69 Volumen 31 No. 2 Abril-Junio 2006. p.

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edigraphic.com
Artculo de revisin
Biologa molecular
Deteccin e identificacin de bacterias causantes
de enfermedades transmitidas por alimentos mediante
la reaccin en cadena de la polimerasa
Rafael Antoni o Rojas-Herrera, Tani a Gonzl ez-Fl ores*
* Unidad Sureste. Centro de Investigacin y Asistencia en Tecnologa y Diseo del Estado de Jalisco, A. C. Av. Normalistas 800 S.H.
Colinas de la Normal. Guadalajara, Jalisco, Mxico.
Correspondencia:
Dr. Rafael Antonio Rojas-Herrera. Unidad Sureste. Calle 30 Nm. 151 x 7 y 7-A. Colonia Garca Giners. Mrida, Yucatn, Mxico.
97070. e-mail: rrojas@ ciatej.net.mx
Recibido: 02-06-2005
Aceptado: 07-02-2006
RESUMEN
La l ucha contr a l os mi cr oor gani smos patgenos, causantes
de enfer medades tr ansmi ti das por al i mentos (ETA) r equi er e
de pr ocedi mi entos adecuados de i nspecci n sani tar i a, l o que
ha l l evado al desar r ol l o de mtodos cada vez ms r pi dos y
efecti vos par a l a detecci n e i denti fi caci n de bacter i as noci -
vas en l as r eas en l as que l a segur i dad bi ol gi ca es de mu-
cha i mpor tanci a. Las tcni cas de i denti fi caci n basadas en
el cul ti vo y l as car acter sti cas fenot pi cas de l as bacter i as
son l abor i osas y pueden r equer i r var i as semanas par a obte-
ner r esul tados, l o cual no r esul ta vi abl e cuando se anal i zan
al i mentos per eceder os como l os l cteos y l a car ne fr esca. La
apl i caci n de mtodos de detecci n i ndependi entes de cul ti -
vo, como l a r eacci n en cadena de l a pol i mer asa (PCR) pue-
de ayudar a r esol ver l os pr obl emas antes menci onados, aun
cuando es necesar i o que estos mtodos cuenten con una va-
l i daci n i nter naci onal . En el pr esente tr abajo se r evi sa l a
uti l i dad, ventajas y desventajas de l a PCR como her r ami en-
ta par a l a detecci n e i denti fi caci n de bacter i as patgenas
en muestr as de al i mentos, as como l as nuevas tendenci as
en el uso de estas her r ami entas mol ecul ar es de di agnsti co
y l os esfuer zos actual es tendi entes a su estandar i zaci n i n-
ter naci onal .
Palabras clave: PCR, detecci n, bacter i as patgenas, al i -
mentos.
INTRODUCCIN
Las bacteri as pueden ocasi onar enormes prdi das eco-
nmi cas no sl o por que deter i or an l os pr oductos al i -
menti ci os, si no que, adems, al gunas patgenas r e-
ABSTRACT
Struggle agai nst food-borne pathogeni c mi croorgani sms
i s based on plausi ble poli ci es for sani tary i nspecti on, thus
leadi ng to the development of faster and more effecti ve
methods for detecti ng and i denti fyi ng hazardous bacteri a
i n those areas where bi ologi cal hazard pose a securi ty
problem. I denti fi cati on techni ques based on culture me-
thods and phenotypic characteristics of bacteria are tedious
and can overtake weeks, maki ng them unpracti cal for ana-
lyzi ng peri shable foodstuff such as dai ry, meat, poultry
and fi sh. The appli cati on of culture-i ndependent methods
such as the polymerase chai n reacti on (PCR) can help to
solve thi s problem. Current efforts are ai med to the esta-
bli shment of international standards for the application of
PCR-based methods for the detecti on of pathogeni c bacte-
ri a i n foods. I n thi s paper, the usefulness and advantages/
di sadvantages of PCR as a tool for the i denti fi cati on of
pathogeni c bacteri a i n foodstuff, as well as the new trends
of i ts appli cati on and current efforts toward i nternati onal
standardi zati on of protocols are revi ewed.
Key wor ds: PCR, detecti on, pathogeni c bacteri a, food.
sul tan extremadamente di f ci l es de el i mi nar de l os al i -
mentos, l o que or i gi na di ver sas enfer medades en l os
consumi dores.
Una de l as pri nci pal es fuentes de contagi o con bac-
teri as patgenas es el consumo de al i mentos contami -
Rafael Antonio Rojas-Herrera y col. MG
70 Bioquimia
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nados, entre l os que se pueden menci onar pescados y
mar i scos,
1-4
pr oductos cr ni cos y av col as, pr oductos
l cteos, vegetal es,
5
huevos frescos
6
e i ncl uso l a mi el de
abeja.
7
Se ha demostrado que l os al i mentos se pueden
contami nar durante su procesami ento o por el empl eo
de materi a pri ma contami nada pues al gunas de estas
bacteri as consti tuyen parte de l a fl ora normal de aves,
cer dos y ganado. Tambi n se ha suger i do l a posi bi l i -
dad de contami naci n en al i mentos deshi dratados, de-
bi do a un manejo domsti co i nadecuado.
8
Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA)
conti nan si endo una amenaza a l a sal ud pbl i ca en
todo el mundo y son una causa i mpor tante de mor bi -
l i dad. Aunque l a mayor a son l eves y se asoci an a s n-
tomas gastr oi ntesti nal es agudos tal es como di ar r ea y
vmi to, en al gunas ocasi ones l a ETA es mucho ms
sever a y pel i gr osa par a l a vi da, especi al mente en ni -
os, y l a i nfecci n puede ocasi onar enfer medades cr -
ni cas.
5
En el pr esente tr abajo se r evi sa l a uti l i dad, venta-
jas y desventajas de l a PCR como her r ami enta par a
l a detecci n e i denti fi caci n de bacter i as patgenas
en muestr as de al i mentos, as como l as nuevas ten-
denci as en el uso de estas her r ami entas mol ecul ar es
de di agnsti co y l os esfuer zos actual es tendi entes a
su estandar i zaci n i nter naci onal .
ETIOLOGA DE LAS ETA
En aos r eci entes, l a eti ol og a de l as ETA ha cam-
bi ado, a l a vez han sur gi do patgenos nuevos o cepas
ms agr esi vas y r esi stentes a l os anti bi ti cos. Entr e
l as enfermedades que son catal ogadas como emergen-
tes se i ncl uyen l a ocasi onada por Escherichia coli en-
ter ohemor r gi ca (par ti cul ar mente el ser ovar
O157:H7), Campylobacter jejuni y Salmonella typhi-
murium del ti po defi ni ti vo (DT) 104.
