REACCIONES DE AGLUTINACIN

Entonces, la diferencia entre una reaccin

de aglutinacin y una de
inmunoprecipitacin, es que la reaccin de
inmunoprecipitacin tenemos el fenmeno
de prozona que estudiamos en la clase
anterior. Aqu para que se produzca la
reaccin aglutinacin necesitamos que uno
de los reactantes, ya sea el antgeno o el
anticuerpo, se encuentren antiginados (
1:28) y esto se puede lograr ya sea porque
hay un antgeno particulado como el
ejemplo que aparece aqu que es un eritrocito; una reaccin donde una inmunoglobulina
entrecruza dos eritrocitos vamos a tener un antgeno particulado en este caso un eritrocito. Lo
vamos a ver como una clula, pero aparece entonces como una partcula. Entonces cuando la
reaccin antgeno anticuerpo involucra a los eritrocitos, vamos a poder observar el fenmeno de
aglutinacin. Tambin se puede hacer artificialmente particulado el anticuerpo y eso tambin lo
van a ver en el trabajo prctico, se usan anticuerpos que se les han enlazado molculas de alto
peso como partculas de ltex monocoloidal, entonces se pueden dar reacciones artificiales de
aglutinacin. Ambas ustedes las van a poder ver en el trabajo prctico en que van a tener la
opcin de ver la aglutinacin de sus propios eritrocitos para saber sus grupos sanguneos,
pincharse el dedo dejando 4 gotitas de sangre en el portaobjeto y agregarles los anticuerpos que
son especficos que son con los antgenos de su grupo sanguneo para ver si aglutinan. Porque
ejemplo si ustedes aglutinan con un suero anti -A son del grupo A. En el caso del B, darn del
grupo B... lo mismo con AB y lo mismo con el factor RH.
Pregunta alumno: Que grupo es ms predominante? No se estudios estadstico, pero hay una
doctora que ha hecho hartos estudios donde creo que el B era ms predominante en la poblacin
indgena nativa pero en general en la poblacin lo que yo ms veo es O RH positivo. O negativo
es un problema porque lo nico que puedes recibir es O negativo, lo que pasa es que es
incompatible con otros grupos, es donante universal pero como receptor solo puede recibir del
mismo grupo sanguneo.

Y esto es como se ve, si ustedes ven un botoncito rojo ,
esto est hecho en una placa de 96 pocillos, uno ve esto
que es la sangre depositada entera ah, no ocurri nada,
en cambio esto muestra una reaccin de aglutinacin
positiva que vista ms grande es como leche cortada ,
muchos grumos, se va a ver como muy multiforme. Y
cuando no es sangre, no es eritrocito el antgeno
particulado, ustedes van a ver algo as y ah dentro, si
ustedes enfocan un poquito se van a ver puntitos blancos.
Y ustedes van a ver unos test de aglutinacin que existen,
son test rpido, y ustedes se deben dar cuenta que test
son rpidos y lentos, cuales podra hacer en la puerta de un aeropuerto, como estos de
aglutinacin que en minutos ustedes pueden tener los resultados y cuales son ms complicados
como Elisa, donde ustedes van a ver que se hacen muchos lavados que se necesitan
incubadores a 37C y evidentemente, yo no lo podra montar como una prueba de emergencia.
Ustedes se van a tener q ir dando cuenta de eso, a partir de su experiencia en el laboratorio.

Y este otro test, entonces hasta aqu aglutinacin y
entonces puede ser utilizando inmunoglobulina ligada a
partcula de ltex u oro coloidal con un antgeno particulado
como el caso de los eritrocitos. Por otra parte este test, se
usa poca actualmente pero lo paso porque es difcil de
entender y porque el test da muchos conceptos
interesantes. Tenemos que se llama Test de fijacin del
complemento y como su nombre lo indica utiliza como uno
de sus reactivos el complemento y ustedes saben que el final del complemento que es... entre
otras cosas, lisis celular. Y la lisis celular, si ustedes tienen tambin como reactivo los eritrocitos,
va a significar que la hemoglobina sale de su estado
intracelular y va a darles una solucin roja que ustedes
pueden determinar y leer espectroscpicamente, van a
tener una longitud de onda de mx. Absorcin y lo llevan
al espectrofotmetro y podran llegar incluso a cuantificar.
