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mmCultura esferide como uma ferramenta para a criao de Tecidos complexos 3D

mtodos 3D de cultura de clulas confere um elevado grau de clnica e relevncia biolgica


para modelos in vitro. Isto especificamente o caso com a cultura esferide, onde um
pequeno agregado de clulas cresce livre de materiais estranhos em esferides culturas, as
clulas segregam na matriz extracelular (ECM) em que residem, e eles podem interagir com
clulas de seu microambiente originais. O valor de culturas esferides est aumentando
rapidamente devido a novos plataformas microfabricados passveis de alta-through put
rastreio (HTS) e avanos na cultura de clulas. Aqui, ns avaliar novas possibilidades que
combinam os pontos fortes de cultura esferide com nova fabricao microambiente mtodos
que permitem a criao de grandes nmeros de alta reprodutibilidade, tecidos complexos.

Esferide cultura em comparao com a cultura 2D No corpo, as clulas so normalmente
rodeada por uma ECM, ou esto em contacto fsico directo com as clulas a partir de qualquer
linhagens mesmos ou diferentes. No entanto, a maioria dos estudos em clulas biologia so
realizados utilizando as clulas de interesse no cultivadas cultura celular de poliestireno-
compatvel numa monocamada 2D.
Essa abordagem resulta em um bem controlada e homognea ambiente de clulas, facilita a
anlise microscpica e alteraes a mdio e sustenta a proliferao de clulas para a maioria
dos tipos de clulas. No entanto, esta no geralmente considerada o microambiente das
clulas naturais. Alternativamente, em Mtodos de cultura 3D, as clulas so cultivadas como
agregados [1], so cultivados em materiais de andaime 3D [2], ou so incorporados no geles de
[3]. Agregados tem muitos nomes diferentes; variando de mammosphere [4], de micromassa
[5], e esferides [6], aos tecidos microfabricados [7] .Ns preferem o termo esferide nesta
reviso para indicar clulas agregadas no (necessariamente constituindo uma forma esfrica
perfeita), que no aderem para qualquer substrato de cultura (por exemplo,
poliestireno). As clulas em um ambiente 3D comportar fundamentalmente diferente a partir
de clulas em cultura em monocamada. Por exemplo, tanto condrcitos articulares primrios,
bem como hepatcitos perdem rapidamente seu fentipo normal, uma vez retirado do o
corpo e colocado em cultura de clulas em 2D, mas esta perda pode ser atenuada ou mesmo
revertido pela metodologia de cultura 3D [8,9]. Alm disso, clulas do estroma mesenquimal
multipotentes MSC) -derived hepatcitos apoiar funes-chave como albumina e sntese de
uria, bem como amnia e drogas apuramento melhor em um ambiente 3D [10]. Muitos dos
as diferenas observadas entre 2D e cultura esferide (ver Glossrio) so devidas a diferencial
de clula-clula e clula-matriz interaces e, portanto, desempenham um papel importante
neste reviso. Por exemplo, modificando adeses clula-matriz em 3D por meio do
esgotamento de b1-integrina diminui esferide capacidade de formao de clulas de
adenocarcinoma de prstata PC3 em suspenso, enquanto isso no impedi-los de aderindo
cultura de tecidos de plstico [11]. Alm disso, a perda de condrcitos articular fentipo
tambm acompanhado por uma alterao na expresso de molculas de adeso celular [12].
Vrios mtodos de fabricao so utilizadas para criar esferides (ver Figura I na Caixa 1). Os
primeiros registros descrevem o mtodo de gota suspensa (ver Figura Ia, b na Caixa 1), onde
clulas agregam espontaneamente na parte inferior de uma gota depois invertendo a placa
com gotas de suspenso de clulas [13]. este tcnica freqentemente usada para gerar
corpos embriides de clulas-tronco embrionrias. Alternativamente, frascos rotativos
permitir agregao espontnea de clulas [14]. Uma outra tcnica, o tcnica esttica lquido de
cobertura (LOT), que suspensa .As clulas so cultivadas sobre um substrato no-aderentes,
faz com que as clulas se agregar em vez de aderir a uma superfcie de [15] (ver Figura Ia caixa
de entrada 1). Os esferides podem tambm ser formadas por centrifugao [16]. Mais
recentemente, as clulas foram semeadas em aderentes superfcies micropatterned em
dispositivos microfabricados [7] (ver Figura Id no Box 1). Estas tcnicas abrem novas aplicaes
de culturas de esferide, tal como de alto rendimento Rastreio tecido 3D e a formao do
complexo, organotypical enxertos de tecidos [17]. Aqui, discutimos esferide cultura modelos
e como novos mtodos de fabricao combinados com cultura esferide pode levar a um
grande nmero de altamente reprodutveis, tecidos complexos. Esferides como uma
ferramenta para investigar intercelular e interaes clula-matriz Como um resultado da
replicao de um nicho celular natural, esferides so excelentes ferramentas para mecnica
baseada em tecido Oms ensaios, assim como para a clula-clula e clula-matriz sondagem
interaes. Por exemplo, esqueletognese embrionrio comea com a formao de brotos de
membros atravs da condensao de MSCs. Ncadherin, uma protena de adeso intercelular,
expressa em mesnquima condensada, e bloque-lo com um anticorpo monoclonal resultados
de anticorpos tanto em condrognese reduzida em cultura de micromassa e desenvolvimento
dos membros in vivo perturbado [18]. No s por bloqueio directo, mas tambm
indirectamente atravs da diminuio da Ras-relacionados C3 substrato de toxina botulnica 1
(Rac1) de sinalizao, resultando em diminuio da N-caderina expresso, MSC condensao, e
expresso de condrognica Os genes marcadores. O aumento de sinalizao tem a Rac1 efeito
oposto [19]. A migrao de clulas depende de intercelular e interaes clula-matriz, e de
outro knockdown um membro da famlia da caderina, caderina-7, diminui condrognica
diferenciao e reduz a condensao atravs migrao prejudicada [20]. Esferides tambm
tm sido utilizados como uma ferramenta para investigar o papel de molculas de adeso na
biologia do tumor. multicelular esferides de tumor tm uma maior resistncia
quimioteraputica do que as mesmas clulas em cultura em monocamada. Expresso de um E-
caderina negativo dominante ou tipo selvagem E-caderina em um modelo de tumor esferide
Sarcoma de Ewing clulas diminui ou aumenta a resistncia quimioterapia, respectivamente
[21]. Em outro modelo de sistema, um papel para a famlia da calicrena (KLK) RELACIONADA
peptidases esteve encontrada na cultura esferide de ovrio epitelial seroso carcinoma (EOC).
Dois transcritos diferentes, de KLK7 KLK7-253 e KLK7-181 so apenas expressas em EOC mas
no em tecido de ovrio saudvel. O aumento da expresso desses transcries provoca uma
maior formao esferide atravs mediada por integrina a aderncia, e esferides
expressando essas transcries mostram aumento chemoresistance para paclitaxel [22].
Cultura esferide tambm tem sido crucial para a anlise de um novo fenmeno imune-
ativao, denominado nemosis. ele descrito como a morte celular programada em
fibroblastos activados esferides sem a expresso de marcadores de apoptose e acompanhado
pela produo de ciclo-oxigenase (COX) 2, proteinases [por exemplo, metaloproteinases de
matriz (MMP) 1] e cito pr-inflamatrias e quimiocinas [23]. Nemosis iniciada pela integrina
da fibronectina (FN) vinculativo e regula a formao esferide fibritos. interferindo com
esta interaco, quer utilizando fibronectina linhas celulares nocaute ou por bloqueio do
receptor de integrina com anti-a5, e -b1 anticorpos de integrina resulta em deficincia
formao de esferides por at 12 horas de tratamento e aumentada de induo COX-2 [24].
