aumenta con la centrifugacin. Inmediatamente despus se determina la concentracin con ayuda de un espectrofotmetro, a partir de alcuotas diluidas.
La exacta y ms segura comprobacin de la integracin de las estructuras gnicas se puede llevar a cabo por medio del mtodo Southern-Blot. Aproximadamente 20-30 g de ADN genmico de alto peso molecular es hidrolizado completamente con enzimas de restriccin adecuadas. Despus de la divisin, la mezcla de fragmentos de ADN es separada electroforticamente en gel-agarosa horizontal. Un marcador aplicado al mismo tiempo permitir la determinacin del tamao de los diferentes fragmentos de ADN. Los fragmentos separados son transportados a filtros de celulosa o a membranas de Nylon segn el mtodo de SOUTHERN (1975). El ADN, separado en el gel de agarosa, es transportado - despus de la desnaturalizacin alcalina- a la nitrocelulosa o membrana de nylon que se encuentran directamente sobre agar por medio de capilaridad con ayuda de un buffer de transferencia. Con ADN genmico, el Blot puede terminar al cabo de 10-16 h. El tiempo de transferencia de ADN puede reducirse a menos de una hora con aparatos de vaco o de electro-Blotting. En un mtodo rpido de evaluacin de un nmero grande de pruebas de ADN se transporta una alcuota de ADN desnaturalizado y lavado en forma grosera, a una membrana soporte bajo presin negativa e inmediatamente despus se hbrida con una prueba marcada radioactivamente. Con el mtodo descrito por BRENIG y col. (1989) puede comprobarse la estructura gnica en el ADN del animal hospedador en 25-30 h. Con el reemplazo de la marcacin radioactiva por un mtodo de luminiscencia qumica puede ahorrarse ms tiempo.
Despus de la desnaturalizacin y neutralizacin se contina la transferencia de los fragmentos separados del gel al filtro de nitrocelulosa. Los fragmentos de ADN utilizados en la prueba son marcados radioactivamente. Ello puede llevarse a cabo mediante translacin "nick" u oligopriming.
Los filtros de nitrocelulosa son pre-hibridizados con ADN no especfico e hibridizados posteriormente con ADN radioactivo. Despus de un lavado astringente abundante, los filtros son expuestos a un film Brem & col. Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 160 radiogrfico con una pelcula reforzadora durante un tiempo determinado a 80 o C. Una alternativa al uso de sustancias radioactivas es la aplicacin de dUTP biotinilado (LANGER y col., 1981) para el marcado de fragmentos. Biotina tiene una fuerte afinidad a la avidina, la cual por su parte puede acoplarse a indicadores adecuados (anticuerpos, enzimas, colorantes). De esta forma se pueden identificar tambin las cantidades ms pequeas de complejos biotina/ADN.
En el mtodo Southern-Blot la eleccin de la o las enzimas y de las pruebas de hibridacin tiene una importancia definitiva. En los casos ms adecuados hay una enzima cuyos dos lugares de divisin en la estructura gnica estn separados entre si en forma suficiente para usar el fragmento ubicado entre medio como grupo de hibridacin. Si para la divisin del ADN se emplean los lugares de corte marginales, en los cuales el fragmento fue separado del vector, aparecen en el anlisis Southern-Blot, junto con el o los fragmentos esperados con el tamao correspondiente a la estructura gnica, dos fragmentos en lo general ms largos.