Y me gusta pasar esto, porque aqu hay que pensar al
revs, porque cuando yo veo la lisis y veo que la solucin
se me torna roja en vez de ver los eritrocitos intactos en
el fondo del tubo, es la reaccin negativa. Una reaccin en
que hay hemolisis, cuando un eritrocito
se rompe y decimos que hay hemolisis,
que va a significar que este tubo se
torne rojo es una reaccin no reactiva.
En cambio una reaccin positiva, es
cuando no le pasa nada a mi tubo, Por
qu? Lo que yo estoy tratando de
detectar, es decir mi analito, son
anticuerpos. En este tubo hay
anticuerpos, en este otro no estn los
anticuerpos, digamos que yo quiero
saber si alguna de ustedes, quien era la
que estaba embarazada el otro da
(hacia alumna), ya por ejemplo mejor
la Camila Vallejos, yo quiero saber si
ella tiene anticuerpos anti rubeola,
entonces tengo un tubo que la paciente
si tiene los anticuerpo anti rubeola y en
el otro estn ausentes. Estos
anticuerpos tienen que ser fijadores del
complemento, luego esto es mi muestra problema 1 y esta es mi muestra problema 2, luego se
empiezan a agregar los reactivos con que yo cuento, los reactivos con los que yo cuento son el
antgeno para el cual voy a medir el anticuerpo, por ejemplo antgenos para el virus de la
rubeola, los agrego y si es que la paciente tiene los anticuerpos, el antgeno va a quedar
capturado por los anticuerpos. En cambio, si la nia no tiene los anticuerpos los antgenos
quedan libres. Luego, tercer paso, agrego otro reactivo que es el complemento, en este caso,
voy a tener un complejo antgeno-anticuerpo-complemento como siempre pasa. Aqu voy a
tener el complemento no unido y luego agrego eritrocitos sensibilizados que si se encuentran
con el complemento van a hemolizar, porque aqu no hemolizan porque esta capturado el
complemento por el complejo, entonces ante la hemolicina no van a hemolizar, porque no hay
complemento para inducir el complejo de ataque a membrana. Que pasa en el otro tubo?
Complemento libre porque no hay anticuerpos, luego yo agrego mis eritrocitos sensibilizados
(eritrocito que tiene pegado un anticuerpo eritrocitario) , con complemento voy a tener antgeno
anticuerpo complemento hemolisis y ah se entiende clarito porque la hemolisis es signo de una
reaccin negativa, no estn los anticuerpos presentes, desde el punto de vista de razonamiento
es una prueba muy linda aunque se ha ido dejando de ocupar.
Y ahora estos ensayos que son los inmunoensayos, que en un momento fueron la modernidad
pura y que los vamos a ocupar mucho en qumica fisiolgica, es una de las razones de por qu
se pide en qumica fisiolgica que ustedes sepan inmunologa primero, y porque son
importantes ? porque uno de los grandes temas que van a hablar en qca fisiolgica se trata de
las hormonas, van a tener hormonas para arriba para abajo, o sea si les gustan las hormonas lo
van a pasar bien porque porque un gran capitulo temtico es la endocrinologa. Los primeros de
estos ensayos eran con radioactividad y se llamaban radioinmunoensayo y originalmente, hay
una unin ligan receptor donde vamos a tener obviamente anticuerpos y por algo hablamos de
inmuno ensayo, y en algunos, digamos, disposiciones este puede estar libre y en general los
ms modernos siempre vamos a tener, ya sea el antgeno o el anticuerpo, inmovilizado. Los ms
modernos estn todos inmovilizados. Qu significa inmovilizados ? es que yo tengo, por ejemplo,
un tubo de ensayo o una cubetita chica donde hay pegado reactivo ese es el concepto de
inmovilizado y eso va a hacer muy importante porque facilita los procesos, yo no tengo que
hacer particulacin (? min 13) porque todo va a ir quedando pegado en el tubo o de un
pequeo pocillo.
Y aqu tenemos un ejemplo, hay muchas
categoras y hay muchos diseos, yo espero
que ustedes aprendan a disear
inmunoensayos segn el analito que
ustedes esten buscando, a veces el analito
puede ser un anticuerpo como en el que
vimos con la fijacin del complemento pero
a veces el analito puede ser un antgeno.
Entonces ustedes tienen que saber cmo
disear un inmunoensayo. Lo ms
probables es que yo les voy a pedir tanto en
los laboratorios y en los controles de
laboratorio como en las pruebas integrales
dibujarme o disearme un inmunoensayo y
ah tienen que pensar, no sacan nada con aprendrselo de memoria, tienen que pensar y decir si
esto me sirve realmente para lo que quiero o estoy midiendo otra cosa , si estoy o no
contestando la pregunta.