Protenas de adeso intercelular novela, como conexinas e pannexins tambm foram
investigadas em esferides. Pannexins (Panxs) so uma classe de protenas de junes de hiato
[25]. Induo Panx1 na linha de clulas de glioma C6 acelera formao de agregados
multicelulares e um mais maduro Citoesqueleto de actina F, enquanto que a interferir com
Panx1 possui o efeito oposto. Em uma co-cultura de Panx1 e Panx2 As clulas, a percentagem
de clulas Panx1 determina o grau de compactao dos agregados [26]. estes exemplos
ilustram que esferides recapitular mais fisiolgico interaes clula-clula e morfogentica
subseqente movimentos como a contrao do tecido e condensao. Tecidos nativos de
engenharia Os rgos e tecidos no so tipicamente compostas de um homognea populao
de clulas, mas so estruturas complexas com intricadas relaes entre vasos, nervos e
estroma. Essa interao complexa de fatores requer um 3D ambiente para dar conta das
muitas interaes complexas. Exemplos clssicos de utilizao de esferides para o replicao
de um ambiente de tecido complexo so cartilagem tecido [27], o tecido pancretico [28], e no
msculo cardaco [29]. Exemplos mais recentes incluem a formao de rgos tais como a
glndula pituitria [30], copo ptica [31], e em camadas tecido cortical [32]. Ns fornecemos
exemplos que so indicativos das possibilidades de tecidos complexos de engenharia ou para a
regenerao ou a pesquisa biolgica bsica quando utilizando cultura esferide. Construes
de engenharia de tecidos so limitados em tamanho, porque eles geralmente no tm uma
rede vascular. Isto resulta na distribuio inadequada de oxignio e nutrientes para o
construo implantada e integrao limitada com o acolhimento. Uma possvel resposta para
esse problema a prevascularization in vitro de enxertos [6,33,34] (Figura 1). vascularizao
3D um processo em que as estruturas vasculares desenvolvem dentro de outro tecido. Isso
faz com que co-cultura de esferides um sistema modelo interessante para vascularizao,
porque o ambiente celular densa combinada com a presena de ECM natural ea possibilidade
de incluir o apoio As clulas mesenquimais, tais como precursores, oferecer um bom
semelhana do ambiente natural em que a vascularizao ocorre. Alm de tecidos, tais como
fgado, msculo e tecido cardaco [35], foram utilizados esferides para engenheiro osso
prevascularized [6]. Formar vasos sanguneos Corpos embriides a Partir de Clulas endoteliais
that montados los primitivas Redes vasculares [36]. Esferides de forma MSCs Humanas e
Clulas endoteliais da veia umbilical Humana (HUVECs) also desenvolvem Estruturas vasculares
primitivas [37] (Figura 1). Disso de Alm, ESSA Comunicao celular heterotpico conduz a
hum aumento da diferenciao osteognica [37,38] e ativao da via de Sinalizao Wnt [38].
tal engenharia Redes vasculares PODEM se conectar com a vasculatura fazer hospedeiro apos
a Implantao e Aumentar a Sobrevivncia dos como Clulas implantadas [39]. ELES devem
amadurecer rapidamente (Exemplo POR, submtrico tubulogenesis completo, e Sor Coberta
COM pericitos) e Ser rapidamente perfundido pargrafo Ser funcional apos Implantao [6,34].
O morfognio sonic hedgehog (Shh), E that Crtica de para uma Formao do tubo endotelial
Durante embrionrio Desenvolvimento [40], Tem se mostrado til pargrafo tubulogenesis
regulares co-Cultura Nesta de Clulas endoteliais e MSCs. regula Shh o numro de lmenes e
uma hierarquia sem tamanho dos lumens de UMA forma dela dependente da dose de e
conduz a UMA Aumentar los lumens perfundidos los hum MSC / HUVEC co-Cultura Apos um
ratinhos Implantao los [6]. Funcionalmente, Estes engenharia Redes vasculares contribuem
par melhorar a Sobrevivncia das Clulas implantadas [39], a Formao de novo de osso [6], e
Tecidos Msculo esqueltico OS fazer [34]. A Assim, um Formao de Recursos Nativos (POR
Exemplo, Sangue e Redes neurais), EM PODE Ser Necessario esferides pargrafo promover
adequada dos Tecidos Desenvolvimento in vitro. Outro Tecido Complexo E uma clula-tronco
hematopoiticas (HSC) nicho. HSCs residir los hum nicho subendosteal no medula ssea. ELES
PODEM Sair fazer nicho pargrafo ENTRAR no Perifrico o Fluxo de Sangue e, eventualmente,
repovoar o nicho los hum Processo Chamado de homing. TEM Sido propostos Vrios tipos de
Clulas pargrafo CRIAR Nichos pargrafo HSC. Osteoblastos OS, endotelial Como Clulas, e
pericitos OS, Pelo Menos, So de grande importancia NAS ancoragem e modulando HSC
Destino [41]. esferides formada usando Diferentes tipos de Clulas modelar um Interao de
HSCs com Clulas subendosteal [42]. Os esferides foram formados com MSCs OU
predifferentiated Par o osteognico Novas tecnologias facilitam HTS longo prazo de
esferides, 384 para permitir que os esferides ser cultivadas numa gota suspensa moda, mas
que permite a mudana de mdio e triagem de drogas [48]. Cultura 3D tambm pode ser
alcanado com microfluidos para fornecer um fluxo constante de nutrientes e substncias para
grandes conjuntos de esferides [49,50] (ver Figura Ie, f in Box 1). HTS baseados em clulas 2D
protocolos analticos so bem estabelecidos, como revisto em [51], enquanto mtodos HTS 3D
representam novos desafios analticos. Ao ligar para anlise HTS 3D, muitos ensaios so
inutilizados. Por exemplo, em a lactato desidrogenase (LDH), ensaio de viabilidade celular, uma
sinal crescente fluorescente permanece aps a reaco est quimicamente interrompida, o
que torna difcil avaliar a viabilidade celular, e apenas o ensaio da actividade da fosfatase cida
fivel [52]. Alternativamente, microscopia confocal pode ser utilizado para imagem de at
320 mm de profundidade em esferides [53]. a necessidade para tais intervenes dificulta a
aplicabilidade da confocal de imagem para 3D HTS [54]. Alm disso, a maioria de alto
rendimento programas analticos so projetados para adequar as necessidades de 2D HTS
analisando sinais fluorescentes ou quimioluminiscentes [55], o que representa mais um
obstculo para 3D HTS, onde a estrutura em camadas pode interferir com os sinais. Alm dos
obstculos analticos, HTS resultados de imagem 3D em grandes quantidades de dados que
exigem uma infra-estrutura adaptada para processamento e anlise [56]. Rastreio HTS 3D tem
no entanto, foi provado ser possvel em casos especficos. para exemplo, o volume de
esferide, a migrao celular, invaso e em Matrigel podem ser analisadas de uma forma
automatizada usando brilhante imagens campo depois do tratamento com trs frmacos anti-
cancergenos [57]. Para o melhor de nosso conhecimento, anlise estrutural confocal de alto
rendimento do 3D culturas ainda no foi estabelecido. Outros ensaios, tais como de genes e
anlise de protenas usando o PCR multiplex e ELISA multiplex, respectivamente, pode ser
aplicado para esferides lisado ou meio condicionado.