El anlisis de patrones ("pattern") de tal naturaleza permite sacar algunas conclusiones sobre la integracin. Se sabe que, en muchos animales transgnicos, no slo se integra una copia de la estructura gnica inyectada. Varias copias son frecuentes en dependencia de los lugares marginales, concatmeros unidos al genoma en forma de "head to tail", "head to head" o "tail to tail". De la misma forma no es un fenmeno extrao que se pierdan algunas bases en terminales sobresalientes de los fragmentos, durante la integracin. De esta forma desaparecen los lugares de divisin en los terminales 5'-3'- en los fragmentos integrados de ADN. Si se divide el ADN genmico con enzimas de restriccin, que cortan al final de la estructura gnica, se separan los concatmeros del interior del fragmento de ADN en forma precisa y esperada. Sin embargo, dado que los lugares de corte en las terminales se pierden, se originan en las posiciones 5'-3'- fragmentos ms grandes. Ello es as porque en ambas copias marginales del genoma se encuentran an las secuencias hasta los prximos lugares de fragmentacin en la cadena de ADN, apropiados para las enzimas de restriccin. El largo de esas copias gnicas marginales es casual y depende de la presencia de lugares de divisin adecuados en la zona de integracin del ADN genmico. En casos relativamente escasos la integracin de la estructura gnica se produce no solamente en un lugar sino en dos o ms. En casos favorables puede comprobarse su existencia por medio de anlisis Southern-Blot. Con frecuencia esto no se logra en el primer animal receptor, pero s despus de la segregacin del transgen en la descendencia. Se supone que para la expresin de las estructuras gnicas la prdida de bases marginales en general no tiene importancia.
Si se emplean en la transferencia gnica secuencias homlogas, es decir fragmentos de ADN provenientes de la misma especie, el anlisis Southern-Blot debe planearse cuidadosamente. En esos casos la comprobacin especfica de la integracin gnica slo es posible mediante la correcta seleccin de adecuadas enzimas de restriccin, de lo contrario la diferenciacin entre el ADN endgeno y el transferido es difcil. Dado que, sin embargo, slo en casos excepcionales se elige el mismo orden de regiones no trasladadas promotoras y estructurales del gen y del genoma, se adecuan especialmente los lugares entre ambos genes como pruebas de hibridacin. A pesar de ello ocurren tambin en esos casos seales a travs de la hibridacin cruzada de las pruebas con secuencias genmicas, que deben ser consideradas en el anlisis. De vez en cuando se observan en las pruebas de integracin patrones de integracin inesperados. En esos casos el complejo patrn de restriccin, que no responde al original, se puede determinar mediante un anlisis de restriccin y Southern.
El nmero de estructuras gnicas integradas en el genoma se determina por medio del anlisis Dot-blot. El mismo no es una tcnica de transferencia capilar, dado que el ADN es aplicado a la membrana de soporte mediante una mscara perforada. La electroforesis no es necesaria y la calidad del ADN no necesita ser tan buena como para el anlisis de Southern-Blot. El ADN desnaturalizado es aplicado, lavado, horneado e hidrolizado. A travs de la cuantificacin densimtrica se calcula aproximadamente el nmero de copias del transgen (tamao del genoma haploide =3 . 10 9 pb).
Animales transgnicos Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 161 Una tcnica desarrollada hace pocos aos, la reaccin PCR (Polymerase Chain Reaction, captulo XV), puede emplearse para evaluar si un animal es transgnico en un tiempo relativamente corto y con poco material celular. Cuando se pretende localizar el lugar de integracin en el cromosoma se puede llevar a cabo una hibridacin in situ de los cromosomas en metafase. El trmino hibridacin in situ se emplea tambin para la comprobacin directa de ADN y ARN en muestras de tejidos congelados.
La especificidad para la expresin de un gen o estructura gnica en un tejido se establece, entre otros, a travs de su promotor. Por esa razn, para la evaluacin de la transcripcin correcta de una estructura gnica inyectada se aisla el ARN de los tejidos en los cuales se espera la mayor expresin. La preparacin del ARN se lleva a cabo segn los protocolos de CHIRGWIN y col. (1979) y GLISIN y col. (1974), los cuales se basan en la lisis celular y desnaturalizacin proteica con isotiocianato de guanidina. El ARN es transferido a filtros de nitrocelulosa o de nylon (THOMAS, 1980) como para el anlisis Southern-Blot o a geles desnaturalizados de agarosa/formaldehido, despus de su desnaturalizacin con glioxal o dimetilsulfxido (DMSO).