Una de las grandes clasificaciones,
porque hay varias clasificaciones, es
si es no competitivo o si es
competitivo. En este caso que
tenemos una superficie que puede
ser el fondo de un tubo, un pequeo
tubo de ensayo o un micro pocillos de
estas placas de 96 pocillos que
ustedes van a tener la oportunidad de
trabajar en el laboratorio y ah van a
entender un poquito mejor e
imaginarse estas cosas. Pero ustedes
no pueden ver, pero lo que ocurre es
que hay en este tipo de diseo, ya
vamos a ver que pueden haber otros,
un anticuerpo o puede ser al revs,
pero ya que este se ve como un anticuerpo vamos a llamar a este ligando un anticuerpo que va
a reaccionar con el analito. Pensemos en un ensayo que no es competitivo, cmo se disea, el
analito es mis muestras, esto que est en gris es mi muestra. Digamos que estoy buscando una
hormona tiroidea, entonces esto
es una hormona tiroidea se va a
pegar a un anticuerpo contra la
hormona tiroidea y despus para
poder visualizar esta reaccin
tengo que venir con un segundo
anticuerpo contra la hormona
tiroidea que tiene que reconocer
otro determinante antignico
pero que tenga algn tipo de
marca, qu puede ser esta marca? fluorocromo, puede tener pegado un fluorocromo, entonces
yo le hago incidir una longitud de onda que corresponde a la de excitacin y mido la de emisin.
Entonces el marcador puede ser un fluorocromo, puede ser una enzima en que yo coloco el
sustrato y tengo un producto que me da una seal que puede ser color ilumino en un
espectrofotmetro, puede ser luz ilumino en un luminometro, ya sea los diseos que tengo hoy
en da. Y en este caso digo que es no competitivo porque nadie est compitiendo por estos
espacios de unin, por lo tanto mi seal va a hacer directamente proporcional a la analito,
mientras ms hormona tiroidea haya ms fluorescencia voy a ser capaz de detectar. En cambio,
en ensayo competitivo lo que hace es introducir analito marcado, tengo una cantidad de analito
marcado compitiendo por los sitios de unin, que va a ocurrir? mientras ms analito en la
muestra, porque este es un reactivo que viene con mi ensayo, esto no es del paciente, el
paciente aporta con estas hormonas no marcadas, mientras ms analito haya en la muestra del
paciente menos marca, por lo tanto la seal es inversamente proporcional a la seal. Y esto
entonces es un concepto que es bien importante que ustedes internalicen, porque no solo les va
a servir conmigo sino tambin en los cursos que vienen. Ac hay otro ejemplo en el que yo estoy
como analito de mancuerna (? 17:31) cualquier medicin de anticuerpo tiene la gracia en que
lo que yo voy a fijar en mi tubo qu es lo que va a hacer? el antgeno. Y as es como se hacen
las pruebas de acidez, yo tengo antgeno contra el virus y voy a ver si el paciente tiene
anticuerpos. Ustedes que estn haciendo microbiologa, los virus en general se detectan
buscando los anticuerpos contra el virus, es muy poco lo que se hace del aislamiento del virus
porque es tedioso porque hay q tener cultivos celulares, la tcnica nmero 1 para detectar si
usted ha tenido cualquier virus como la hepatitis , el VIH, cuando la gente habla de ELISA para
el HIV, la gente cree errneamente que el ELISA es sinnimo de un test para el HIV. El ELISA es
un enzima inmunoensayo que puede ser para el HIV pero puede ser para muchas otras cosas y
en que se basa, en que yo voy a tener antgeno viral en la superficie ligado/fijado a la superficie
de un plstico, un tubo o un pocillo, la muestra del paciente va a tener un sin nmeros de
anticuerpos y los especficos para este antgeno van a fijarse, despus lavo, este lavado es
fundamental (importante *) porque aqu ustedes van dejando remanente que no estn fijados
especficamente empiezan a tener falsos positivos, vale decir que la muestra tiene cuando no
tiene y luego viene con un segundo anticuerpo que tiene la marca , el segundo anticuerpo
reconoce al primero en forma especfica y lleva algn tipo de marca, lavado, si aqu yo no lavo,
ste que no est pegado voy a decir que hay ms de lo que realmente hay, los lavados son muy
importantes, en este tipo de ensayos.