5
Las bacter i as
ms fr ecuentemente asoci adas a casos de i nfecci ones
por consumo de al i mentos contami nados apar ecen
enl i stadas en el cuadro I . La par ti ci paci n de E. coli
en l as enfer medades humanas ha si do r econoci da
pr cti camente desde su descubr i mi ento. En aos r e-
ci entes l a i ndustr i a de al i mentos ha r eenfocado su
atenci n sobr e este mi cr oor gani smo como una causa
de mor bi l i dad y mor tal i dad si gni fi cati va y r econoce
su val or como un i ndi cador del estado hi gi ni co de
muchos ti pos de al i mentos. Por esa r azn, E. coli es
uno de l os patgenos que mayor atenci n han r eci bi -
do y haci a l as cual es se ha di r i gi do l a mayor par te de
l as i nvesti gaci ones.
La cepa de E. coli pr oductor a de l a toxi na Shi ga
(STEC), tambi n conoci da como E. coli ver otoxi gni -
ca, fue descubi er ta a fi nal es de l os aos 70 en Cana-
d. Por otra parte, l a cepa enterohemorrgi ca (EHEC)
O157:H7 se ai sl por pr i mer a vez en 1975 y se i denti -
fi c en 1982 como un patgeno i mpor tante pr esente
en l os al i mentos.
9
Estas bacter i as, adems de l as ci to-
toxi nas, pueden pr oduci r otr os factor es vi r ul entos
como l a i nti mi na, l a hemol i si na y pr ote nas asoci a-
das a l a vi r ul enci a.
10,11
De acuer do al Ser vi ci o de I nspecci n y Segur i dad
Al i menti ci a (FSI S: Food Safety I nspection Service)
del Depar tamento de Agr i cul tur a de l os Estados Uni -
dos (USDA), l a pr esenci a de al menos 1 uni dad for -
mador a de col oni as (UFC) de E. coli O157:H7 en l a
car ne mol i da de r es consti tuye un factor de r i esgo
par a el consumi dor ,
12
l o que i mpl i ca entonces di spo-
ner de mtodos con ni vel es de sensi bi l i dad adecuados
a estas exi genci as.
Por otr a par te, este mi cr oor gani smo conti na
si endo un desaf o a l a segur i dad al i menti ci a debi do a
l a ampl i a di versi dad de ti pos dentro de l a especi e, que
van desde comensal es i nofensi vos hasta patgenos
humanos. Esta mi sma si tuaci n se obser va entr e l as
especi es del gner o Vibrio con al gunas cepas que son
uti l i zadas como pr obi ti cos en l a al i mentaci n de ca-
mar ones,
13
mi entr as que Vibrio cholerae es el agente
causal del cl er a que puede tr ansmi ti r se a l os huma-
nos por el consumo de pescado o mar i scos contami -
nados. En otr os gner os, como Bacillus
14
y Enteroc-
cocus,
15
tambi n se i ncl uyen bacter i as ti l es en l a
pr oducci n de al i mentos y patogni cas par a l os ser es
humanos.
DETECCIN DE PATGENOS
EN ALIMENTOS
La detecci n y l a enumeraci n de mi croorgani smos en
al i mentos o en superfi ci es que ti enen contacto con al i -
mentos consti tuyen una parte i mportante de cual qui er
esquema de control de cal i dad. Debi do a esto es nece-
sari o i mpl ementar tcni cas de detecci n para efectuar
l a vi gi l anci a y el control de di chos mi croorgani smos y
preveni r l as enfermedades que stos producen. El esta-
bl eci mi ento de medi das de control apropi adas requi ere
de mtodos confi abl es de di ferenci aci n entre bacteri as
patgenas y no patgenas, as como de bacter i as ubi -
cuas pr esentes en el suel o, el agua y el tr acto gastr o-
i ntesti nal ,
16
l o cual i mpl i ca que deben ser r pi dos y
sensi bl es pero sobre todo al tamente espec fi cos.
El i nter s gener al en l os mtodos al ter nati vos de
detecci n y/o cuanti fi caci n de mi cr oor gani smos ha
si do esti mul ado en par te por el i ncr emento en l a pr o-
ducci n de al i mentos y por l a apl i caci n de pr ocedi -
Deteccin e identificacin de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
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mi entos de anl i si s de r i esgos e i denti fi caci n y con-
tr ol de puntos cr ti cos (ARI CPC) por par te de l as em-
pr esas pr oductor as.
17
Los avances en l a i nstr umentaci n e i mpl ementa-
ci n de l os descubr i mi entos de l a bi oqu mi ca y l a bi o-
l og a mol ecul ar per mi ten uti l i zar l a i nfor maci n ge-
nti ca de l os mi cr oor gani smos como her r ami entas de
i denti fi caci n y cuanti fi caci n de aqul l os de i nter s
par a el hombr e. Entr e estos mtodos destacan l a r e-
acci n en cadena de l a pol i mer asa (PCR).
La i nvenci n de l a r eacci n en cadena de l a pol i -
merasa
18
permi te l a ampl i fi caci n sel ecti va de secuen-
ci as espec fi cas de ADN que se encuentr an en canti -
dades muy pequeas. Como su nombr e i ndi ca, se
Cuadro I. Al gunos pr otocol os basados en l a r eacci n en cadena de l a pol i mer asa desar r ol l ados par a l a detecci n e i denti fi caci n
de bacter i as patgenas en al i mentos.
Tr astor no que Posi bl e pr oducto Mtodo
Mi cr oor gani smo ocasi ona por tador uti l i zado Secuenci a bl anco Refer enci a
Arcobacter spp. Di ar r ea, bacter emi a Car ne de aves ERI C-PCR, Genes
RAPD-PCR 16S y 23S. 50
Baci llus cereus Di ar r ea, vmi tos Ar r oz, especi as, PCR si mpl e Gen gyr B (gi r asa),
pr oductos l cteos y enter otoxi nas y
cr ni cos hemol i si na. 35
Campyl obacter Di ar r ea Car ne de aves, cer do PCR ml ti pl e, Genes hi pO, glyA y 51,52
spp. y r es, l eche cr uda PCR semi -ani dado sapB2, fla.
Cl ostri di um Botul i smo, Pescado, mi el , PCR-ELI SA, Regi ones de l os genes
botul i num vmi tos al i mentos enl atados PCR si mpl e bont (codi fi can par a l as 3,4,7
neur otoxi nas botul ni cas).
Cl ostri di um Di ar r ea, dol or Car ne de r es y aves, PCR dpl ex Gen de l a enter otoxi na y 41
perfri ngens abdomi nal sal sas de fosfol i pasa.
Escheri chi a Di ar r ea, col i ti s Car ne de r es y PCR ml ti pl e, Genes de toxi nas 9,10,31,53-57
col i hemor r gi ca, pr oductos l cteos H-CM-PCR, Shi ga, shi ga-l i ke y
s ndr ome PCR-TR, RT-PCR, ver otoxi gni ca, ui dA
hemol ti co-ur mi co QC-PCR (!-gl ucur oni dasa),
factor es de vi r ul enci a,
genes del oper n rfb.