Para recabar informacin sobre cantidad, estructura o porcentaje de sntesis se llevan a cabo tests con nucleasa S1 y ribonucleasa o ensayos de extensin del iniciador ("primer"). En el anlisis S1 (SHARP y col., 1980) o el test de la proteccin de la ribonucleasa (CHAMBERLIN y RYAN, 1982) se emplean pruebas de cadenas simples, complementarias con el ARN que se pretende evaluar. Con ese mtodo se pueden estudiar los puntos terminales 5'- y 3'- como as tambin la cantidad especfica de ARN.
Despus que se pudo comprobar que la estructura gnica microinyectada se transcribe correctamente, se debe evaluar la translacin. Se analiza en primer lugar si la protena correspondiente se sintetiza y, de ser as, en que cantidad. Para ello se disponen de mtodos colorimtricos o electroforticos en gel con coloracin posterior (Comassie-Blue, plata) del gel o transporte a filtros de nitrocelulosa o membranas de nylon (Western-Blot). Adems pueden emplearse mtodos clnicos de diagnstico (radioinmunoensayo, ELISA), los cuales estn disponibles en parte en forma de kit. Para ms informacin sobre esos mtodos consultar la literatura siguiente: LOWRY y col., 1951; BRADFORD, 1976; PETERSON, 1977; PETERSON, 1979; OAKLEY y col., 1980 HAMES & RICKWOOD, 1981; MOEREMANS y col, 1985; DARBRE, 1986; MOEREMANS y col., 1986; SALINOVICH & MONTELARO, 1986.
Herencia del transgen
Un requisito indispensable para la aplicacin de la transferencia gnica en produccin animal es que el gen transferido se transmita a la descendencia. Para ello es necesario que el animal receptor del gen (microinyectado) posea en todas o, al menos, en parte de sus clulas reproductivas el transgen. Lamentablemente se conoce poco sobre los caminos moleculares y biolgicos que se suceden en la integracin de un ADN inyectado. Por ejemplo, no se conoce exactamente cuando se lleva a cabo la integracin y si sta permanece estable en todas las clulas durante el desarrollo posterior del embrin. En ensayos de evaluacin de animales nacidos transgnicos y especialmente en aquellos de produccin de descendencia transgnica se ha observado que a pesar de la inyeccin del ADN, en el proncleo embrionario pueden originarse mosaicos.
Mosaicos son animales originados por diferentes lneas, que provienen de un cigoto pero que poseen diferentes genotipos. Mosaicos transgnicos poseen clulas que contienen el transgen y otras que no lo tienen. Ello puede conducir a problemas en la formacin de descendencia transgnica cuando en las clulas gonadales de los progenitores no est presente el transgen. Segn las experiencias obtenidas se puede esperar que aproximadamente 30% de los animales receptores primarios del gen (por medio de microinyeccin) son mosaicos y que no transmitirn el transgen a su descendencia en la frecuencia esperada de 50%.
Brem & col. Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 162 La herencia de animales transgnicos, en los cuales la estructura gnica inyectada se integr en forma estable y se transmite a la descendencia, responde a las leyes mendelianas, dado que en general la integracin del gen se produce en un solo lugar en un cromosoma. De acuerdo a la definicin se describe a este tipo de animales como transgnicos heterocigotas. Sin embargo este trmino no es el adecuado, dado que falta el alelo correspondiente al transgnico en el cromosoma homlogo. Como es de esperar, 50% de la descendencia debe poseer el transgen. Sin embargo, si las gnadas son mosaicos de lneas transgnicas y no transgnicas, el porcentaje de descendencia transgnica variar entre 0-50% de acuerdo a la participacin cuantitativa de ambas lneas celulares. Los mosaicos se originan slo en la generacin F0. Los animales transgnicos de la generacin F1 y posteriores poseen, si son positivos, la estructura gnica en todas las partes del cuerpo y clulas de la hilera germinal. Se ha observado, no obstante, que la integracin no siempre permanece estable a travs de las generaciones.