Este es un ejemplo de un RIA, en que es un
ensayo entonces competitivo, al ser un ensayo
competitivo qu es lo que pasa ? la seal a
medida que aumenta, el antgeno no marcado,
es decir el de mi muestra, la seal va
disminuyendo. Este es el tipo de curva de
calibrado, esta es una curva de calibrado, en
que aqu lo que ustedes estn midiendo es la
radioactividad, porque los RIA eran ensayos de
tipo ......... (20:08) en que el analito que
competa estaba marcado con algn tipo de
isotopo radioactivo. Entonces, mirmoslo ac,
mejor ms fcil de entender. Tengo... estos
son reactivos, el primer anticuerpo y un
antgeno radiactivo, digamos que la
testosterona, voy a medir testosterona en un
muchacho, y lo que voy a ver, el kit que yo voy a comprar, los reactivos que voy a comprar
traen testosterona radioactiva, traen un primer anticuerpo, luego agrego la muestra del joven
que estoy midiendo y va a producir un desplazamiento del antgeno marcado radiactivamente
por el no marcado. Y luego en el sobrenadante, voy a ver cuanta radiactividad quedo libre,
mientras ms antgeno testosterona traa ese muchacho ms desplazamiento hubo y ms
entonces voy a encontrarlo en el sobrenadante y menos en el precipitado donde lo voy a medir.
Este tipo de ensayo, que fueron muy usados antiguamente han sido siendo desplazados por
aquellos que usan fluorocromo o enzimas por razones que ustedes ya saben.
Este es un ejemplo de un ELISA, el ELISA no significa
entonces y por eso que les puse este sinnimo del test del
sida. El test del sida que se usa en realidad para un
screning de aquellos potenciales infectados, de los cuales
vamos a hablar cuando hagamos las clases de
inmunodeficiencia, es un ensayo cuya.. el acrnimo
(siglas) significa Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,
Ensayo por inmunoabsorcin ligado a enzimas, significa
que el anticuerpo esta unido a una enzima, tenemos en
este caso el anticuerpo en la plaza adherido o inmovilizado
y est midiendo troponina. La troponina se va a pegar y
luego ustedes llegan con un segundo anticuerpo, que en
este caso tiene a la enzima peroxidasa de rbano, cuando
agregan el sustrato lo que da un producto coloreado a 450
nm. Si hubiese sido con luminol da luminiscencia que se
mide en un luminometro, tambin se puede usar un
sustrato que tiene un nombre muy largo que es derivado
de la bencidina que cuando se rompe da un producto
coloreado y eso tambin se puede medir colorimtricamente.
Este es otro ejemplo, en realidad es un poquito ms de lo mismo, el antgeno , despus viene el
secundario con la enzima y luego se agrega el sustrato para que aparezca producto, porqu les
muestro varios formatos? porque ustedes deben ser capaces de dibujar ....
A: Todos estos test son a base de color, es decir se miden por ste? No, pueden ser
fluorescencia que no es color, puede ser luminiscencia que es un destello de luz.
A: Y por ejemplo por actividad metablica en la enzima? No, porque t tienes que pensar que
con miras de estar en un laboratorio, de estar dentro de un equipo automatizado y ms
automatizado que un espectrofotmetro. Si ustedes escogen la prctica en laboratorio clnico lo
que van a hacer es inyectar la muestra dentro del equipo, va a pasar todo esto, y a ti te va a
salir una guincha con los resultados, entonces lo que t dices de medir una actividad enzimtica
con mtodos bioqumicos tradicionales es demasiado engorroso porque tienes un equipo
automatizado. En la poca del romanticismo del laboratorio clnico, en donde todo era a mano s
esto pasaba, hoy da todo esto la biotecnologa y la tecnologa de ingeniera biomdica, nos ha
llevado que t puedas procesar un alto nmero de muestras con la misma cantidad de personal.
Nunca he visto algo como lo que t me dices, pero eso no quiere decir que quizs en el futuro si
se puede hacer, que alguien desarrolle esto.
Esto es lo mismo, solo para mostrar lo que es el HIV
que es un ELISA , en donde hay antgenos contra el
virus y se mide en que el paciente haya producido las
Inmunoglobulinas, por eso que es un test de screning
porque tu puedes hacer muchos pacientes
simultneamente pero el hecho que ustedes salgan
negativos no significa que estn libres de la
enfermedad y eso lo voy a dejar as para que lo
discutamos cuando hagamos la clase de
inmunodeficiencia.