Li steri a spp. Li ster i osi s Pat, l eche, queso PCR ml ti pl e, Detecci n de factor es de 58-60,42
suave, car ne, PCR - DGGE, vi r ul enci a (gen iap,
mar i scos, RT-PCR, PCR hly, i nlB, plcA, etc.)
ensal ada de col si mpl e, PCR-TR o de pr ote nas de enl ace
(gen fbp).
Salmonella spp. Gastr oenter i ti s Car ne de r es y aves, PCR si mpl e genes 16S y 23S, 61,42
l eche, huevos cr udos genes que codi fi can
par a l as fi mbr i as.
Shi gella spp. Di senter a baci l ar , Mayonesa, vegetal es PCR combi nado gen vi r A. 62,42
fi ebr e, cal ambr es cr udos, l eche, aves, con hi br i di zaci n
pr oductos l cteos de ADN,
PCR si mpl e
Staphyl ococcus I ntoxi caci n Leche cr uda PCR ml ti pl e-ELI SA, Genes que codi fi can 63-66
aureus estafi l occi ca PCR ml ti pl e par a toxi nas pi r ogni cas.
Vi bri o cholerae Cl er a Ostr as cr udas, PCR-TR Secuenci a de hemol i si na 67
pescado no cl si ca (hlyA),
pr ote nas de membr ana
(OmpW).
Yersi ni a Yersi noi si s Leche o agua PCR-TR Regi ones del gen de 68
enterocol ti ca contami nada, tofu, i nvasi n ai l.
canal es de cer do
Abr evi atur as:
ERI C = Enterobacterial RepetitiveI ntergenic Consensus
PCR-TR = PCR en tiempo real
RAPD = Random Amplified Polymorphic DNA
H-CM-PCR = Hibridacin-captura magntica-PCR
QC-PCR = PCR competi ti vo cuanti tati vo
RT-PCR = PCR transcriptasa reversa
DGGE = Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
Rafael Antonio Rojas-Herrera y col. MG
72 Bioquimia
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:rop odarobale FDP
VC ed AS, cidemihparG
arap
acidmoiB arutaretiL :cihpargideM
sustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
basa en l a acti vi dad de l a enzi ma ADN pol i mer asa
que es capaz de si nteti zar una cadena de ADN com-
pl ementar i a a otr a ya exi stente. El mtodo de PCR
uti l i za dos secuenci as cor tas de ol i gonucl eti dos l l a-
madas i ni ci ador es o cebador es que son compl ementa-
r i os a l os extr emos de l a r egi n de ADN que se pr e-
tende ampl i fi car . Dado que en cada r eacci n ambas
cadenas de ADN pueden ser vi r de mol de par a l a s n-
tesi s de su cadena compl ementar i a, el nmer o de
eventos de r epl i caci n est dado por l a expr esi n 2
n
,
donde n es el nmer o de ci cl os de ampl i fi caci n. Pue-
de notarse que despus de 20 ci cl os se tendrn ms de
un mi l l n de copi as del ADN or i gi nal . Una expl i ca-
ci n amena y detal l ada de l a PCR se puede encontr ar
en Ml l i s (1999).
19
Uno de l os factor es que l l evan al xi to en l a i mpl e-
mentaci n de l a PCR par a l a i denti fi caci n de mi cr o-
or gani smos patgenos es l a el ecci n cor r ecta de l a se-
cuenci a bl anco. Esta secuenci a debe per mi ti r l a
i denti fi caci n del mi croorgani smo de i nters i ndepen-
di entemente de l a pr esenci a de otr as fuentes de ADN
(de mi cr oor gani smos concomi tantes o de l a muestr a
mi sma). Las di fer enci as en l a secuenci a de genes or -
tl ogos pueden ser vi r como her r ami enta ti l en l a ti -
pi fi caci n de di fer entes cepas y ser oti pos de una mi s-
ma especi e o de especi es cercanas fi l ogenti camente.
SELECCIN DE SECUENCIAS BLANCOS
Y DISEO DE CEBADORES
Las secuenci as ms empl eadas para el di seo de ceba-
dor es han si do l as r el aci onadas con l os genes que co-
di fi can par a toxi nas y pr ote nas anti gni cas espec fi -
cas (Cuadro I ).
Par a l a detecci n y di agnsti co de E. coli, l as se-
cuenci as bl anco por excel enci a han si do l os genes stx
1
y stx
2
que codi fi can par a l as dos var i antes de l a toxi -
na Shi ga, STX
1
y STX
2
r especti vamente. La STX
1
de
E. coli es i dnti ca a l a que pr oduce Shigella dysente-
riae mi entr as que l a homol og a entr e STX
1
y STX
2
es
de 56%.
20
Numer osos autor es r epor tan el uso de es-
tas secuenci as par a el di seo de cebador es espec fi cos
par a l a detecci n y di agnsti co de STEC, as como de
otr os genes que codi fi can par a pr ote nas de vi r ul en-
ci a accesor i as como l a eaeA (i nti mi na) y l a hlyA (he-
mol i si na).
11,21-25
El gen wzy (pol i mer asa) tambi n puede ser un
buen bl anco par a el di agnsti co de ser oti pos O de E.
coli, pues posee muy baja homol og a con l as secuen-
ci as deposi tadas en l as bases de datos, pudi ndose as
di fer enci ar l os ser oti pos O111, O157 y O113.
26,27
Otr as r egi ones del oper n rfb han si do usadas como
bl ancos par a el di seo de cebador es espec fi cos de l os
ser oti pos O111
28
y O157,
29-31
por menci onar al gunos
ejempl os. Los genes del oper n rfb tambi n son ti l es
par a l a i denti fi caci n y di fer enci aci n de l os ser ogr u-
pos A, B, C2 y D de Salmonella.
31
VENTAJ AS Y DESVENTAJ AS DE LA PCR
Las pr i nci pal es ventajas del uso de l a PCR en l a de-
tecci n e i denti fi caci n de bacter i as causantes de
ETA r adi ca en tr es aspectos fundamental es: su sensi -
bi l i dad, su especi fi ci dad y su capaci dad de pr ocesa-
mi ento de grandes canti dades de muestras.
Actual mente exi sten mtodos de PCR establ eci dos
par a l a detecci n de bacter i as espec fi cas que l ogr an
detectar ni vel es muy bajos de mi cr oor gani smos, por
ejempl o, para E. coli se ha reportado l a uti l i zaci n de
medi os de enr i queci mi ento segui dos de PCR par a l a
detecci n de 1 UFC/g de carne de res (15 h de enri que-
ci mi ento)
9
y de hasta 3 UFC/25 g de carne mol i da des-
pus de un enri queci mi ento de 12 h.
10
Adi ci onal mente
estos mtodos i denti fi can mi cr oor gani smos que no
pueden ser estudi ados por tcni cas convenci onal es o
que no pueden cul ti varse en substratos arti fi ci al es.