La observacin de que un transgen no permanece estable sino que puede perderse no fue aclarada en forma suficiente. An ms frecuente que la inestabilidad de la integracin es la gran variabilidad de la expresin del transgen, de forma tal, que en el curso de las generaciones, se presentan todas las formas posibles de variacin: aumento, disminucin o ausencia de expresin. An dentro de grupos de hermanos enteros se observ variabilidad de la expresin del transgen entre animales positivos. Las razones para ello no han sido aclaradas, seguramente desempea el fenmeno conocido como "imprinting" un rol de importancia. A travs de la diferente metilacin, la expresin de un gen depende de su origen materno o paterno.
La comprobacin de varios lugares de integracin en el genoma de animales transgnicos ocurre con relativa poca frecuencia. Si los lugares de integracin estn tan alejados entre s, que pueden conducir a recombinaciones al azar, pueden originarse ms de 50% de descendencia transgnica. De un animal transgnico con dos tipos de integracin independientes puede esperarse que el 75% de la descendencia hereden el transgen, 25% recibir uno de ambos transgenes y otro 25% ambos tipos en su genoma. El 25% restante no ser transgnico. A travs del apareamiento de animales transgnicos heterocigotas se obtiene, en casos normales, 50% de transgenes heterocigotas, 25% de homocigotas y 25% de negativos.
El azar de la integracin gnica en los animales transgnicos primarios (F0) puede conducir a la integracin en el sector de un gen de importancia para el desarrollo del feto. Mientras un alelo intacto en el cromosoma homlogo de animales heterocigotas est presente, no se producen problemas como consecuencia de esa mutacin por insercin. Una excepcin la constituyen posiblemente los efectos gnico-aditivos, cuya integracin en un lugar gnico determinado tienen como consecuencia una reducida expresin de la caracterstica endgena aditiva. Del apareamiento de animales heterocigotas que tienen una mutacin de insercin no es posible obtener descendencia transgnica homocigota. Si el gen afectado por la mutacin de insercin es esencial para el desarrollo del feto no nacern animales transgnicos homocigotas. Antes de la reproduccin de animales transgnicos debe evaluarse si los animales son libres de mutaciones de insercin, a fin de evitar un aumento de la carga letal. Dichas mutaciones de insercin pueden ser interesantes en investigacin bsica.
Para la produccin animal la aparicin de mosaicos y mutantes de insercin tiene como consecuencia que para la introduccin de un gen determinado en una poblacin, un solo animal transgnico no es suficiente. Independientemente de la alta tasa de consanguinidad que se pueda generar, las posibilidades de producir una lnea transgnica con un solo animal son reducidas.
Para que una lnea transgnica pueda tener xito y aplicacin en la prctica deberan cumplir las siguientes condiciones:
- Transmisin estable del transgen a la descendencia. Animales transgnicos Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 163 - Ausencia de mutaciones de insercin y la posibilidad de producir animales transgnicos homocigotas. - Expresin estable del transgen y efecto biolgico positivo sobre la caracterstica deseada.
De ello se desprende que se deben producir como mnimo 5-10 animales transgnicos primarios (F0) para producir, con una probabilidad suficientemente alta, lneas que respondan a las exigencias establecidas.
Programa de transferencia gnica en el bovino
Despus que se inform por primera vez, en el ao 1985 (HAMMER y col., 1985; BREM y col., 1985), sobre la exitosa aplicacin de la transferencia gnica en los animales domsticos (cerdo, oveja, conejo) se intensificaron los esfuerzos en los aos siguientes para mejorar la metodologa y los genes. Mientras que la tasa de integracin no aument sensiblemente, en algunos ensayos se pudo mejorar la expresin a travs del empleo de genes optimizados. La eficacia de un programa de transferencia gnica depende de una serie de factores, como la habilidad en la manipulacin embrionaria, el tipo y duracin del cultivo in vitro, la calidad de la transferencia de los embriones, la edad de las receptoras empleadas y la sincronicidad entre donantes y receptoras.
