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El presente artculo describe un mtodo directo
de cromatografa inica utilizando elucin isocr-
tica y deteccin amperomtrica pulsada (PAD =
pulsed amperometric detection) para la determi-
nacin altamente sensible de polioles hidrosolu-
bles y alcoholes de azcar as como de monosa-
cridos, disacridos y oligosacridos en alimentos
esenciales y no esenciales. Mientras que la deter-
minacin de carbohidratos en la mayora de los
alimentos exige slo una preparacin mnima de
las muestras como dilucin y filtracin, las mues-
tras con matrices complicadas como las de pro-
ductos lcteos que contienen protenas deben so-
meterse a una dilisis antes de la inyeccin.
Introduccin
Los carbohidratos o sacridos, denominados
tambin azcares, son las molculas orgnicas
ms abundantes en la biosfera. Existen diferentes
clases de sacridos: los monosacridos (por
ejemplo, glucosa, fructosa, xilosa o manosa), los
disacridos (por ejemplo, sacarosa, lactosa o mal-
tosa), los trisacridos, los oligosacridos y los po-
lisacridos. Los carbohidratos son uno de los tres
macronutrientes (adems de las protenas y las
grasas) que suministran energa al organismo. Pa-
ra que el cuerpo humano pueda usar esta ener-
ga, captada y almacenada bsicamente en el pro-
ceso de fotosntesis, los carbohidratos se deben
metabolizar. Los polisacridos complejos son
elementos estructurales en las paredes de las c-
lulas de plantas y bacterias, almacenados para ali-
mento y funcin de soporte estructural. Adems,
la ribosa y la deoxiribosa forman parte de la es-
tructura del ADN y del ARN.
Debido al amplio uso y a la gran importancia de
los carbohidratos, su determinacin es de sumo
inters para la investigacin biolgica, medio
ambiental, clnica y mdica. Adicionalmente, el
control de calidad de los alimentos asegura a los
consumidores un suministro ptimo de carbohi-
dratos.
Las tcnicas de anlisis ms comunes para la de-
terminacin de carbohidratos son la resonancia
magntica nuclear
1
H (RMN), la espectroscopa
infrarroja por transformada de Fourier (FT-IR), la
electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE), la
espectrometra de masas (MS) y la cromatografa
de gases y lquidos. Mientras que para los mto-
dos espectromtricos se necesitan instrumentos
costosos y personal altamente especializado, las
tcnicas de cromatografa de gases exigen deriva-
tizaciones que requieren mucho tiempo. Debido
a estos inconvenientes, el uso de la cromatogra-
fa de intercambio de aniones de alta eficacia es
cada vez ms utilizada para la determinacin de
carbohidratos. En fases mviles fuertemente al-
calinas, los aniones de azcar se separan en una
resina de intercambio aninico de carga positiva.
Sutiles diferencias en los valores pK
a
de los gru-
pos hidroxilo de los carbohidratos permiten una
separacin eficiente de sacridos de bajo peso
molecular. Sin embargo, la deteccin sensible
y directa de los carbohidratos separados ha sido
un problema durante mucho tiempo. Debido a la
ausencia de cromforos y fluorforos, no es po-
sible utilizar ni detectores UV ni de fluorescencia.
Adems la deteccin del ndice de refraccin se
ve afectada por la baja sensibilidad y por la impo-
sibilidad de aplicar la elucin en gradiente. Duran-
te muchos aos se han recomendado las reaccio-
nes de derivatizacin postcolumna para la detec-
cin espectrofotomtrica de carbohydratos.
Pero si bien estos mtodos son ms sensibles,
tambin es cierto que la derivatizacin exige un
intenso trabajo de laboratorio y es a menudo
propensa a errores.