32
Por otr a par te, l a PCR ml ti pl e desar r ol l ada por
Chamber l ai n y col s. (1988),
33
per mi te l a detecci n si -
mul tnea de di fer entes toxi nas y/o factor es de vi r u-
l enci a en una sol a r eacci n. Paton y Paton (1998)
21
desarrol l aron dos estrategi as de PCR ml ti pl e para l a
detecci n de stx
1
, stx
2
, eaeA y hlyA en un caso y par a
r egi ones del oper n rfb de E. coli O111 y O157 en el
otr o. Ambos ensayos fuer on efecti vos par a l a detec-
ci n di r ecta y car acter i zaci n de 52 cepas de STEC
(ser oti pos O), ai sl ados de heces humanas, ani mal es
domsti cos y al i mentos. La sensi bi l i dad de ambos en-
sayos fue de 10
3
UFC.
El descubr i mi ento de l as ADN pol i mer asas ter -
moestabl es
34
permi ti l a automati zaci n del proceso a
l a vez que redujo el ti empo de ejecuci n y permi ti un
aumento si gni fi cati vo en el nmer o de muestr as que
se pueden procesar.
El desar r ol l o de mtodos de detecci n que no r e-
qui er en de l a separ aci n de l os fr agmentos medi ante
el ectr ofor esi s ha per mi ti do un aumento consi der abl e
en l a capaci dad de pr ocesami ento de muestr as de l os
pr otocol os de PCR. Entr e estos mtodos se pueden
menci onar aqul l os acopl ados a detecci n con anti -
cuer pos (ELI SA-PCR) y el PCR en ti empo r eal .
Entr e l os factor es que l i mi tan l a apl i caci n de l a
PCR en l a i denti fi caci n de mi cr oor gani smos patge-
nos en muestr as de al i mentos destaca l a pr esenci a de
sustanci as que pueden ejer cer un efecto i nhi bi tor i o
Deteccin e identificacin de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
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sustradode-m.e.d.i.g.r.a.p.h.i.c
cihpargidemedodabor
sobr e l a r eacci n. La exi stenci a de tal es i nhi bi dor es
en muestr as de al i mentos, cl ni cas y ambi ental es ha
si do r epor tada por var i os autor es
4,7,35-38
y r evi sada por
Wi l son (1997)
39
y pueden actuar a di fer entes ni vel es
dur ante el pr oceso de extr acci n y ampl i fi caci n de
l os ci dos nucl ei cos y, eventual mente, conduci r a l a
obtenci n de fal sos negati vos,
40,41
por l o que se deben
tomar pr ecauci ones par a i mpedi r o l i mi tar su efecto
sobr e l a r eacci n.
42
Entr e l os muchos compuestos
i denti fi cados que ejer cen un efecto negati vo sobr e l a
PCR se pueden ci tar : l a hemogl obi na, l a l actofer r i -
na,
43
l os pol i sacr i dos, l as gr asas, pr ote nas y i ones
metl i cos presentes en l as matri ces al i menti ci as,
44
ade-
ms, al gunas sal es usadas comnmente en l os pr oto-
col os de extr acci n de ci dos nucl ei cos tambi n pue-
den i nhi bi r l a PCR
43
(ver Wi l son
39
para ms detal l es).
Si n embar go, aunque l os genes que codi fi can par a
l os factor es de vi r ul enci a de l as EHEC pueden ser de-
tectados por PCR con aceptabl e sensi bi l i dad, esto no
i mpl i ca que el factor de vi r ul enci a se expr ese. A este
r especto, Kudva y col s. (1997)
45
demostr ar on que no
todos l os ai sl ami entos stx posi ti vos er an capaces de
expr esar l a toxi na Shi ga, mi entr as que Kehl (2002)
20
ha seal ado que l a i nti mi na no es un factor de vi r u-
l enci a esenci al , l o que i mpl i ca que l a detecci n de ta-
l es secuenci as puede conduci r a r esul tados fal sos o
poco confi abl es.
Fi nal mente, el mtodo de extr acci n del ADN i n-
fl uye notabl emente en l a ejecuci n y sensi bi l i dad de
l a PCR. Por ejempl o, Cor nejo y col s. (1998),
46
demos-
tr ar on que con el ADN extr a do de muestr as de l e-
che, uti l i zando mtodos qu mi cos, se obti ene una me-
jor ampl i fi caci n que cuando el ADN se extr ae
uti l i zando mi cr oesfer as de vi dr i o. Esto i ndi ca cl ar a-
mente l a necesi dad de estandar i zar un mtodo de ex-
tr acci n de ci dos nucl ei cos consi der ando l a natur a-
l eza de l a muestra, para aumentar as l a confi abi l i dad
de l os r esul tados.
ESTANDARIZACIN Y VALIDACIN DE LOS
PROTOCOLOS BASADOS EN PCR
Aunque muchos l aboratori os de di agnsti co al rededor
del mundo han establ eci do mtodos de PCR para l a de-
tecci n de patgenos, exi sten al gunos parmetros que
pueden afectar l a efi ci enci a de l a reacci n, con l o que
l os resul tados de l as pruebas desarrol l adas o publ i ca-
das por al gn l aboratori o en ocasi ones pueden ser di f -
ci l es de reproduci r en otros l aboratori os. Por l o tanto,
para l a adopci n exi tosa de metodol og as de di agnsti -
co basadas en PCR es necesari o contar con pruebas de
val i daci n apropi adas y consensuadas.
En aos r eci entes se ha desar r ol l ado un pr oyecto
europeo denomi nado Food-PCR cuyo objeti vo es fa-
ci l i tar l a i mpl ementaci n de PCR para l a detecci n de
l os patgenos Campylobacter spp. ter mof l i co, E. coli
O157, Yersinia enterocoltica, Listeria monocytogenes
y Salmonella spp., medi ante l a val i daci n y estanda-
r i zaci n de l as metodol og as de PCR.
47
Se han r eal i zado al gunos i ntentos de val i daci n de
pruebas de PCR no comerci al es, por ejempl o, el grupo
di r i gi do por Lbeck (2003) eval u 17 cebador es y
tr es pol i mer asas par a l a detecci n de Campylobacter
en al i mentos y desar r ol l ar on un mtodo estandar i za-
do y espec fi co par a l a detecci n de tr es de l as cepas
de este mi cr oor gani smo ms fr ecuentemente ai sl adas
de l os al i mentos. Se estudi ar on 15 cebador es de l a se-
cuenci a de 16S r RNA y dos cebador es cuya r egi n
bl anco es el gen 23S r RNA, l os pr obar on contr a 150
cepas del patgeno y encontr ar on que el par OTI 559/
18-1 es sel ecti vo. Tambi n l l egar on a l a concl usi n
que l a enzi ma ms r esi stente a l os i nhi bi dor es pr e-
sentes en l a car ne de pol l o fue l a Tth.