A: El lavado con que se hace? Con buffer, es un buffer
que vara de test a test para que no vare mucho el pH ptimo para que se produzcan las
uniones, en el caso de ustedes nosotros se lo vamos a dar hecho, vienen listos en el kit, donde
viene concentrado y hay que diluirlo, se hacen 5 lavados de 300 uL y le agregas el siguiente
reactivo y se espera media hora. Hay que partir por el ELISA, porque hay una espera 3 veces de
media hora.

Esto lo puse, para
mostrarles otra prueba
inmunolgica que ustedes
estudiaron seguramente en
bioqumica, que son formas
de hacer cromatografa de
afinidad, ustedes en bioqca
cuando vieron las
cromatografas y las
electroforesis aprendieron
de la cromatografa de
afinidad que se puede hacer
de muchas maneras y una
de esas es pegando un
anticuerpo. Entonces si
usted pega un anticuerpo en
una columna de sefarosa,
despus pueden pegar un antgeno que se quiera aislar, despus de que esto se pego, sali se
eluyo todo lo que no quera le agrego un buffer con alta fuerza inica y desarmo la interaccin
antgeno-anticuerpo y logran entonces el antgeno purificado o pueden tambin purificar un
anticuerpo, pero para purificar un anticuerpo necesito a la sefarosa pegarle el antgeno. Y podra
separar grandes cantidades de anticuerpo.
Tambin estn los micro arreglos de protenas, que yo se los pase el ao pasado en b.
molecular, es que usted podra tener por ejemplo estos famosos reticulados con muchas
protenas pegadas en una membrana y luego poner el suero del paciente y ver para que
protenas tiene autoanticuerpos, anticuerpo secundarios marcados cierto, y vemos las marcas. Y
podemos decir, por ejemplo esto podra pedirlo la Carolina que est pidiendo un anticuerpo
antinucleares podra pedirme ms microarreglos con una serie de distintas protenas para lo cual
pudiera... autoanticuerpos, si est pensando en descartar muchas enfermedades autoinmunes,
pero si me lo pide le voy a decir que no haba plata para enfermas ? (29:08) porque as
llegara muy rpido a su resultado final.
Y este otro, yo antes no lo
pona pero cuando me
toc, o sea yo voy todos
los aos al comit de la
farmacopea de los EE.UU
que se dedica a traducir
las monografas y as me
enter que la USP....
Cuando tomen tecnologa
farmacutica sus grandes
libros compaeros y en
biofarmacia tambin
podran haber consultado
a este libro que es un
referente internacional de
monografas de control de
calidad de los
medicamentos, donde
nosotros estamos tratando de actualizar la chilena, qu es lo que mira el mundo internacional en
general es la de los EE.UU, la farmacopea de los EE.UU y dentro de los monografas de los
captulos generales de las tcnicas est esta. Que quiere decir? esta tcnica inmunolgica es
importante para los farmacuticos, por lo tanto si es importante para los farmacuticos yo se las
tengo que poner, a veces es un poco complicada de entender, yo les voy a dar la generalidad
pero si ustedes quieren saber ms pueden ir a pedir la farmacopea, porque estn todas las
ediciones de la farmacopea de los EE.UU en el departamento de tecnologa farmacutica con la
profesora Patricia Carreo y leer un poquito ms de eso. Est tcnicalo primero cuando ustedes
ven una tcnica tienen que entender para qu sirve la resonancia superficial de plasmn?
el plasmn en el fondo es este fenmeno que ocurre de refraccin de la luz que pasa a travs de
un prisma, el fenmeno fsico que ocurre aqu es un plasmn. Esta tcnica sirve para estudiar
interaccin ligando-receptor, entonces yo lo que voy a tener es anticuerpos, si ustedes se fijan
se parece mucho a las tcnicas que hemos visto antes, tengo anticuerpos pero en este caso en
vez de tenerlos en un plstico, los tengo en una superficie de oro dextrano. Entonces, quizs
conceptualmente es algo complicado, as que vamos despacito, le hago incidir una luz a esta
superficie y esto va a significar que despus va a reflectar y esa luz reflectada es lo que se
conoce como plasmn, en un distinto ngulo De qu depende este ngulo? el ngulo depende si
el anticuerpo est libre o unido entonces, para que me sirve? tienen que pensar que esta
tcnica farmacopeica son para cuantificar, por ej: medicamentos, voy a tener un anticuerpo
contra el medicamento y aplicar el medicamento al que le estoy haciendo control de calidad, si
hay poco medicamento voy a tener esta deflexin de la luz y la voy a poder medir aqu en el
detector, y si hay harto en proporcin a la cantidad que exista, voy a tener como todos estos
como complejos antgeno-anticuerpo y entonces voy a tener otra deflexin de la luz detectada.