El esquema de desarrollo de un programa de transferencia gnica se inicia con la seleccin, estimulacin e inseminacin (natural o artificial) de las donantes (fig. 1). La obtencin de los cigotos se lleva a cabo por medio de la matanza o ciruga de las donantes, 75-97 h despus del celo. Los embriones son centrifugados para exponer los proncleos (WALL, 1985). J unto con embriones de una clula se emplean para la inyeccin tambin embriones con 2 blastmeros. Una forma alternativa para la obtencin de embriones para la microinyeccin de ADN en el bovino es la produccin in vitro de embriones (ver captulo XI).
En la actualidad este mtodo biotecnolgico desplaza a la obtencin in vivo de los embriones. La produccin y el cultivo in vitro presentan las ventajas de ser ms econmicos, se evita la intervencin quirrgica de las donantes y receptoras como as tambin de los animales empleados para el cultivo temporal. Otra ventaja de la produccin in vitro es la posibilidad de determinar el estadio del proncleo con mayor precisin. Ello permite la inyeccin de un mayor nmero de embriones. Despus de la microinyeccin los embriones se cultivan in vitro o in vivo en el oviducto de receptoras temporales. La desventaja del ltimo mtodo se basa en las reducidas tasas de recuperacin de los embriones como as tambin en su trabajosa ejecucin. Los problemas de falta de desarrollo de los embriones producidos in vitro, a partir de los estadios de 8 y 12 clulas, pudieron resolverse con la aplicacin del cocultivo de los embriones con clulas de la granulosa y del oviducto. Los embriones microinyectados son transferidos en los das 6-7 de desarrollo, momento en que alcanzan los estadios de mrula o blastocisto, en forma no quirrgica a receptoras sincronizadas.
LOHSE y col. (1985) informaron sobre el primer ensayo de transferencia gnica en el bovino. Los autores inyectaron en ovocitos fertilizados una estructura gnica TQ (timidin quinasa) y demostraron que 30% de los embriones indicaban una actividad TQ de 2 desviaciones estndar por encima de los controles. LOSKUTOFF y col. (1986) lograron 3 preeces de la transferencia de 43 cigotos y 17 embriones de dos blastmeros inyectados. En otro estudio McEVOY y col. (1990) obtuvieron 569 ovocitos de 52 vaquillonas superovuladas (5,1 embriones de una y dos clulas por cada donante) por medio de laparotoma en la lnea media. Los proncleos fueron observados en 71% de los casos despus de 3 min y 81% despus de 5 min de centrifugacin a 13000 g, 62 y 60% de ellos se desarrollaron 24h despus del cultivo. Como consecuencia de la microinyeccin degeneraron 20% de los cigotos. Embriones de una y dos clulas (n =108) fueron transferidos a 46 receptoras. Al da 55 fueron detectadas 20 hembras (43%) con 32 fetos, 17 de las cuales parieron (37%). Uno de los 27 terneros nacidos fue transgnico. La tasa de sobrevivencia de los embriones de uno y dos blastmeros Brem & col. Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 164 fue de 22 a 36%. CHURCH y col. (1986) informaron que se desarrollaron 111 embriones de 852 cigotos bovinos inyectados con el gen de la fetoprotena alfa, de los cuales se identificaron 4 que integraron el gen. Despus de la inyeccin de 1161 cigotos con 3 diferentes estructuras gnicas y la transferencia de 641 (55%) la tasa de nacimiento fue de 10,5% (126) frente a 43% del grupo control. De los 126 embriones inyectados y transferidos integraron el ADN 7 terneros. BIERY y col. (1988) informaron sobre la tasa de deteccin de los proncleos despus de la centrifugacin de 1325 cigotos a 15000 g durante 4 min. Despus de la microinyeccin y el cultivo in vivo en oviducto de oveja durante 6 das, se recuperaron 84% de los embriones, de los cuales 21% se desarrollaron hasta los estadios de mrula y blastocisto.