48
Par a eval uar
l a r epr oduci bi l i dad del anl i si s de PCR desar r ol l ado
en el pr oyecto pr evi o, doce l abor ator i os par ti ci par on
en un ensayo de val i daci n y concl uyen que el PCR
di seado puede ser par te de l as bases de una her r a-
mi enta de bsqueda pr eci sa, estandar i zada y sl i da
par a l a deter mi naci n de cepas enter opatogni cas de
Campylobacter spp. en al i mentos.
49
Mal or ny y col s. (2003)
47
r eal i zar on l a val i daci n
de l a metodol og a de detecci n de Salmonella entr e
16 l abor ator i os eur opeos y encontr ar on que l os ce-
bador es ms efecti vos fuer on el 139-141, cuya se-
cuenci a bl anco es el gen invA. Se pr obar on 364 ce-
pas de Salmonella y se obtuvo una i ncl usi vi dad del
99.6% y una excl usi vi dad del 100%, por l o que des-
pus de este anl i si s exhausti vo, el gr upo de tr abajo
pr opone uti l i zar esta metodol og a como un estndar
i nter naci onal .
SITUACIN ACTUAL DEL USO DE LA PCR
Actual mente exi sten 3 fabr i cantes de estuches co-
mer ci al es basados en PCR par a l a detecci n de mi -
cr oor gani smos causantes de ETA.
17
El denomi nado
BAX

(Qual i con, USA) uti l i za r eacti vos en tabl etas

y un ter moci cl ador convenci onal . Las muestr as po-
si ti vas son vi sual i zadas como bandas en un gel de
el ectr ofor esi s. El si stema no r equi er e de l a extr ac-
ci n de ADN. La i ncl usi vi dad y l a excl usi vi dad del
si stema BAX

al canzan casi el 100%, si gni fi cando

que l as tasas de fal so posi ti vo y fal so negati vo son
casi cer o. Exi sten estuches de BAX

par a Salmone-
Rafael Antonio Rojas-Herrera y col. MG
74 Bioquimia
edigraphic.com
l l a, gner os de Li steri a, Li steri a monocytogenes y
E. coli O157:H7. Las pr uebas par a Salmonella y E.
coli han r eci bi do el Status of Performance Tested
del I nsti tuto de I nvesti gaci ones de l a Asoci aci n
Ofi ci al de Qu mi cos Anal ti cos (AOACRI , por sus
si gl as en i ngl s).
El segundo mtodo comer ci al di sponi bl e es el estu-
che Pr obel i a (Sanofi , Fr ance), el cual empl ea PCR
convenci onal segui do de un i nmunoensayo y un si s-
tema de detecci n col ori mtri ca, esta metodol og a si r-
ve par a l a detecci n de Salmonella y Listeria. El si s-
tema i ntenta el i mi nar l a contami naci n del pr oducto
de PCR al susti tui r ti mi na por ur aci l o dur ante el
protocol o de PCR.
El l ti mo es el TaqMan (Per ki n El mer , USA), el
cual usa un si stema novedoso de sondas e i ncor po-
r a el mar cador TaqMan que no es fl uor escente en
su for ma nati va per o l a acti vi dad exonucl easa de l a
ADN pol i mer asa l i ber a un pr oducto fl uor escente, el
cual es detectado y cuanti fi cado con un si stema es-
pec fi co de detecci n. Los estuches de TaqMan estn
di sponi bl es par a Salmonella y estn desar r ol l ndo-
se l os de Li steri a y E. coli O157; si n embar go, uno
de l os aspectos ms i nter esantes del TaqMan es su
potenci al par a cuanti fi car el mi cr oor gani smo de
i nter s.
CONCLUSIONES
Par a di smi nui r el r i esgo de i nfecci n por patgenos
se necesi ta un contr ol mi cr obi ol gi co estr i cto en l a
cadena de pr oducci n de al i mentos. La di sponi bi l i dad
de pr uebas confi abl es, r pi das e i nter naci onal mente
aceptadas par a l a deter mi naci n de mi cr oor gani smos
patgenos se ha vuel to i mpor tante par a l a i ndustr i a
al i menti ci a, as como par a l a r egul aci n de l a segur i -
dad al i menti ci a. La ampl i fi caci n del ADN medi ante
l a PCR par ece ser una her r ami enta poder osa en el
di agnsti co mi cr obi ol gi co.
El desar r ol l o de l os mtodos basados en el ADN
tanto par a l a detecci n e i denti fi caci n/car acter i za-
ci n de mi cr oor gani smos patgenos han pr opor ci ona-
do nuevas her r ami entas a l os mi cr obi l ogos de al i -
mentos y no hay duda que estas i nvesti gaci ones
pueden conti nuar pr opor ci onando mecani smos anal -
ti cos si gni fi cati vos que actual mente son di f ci l es de
i magi nar .
A pesar de que l a PCR est si endo apl i cada ampl i a-
mente en l a mayor a de l abor ator i os de i nvesti gaci n
y de que su uti l i dad como tcni ca de detecci n de pa-
tgenos en al i mentos ha si do demostr ada, todav a
exi sten r eser vas r especto a su apl i caci n en el anl i -
si s r uti nar i o de al i mentos. Su i ncor por aci n en el
sector de l a i ndustr i a al i menti ci a todav a r equi er e de
l a for maci n del per sonal tcni co y l a adaptaci n de
l os pr otocol os descr i tos en l a bi bl i ogr af a ci ent fi ca a
l a pr cti ca de un l abor ator i o de anl i si s.
REFERENCI AS
1. Auti o T, Hi el m S, Mi etti nen M, jber g A-M, Aar ni sal o K,
Bjr kr oth J, et al . Sour ces of Li steri a monocytogenes con-
tami nati on i n a col d-smoked r ai nbow tr out pr ocessi ng
pl ant detected by pul sed-fi el d gel el ectr ophor esi s typi ng.
Appl Envi ron Mi crobi ol 1999; 65: 150-155.
2. Venkateswar an K, Dohmoto N, Har ayama S. Cl oni ng and
nucl eoti de sequence of the gyrB gene of Vi bri o parahaemo-
lyti cus and i ts appl i cati on i n detecti on of thi s pathogen i n
shr i mp. Appl Envi ron Mi crobi ol 1998; 64: 681-687.
3. Hi el m S, Bjr kr oth J, Hyyti E, Kor keal a H. Pr eval ence of
Cl ostri di um botul i num i n fi nni sh tr out far ms: pul sed-
fi el d gel el ectr ophor esi s typi ng r eveal s extensi ve geneti c di -
ver si ty among type E i sol ates. Appl Envi ron Mi crobi ol
1998; 64: 4161-4167.
4. Fach P, Per el l e S, Di l asser F, Gr out J, Dar gai gnar atz C,
Botel l a L, et al . Detecti on by PCR-enzyme-l i nked i mmuno-
sor bent assay of Clostri di um botuli num i n fi sh and envi -
r onmental sampl es fr om a coastal ar ea i n nor ther n Fr an-
ce. Appl Envi ron Mi crobi ol 2002; 68: 5870-5876.