Entonces la deflexin de la luz es proporcional a la cantidad de complejo antgeno-anticuerpo y a
su vez, la cantidad de complejo antgeno-anticuerpo es proporcional a la cantidad de analito o
del antgeno. Entonces para eso se usa esta metodologa, que est en la farmacopea, los
inmunoensayos tambin estn en la farmacopea, para que ustedes vean que estos son temas
farmacuticos y que es lo que a mi me interesa que ustedes sepan.
Y ese es un ejercicio que no
vamos a hacer, ustedes lo
resuelven, pueden salir cosas
parecidas en la prueba.

CITOMETRIA DE FLUJO
Una de las tcnicas ms importantes de la
inmunologa es la CITOMETRIA DE FLUJO.
(Habla sobre prctica profesional en Lab de Puebla)
De qu se trata la citometra de flujo? Aqu est el
primer principio Porqu flujo? Por qu cito-metria?
citometria es que voy a medir las clulas, cito es
clulas y metria es medir, uno de los primeros
aspectos para entender esto es que las clulas van a
pasar por un capilar, yo voy a hacer que mis clulas
que vienen aqu desordenadas adopten un flujo
laminar, y es tan angostito el capilar por donde van
a pasar que van a pasar de a una, tericamente,
entonces las fuerzo porque las succiono con una
bomba de vaco y las hago pasar por un pequeo
capilar, una a una van desfilando ordenaditas las
clulas. En algn punto del capilar yo soy capaz de
hacerles incidir luz que evidentemente va a ser
dispersada por las clulas segn sus propiedades, y
ese es el primer principio con el que opera el citmetro de flujo, hay una dispersin de la luz
segn las caractersticas de la clula que est pasando.

Hay 2 tipos de dispersin, aquella que es hacia
adelante (que en un citmetro dir
forward=adelante) entonces la dispersin
hacia delante nos habla de el tamao de
estas clulas, mientras ms grande, mas va a
dispersar la luz hacia delante.


Existe otra dispersin de la luz que es hacia
los lados, que es en 90 , y esa nos habla de
la granulosidad, mientras ms granulosa
sea la clula (acurdense que hay clulas tan
granulosas que las llamamos granulocitos)
por lo tanto voy a poder diferenciar las clulas
si las pongo en un grfico. Entonces yo puedo
dentro de las clulas sanguneas tener una
dispersin as, donde aqu tengo las ms
pequeas y mas lisas en su citoplasma y aqu
las ms grandes y granulosas, sin embargo,
esto no es comn que se d, uno no hace la
formula sangunea en un citmetro de flujo,
porque es un equipo muy caro para eso, existen analizadores automticos que van a estudiar en
qca fisiolgica, que funcionan parecido pero por
principios de impedancia elctrica ms que de
dispersin de la luz, porque me pasa mucho que
cuando estn en qca fisiolgica ustedes
confunden el analizador hematolgico
automtico con el citmetro de flujo, en esto se
mide las clulas que pasan pero uno los usa
para obtener la proporcin de las distintas
clulas en una muestra desconocida, en
realidad usamos el citmetro de flujo para otras
cosas, trabajamos con la deteccin de seales
fluorescentes. Cada clula de aqu podra, segn
el tratamiento previo, tener una fluorescencia y
qu es ese tratamiento previo?, eso significa
que a la clula que va a pasar o al conjunto de
clulas, yo la marqu, por ejemplo, con anticuerpo antiCD4 y que tiene un fluorocromo y otro
grupo la marque con un anticuerpo anti CD8 que tiene otro fluorocromo, entonces yo puedo
saber en una muestra de sangre cuantos tengo de CD4 y cuentos de CD8 y muchos de ustedes
van a tener que pedir esta prueba en su caso clnico (reto por poca dedicacin al caso clnico) si
ustedes piensan en un hemograma le dice cuantos linfocitos pero no les dice cuantos B cuantos
T, cuantos CD4, cuantos CD8, cuantos NK, por lo tanto esta es una prueba muy til. Entonces
las clulas van a ir emitiendo una fluorescencia que yo puedo detectar una a una mientras van
pasando y yo les aplico un laser, y luego yo tengo detectores de fluorescencia. Los citometros de
flujo pueden tener 2, 4, 6 detectores
segn el equipo, el modelo, y asi voy
a poder medir ms marcadores de