Direo arquitetura do tecido complexo
Tecido natural tem a sua prpria arquitectura em que as clulas receber sinais mecnicos que
iro orientar o seu comportamento. Por exemplo, em tecido sseo, a matriz de controlo de
rigidez a expresso do gene osteognico [58], mas tambm a migrao de clulas controles de
arquitetura do tecido [59]. Uma das teorias que descrevem esta arquitetura ou organizao de
populaes de clulas esferides utiliza como base. Em 1963, Steinberg postulou a "adeso
diferencial hiptese "(DAH), em que as populaes de clulas de triagem em desenvolvimento
ou a reconstruo de tecidos so comparados com lquidos de mistura, de modo que as foras
de adeso intercelular que determina a configurao final das populaes minimizar a energia
livre de superfcie total de [60,61]. tecidos com baixa tenso de superfcie (por exemplo,
lquido) com tecidos do envelope a tenso do tecido superior (por exemplo, estado slido
elstico) [62] e vai ter uma forma esfrica, independentemente da sua composio. Evidncias
morfolgicas para a teoria vem da embriologia Se os tecidos com uma maior tenso superficial
do tecido (TST, por exemplo, o corao) so envolvidos por tecidos com um TST menor (por
exemplo, o fgado) [62]. Por exemplo, o aumento da integrina a5b1 nveis de transfeco
conduz a um aumento no TTS. simultaneamente aumentando a fibronectina exgena
disponveis leva a uma transio dos esferides de um estado lquido para o estado slido
elstico (aumento TST). Estes dados indicam que o comportamento de populaes de clulas
podem ser ajustados a partir de lquido de elstico ao interferir com qualquer um dos
receptores ou densidade de ligando, que levam a diferentes propriedades mecnicas [63], e
pode ser visto como uma ferramenta de engenharia para manipular morfognese de tecidos in
vitro. Outra forma de orientar a organizao espacial da clula
populaes a utilizao de micromolded thermoresponsive substratos, em que as clulas so
semeadas dentro de uma forma circular a 24 8C. Aps a incubao subsequente a 37 8C, os
substratos encolher, criando um espao em torno do primeiro agregado As clulas em que
uma segunda populao de clulas podem ser cultivadas, determinando, assim, a organizao
espacial dessas clulas tipos [64]. Composio do tecido tipicamente de natureza repetitiva.
a fgado, por exemplo, est organizada em lbulos e composto de sinusides que todos tm
uma arquitetura idntica; a "construo blocos "do fgado. Ferramentas de microfabricao
permitir fabricao de alta preciso de modelos para microescala blocos de construo que
podem ser combinados para formar complexo tecidos com diversas geometrias. Por exemplo,
um modelado substrato de cido hialurnico pode ser criada com um microfluidos molde. A
superfcie nonpatterned revestido com fibronectina, onde cardiomicitos induzida
preferencialmente anexar, alongar e alinhar com o padro de, eventualmente, formam
Organides batendo milmetro de tamanho [65]. tcnicas similares tornam possvel criar
formas que foram agregado clulas em uma geometria fixa. Geometria substrato pode mudar
a forma da clula e destino das clulas atravs de actina e miosina tenso mediada sinalizao
RhoA-ROCK [66]. microfabricao tcnicas foram aplicadas a co-culturas de As clulas
agregadas para gerar formas diferentes tecidos (Figura 2). Em co-culturas em forma de estrela
e triangulares de Clulas HUVECs e hMSC, PECAM-1 + preferem reas de alta deformao
(cantos) e correspondem a reas de maior As concentraes de factor de crescimento
endotelial vascular (VEGF)-A e do receptor de VEGF (VEGFR) -2 (Figura 2c). Os efeitos da
deformao externo pode ser atenuado atravs da inibio da tenso do citoesqueleto de
actina e por agentes de bloqueio de miosina [67]. Impresso microcontact tornou possvel para
criar 2D formas que foram as clulas em uma geometria fixa. microcontact impresso foi
estendido para estudar o comportamento multicelular [68], ou o comportamento modelado
de clulas em estruturas similares para os tecidos. Tcnicas de microfabricao ter sido mais
aplicado para a montagem 3D, de livre flutuao, tecidos geomtricos utilizando agregados
multicelulares de clulas endoteliais e MSCs como blocos de construo. Estes tecidos 3D
microfabricados deformar-se e mudar de forma autnoma, devido endgeno actina / foras
geradas por miosina. Eles formam a auto-organizado padres de estruturas vasculares em
regies de elevada deformao, e correlacionam-se com a formao de um longo intervalo
gradiente de VEGF em clulas intersticiais nestas regies. As clulas intersticiais nas regies
deformadas superexpressam Clulas endoteliais VEGFR-2, e mostram um aumento taxa de
proliferao. Contractilidade do tecido e deformao podem induzir a formao de gradientes
de microambientes angiognicos que poderia contribuir para a padronizao de longo alcance
do sistema vascular [67] (Figura 2c). cincia, emais abordagens orientadas para a aplicao.
Tcnico melhorias na ltima dcada tm facilitado a a fabricao de um grande nmero de
esferides altamente reprodutveis. Tecidos complexos podem ser manipulados atravs da
utilizao de esferide culturas e tcnicas de microfabricao. embora vemos o agregado de
clulas em formas esfricas em processos biolgicos, estas tcnicas no deve limitar-se para a
forma esfrica, por si s, porque elas podem revelar mecanismos que no esto presentes em
esferides (deformao por exemplo, local). Estudos Weencourage que investigam a formao
de tecidos complexos como modelos biolgicos ou solues de engenharia, de modo que as
grandes populaes de pacientes pode beneficiar engenharia de tecido cardaco ou do
pncreas, por exemplo. esferide cultura tambm entrou no reino da HTS, no entanto, porque
no existem testes desenvolvidos especificamente para esferide HTS, theymust ser feito sob
medida. Ensaio e desenvolvimento a anlise de grandes quantidades de dados so dois
importantes desafios a enfrentar para o futuro da HTS esferides. quando esses desafios so
cumpridos, HTS triagem de tecido complexo deve ser possvel, o que pode gerar uma
reviravolta para muitos outras reas de pesquisa, como j fez por cancermedicine com
esferides de tumor a uma escala pequena. Para concluir, acreditamos que a cultura esferide
em conjunto com estabelecido tcnicas podem fornecer novos insights e solues para um
desafio questes cientficas.

ARTIGO 2 Tridimensional tcnica de cultura de clulas e fisiopatologia
Construes de tecido (3D) tridimensionais compostas de clulas humanas abriram um novo
caminho para a engenharia de tecidos, aplicaes farmacuticas e fisiopatolgicos, e tm
grande potencial para estimar a dinmica efeitos farmacolgicos de candidatos a frmacos, os
processos de metstases de clulas cancerosas, e expresso da toxicidade nano-materiais,
como um modelo de tecido 3D-humana, em vez de experimentos in vivo em animais. No
entanto, a maioria celular 3D construes so um esferide das clulas, o que uma
agregao heterognea, e, assim, a reconstruo da delicada e preciso 3D-localizao de vrios
tipos de clulas quase impossvel. Nos ltimos anos, vrias tecnologias para desenvolver
novos tecidos 3D-humano complexos, incluindo sangue e linfa redes capilares tm
demonstrado que as respostas fisiolgicas dos tecidos humanos podem ser replicados no
gamas nano / micro-metros. Aqui, ns fornecemos um breve panorama sobre tecnologias de
fabricao de tecidos 3D atuais e suas aplicaes biomdicas. Os modelos de tecido 3D-
humana ser uma poderosa tcnica para fisiopatolgico aplicaes.