5. Bl ackbur n C, McCl ur e P. I ntr oducti on. En: Bl ackbur n, C y
McCl ur e, P. Foodborne pathogens. Hazards, ri sk analysi s
and control. Boca Raton, FL: CRC Pr ess; 2002: 3-12.
6. Agr on P, Wal k er R, Ki n de H, Sher i l yn J, Hayes D, Wo-
l l ar d J, et al . I den ti fi cati on by subtr acti ve h ybr i di za-
ti on of sequen ces speci fi c for Sal monel l a enteri ca se-
r ovar En ter i di ti s. Appl Envi ron Mi crobi ol 2002; 67:
4984-4991.
7. Nevas M, Hi el m S, Li ndstr m M, Hor n H, Koi vul ehto K,
Kor keal a H. Hi gh pr eval ence of Clostri di um botuli num
types A and B i n honey sampl es detected by pol ymer ase
chai n r eacti on. I nt J Food Mi crobi ol 2002; 72: 45-52.
8. Abushel ai bi A, Sofos J, Samel i s J, Kendal l P. Sur vi val and
gr owth of Salmonella i n r econsti tuted i nfant cer eal hydr a-
ted wi th water , mi l k or appl e jui ce and stor ed at 4C, 15C
and 25C. Food Mi crobi ol 2003; 20: 17-25.
9. Chen J, Johnson R, Gr i ffi ths M. Detecti on of ver otoxi geni c
Escheri chi a coli by magneti c captur e-hybr i di zati on PCR.
Appl Envi ron Mi crobi ol 1998; 64: 147-152.
10. Chen S, Xu R, Yee A, Wu H, Wang C, Read S, et al . An au-
tomated fl uor escent PCR method for detecti on of Shi ga
toxi n-pr oduci ng Escheri chi a coli i n foods. Appl Envi ron
Mi crobi ol 1998; 64: 4210-4116.
11. Fagan P, Hor ni tzky M, Bettel hei m K, Djor djevi c S. Detec-
ti on of Shi ga-l i ke toxi n (stx1 and stx2), i nti mi n (eaeA), and
enter ohemor r hagi c Escheri chi a coli (EHEC) hemol ysi n
(EHEC hlyA) genes i n ani mal feces by mul ti pl ex PCR.
Appl Envi ron Mi crobi ol 1999; 65: 868-872.
12. Johnson J, Br ooke C, Fr i tschel S. Compar i son of the BAX
for scr eeni ng E. coli O157:H7 method wi th conventi onal
methods for detecti on of extr emel y l ow l evel s of Escheri -
chi a coli O157:H7 i n gr ound beef. Appl Envi ron Mi crobi ol
1998; 64: 4390-4395.
13. Vandenber ghe J, Ver donck L, Robl es-Ar ozar ena R, Ri ver a
G, Bol l and A, Bal l adar es M, et al . Vi br i os associ ated wi th
Deteccin e identificacin de bacterias causantes de enfermedades transmitidas por alimentos
75 Volumen 31 No. 2 Abril-Junio 2006. p. 69-76
edigraphic.com
Li topenaeus vannamei l ar vae, postl ar vae, r oodstock, and
hatcher y pr obi onts. Appl Envi ron Mi crobi ol 1999; 65:
2592-2597.
14. Daffonchi o D, Bor i n S, Fr ova G, Gal l o R, Mor i E, Fani
R, et al . A r andoml y ampl i fi ed pol ymor phi c DNA mar ker
speci fi c for the Baci l l us cereus gr oup i s di agnosti c for
Baci l l us anthraci s. Appl Envi ron Mi crobi ol 1999; 65:
1298-1303.
15. Eaton T, Gasson M. Mol ecul ar scr eeni ng of Enterococcus
vi r ul ence deter mi nants and potenti al for geneti c exchange
between food and medi cal i sol ates. Appl Envi ron Mi cro-
bi ol 2001; 67: 1628-1635.
16. Coetsi er C, Vannuffel P, Bl ondeel N, Denef J, Coci to C,
Gal a J. Dupl ex PCR for di ffer enti al i denti fi cati on of Myco-
bacteri um bovi s, M. avi um, and M. avi um subsp. paratu-
berculosi s i n for mal i n- fi xed par affi n-embedded ti ssues
fr om cattl e. J Cli n Mi crobi ol 2000; 38: 3048-3054.
17. Betts R, Bl ackbur n C. Detecti ng pathogens i n food. I n:
Betts R y Bl ackbur n C. Foodborne pathogens: Hazards,
ri sk analysi s and control. Boca Raton, Fl .: CRC Pr ess;
2002: 13-52.
18. Sai ki R, Schar f S, Fal oona F, Mul l i s K, Hor n G, Er l i ch H,
et al . Enzymati c ampl i fi cati on of !-gl obi n genomi c sequen-
ces and r estr i cti on si te anal ysi s for di agnosi s of si ckl e cel l
anemi a. Sci ence 1985; 230: 1350-1354.
19. Mul l i s K. The unusual or i gi n of the pol ymer ase chai n r eac-
ti on. Sci Am 1999;36-43.
20. Kehl S. Rol e of the l abor ator y i n the di agnosi s of enter ohe-
mor r hagi c Escheri chi a coli i nfecti ons. J Cli n Mi crobi ol
2002; 40: 2711-2715.
21. Paton A, Paton J. Detecti on and char acter i zati on of shi ga
toxi geni c Escheri chi a coli by usi ng mul ti pl ex PCR assays
for stx1, stx2, eaeA, enter ohemor r hagi c E. coli hlyA,
rfbO111 and rfbO157. J Cli n Mi crobi ol 1998; 36: 598-602.
22. Rei schl U, Youssef M, Ki l wi nski J, Lehn N, Zhang W, Kar -
ch H, et al . Real -ti me fl uor escence PCR assays for detecti on
and char acter i zati on of shi ga toxi n, i nti mi n, and enter ohe-
mol ysi n genes fr om shi ga toxi n-pr oduci ng Escheri chi a
coli . J Cli n Mi crobi ol 2002; 40: 2555-2565.
23. Paton A, Paton J. Di r ect detecti on and char acter i zati on of
shi ga toxi geni c Escheri chi a col i by mul ti pl ex PCR for
stx1, stx2, eae, ehxA, and saa. J Cl i n Mi crobi ol 2002; 40:
271-274.
24. Wang G, Cl ar k C, Rodger s F. Detecti on i n Escheri chi a coli
of the genes encodi ng the major vi r ul ence factor s, the ge-
nes defi ni ng the O157:H7 ser otype, and components of the
type 2 Shi ga toxi n fami l y by mul ti pl ex PCR. J Cli n Mi cro-
bi ol 2002; 40: 3613-3619.