La solucin: Cromatografa inica con detec-
cin amperomtrica pulsada
Como los carbohidratos son electroqumicamen-
te activos, la deteccin amperomtrica supera los
inconvenientes antes citados. Se trabaja con el
principio de medida de tres electrodos, usndose
normalmente un electrodo de trabajo de oro. Se
emplean tres potenciales de trabajo diferentes:
Primero se aplica un potencial positivo (E1) para
determinar los analitos objetivo, seguido de un
segundo potencial ms positivo (E2) para la elimi-
nacin oxidativa de cualquier producto de reac-
cin de la superficie del electrodo. El tercer po-
tencial (E3), negativo, se aplica para reducir cual-
quier xido de la superficie del electrodo. Todo
el proceso de tres pasos dura generalmente un
segundo y se repite cada segundo para evitar la
contaminacin del electrodo. La PAD ha demos-
trado su efectividad no slo para los carbohidra-
tos, sino tambin para aminoazcares, aminoci-
dos, aminas biognicas, especies que contienen
sulfuro, alcoholes y algunos antibiticos.
Por medio de diversas aplicaciones demostrare-
mos el potencial que ofrece la cromatografa i-
nica seguida de deteccin amperomtrica pulsa-
da para la determinacin de muestras de alimen-
tos y bebidas.
Materiales y mtodos
a) Instrumentos
La columna de separacin empleada y los par-
metros ms importantes estn indicados en los
cromatogramas correspondientes. Se usaron los
aparatos siguientes (Figura 1):
850 Professional IC con IC Ampero-
metric Detector
858 Professional Sample Processor
El control de los instrumentos, la re-
copilacin y el procesamiento de los
datos se realizaron con el software
MagIC Net (Metrohm AG).
b) Reactivos y eluyentes
Los carbohidratos fueron de grado analtico, ad-
quiridos de Fluka (Sigma Aldrich, Buchs, Suiza).
Todas las soluciones patrn y eluyentes se prepa-
raron con agua desionizada con una resistencia
especfica superior a 18 Mcm.
Ejemplo 1 Determinacin de carbohidra-
tos en extractos de malta
Los extractos de malta viscosos o secos se obtie-
nen de cebada germinada y contienen enzimas na-
turales, en particular amilasas, que convierten el
almidn en azcares hidrosolubles. Los extractos
de malta se destacan por sus altos valores nutri-
cionales y fisiolgicos. La malta se agrega como su-
plemento nutricional a las dietas de nios y perso-
nas mayores. Adems, es un ingrediente interme-
dio muy empleado en alimentos para nios y mas-
cotas, en variedades de pan, caf instantneo, be-
bidas, helados, productos farmacuticos, etc.
Informacin experimental
La preparacin de muestras de extractos de mal-
ta es directa y consiste solamente en una dilucin
1:100, tras la cual la muestra se puede inyectar
directamente.
Resultados
La glucosa, la fructosa y la sacarosa son los com-
ponentes responsables de la dulzura. Como los
dos ltimos azcares no estn presentes en con-
centraciones detectables (Figura 2), los extractos
de malta slo se perciben mucho menos dulces
que los productos que contienen principalmente
sacarosa. Adems de glucosa y maltosa, el extrac-
to de malta analizado contiene tambin varios
Anlisis de carbohidratos en alimentos esenciales y no esenciales
por cromatografa inica
Figura 1: 850 Professional IC con IC Amperome-
tric Detector y 858 Professional Sample Processor.
Figura 2: Cromatograma PAD de una muestra
dializada de extracto de malta que contiene
593 mg/L de glucosa, 5642 mg/L de maltosa,
1029 mg/L de maltotriosa, 291 mg/L de maltote-
traosa, 164 mg/L de maltopentaosa, 327 mg/L de
maltohexaosa y 97 mg/L de maltoheptaosa.
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maltooligosacridos. El perfil de sacridos obser-
vado en la muestra analizada corresponde a la
composicin general de un extracto de malta.