introduo
Quantitativa e time-lapse analisa inmicroenvironments de droga difuso, a toxicidade de
drogas, e entrega as ofmolecules libertao fromdrug portadores so teis para explorar os
processos fisiolgicos, mecanismos, e tratamentos de doenas ou ferimentos atravs de
fisiopatologia. Vrios instrumentos de anlise espacial como a tomografia computadorizada,
magntico ressonncia e tomografia por emisso de psitrons foram empregado para geral em
experincias com animais in vivo em fisiopatologia.No entanto, apesar de seus limites de
deteco foram melhorados dia por dia, a deteco de eventos na escala micro-metros ainda
difcil. Alm disso, diferenas de espcies entre animais e seres humanos pode causar variveis
de confuso fundamentais, tais como os processos metablicos, enzimas e protenas de
membrana. Deste modo, in vitro, as avaliaes de drogas base de clulas humanas, incluindo
testes de drogas eficcia, toxicologia e biologia celular bsica [1,2], so de grande importncia
como uma alternativa para experimentos com animais para resolver o problema significativo
de diferenas entre as espcies. Em particular, os animais foi proibida de testes para
cosmticos e produtos qumicos no mbito do stimo Alterao Directiva Cosmticos
(Directiva 76/768 / CEE) e REACH (registo, avaliao, autorizao e restrio de produtos
qumicos) da Unio Europeia (UE) de maro de 2013 [3]. Avaliao de drogas base de clulas
tm sido geralmente realizada num prato de plstico sob monocamada (bidimensionais; 2D)
condies celulares. Uma vez que quase todos os tecidos so estruturas tridimensionais (3D)
integrado de vrios tipos de clulas e matriz extracelular (ECM), e desde sinalizao
intercelular importante para as funes biolgicas, que geralmente difcil estimar os efeitos
de drogas reais sobre as funes fisiolgicas por Mtodos 2D-cultura. O desenvolvimento das
construes de tecido humano 3D que consiste em estruturas de tecidos simplificados com
mltiplos tipos de clulas e as Aes um desafio fundamental para farmacuticos e
fisiopatolgica avaliaes e engenharia de tecidos. Em geral, um esferide celular tem sido
utilizada como o 3D-cultura modelo, especialmente esferides 3D de cncer de metstase ou
farmacolgico ensaios de clulas cancerosas [4-6] e esferides 3D de hepatcitos para a
induo maior actividade de hepatcitos [7-9]. Embora interessante 3D-co-cultura esferides
foram relatados para investigar a invaso tumoral [10,11], para melhorar as funes de
hepatcitos [12] e para imitar as condies in vivo [13], a reconstruo da-localizao 3D
delicada e precisa de vrios tipos de clulas no foi conseguido ainda devido sua
heterogeneidade, a falta de controle do nmero de clulas e localizao, e necrose no interior
das clulas, porque de nutrientes insuficientes. Aqui ns fornecemos uma breve viso geral
das tecnologias para a construo de construes de tecidos em 3D, principalmente a
cellmanipulation hierrquica tecnologias, em seguida, discutir como estas-tecidos 3D poderia
contribuir para a compreenso nano-fisiopatologia.
2. abordagem top-down para o desenvolvimento de construes 3D de tecidos
Existem basicamente dois tipos de abordagens, de cima para baixo e bottomup aproxima-se,
para a construo de construes de tecido 3D (. Fig 1). A abordagem top-down foi relatado
historicamente, especialmente o biodegradvel mtodo andaime. Scaffolds biodegradveis e
hidrogis que consiste em polmeros biodegradveis, tais como poli (cido lctico)poli (cido
gliclico), e alginato de colagnio tm sido utilizados para a construo de 3D-construes
contendo clulas vivas [14,15]. o topolgica controle de scaffolds biodegradveis porosos [16],
especialmente nanofibras andaimes por eletrofiao [17] ou de auto-montagem peptdeos
anfiflicos [18], tem atrado muita ateno devido sua alta porosidade e o alinhamento das
fibras controlada para controlar a funo celular. a clulas encapsuladas nos andaimes podem
crescer activamente, e finalmente formado agregaes celulares aleatrios dentro dela.
Embora a taxa de crescimento pode ser controlado atravs de fatores de crescimento no meio
de cultura, 3D-engenharia tecidos que possuem tipos de clulas-controlados com preciso, o
alinhamento das clulas, e interaco clula-clula no foram ainda desenvolvidos. Estes
scaffolds de nanofibras pode contribuir para o alinhamento de clulas ou de aderncia
provisria devido morfologia, mas difcil de manter estes efeitos, uma vez que o nanofibras
so completamente coberto com clulas cultivadas e expressa ECMs fromthe clulas. Por
conseguinte, uma abordagem convencional usando biodegradvel matrizes, tais como
hidrogis ou andaimes de fibra parece ter vrias limitaes no desenvolvimento de
construes de tecidos 3D que satisfaam os requisitos acima. A abordagem bottom-up
usando clulas mltiplas tipos como pedaos de tecido tem atrado recentemente grande
ateno para resolver estes problemas ..
3. abordagem bottom-up para o desenvolvimento de 3D-tecidos
Vrias abordagens bottom-up, como folhas de celulares [19], lipossomas magnticos
[20], a manipulao de clulas hierrquica [21], aquosa polimrica
sistemas de duas fases [22] e clulas de impresso e polmeros [23] tm
foram relatados na construo de uma estrutura de tecido complexo. estes
abordagens ascendentes so geralmente classificados em dois grupos: cellbasedmethods,
e de clulas e mtodos de polmero base de. Aqui, as caractersticas,
vantagens e problemas com ambas as abordagens so brevemente
resumida.
3.1. Abordagens Cellular camada camada por
Um dos mtodos mais gerais das abordagens ascendentes
camada por camada celular (LbL). Okano e colaboradores relataram a
ofmonolayers de fabricao de folhas de clulas e seu empilhamento para createmultilayered
estruturas utilizando polmero enxertado cultura sensvel temperatura
pratos [19]. Usando pratos sensvel temperatura, as clulas cultivadas
podem ser colhidas como folhas frgeis por mudanas de temperatura, assim
evitando o uso de enzimas proteolticas. Eles prepararam vrias folhas
estruturas de cardiomicitos para a reconstruo do 3D-miocrdica
tecidos por empilhar as folhas de clulas [24]. Porque as folhas de clulas tm
ECM na parte inferior por baixo da folha, que pode empilhar facilmente, devido os
receptores interactionswith cellmembrane. Este um dos principais
mtodos para o fabrico de estruturas celulares em mltiplas camadas.
Embora a camada de clulas um mtodo intrigante, a utilizao do frgil
folhas no fcil para leigos. O outro mtodo para se ligar clula de formar 3Dstructures,
fora magntica tem sido relatada a partir de Ito e colegas de trabalho
[20]. Eles aplicaram uma fora magntica para construir um heterotpico, em camadas
co-cultura systemof hepatcitos e clulas endoteliais que no se limitava
pelo tipo de clula. Lipossomas catinicos magnticos com positivelycharged
as superfcies foram adsorvidos em superfcies de clulas, e, em seguida, magntico
forceswere aplicada para criar estruturas de vrias camadas. Thismethod
podem fabricar estruturas em camadas mltiplas de clulas, independentemente da clula
tipo, porque a fora motriz magntico. Apesar de a remanescente
quantidade de lipossomas magnticos muito pequena, eles ainda podem induzir
toxicidade.
Takayama e colaboradores relataram uma nova abordagem, um sistema bifsico
para a impresso de clulas no-contato em clulas [22]. As solues aquosas de
polietileno glicol (PEG) e dextrano (Dex) acima de uma certa concentrao,
e segregar e formam um sistema de duas fases, com Dex sempre
formao da fase inferior. Eles controlado a tenso interfacial
cada fase para conseguir a impresso de clulas em clulas, e relatou que celular
nichos suportado a diferenciao neuronal de rato embrionrio as clulas-tronco (Mesc) e
mostrou-se que a densidade de impresso uma MESC fator importante para orientar a
diferenciao MESC em neurnios. este uma tcnica nica para preparar construes de
bicamada celulares, e assim que se espera que seja aplicvel por mais de trs camadas.