25. Nor manno G, Dambr osi o P, Quagl i a N, Montagna D,
Chi occo D, Cel ano G. Typi ng of Escheri chi a coli O157
str ai ns i sol ated fr om fr esh sausage. Food Mi crobi ol 2004;
21: 79-82.
26. Paton A, Paton J. Di r ect detecti on of shi ga toxi geni c Es-
cheri chi a coli str ai ns bel ongi ng to ser ogr oups O111,
O157, and O113 by mul ti pl ex PCR. J Cli n Mi crobi ol 1999;
37: 3362-3365.
27. Paton A, Paton J. Mol ecul ar char acter i zati on of the l ocus
encodi ng bi osynthesi s of the l i popol ysacchar i de O anti gen
of Escheri chi a coli Ser otype O113. I nfect I mmun 1999; 67:
5930-5937.
28. Wang L, Cur d H, Qu W, Reeves P. Sequenci ng of Escheri -
chi a coli O111 O-anti gen gene cl uster and i denti fi cati on of
O111-speci fi c genes. J Cli n Mi crobi ol 1998; 36: 3182-3187.
29. Desmar chel i er P, Bi l ge S, Fegan N, Mi l l s L, Var y J, Tar r P.
A PCR speci fi c for Escheri chi a coli O157 based on the rfb
l ocus encodi ng O157 l i popol ysacchar i de. J Cli n Mi crobi ol
1998; 36: 1801-1804.
30. Wang L, Reeves P. Or gani zati on of Escheri chi a coli O157
O anti gen gene cl uster and i denti fi cati on of i ts speci fi c ge-
nes. I nfect I mmun 1998; 66: 3545-3551.
31. Maur er J, Schmi dt D, Petr osko P, Snchez S, Bol ton L, Lee
M. Devel opment of pr i mer s to O-Anti gen bi osynthesi s ge-
nes for speci fi c detecti on of Escheri chi a coli O157 by PCR.
Appl Envi ron Mi crobi ol 1999; 65: 2954-2960.
32. Scheu P, Ber ghof K, Stahl U. Detecti on of pathogeni c and
spoi l age mi cr oor gani sms i n food wi th the pol ymer ase chai n
r eacti on. Food Mi crobi ol 1998; 15: 13-31.
33. Chamber l ai n J, Gi bbs R, Rai ner J, Nguyen P, Caskey C.
Del eti on scr eeni ng of the Duchenne muscul ar dystr ophy
l ocus vi a mul ti pl ex DNA ampl i fi cati on. Nuclei c Aci ds Res
1988; 16: 11141-11156.
34. Sai ki R, Gel fand D, Stoffel S, Schar f S, Hi guchi R, Hor n G, et
al . Pr i mer -di r ected enzymati c ampl i fi cati on of DNA wi th a
thermostabl e DNA pol ymerase. Science 1988; 239: 487-491.
35. Yamada S, Ohashi E, Agata N, Venkateswar an K. Cl oni ng
and nucl eoti de sequence anal ysi s of gyrB of Baci llus ce-
reus, B. thuri ngi ensi s, B. mycoi des, and B. anthraci s and
thei r appl i cati on to the detecti on of B. cereus i n r i ce. Appl
Envi ron Mi crobi ol 1999; 65: 1483-1490.
36. Shar ma V, Car l son S. Si mul taneous detecti on of Salmone-
lla str ai ns and Escheri chi a coli O157:H7 wi th fl uor ogeni c
PCR and si ngl e-enr i chment-br oth cul tur e. Appl Envi ron
Mi crobi ol 2000; 66: 5472-5476.
37. Li ndstr om M, Keto R, Mar kkul a A, Nevas M, Hi el m S, Kor -
keal a H. Mul ti pl ex PCR assay for detecti on and i denti fi ca-
ti on of Clostri di um botuli num Types A, B, E, and F i n
food and fecal mater i al . Appl Envi ron Mi crobi ol 2001; 67:
5694-5699.
38. Knutsson R, Lofstr om C, Gr age H, Hoor far J, Radstr om
P. Model i ng of 5' nucl ease r eal -ti me r esponses for opti mi za-
ti on of a hi gh-thr oughput enr i chment PCR pr ocedur e for
Salmonella enteri ca. J Cli n Mi crobi ol 2002; 40: 52-60.
39. Wi l son I . I nhi bi ti on and faci l i tati on of nucl ei c aci d ampl i fi -
cati on. Appl Envi ron Mi crobi ol 1997; 63: 3741-3751.
40. Gentr y-Weeks C, Hutcheson H, Ki m L, Bol te D, Tr aub-
Dar gatz J, Mor l ey P, et al . I denti fi cati on of two phyl ogene-
ti cal l y r el ated or gani sms fr om feces by PCR for detecti on
of Salmonella spp. J Cli n Mi crobi ol 2002; 40: 1487-1492.
41. Fach P, Popoff M. Detecti on of enter otoxi geni c Clostri -
di um perfri ngens i n food and fecal sampl es wi th a dupl ex
PCR and the sl i de l atex aggl uti nati on test. Appl Envi ron
Mi crobi ol 1997; 63: 4232-4236.
42. Lampel K, Or l andi P, Kor negay L. I mpr oved templ ate pr e-
par ati on for PCR-based assays for detecti on of food-bor ne
bacter i al pathogens. Appl Envi ron Mi crobi ol 2000; 66:
4539-4542.
43. Al -Soud W, Radstr om P. Pur i fi cati on and char acter i zati on
of PCR-i nhi bi tor y components i n bl ood cel l s. J Cli n Mi cro-
bi ol 2001; 39: 485-493.
44. Rossen L, Nor skov P, Hol mstr om K, Rasmussen O. I nhi bi -
ti on of PCR by components of food sampl es, mi cr obi ol ogi -
cal di agnosi s assays and DNA-extr acti on sol uti ons. J Food
Mi crobi ol 1992; 17: 37-45.
45. Kudva I , Hatfi el d P, Hovde C. Char acter i zati on of Escheri -
chi a coli O157:H7 and other Shi ga toxi n-pr oduci ng E. coli
ser otypes i sol ated fr om sheep. J Cli n Mi crobi ol 1997; 35:
892-899.
46. Cor nejo B, Sahn-Ru z A, Sur ez-Gemes F, Thor nton C,
Fi cht T, Adams L. Compar i son of C18-car boxypr opyl betai -
ne and gl ass bead DNA extr acti on methods for detecti on of
Rafael Antonio Rojas-Herrera y col. MG
76 Bioquimia
edigraphic.com
Mycobacteri um bovi s i n bovi ne mi l k sampl es and anal ysi s
of sampl es by PCR. Appl Envi ron Mi crobi ol 1998; 64:
3099-3101.
47. Mal or ny B, Hoor far J, Bunge C, Hel muth R. Mul ti center
val i dati on of the anal yti cal accur acy of Salmonella PCR:
Towar ds an i nter nati onal standar d. Appl Envi ron Mi cro-
bi ol 2003; 69: 290-296.