Ejemplo 2 Contenido de carbohidratos en
productos lcteos
A diferencia de la preparacin directa de la mues-
tra de extracto de malta, el anlisis de muestras
que contienen protenas, tales como los produc-
tos lcteos, es ms exigente. La precipitacin de
las protenas contamina la columna y termina des-
truyndola. Esto puede evitarse integrando pro-
cedimientos de precipitacin previos como la
precipitacin Carrez. Sin embargo, la prepara-
cin de estas soluciones es muy laboriosa, ade-
ms la precipitacin presenta los inconvenientes
de coprecipitacin, inclusiones y una elevada des-
composicin de los azcares.
Por el contrario, la separacin de carbohidratos
de protenas de alto peso molecular se puede efec-
tuar sencillamente mediante la tcnica de dilisis
stopped-flow (flujo detenido). Este procedi-
miento se basa en la difusin selectiva de molcu-
las o iones desde un lquido (donador o solucin
de muestra) a otro (solucin aceptadora) a travs
de una membrana. La fuerza que impulsa la trans-
ferencia es el gradiente de concentracin a travs
de la membrana. Los umbrales de separacin mo-
lecular estn determinados generalmente por el
espesor y la porosidad de la membrana.
A diferencia de la dilisis dinmica, donde dos so-
luciones pasan continuamente a travs del mdu-
lo de dilisis, en dilisis de equilibrio el flujo de al
menos una de las soluciones se detiene temporal-
mente hasta que la concentracin en la solucin
aceptadora es la misma que en la solucin dona-
dora. Este procedimiento patentado de flujo de-
tenido tiene una duracin de 14 minutos aproxi-
madamente y se puede acoplar directamente a
un cromatgrafo inico (Figura 3). Como la di-
lisis se efecta durante el registro del cromatogra-
ma de la muestra precedente, la duracin del an-
lisis no es ms larga.
Informacin experimental
El contenido de carbohidratos en muestras de yo-
gures de frutas se determin segn el siguiente
procedimiento: antes de la dilisis se disolvieron
10 g de yogur en 1 L de agua ultrapura y la solu-
cin resultante se diluy en una proporcin de
1:10 (v/v). Despus, 10 mL de esta solucin pa-
saron a lo largo de la membrana de dilisis trans-
Extracto de patatas T, D, F + + +
Comida funcional T, D, F + + + + + +
Alimentos Extractos de alimentos T, D, F + + + + +
Productos lcteos Dilisis + + + + + + +
Comida para bebs Dilisis + + + +
T instantneo D, F + + + +
Cerveza U, D +
Mosto de cerveza F, D + + + + +
Extracto de malta D + + + + + + +
Bebidas Vodka D + + +
Zumo de manzana D +
Bebida cola D + + +
Cola diettica D + + + +
Zumo de naranja D, F + + + +
Caf instantneo E, D, F + + + + + + + +
Extractos &
Extractos de remolacha D + + + + + + + + + +
jarabes
Jarabe de maz D + + +
Jarabe de arce D + + +
Chicle sin azcar E, D, F + + + +
Golosinas Dulces E, D, F + + + + +
Chocolate E, D, F + + + + + + + + + + +
Tabla 1: Seleccin de varias determinaciones de azcares.
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polioles alcoholes
de azcar
monosacridos disacridos oligosacridos
T: trituracin, D: dilucin, E: extraccin, F: filtracin, U: tratamiento por ultrasonido
Figura 3: Diagrama esquemtico que muestra la clula de dilisis inline (a) y su conexin al CI (b). El
diagrama y la foto en la parte izquierda inferior (c) muestra la clula de dilisis de flujo en espiral pa-
tentada por Metrohm.
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rutinaria, calibracin y capacitacin profe-
sional. Para apoyar sus requerimientos de
validacin, se ofrece una documentacin,
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dacin (VSP = Validation Support Package)
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Anote el 212-28
Instrumentos, insumos y servicios de asistencia
portados por la bomba peristltica integrada en
el 838 Advanced IC Sample Processor, mientras
la solucin aceptadora se detena. Durante la mi-
gracin de los carbohidratos dializables desde el
flujo de la muestra a la solucin aceptadora, las
protenas de alto peso molecular permanecieron
en el lado de la membrana correspondiente a la
muestra. Finalmente, la solucin aceptadora se
transfiri al lazo de muestra.