3.2. Nano-ECM assistida LbL celular

Para desenvolver uma abordagem simples, de baixo para cima, ns nos concentramos em que
o adesivo celular
propriedades do ECMsurrounding o cellmicroenvironment. em
mais em mtodos de cultura de clulas in vitro, os pesquisadores obter apenas celular
monocamadas, provavelmente devido ausncia de ECM suficiente na clula
superfcies. Se adesivas celular nanomtricas materiais como um ECM foram
fabricado diretamente na superfcie das membranas celulares, em seguida, o de controle 3D
a adeso clula-clula seria possvel. Estamos focados na tcnica de automontagem,
que um mtodo apropriado para preparar filmes nanomtricos de tamanho em um
substrato alternativo por imerso em solues de polmero interactivos
[25,26]. A escolha apropriada dos componentes da matriz extracelular para a naturais
preparao de nanofilmes importante para evitar a toxicidade e o tpico
ECM apresenta com grupos de clulas-adesivo, como RGD (arginina
outras unidades funcionais de cido glicina-asprtico) e [27]. Ns selecionamos
fibronectina (FN) e gelatina (G) para preparar filmes de nano-ECM na clula
superfcie. FN uma glicoprotena multifuncional flexvel, e desempenha um importante
papel na ligao de clulas, migrao, diferenciao, e assim por diante
[28,29]. FNiswell conhecido no interagir onlywith uma variedade de ECMproteins
tais como colagnios (gelatinas) e glicosaminoglicanos, mas alsowith
o receptor de integrina 51 na superfcie da clula [30]. Temos anteriormente
reportados multicamadas LbL baseados em FN compostos por componentes FN e ECM,
tais como gelatina, heparina, e elastina, e foram construdos por alternativo
imerso nas solues (montagem LbL) [31]. embora FN
e L tem uma carga negativa sob condies fisiolgicas, eles interagem
uns com os outros porque FN tem um domnio de ligao do colagnio [29], indicando
as diferentes foras motrizes de polieletrlito (PE) filmes usando
polictions. Assim, era esperado que as nanofilmes FN-G para proporcionar uma adequada
clula-adesiva de superfcie semelhantes ao ECM natural para o segundo camada de clulas,
sem qualquer citotoxicidade. Essa a ideia-chave por trs da
Mtodo para a clula LbL ", a manipulao de clulas hierrquico" (Fig. 2) [21,32-34].
A fabricao de multicamadas 3D-celular composta de clulas e FNG
filmes nano-ECM foi realizada de acordo com o processo seguinte
[21]. Resumidamente, o conjunto LbL de FN e G na superfcie da clula foi analisada
quantitativamente usando uma microbalana de cristal de quartzo (QCM), como o
substrato de montagem, e com uma membrana de camada dupla de fosfolpidos. a
espessura do conjunto LbL dizer depois de 1, 7, e 23-stepswas calculado
de 2,3, 6,2, e 21,1 nm, respectivamente. As partes superior e transversais de
o microscpicos de varredura a laser confocal (MCVL) imagens 3D resultante da fuso
indicada uma montagem homognea das marcado por fluorescncia-FN-L
nanofilmes sobre a superfcie do rato L929 fibroblasts.We fabricada uma bicamada
de clulas L929 de fibroblasto com ou sem G-FN nanofilmes
usando uma tampa de vidro como um substrato. Quando o 7-passo montado FN-L
nanofilmes foram preparadas na superfcie da primeira camada de clulas L929, o
As clulas foram ento segunda camada observado sobre a primeira camada de clulas. No
entanto,
quando os nanofilmwas no preparadas ou o nanofilme 1-montados passo
(apenas FN) foi montada sobre a primeira camada de clulas, ento a arquitectura de
bicamada
no foi observado. Estes resultados sugerem que uma espessura de 2,3 nm FN
filmwas inadequada, e, pelo menos, cerca de 6 nm de FN-G nanofilme
foi necessria como uma superfcie adesiva estvel para a segunda camada de clulas. quatro
em camadas (4L) cellularmultilayerswere claramente observada aps quatro repeties
uma dessas etapas por MCVL e HE (HE).
A espessura das obtainedmultilayers calculada a partir dos reconstruo 3D
CLSMimages linearlywith aumentado aumentando o nmero de camada celular.
Esta tcnica de manipulao celular hierrquica pode ser aplicada a
vrios tipos de clulas, no s das clulas de fibroblastos, mioblastos, mas tambm
micitos cardacos, clulas do msculo liso (SMC), os hepatcitos, e de tumores
fibroblastos fibrticas (. Fig 3) [35]. Alm disso, usando uma combinao de
vrios tipos de clulas, por exemplo, SMC e as clulas endoteliais e fibroblastos
e queratincitos, que era possvel fabricar vasos sanguneos humanos
e modelos de pele, respectivamente [33].
3.3. -Clula 3D montagem abordagens
Mtodos LbL celulares so teis para a construo de estruturas em camadas mltiplas
um por um, mas preciso um longo tempo para fabricar construes de tecidos grossos
porque uma incubao de cerca de metade do dia necessria para a adeso de clulas
estveis
sobre as superfcies das clulas. Assim, as abordagens de montagem de clulas 3D tem
recentemente
atrado muita ateno. Takeuchi e Matsunaga relatou uma
tcnica de moldagem de grnulos de clulas, que so prolas de gel de colagnio coberto
com clulas aderidas [36]. Os grnulos de clulas em um aremolded customsilicone
cmara de formthe macroscpicas construes de tecido 3D. No molde, a
grnulos de clulas podem aderir umas s outras atravs das clulas que revestem o colagnio
contas de gel. Finalmente, uma vez que os grnulos de gel de colgeno foram degradados por
enzimas
segregado a partir das clulas, os tecidos moldados podem ser libertados.
Eles relataram melhorias na quantidade de albumina secretado
Clulas HepG2 por co-cultura com clulas de fibroblastos nas 3Dtissues construdas.
A construo de tecidos 3D complexmacroscopic usingmultiple
tipos de clulas esperado utilizando este mtodo.
Recentemente, desenvolveu uma abordagem bottom-up simples e rpido,
denominada a tcnica de acumulao celular, por revestimento de uma nica clula utilizando
FNG
nanofilmes [34]. Uma vez que os nanofilmes FN-L preparada em clulas individuais
superfcies de proporcionar um receptor de propertywith the51 integrina interactivo
da membrana celular, a adeso clula-clula de todas as clulas semeadas em trs
dimenses pode ser induzida ao mesmo tempo, a "acumulao de clulas (figura 4.
tcnica ").
A fabricao de cerca de 6 nm de espessura filmes FN-G numa disperso
superfcie de uma nica clula foi realizada com base em nossos relatrios anteriores
para a preparao de PE nanofilmes LbL sobre partculas de slica [37]. a clula
viabilidade depois de preparar os nanofilmes FN-G foi avaliada e comparada
para os filmes de PE. No caso de o nanofilme FN-L, quase completa
a sobrevivncia foi confirmada (N98%), ao passo que os outros nanofilmes preparado
por foras eletrostticas mostrou citotoxicidade dependente da sua
Nmero da etapa LbL. Ns tambm confirmou mais de 91% de viabilidade celular para NHDFs,
HUVECs, e carcinoma hepatocelular humano (HepG2) aps a preparao de clulas
estes filmes FN-G. Depois do revestimento com as nanofilmes FN-L, 2 106
NHDFswere incubadas em uma insero de cultura de clulas durante um dia. Construtos 8D-
densos
de 35 4 mM espessuras foram obtidas com sucesso, enquanto que um
estrutura esfarrapado e poroso foi mal obtidos utilizando no-revestido
clulas. A espessura das construes de tecido obtidas aumentada por aumento
o volume do meio de cultura, e, portanto, a corrente mxima
espessura superior a 100 um para a maior do que 20D-estruturas. Mais
importante, a construo de cerca de 20L-estruturas por dia
depois de apenas um revestimento nanofilme dentro de 1 h nunca foi relatado anteriormente,
e esta abordagem tem um grande versatilidade em diversas clulas.