48. Lubeck P, Wol ffs P, On S, Ahr ens P, Radstr om P, Hoor far
J. Towar d an i nter nati onal standar d for PCR-based detec-
ti on of food-bor ne ther motol er ant campyl obacter s: Assay
devel opment and anal yti cal val i dati on. Appl Envi ron Mi -
crobi ol 2003; 69: 5664-5669.
49. Lubeck PS, Cook N, Wagner M, Fach P, Hoor far J. Towar d
an i nter nati onal standar d for PCR-based detecti on of
food-bor ne ther motol er ant campyl obacter s: Val i dati on i n a
mul ti center col l abor ati ve tr i al . Appl Envi ron Mi crobi ol
2003; 69: 5670-5672.
50. Houf K, De Zutter L, Van Hoof J, Vandamme P. Assess-
ment of the geneti c di ver si ty among ar cobacter s i sol ated
fr om poul tr y pr oducts by usi ng two PCR-based typi ng me-
thods. Appl Envi ron Mi crobi ol 2002; 68: 2172-2178.
51. Waage A, Var dund T, Lund V, Kapper ud G. Detecti on of
smal l number s of Campylobacter jejuni and Campylobac-
ter coli cel l s i n envi r onmental water , sewage, and food
sampl es by a semi nested PCR assay. Appl Envi ron Mi cro-
bi ol 1999; 65: 1636-1643.
52. Lai -Ki ng N, Bi n Ki ngombe C, Yan W, Tayl or D, Hi r atsuka
K, Mal i k N, et al . Speci fi c detecti on and confi r mati on of
Campylobacter jejuni by DNA hybr i di zati on and PCR.
Appl Envi ron Mi crobi ol 1997; 63: 4558-4563.
53. Venkateswar an K, Kami joh Y, Ohashi E, Nakani shi H. A
si mpl e fi l tr ati on techni que to detect enter ohemor r hagi c Es-
cheri chi a coli O157:H7 and i ts toxi ns i n beef by mul ti pl ex
PCR. Appl Envi ron Mi crobi ol 1997; 63: 4127-4131.
54. Lehmacher A, Mei er H, Al eksi c S, Bockemhl J. Detecti on
of hemol ysi n var i ants of shi ga toxi n-pr oduci ng Escheri -
chi a coli by PCR and cul tur e on vancomyci n-cefi xi me-cef-
sul odi n bl ood agar . Appl Envi ron Mi crobi ol 1998; 64:
2449-2453.
55. Ober st R, Hays M, Bohr a L, Phebus R, Yamashi r o C, Pas-
ko-Kol va C, et al . PCR-based DNA ampl i fi cati on and pr e-
sumpti ve detecti on of Escheri chi a coli O157:H7 wi th an
i nter nal fl uor ogeni c pr obe and the 5' nucl ease (TaqMan)
assay. Appl Envi ron Mi crobi ol 1998; 64: 3389-3396.
56. Li W, Dr ake M. Devel opment of a quanti tati ve competi ti ve
PCR assay for detecti on and quanti fi cati on of Escheri chi a
coli O157:H7 cel l s. Appl Envi ron Mi crobi ol 2001; 67:
3291-3294.
57. McI ngval e S, El hanafi D, Dr ake M. Opti mi zati on of r ever -
se tr anscr i ptase PCR to detect vi abl e Shi ga-toxi n-pr odu-
ci ng Escheri chi a col i . Appl Envi ron Mi crobi ol 2002; 68:
799-806.
58. Cocol i n L, Rantsi ou K, I acumi n L, Cantoni C, Comi G. Di -
r ect i denti fi cati on i n food sampl es of Li steri a spp. and Li s-
teri a monocytogenes by mol ecul ar methods. Appl Envi ron
Mi crobi ol 2002; 68: 6273-6282.
59. Nogva H, Rudi K, Nater stad K, Hol ck A, Li l l ehaug D.
Appl i cati on of 5'-nucl ease PCR for quanti tati ve detecti on of
Li steri a monocytogenes i n pur e cul tur es, water , ski m mi l k,
and unpasteur i zed whol e mi l k. Appl Envi ron Mi crobi ol
2000; 66: 4266-4271.
60. Kl ei n P, Juneja V. Sensi ti ve detecti on of vi abl e Li steri a
monocytogenes by r ever se tr anscr i pti on-PCR. Appl Envi -
ron Mi crobi ol 1997; 63: 4441-4448.
61. Cohen H, Mechanda S, Li n W. PCR ampl i fi cati on of the
fi mA gene sequence of Salmonella typhi muri um, a speci fi c
method for detecti on of Salmonella spp. Appl Envi ron Mi -
crobi ol 1996; 62: 4303-4308.
62. Vi l l al obo E, Tor r es A. PCR for detecti on of Shi gella spp. i n
mayonnai se. Appl Envi ron Mi crobi ol 1998; 64: 1242-1245.
63. Omoe K, I shi kawa M, Shi moda Y, Hu D, Ueda S, Shi na-
gawa K. Detecti on of seg, seh, and sei genes i n Staphylo-
coccus aureus i sol ates and deter mi nati on of the enter o-
toxi n pr oducti vi ti es of S. aureus i sol ates har bor i ng seg,
seh, or sei genes. J Cli n Mi crobi ol 2002; 40: 857-862.
64. Shar ma N, Rees C, Dodd C. Devel opment of a si ngl e-
r eacti on mul ti pl ex PCR toxi n typi ng assay for Staphyl o-
coccus aureus str ai ns. Appl Envi ron Mi crobi ol 2000;
66: 1347-1353.
65. Monday S, Bohach G. Use of mul ti pl ex PCR to detect cl as-
si cal and newl y descr i bed pyr ogeni c toxi n genes i n Sta-
phylococcal i sol ates. J Cli n Mi crobi ol 1999; 37: 3411-3414.
66. Becker K, Roth R, Peter s G. Rapi d and speci fi c detecti on of
toxi geni c Staphylococcus aureus: Use of two mul ti pl ex
PCR enzyme i mmunoassays for ampl i fi cati on and hybr i di -
zati on of staphyl ococcal enter otoxi n genes, exfol i ati ve toxi n
genes, and toxi c shock syndr ome toxi n 1 gene. J Cli n Mi -
crobi ol 1998; 36: 2548-2553.
67. Lyon W. TaqMan PCR for detecti on of Vi bri o cholerae O1,
O139, Non-O1, and Non-O139 i n pur e cul tur es, r aw oys-
ter s, and syntheti c seawater . Appl Envi ron Mi crobi ol
2001; 67: 4685-4693.
68. Jour dan A, Johnson S, Wesl ey I . Devel opment of a fl uor o-
geni c 5' nucl ease PCR assay for detecti on of the ai l gene of
pathogeni c Yersi ni a enterocoli ti ca. Appl Envi ron Mi cro-
bi ol 2000; 66: 3750-3755.