una clula en forma simultanea Qu
voy a obtener? distintas tipas de
salidas que ustedes debieran saber
interpretar, por ejemplo voy a tener
frecuencia en el eje y e intensidad de
la fluorescencia en el x Cmo
interpreto un grafico as? voy a decir,
fluorescencia casi nula, cerca del cero,
pocas clulas; tengo muchas clulas
que tienen esta fluorescencia
intermedia, y una fluorescencia
grandre gandre grande tambin tengo
pocas. entonces ustedes pueden ver
la distribucin de fluorescencias en
una poblacin de clulas, cuantas son
poco fluorescentes, cuantas son muy fluorescentes y cuantas tienen una fluorescencia mediana,
y eso les permite caracterizar una poblacin y las pueden asociar con enfermedades, por
ejemplo un seor que tiene al reves la relacin CD4/CD8, esta en una etapa muy avanzada del
SIDA y eso se sabe y se utiliza en estos pacientes para ir viendo la evolucin de su tratamiento.
Esto es como un espectofotometro al final, conla
diferencia que aqu tiene el flujo de clulas y a
medida que van pasando incide el laser va a haber
una longitud de onda que va a exitar a las
fluorocromos y van a tener distintos tubos
fotomultiplicadores que van a detectar la presencia
amarilla, la verde, la roja, la azul, segn el tipo de
instrumento que tengamos y asi podemos detectar
distintas deales fluorescentes de distintos
fluorocromos y asi saber la representatividad de los
distintos marcadores de la membrana plasmtica,
por eso es una tcnica inmunolgica que permite la
inmunotipificacin de las celulas.

Y ah est, una clula tiene muchos antgenos en su
superficies, entonces por excelencia la citometria de
flujo es una tcnica que me permite detectar antgenos
de superficie. Hoy da se han desarrollado artimaanas
para permeabilizar la clula y poder detectar antgenos
adentro, pero la mayor agilizacin de esta tcnica es
para los antgeno de la superficie. ES MUY
CUANTITATIVO, porque tu vas a decir tantas clulas
tienen tal inmunidad, tu haces normalmente pasar 10
mil clulas y despus vas tener proporciones, esto me
gusta porque tu en un experimento de un da tienes
muchos datos, mucha informacin.


Esto es un tpico inmunofenotipificacion en
que esto es frecuencia en el ejey y esto es
intensidad (x), entonces yo decido que aqu
a partir de 10 es una seal positiva
entonces yo veo que prcticamente todas
mis clulas son positivas con un promedio
de 100 unidades (arbitrareas) de
fluorescencia (no tiene unidades). Entonces
veo, son pocas las que tienen mucha, nada
aqu, unas poquitas. Pero adems lo que
ms me gusta son los graficos de
cuadrantes, se podran poner 3
marcadores con un eje z, y esto es algo
que me voy a detener, este tipo de grafico
se llama histograma y es una forma de
representar un solo marcador o un solo
fluorocromo detectado, en cambio, un
grafico de cuandrantes me permite
evaluar en una poblacin de clulas
dos marcadores en el eje x y en el y; y
adems genero estas lneas que me
generan 4 cuadrantes, gracias a tener
controles negativos yo puedo decidir que
en el eje x todo lo que esta a la izquierda
corresponde a clulas negativas, o sea
cualquier seal dentro de este sector va a ser negativa para el marcador, en este caso CD8. Y en
el eje y puedo decir lo mismo y defino esta lnea (son lneas operacionales que se definen en el
equipo con clulas controles que son no teidas) y todo lo que este por debajo de esto se
considera negativo para CD4, por lo tanto este primer cuadrante que est abajo y a la izquierda
se considera el cuadrante de las DOBLES NEGATIVA, porque? porque son negativas para ambos
marcadores, el cuadro inferior derecho se consideran SIMPLES POSITIVAS (26%) significa que
un 26% de las clulas que pasaron por el citmetro tenan marca para CD8. El cuadrante
superior izquierdo que sera en (1) se consideran SIMPLES POSITIVAS para el otro marcador,
como lo interpreto? que un 45% de las clulas que pasaron por el citmetros son positivas para
CD4, est es una relacin CD4/ CD8 para un paciente normal, es al revs para un paciente HIV.