3.4. Higher cellular functions in 3D-tissue constructs than in 2Dmonolayers
Cellular functions in the 3D-tissue constructs are expected to be
higher than those of monolayered cells in general culture. Some researchers
have reported the functions of layered cellular architectures
in vitro [38]. However, the basic properties of 3D-cellular structures,
such as their layer number or the cell types, have not been clarified yet.
We evaluated the structural stability of layered constructs consisting
of normal human dermal fibroblasts (NHDFs) and humanumbilical vein
endothelial cells (HUVECs) in relation to their layer number [39]. To
evaluate the general effects of 3D-layered structures on cellular stress
or inflammation,we purposely fabricated biologically-meaningless layered
structures consisting of endothelial cells and fibroblasts. Dulbecco's
modified Eagle's medium (DMEM) containing 10% feral bovine serum
(FBS), a general culture medium, was employed in this study to avoid
the influence of specific growth factors. Interestingly, the HUVEC. derida homogeneamente
sobre a superfcie de 4L-NHDFs, e tightjunction
formationwaswidely observada na escala de centmetros, enquanto
heterogneas estruturas de domnio HUVEC foram observados no
monolayered (1L) NHDFs. A produo de protena de choque trmico 70
(Hsp70) e de IL-6 a partir das estruturas celulares investigadas para elucidar
qualquer efeito 3D-estrutural em funo celular. A expresso de Hsp70
do HUVECs diminuiu aps aderncia sobre a estrutura-4L como NHDF
em comparao com uma monocamada de HUVEC. Surpreendentemente, a produo de
Hsp70
resposta ao choque trmico aumentada drasticamente por cerca de 10
vezes, em comparao com um choque de calor no aps a formao da estrutura 3D,
Considerando que a monocamada de estruturas no apresentaram qualquer alterao. Alm
disso, o
produo da citocina inflamatria IL-6 diminuiu significativamente
dependendo do nmero de camadas de NHDFs. Estes resultados sugerem que
4L-NHDF proporcionou um ambiente mais favorvel para o HUVECs
do que um disco de cultura de clulas de plstico para induzir alta termossensibilidade, e
suprimir a resposta inflamatria do substrato. Uma vez que os FNGnanofilms
preparada sobre a superfcie da clula no afecta as funes celulares
[40], concluiu-se que a construo em camadas seria um anlogo
ambiente para os tecidos naturais. Estes resultados podem ser importantes para
no s a engenharia de tecidos, mas tambm para a biologia celular bsico.


3.5. Potencial aplicao de construes de 3D-tecidos para ensaios farmacuticos
Estruturas de tecido 3D construdos so desejveis como um tecido humano
modelo para assays.However fisiopatolgico, uma vez que um tecido 3D-humano
modelos no foram reportedmuch, seus relatrios de aplicao tambm so
alguns. Tentamos demonstrar o potencial em aplicaes in vitro de 3Dtissue
constri como um modelo de tecido humano para ensaios farmacuticos.
Modelos 3D dos vasos de sangue consistem em SMC humanas e HUVEC
foram fabricados por manipulao de clulas hierrquica [41]. O sangue-5L
modelos de navios que consistem em artria umbilical 4L-SMC (UASMC) e uma
ultraperifrica 1L-HUVEC mostrou padres de colorao histolgicas semelhantes ao
que de vasos sanguneos humanos, e a superfcie da 4L-UASMC / 1LHUVEC
revelou alta biocompatibilidade que evitou a adsoro
e ativao de plaquetas em plasma rico em plaquetas humanas (PRP). Ns
tentou usar modelos 5L-artria que consistem em PMEs da aorta humana e endotelial
clulas (ECS) para analisar a produo e difuso de ntrico
xido (NO) de ECs em resposta bradicinina hormnio peptdeo
[42]. O xido ntrico (NO), produzidos a partir de clulas endoteliais se difunde para o
PMEs atravs de suas membranas celulares e ativa guanilato ciclase
intracelular para produzir monofosfato de guanosina cclico (cGMP),
que induz uma sinalizao pathwaymediated por protenas cinases principais
a SMC relaxamento [43]. Por conseguinte, quantitativa, cintica e espacial
anlises da entrega extracelular das molculas de NO a partir da CE
camada para as camadas de SMC aps estimulao droga so cruciais para o farmacutico
e as avaliaes biomdicas de hipertenso e diabetes.
Recentemente, uma correlao significativa entre a produo e diabetes
mellitus foi clarificada, e.g. reduo da produo de em ambos os tipos 1 e 2
diabetes [44], e tambm aumenta a produo de NO relacionado a melhorias
na diabetes tipo 2 foram relatados [45]. At agora, farmacutica
ensaios de produo de NO foram realizados por experimentos in vivo em animais,
mas pouca reprodutibilidade e diferenas na produo de NO
dependendo dos tipos de animais permanecem questes por resolver. Assim, o
desenvolvimento
de um mtodo conveniente e verstil para quantitativa in vitro
e anlises espaciais de NO difuso dentro da parede da artria, em vez de
experincias com animais importante por razes biolgicas e farmacuticas
aplicaes.
Resumidamente, demonstramos pela primeira vez espacial e quantitativa
anlises de NO a partir da camada de difuso para os CE camadas SMC usando um
Modelo 3D artria com partculas de sensores [37] alocados em cada celular
camada. O efeito estrutural 3D de ECs e PMEs na produo de NO a partir de
ECs foi clarificado em relao direco de interaco entre
estas clulas. Alm disso, uma alterao da concentrao de NO graduada fromthe
camada CE superior para as camadas subjacentes da SMC foi elucidada por 3D
anlise usando CLSM. Este mtodo no requer instrumentos especiais
ou tcnicas e conveniente e eficaz para a triagem de drogas, e
assim, ele tem a possibilidade de ser uma soluo de experincias com animais em geral.
3.6. Celular e abordagens baseadas em polmeros
Estas abordagens baseadas em clulas nos permitem construir uma construo de tecido 3D
com alta clula densitywhich revela interaces clula-clula. No entanto, o
construtos obtidos ainda esto longe fromthe verdadeiro em tecidos in vivo. Em particular,
as propriedades mecnicas e tamanho dos tecidos obtidos so significativamente
menor e menor, respectivamente, do que as dos tecidos reais porque
dos componentes da matriz extracelular. Redes de fibra ECM desempenham um complexo
importante papel para a rigidez e a elasticidade dos nossos tecidos e rgos.
O desenvolvimento de tecidos compsitos que consistem em no apenas as clulas, mas
tambm polmeros ou protenas da MEC, ser importante para a construo
de anlogos de tecidos 3D com mecnica similar e morfolgica
propriedades.
Para controlar a localizao celular da matriz, a impresso a jacto de tinta de clulas
e polmeros tem sido empregue [23]. Mironov e colaboradores demonstraram
o da construo 3D de estruturas complexas, imprimindo em
situ polmeros reticulveis e solues ECM contendo as clulas [46,47].
Nakamura et al. relatado a capacidade de escrever linhas de cerca de 50 m de largura
imprimindo clulas suspensas em alginato de sdio para uma pelcula fina de clcio
cloreto devido formao de gis de alginato atravs de coordenadas
ligao com ons de clcio [48]. Ambos os mtodos relatados a fabricao
de free-standing construes tubulares contendo clulas vivas, e theirmechanical
andmorphological propertieswere claramente superiores aos dos
os produtos a partir de abordagens baseadas em clulas. No entanto, o encapsulado
As clulas foram isoladas no interior da matriz, e no funes fisiolgicas como um
vivendo tissuewere observado at a morte depois de alguns dias de incubao.
Alm disso, as construes de 3D obtidas no eram estveis durante
culturas de longo prazo (mais de uma semana), devido degradao enzimtica
ou hidrlise. A variedade de polmeros reticulveis em situ tambm limitada.