Resultados
La Figura 4 muestra el cromatograma de una
muestra dializada de yogur de frutas con los si-
guientes picos: el poliol inositol, el alcohol de az-
car sorbitol y los monosacridos y disacridos,
glucosa, galactosa, fructosa, lactosa y sacarosa.
Anlisis reiterados no mostraron variaciones en
las reas de pico, alturas de pico o tiempos de re-
tencin. Esto sugiere que las protenas de la
muestra no pasaron a travs de la membrana.
Por el contrario, los porcentajes de recuperacin
de carbohidratos del 95% al 105% indican no s-
lo una permeabilidad cuantitativa de la membra-
na para los carbohidratos por determinar, sino
tambin la conveniencia de la tcnica de dilisis.
Contenido de carbohidratos en diversos ali-
mentos y bebidas una vision de conjunto
El anlisis de carbohidratos ofrece una amplia va-
riedad de posibilidades de aplicacin para el an-
lisis de bebidas, comidas y dulces (Tabla 1). A di-
ferencia de la matriz con protenas arriba mencio-
nada, la mayora de las muestras de alimentos s-
lo exigen mtodos de preparacin como tritura-
cin, dilucin, extraccin, tratamiento por ultra-
sonido y/o filtracin. En la Tabla 1 se presenta
una visin de conjunto de la determinacin de va-
rios polioles, alcoholes de azcar y monosacri-
cos, disacridos y oligosacridos en diferentes ali-
mentos.
El equipo presentado tambin facilita el anlisis
de carbohidratos en extractos de plantas, sangre,
orina, productos farmacuticos, explosivos o
biocombustibles, pero estas determinaciones ex-
ceden el alcance de este artculo.
Conclusin
La cromatografa inica con deteccin ampero-
mtrica pulsada se puede utilizar para la determi-
nacin de varios carbohidratos en diferentes ma-
trices de alimentos. Mientras que la mayora de
las muestras no exigen ms preparacin que la
extraccin, la trituracin, la dilucin o la filtra-
cin, la determinacin de carbohidratos en matri-
ces difciles se puede realizar fcilmente con la
tcnica acreditada de dilisis de Metrohm.
Referencias
1. Cataldi T.R.I., Angelotti M. y Bianco G., Deter-
mination of mono- and disaccharides in milk
products by high-performance anion-exchange
chromatography with pulsed amperometric de-
tection, Anal. Chem. 485, 43-49 (2003).
2. Meyer A., Raba C. y Fischer K., Ion-pair RP-
HPLC determination of sugars, aminosugars
and uronic acids after derivatization with p-ami-
nobenzoic acid, Anal. Chem. 73, 2377-2382
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3. P. Deepak, Carbohydrate analysis in food pro-
ducts and beverages, Food&Pack, 40 (2002).
4. Takematsu M.M., Carreira W., Batista F.F., Za-
nuni L. y Sertek P.A., Quantification of carbohy-
drates and uronic acids in eucalyptus wood spe-
cies by ion chromatography with PAD using a
gold electrode, Pittcon 2008, http://www.
metrohm.com/com/Applications (bsqueda
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5. Rick S., Steinbach A. and Wille A., Analysis of fo-
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ne analysis, G.I.T. Laboratory Journal 11-12, 41-
43 (2008).
Alfred Steinbach y Andrea Wille
Metrohm, Suiza
Anote el 212-305
Figura 4: Cromatograma PAD de una muestra
dializada de yogur de frutas que contiene
0.2 mg/g de inositol, 0.8 mg/g de sorbitol,
21.0 mg/g de glucosa, 7.4 mg/g de galactosa,
16.1 mg/g de fructosa, 26.5 mg/g de lactosa y
77.0 mg/g de sacarosa.
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