Y solo un 2% entra en el cuadrante superior derecho que es de clulas DOBLES POSITIVAS.
Esto en la clnica es muy til y se hace.
Qu linfocitos estarn representados aqu en el doble negativo? Los B y los NK, porque no
tienen estos marcadores.
Este es otro ensayo, este es un
CD4 contra el receptor de
clula T, pero lo que quiero
mostrar aca es otra cosa que
se hace, y porque me servia la
dispersin de la luz hacia
delante y hacia el lado, porque
encuadro una zona donde yo
voy a hacer una anlisis, yo
pienso que todo lo que esta
aqu es basura (restos
celulares) y que todo lo otro
son dupletas (clulas que no
entraron de a una al
citomentro) y tambin las dejo
de lado y encierro la poblacin con la cual voy a hacer mi estudio de fluorescencia y para eso
udo el forward y el (en ingles)= (dispersin hacia el lado).
La citometria sirve para otras
tcnicas inmunolgicas y esto
puede servir para algn caso
clnico, vamos a ver que algunas
inmunodeficiencias lo que tienen es
un problema en la oxidasas de los
polimorfos nucleares, si se acuerdan
ah haban que generar especias
reactivas de oxigeno que dependan
de NADPH oxidasa y yo puedo
medir esa actividad, agrego un
reactivo que tiene que ser oxidado
por estas enzimas y tiene que
cambiar de ser no fluorescente a
ser fluorescente, esto para poder
verlo lo estimulo con otro reactivo
que es PMA que es un ester de
corbopol, entones a mis neutrofilos les agrepo el PMA y la dihidrorodamina que al oxidarse va a
emitir una fluorescencia. Si yo no veo la fluorescencia significa que la enzima NADPH esta poco
funcional, este es un ensayo como de actividad metabolica. *No se oxida el neutrofilo, sino que
molculas de oxigeno, el llamado estallido respiratorio.






Y aca hay un ejemplo de un control negativo
que se le hizo la prueba del anterior,
entonces tengo que ver las fluorescencias,
este es un seor normal (antes de
estimularlos con la fluorescencia) y luego,
fiejnse que la fluorescencia es tan alta que
prcticamente se me sale de la escala, en el
caso de los mellizos, son dos niitos
enfermitos donde casi no hay seal, este
esta mas mal que este se desplazo un
poquito pero este otro prcticamente queda
igual que si no le hubiese agregado la
muestra.



Otra enfermedad que tambin se puede
detectar con citometria de flujo es la
HEMOGLOBINURIA PAROXISTICA
NOCTURNA, si ustedes se acuerdan estos
pacientes carecen de la expresin de
CD59 y CD55, que son estos marcadores?
son maracadores que impiden que el
sistema del complemento genere el
ataque a membrana, si ud. no tiene estos
marcadores que le va a pasar a sus
eritrocitos? se van a hemolizar ante
cualquier ataque de los microorganismos
y luego va a tener hemolisis y por eso
aparece hemoglobinuria, porque hay
hemoglobina en la orina. Entonces aqu
vemos unos pacientes que se ve que en
los eritrocitos tienen dos poblaciones, una que expresa CD59 como un individuo normal y otra
que no tiene expresin y esta (CD55) tambin se fijan que estos graficos hablan por si solo?
porque aqu se ve claramente 2 poblaciones celulares, clulas que tienen una expresin
comparable con la normal y otra que tienen muy baja. Ver este tipo de graficos es diagnostico
de esta patologa. Y por ltimo, esto si lo vimos la clase pasada, se pueden hacer ensayos de
proliferacin celular que ustedes ya conocen
porque se los describ bien la clase pasada
cuando incorporan un ensayo tipo
proliferacin con koncalabalina u otro tipos
de lectinas pero en vez de ver en forma
radioactiva agrego yoduro de propidio que se
intercala en el ADN y que va a emitir una
fluorescencia que puede ser intermedia en la
fase de sntesis o el doble del material
gentico con respecto a una clula en
reposo, por lo tanto, si una poblacin celular
no prolifera ustedes van a tener aqu una
sola seal de fluorescencia a niveles bajo de
fluorescencia, en cambio si hay clulas
proliferando van a tener grficos de esta
forma.