O desafio aqui no desenvolvimento de novos biomateriais para permitir alta
adeso celular, as interaces clula-clula, e estabilidade a longo prazo

4 Desenvolvimento de construes de tecidos vascularizados 3D
Vascularizao em construes de tecidos 3D ainda um desafio-chave na
campo de engenharia de tecidos para evitar a necrose das clulas no interior de espessura de
tecido 3D
constri. Desde o fenmeno da angiognese in vitro foi descoberto
por Folkman e co-autores em 1979 [49,50], os pesquisadores tm
Tentou controlar a formao capilar das clulas endoteliais em andaimes
[51] e reconstrudos-tecidos 3D [52,53]. No entanto, para controlar isdifficult
o alinhamento do sangue capilar reconstruda. Recentemente, microfludica
sistemas de [54] e preparao de canal em hidrogis [55] tem
foi relatado para a construo de redes capilares controlados precisamente por
cobrindo a superfcie interna dos poros com clulas endoteliais. Uma vez que o
morfologia e biolgicas propriedades dos microcanais endothelialized
assemelhava-se em capilares sanguneos vivo, essas tecnologias so esperados
para ser til para o estudo in vitro de angiognese. Atualmente, o
desenvolvimento de redes capilares de sangue perfusable foi avaliado
atravs da ligao ex vivo amostras de tecido para actuar como um leito vascular [56]. porque
de alto desempenho para criar o fluxo de sangue dentro destas capilar
redes, os seus pedidos de campos biomdicos e fisiopatologia
so esperados.
4.1. Abordagens baseadas em andaimes
Unger et al. relataram a formao de estruturas semelhantes a microcapilares
de clulas endoteliais microvasculares drmicas humanas sobre o osso 3D porosa
biomateriais, tais como fosfato de clcio hidroxiapatite, ou por co-cultura
com clulas osteoblsticas ou uma linha de clulas semelhantes a osteoblastos [51]. estes
estruturas microcapilares-like foram interligados entre as camadas de clulas
dos osteoblastos, e no formwhen estmulos angiognicos exgenos
Foram adicionados a estas co-culturas. O modelo de co-cultura apresentaram o
possibilidade experimental para delinear como os genes especficos so regulamentados
como um resultado das interaces clula-clula que envolve as clulas endoteliais e
osteoblastos. Langer et al. relatou a induo de vaso endotelial
redes em construes de tecido muscular esqueltico projetados usando um 3D
sistema multi-cultura que consiste em mioblastos, fibroblastos embrionrios
e clulas endoteliais semeadas em co-altamente poroso, biodegradvel
scaffolds polimricos [52]. Eles verificaram que a adio de fibroblastos embrionrios
aumento dos nveis de expresso endotelial vascular factor de crescimento
na construo, e promoveu a formao e estabilizao de
endoteliais dos vasos. Usando modelos animais in vivo, em melhorias
a vascularizao, a perfuso sangunea e sobrevivncia do tecido muscular
construes aps o implante foram claramente confirmada.
Estes esto levando relatrios que demonstram na vascularizao vitro em
3D-andaimes, e este ltimo apoiar claramente o benefcio de prevascularization
no andaime para in vivo tratamento de doenas. No entanto,
a construo in vitro de perfusable redes vasculares ainda uma tecla
desafio. Chen e colaboradores relataram a formao da rede perfusable
por uma abordagem de modelo sacrificial [55]. Eles impresso rgida filamento 3D
redes de vidro carboidratos e usados Themas um sacrifcio cytocompatible
template em tecidos artificiais contendo clulas vivas para gerar
redes cilndricas que podem ser revestidos com clulas endoteliais e perfundido
com o sangue sob um fluxo pulstil de alta presso. Uma vez que esta simples
abordagem de vazamento vascular permite o controlo independente da rede
geometria, endotelizao e os tecidos extravasculares, compatvel
com uma grande variedade de tipos de clulas, sinttico e natural, extracelular
matrizes e estratgias de reticulao. Eles tambm demonstraram que o
canais vasculares perfundidos sustentado a funo metablica primria
hepatcitos de rato em construes da engenharia de tecidos.
4.2. abordagens microfludicos
O sistema de ensaio in vitro farmacutica vascularizado-tecido 3D
fichas ser adequado para aplicaes em pesquisas fisiopatolgica.
Zheng et al. redes microvasculares vida desenvolvidos em 3D de tecidos
andaimes utilizando um sistema de microfluidos, e demonstraram a sua
biofuncionalidade in vitro [54]. Eles usaram a tcnica litogrfica para
forma endothelialized vasos microfludicos dentro de uma matriz de colgeno nativo,
e elucidou as actividades angiognicas da diferencial endotheliumand
interactionswith prevascular clulas semeadas em grandes quantidades a de colagnio.
Alm disso, a natureza no-trombtica do endotlio vascular e
sua transio para um estado pr-trombtico durante uma resposta inflamatria
Foram demonstrados. Systemshows Thismicrofluidic amplo potencial para
o estudo da biologia e fisiopatologia cardiovascular.
Jeon e colaboradores relataram uma platformwhereby baseado em microfludica
eles modelar programas celulares naturais encontrados durante o desenvolvimento normal
e angiognese para formar redes de perfusable 3D intacta
microvasos, bem como vasculaturas tumorais, com base na spatiallycontrolled
co-cultura de clulas endoteliais com fibroblastos estromais,
pericitos e clulas cancerosas [57]. Chen et ai. tambm descobriu uma biomimtico
modelo para reconstituir surgimento morfognese angiognico [58]. eles
relatado um modelo in vitro biomimtica 3D que reconstitui o potencial
utilidade do modelo para elucidar os mecanismos moleculares que coordenam
a srie complexa de eventos envolvidos na neovascularizao.
4.3. Abordagens Sandwich co-cultura
As abordagens microfludicos e mtodos de sacrifcio-modelo tem
recentemente atraiu a ateno de redes microvasculares projetados, porque
sua morfologia e estrutura so facilmente controladas. No entanto,
a estabilidade a longo prazo das construes microcapilares obtidos ainda
um problema porque as matrizes, tais como gis de colgeno so facilmente decompostos
por enzimas expressas a partir das clulas. Esta instabilidade est intimamente relacionado
para o nmero de clulas inoculadas, porque a quantidade de enzimas expressas
dependente do nmero de clulas. Alm disso, uma vez que o nmero
de clulas circundante bastante baixo e que no entre em contato com o microvascular
redes, difcil avaliar de drogas ou celulares permeaes reais
redes fromthemicrovascular para as clulas circundantes. para desenvolver construes reais
de tecidos vascularizados 3D, as clulas circundantes deve
interagem fortemente com as clulas endoteliais microvasculares. o embutido
estruturas dos micro-vasculatures nos tecidos 3D-celular vai
ser a morfologia dos tecidos in vivo real.
Okano et al. relataram o desenvolvimento de 3D-microcapilares incorporado
em folhas empilhadas clulas [53]. Eles tambm observaram morfolgica
alteraes das HUVECs em estruturas de rede, quando as clulas estavam
ensanduichada entre duas folhas de mioblastos. Por outro lado, o endotelial
redes nas cinco camadas construes folha de mioblastos foram observados para
conectar aos vasos do hospedeiro aps o transplante no subcutnea
tecidos de ratos nus, de que resulte uma neovascularizao que permitiu o
enxerto para sobreviver. Estes 3D-tecidos prevascularized possua o bvio
estruturas incorporadas das microvasculatures nos tecidos camada de clulas,
o que pode refletir a verdadeira relao entre um capilar
e a clulas vizinhas. Actualmente, o desenvolvimento de perfusable
redes capilares sangue foi avaliado atravs da ligao ex vivo de tecidos
Amostras de agir como um leito vascular [56]. Devido ao alto desempenho
para criar o fluxo sanguneo no interior das redes capilares, os seus pedidos de
os campos biomdicos e fisiopatologia so esperados. para fisiopatolgico
aplicaes, a construo de matrizes de tecidos vascularizados 3D
em placas gerais multi-assim ser uma ferramenta poderosa.