La integracin del ADN se registr en 4 fetos. ROSCHLAU y col. (1988) obtuvieron, luego de la castracin de las donantes, 513 cigotos de oviductos que fueron inyectados con 3 diferentes estructuras gnicas virales. En 14 de 44 embriones, de dos semanas de edad, fue posible comprobar la presencia del ADN; 5 embriones exprimieron el gen. De la transferencia de 43 embriones a 23 receptoras resultaron 14 preeces y nacimientos. La integracin del ADN bGH inyectado se comprob en 1 ternero. En ensayos propios (REICHENBACH, 1989) se compararon diferentes sistemas de cultivo in vivo con cultivos in vitro. Las tasas de desarrollo obtenidas se detallan en la tabla 2. De ello se concluye que de las 3 especies obtenidas, el cerdo fue menos y el conejo fue el ms adecuado para el cultivo de los cigotos. Lo destacable de este estudio fue que los sistemas de cultivo in vitro empleados (BERG y BREM, 1989) fueron comparables a los mejores resultados obtenidos in vitro, considerando los embriones cultivados y los transferidos.
Tabla 2: Tasas de recuperacin y desarrollo de los cigotos y embriones cultivados in vivo e in vitro despus de la inyeccin gnica (REICHENBACH, 1989)
Mi =Microinyectados K =no microinyectados (controles)
Tres grupos de trabajo: en Texas (U.S.A, MASSEY, 1990), en Leiden (Holanda, KRIMPENFORT y col., 1990) y en Munich (Repblica Federal de Alemania) publicaron el empleo exitoso de los embriones bovinos producidos in vitro hasta el nacimiento de terneros (tabla 3). Los primeros terneros transgnicos, producidos con el empleo de embriones producidos in vitro, nacieron en 1991 (KRIMPENFORT y col., 1991). Como se seala en la tabla 3, 1% de los ovocitos recolectados culmina en terneros despus de la fertilizacin, microinyeccin, cultivo y transferencia de los embriones tratados. A pesar de ello las ventajas de la produccin in vitro de embriones superan al sistema de produccin in Embriones transferidos de 1 y 2 clulas
Embriones Recuperados Embriones desarrollados
>1 divisin mrulas/blastocistos celular
Cultivo temporal (a) n (b) n (b/a) % (c) n (c/b) % (d) n (d/b) % (d/a) % in vivo vaca 8 Mi 3 K 183 66 93 48 51 73 24 27 26 56 17 14 18 29 9 21 in vivo cerda 3 Mi 1 K 79 29 22 12 28 41 7 5 7 5 3 2 14 17 4 7 in vivo coneja 4 Mi 2 K 82 41 46 31 56 76 28 21 28 21 13 14 28 45 16 34 in vitro 5 Mi 4 K 123 71 123 71 100 100 63 43 63 43 18 21 15 30 15 30 Animales transgnicos Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 165 vivo. En el futuro la produccin de animales transgnicos se desarrollar, con seguridad, apoyada en la produccin in vitro de los embriones, porque se considera que la eficacia de las diferentes etapas mejorar en los prximos aos.
Tabla 3: Microinyeccin de ADN en embriones producidos in vitro segn diferentes autores
Texas, USA MASSEY, 1990 Leiden, Holanda KIMPENFORT y col., 1991 Munich, Alemania resultados propios, 1989, 1991/92 Pasos n % n % n % Maduracin de los ovocitos
2408
-
2297
-
686
- Microinyeccin de los ovocitos
858
36
1154
50
496
72 Embriones transferidos
49
6
129
11
60
12 Gestaciones/ Terneros
12
24
21*
21
12
26 * 2 terneros transgnicos
Dado que las receptoras significan el mayor costo de un programa de transferencia gnica, empleando la produccin in vitro de embriones, se trabaja intensamente en el diagnstico de la integracin del gen ya sea durante la gestacin (a travs de la recoleccin y anlisis de las clulas embrionarias) o, mejor an, en los embriones de 6-7 das de edad, por medio del diagnstico de PCR (captulo XV).
Foto 1: Microinyeccin de ADN en el proncleo de un cigoto de ratn
Brem & col. Biotecnologa de la Reproduccin www.reprobiotec.com 166 Bibliografa
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El Estudio de Las Interacciones de Proteínas en Células Vivas Es de Particular Importancia Porque Las Interacciones Que Ocurren en Una Célula Particular Dependen Del Complemento Completo de Las Proteínas Presentes en La Cé