Ns demonstramos a fabricao de matrizes de tecido 3D vascularizada,
que foram construdos em 12 e 24 placas de micro-poos utilizando a clula
acumulao tcnica [34]. A construo de tecidos thickmultilayered
com redes de tubos endoteliais HUVEC por incorporao em 3Dtissues
composto de NHDFs foi conseguida por cultura sanduche.
Aps 2-7 dias de incubao, altamente desenvolvida e redes capilares
uma morfologia tubular das HUVECs foram claramente observado por CLSM
(. Figura 5). A rede vascularizada densa e homognea no multicamadas
tecidos de um centmetro de largura e 50 mm de altura foi confirmada em 12
e 24 micro-poos inseres de cultura de clulas. A percentagem de rea ocupada
e a distncia da rede capilar de HUVEC foi calculada para ser
cerca de 63 12% e 50-150 fiM por anlise de imagem, respectivamente.
Isso proporcionaria um benefcio para as clulas circundantes, porque as clulas
em tecidos vivos necessitam de redes de tubos endoteliais dentro de um permetro
de 100-150 mM para fornecer oxignio. Alm disso, a rede de capilares linfticos
estruturas tambm pode ser obtido pelo emprego do endotlio linftico
As clulas, em vez de HUVECs.Whenwe utilizado tanto no sangue e linfa endotelial
clulas para o processo de vascularizao, as redes individuais em 3DNHDF
construes de tecido foram obtidas com sucesso. o obtida
construtos vascularizados eram estveis durante a cultura a longo prazo para a
pelo menos 3 semanas. Estes micro-vasculares e -lymph redes em vrios poos
placas sero ferramentas poderosas tanto para farmacuticos e fisiopatolgica
aplicaes.

5. direes futuras
Vrias tecnologias nicas para a construo do complexo 3D-humano
tecidos foram descobertos para a pesquisa bsica em fisiopatologia
e engenharia de tecidos. Uma vez que vrios tipos de clulas humanas so montados
juntos para construir arquiteturas de tecidos, a teoria para 3D de tecidos
construes sero estabelecidas mais cedo. O futuro vai passar para a prxima
passo, a reconstruo de "funcionais" construes de tecido 3D. aqui,
o termo "funo" inclui questes como a estabilidade a longo prazo de
as estruturas 3D como um tecido, propriedades funcionais secundrias para conter
As clulas ou tecidos funcionais e alta reprodutibilidade das estruturas
e funes para comercializao.
Em relao a longo termstability, atualmente relatou um dos themost
funes importantes como um tecido, a estabilidade estrutural dos 3Dconstructs
[59]. Neste artigo, demonstramos que os tecidos 5L-NHDF
mantiveram a sua espessura original nmero, a densidade de clula viva e camada
mesmo depois de um ms de cultura. Com efeito, as clulas apoptticas foram encontrados
nos tecidos durante a cultura de clulas, mas as clulas vivas pareciam proliferar
para encher o espao que foi gerado pelo descolamento do
clulas mortas. Embora as avaliaes de longo prazo no foram realizados ainda,
themaintenance de arquiteturas 3D do complexo ser importante para
seus aplicativos relacionados vascularizao.
Funes mais prticas precisam ser provada em um tecido 3D-humano
modelo. Por exemplo, uma funo importante do sangue capilar o
permeabilidade de molculas ou clulas. Jeon et al. relataram recentemente a
fabricao de redes 3D-microvascular perfusable numa microfluidos
chip de [57]. Tambm demonstramos o desenvolvimento de vrias camadas
capilares sanguneos em hidrogis biodegradveis, e a anlise de diferencial
permeabilidade de molculas de albumina como no interior dos capilares
em comparao com as clulas tubewithout (Figura 6.) [60] vaso sanguneo .Multilayered
estruturas revelou uma inibio da infiltrao de molculas de albumina,
Considerando que as estruturas de tubo sem a cobertura da superfcie por
As clulas apresentaram maior vazamento das molculas. Para outro exemplo,
Placentalmodels 3D-humanas construdas pela tcnica de acumulao celular
indicado pela primeira vez uma resposta sensvel ao ambiente
mudanas de presso parcial de oxignio, o mesmo que o in vivo
placenta humana [61]. Resumidamente, j relatado anteriormente toxicidade das
nanopartculas
com barreiras 2D-trofoblasto preparados empregando o BeWo

inha celular humana [62,63], mas as respostas e funes dessas barreiras
eram pobres, em comparao com as barreiras trofoblsticas reais, devido
2D e estruturas celulares lines.When modelos 3D-trofoblsticas foram desenvolvidos
usando primrios trofoblastos humanos, por esta tcnica, os modelos
revelou praticamente a mesma resposta para a alterao dos factores ambientais.
Este um bom exemplo para fornecer a biolgica e bioqumica
evidncia de clulas 3D reconstrudo constri como um tecido humano funcional
modelo para aplicaes fisiopatolgicos.
No que se refere produo industrial de construes de tecidos em 3D, a automao
do processo de fabrico importante para a elevada repetibilidade
as estruturas e funes. Alm disso, tambm eficaz a automao para
evitar qualquer contaminao causada procedimentos bymanual. como descrito
acima, o fabrico automtico de construes de tecidos em 3D, por exemplo, jacto de tinta
tecnologias de impresso e criao de prottipos, recentemente atraiu muita ateno
(Fig. 6) [23,64]. O controlo preciso das localizaes das clulas e polmeros
por impresso ou distribuio pode nos permitir construir 3D complexo
estruturas que refletem as estruturas de tecidos naturais ou rgos.
Tais tcnicas "biofabrication" esto comeando a desempenhar um papel importante
neste campo. A combinao entre biofabrication e humano
induzida por clulas-tronco pluripotentes (iPS) [65] esperado para abrir novos caminhos
para a pesquisa em patofisiologia porque as clulas iPS tm grande potencial
em alta replicao e diferenciao. Eles tambm tm o potencial
para proporcionar uma fonte ilimitada de clulas para uma variedade de aplicaes,
particularmente
em drogas triagem feita sob medida vitro [66]. Alm disso, uma vez
de doenas especficas clulas iPS, como a doena de Alzheimer ou a doena de Parkinson
ser obtido, o desenvolvimento de 3D-tecidos de doenas especficas
pode ser possvel no futuro, o que importante para a descoberta de medicamentos
andmechanismsolution.Normal e doentes construes de tecido 3D fabricados
numa micro-placa bem geral ser alternativa aplicvel para
testes de rastreio e fisiopatologia.
6. Concluses
Aqui, descrevemos uma viso geral sobre a fabricao de tecidos em 3D atual
tecnologias e suas aplicaes biomdicas, incluindo nossas duas tcnicas,
a manipulao de clulas hierrquica e do acmulo de clulas
tcnica. Construes de tecidos 3D que consistem em clulas humanas tm aberto
uma nova avenida como uma ferramenta fundamental para a engenharia de tecidos, e
farmacutica
e aplicaes fisiopatolgicos. Quanto tecnologias iPS de clulas,
a abordagem de engenharia de tecidos para a construo de tecido 3D-humano
construes deve ser investigado no futuro prximo.
Agradecimentos
Thisworkwas supportedmainly por PRESTO-JST, e em parte por um industrial
Tecnologia ResearchGrant Programin 2006 (06B44017a) de
Nedo do Japo, um Grant-in-Aid para a Investigao Cientfica em Inovadora
reas (21106514) de MEXT do Japo, o Fundo Instituto Noguchi,
e pelo prximo programa de JSPS (LR026).

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