Desarrollo de Metodos Por HPLC

1
QUANTAR ; Laboratorio de Anlisis Qumico Especializado

3
La cromatografa Lquida de Alta Eficiencia es la tcnica
con mayor mercado en el mundo instrumental
analtico gracias a su versatilidad, excelente capacidad
para el anlisis de trazas, rapidez y adaptabilidad.
4
Limitaciones del HPLC : Falta de operadores
experimentados.
Razones :

-Escaso entrenamiento en las universidades (costos de
equipos y escasa experiencia de la mayora de los
profesores).

- Pocas personas interesadas en aprender
cromatografa.

- Poca oportunidad practica de contacto con la tcnica.
6
7
Tiempo de retencin. Tiempo que
transcurre desde la inyeccin de la
muestra hasta que el soluto alcanza el
detector( tambin Ve, Te Tr)
Tiempo muerto. Tiempo necesario
para que una especie que no se
retiene en la fase estacionaria
alcance el detector (tambin Vm).
CROMATOGRAMA
Lnea base. Seal de la fase mvil
Ancho del pico en la base.
Medida del tiempo en
donde se inicia la salida de
la seal hasta donde
termina sta.
8
Longitud
de la
columna
Altura equivalente del plato (HEPT) H = L
N
Es el sitio de interaccin donde se consigue un equilibrio transitorio del
eluato entre la fase estacionaria y la fase mvil.
9
As10% =b/a
Ideal = 1
Aceptable = 0.8 a 1.3
10% Altura
10
11
k = Nmero de moles de soluto en la fase estacionaria
Nmero de moles de soluto en la fase mvil
12
13
Procedimientos empricos = interminables ensayos de prueba y error.
Ejemplos de resultados :

- k muy prximo a cero
- Tailing > 2.0
- Cromatogramas con amplios sectores vacios separando bandas
parcialmente solapadas.
- Ninguna documentacin de los ensayos realizados
- etc
1. Intentar separacin por fase reversa regular
2. Intentar por apareamiento inico
3. Probar con diferentes columnas
4. Modificar pH, temperatura, , etc.
14
Pico 1
Pico 2
Pico 3
Pico 4
20 min. 5 min. 15 min.
15
Procedimientos sistemticos = Lgica y sentido comn (Bases tericas)
Reduccin de tiempos y costos !!
Pico 1
Pico 2
Pico 3
Pico 4
Pico 1
Pico 2
Pico 3
Pico 4
16
17
Objetivos :
- Screening, identificacin o cuantificacin ?

- Nivel de concentracin (macro o microcomponentes) ?

- Precisin requerida ?

- N componentes a valorar ?

- N muestras a procesar ?

- Nivel de tecnologa disponible ?

- Operadores (habilidades, experiencia, capacitacin)
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Informacin Sobre la Muestra :
- Identidad de componentes de inters

- Rango de pesos moleculares

- Estructura qumica, pKa, solubilidad, espectros UV

- Concentracin de los componentes de inters

- Naturaleza de la matriz ( producto natural, muestra biolgica, tabletas, etc.)
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Definicin del Sistema Preliminar :
- Preparacin de la muestra :
Solubilizacin
Extraccin
Preconcentracin
Derivatizacin
- Detector a utilizar :
IR
UV/VIS
Conductividad
Electroqumico
Fluorescencia
- Peso molecular del analito (WM > 2000 Daltons WM < 2000 Daltons ?)
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- Mtodo cromatogrfico para molculas con WM > 2000 Daltons :
Aplicacin en anlisis de Pptidos, Protenas, Polinucletidos, etc.

Primer alternativa :
- Exclusin por tamao o SEC (GPC, GFC)

Otras alternativas :
- C. Afinidad (anticuerpos, hormonas, etc. como fase estacionaria)
- C. Intercambio Inico o IEC ( intercambiadores dbiles WAX y WCX o fuertes
SAX y SCX sobre base Slica o polimrica)
- Interaccin hidrofbica, IEC, RP
- Fase reversa (Partculas de 300 a 1000 )

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-Mtodo o forma cromatogrfica para molculas con WM < 2000 Daltons :

a. Soluble en solventes orgnicos:
- Slica gel no modificada
- Fase normal (NP-BPC)
- Fase reversa (RP-BPC)

b. Soluble en agua :
- Inico IPC, IEC
- No Inico NP, RP

Compuestos Mtodo Columna Fase mvil y Aditivos
Neutros
No inicos
RP C8 - C18
Phe - CN
Agua modificador
(MeOH, AcN, THF)
Acidos dbiles RP Control de la
Ionizacion
C8 - C18
Phe - CN
Agua modificador
Acido Fosfrico a pH 3.0 a 3.5
Bases dbiles RP C8 - C18
Phe - CN
Agua modificador
30mM Trietilamina
Inicos e Ionizables RP de Apareamiento
ionico
Preferida C18
Alternativa C8 -
CN
Agua MeOH
Alquilsulfonatos pH 3.5 (bases)
Tetraalquilamonio pH 7.5 (cidos)
Lipoflicos insoluble en solventes
hidroalcoholicos
NP CN NH2
Silica
Solventes polares
Iones inorgnicos, Aminocidos, Pptidos,
derivados de Acidos nucleicos
IEC SAX SCX
Base silica o
polimerica
Agua modificador
pH controlado
Fuerza inica controlada
Macromoleculas SEC
IEC
Base silica o
polimerica
Acuosos (GFC)
Orgnicos (GPC)
Estereoismeros
Ismeros de posicin
NP Silica Solventes no polares
Enantimeros (Ismeros pticos) RP
Columna Quiral
Quirales C18 Acuosos
Compuestos Quirales
Carbohidratos Columna Amino NH2 Agua - modificador
22
23
24
A. Determinar longitud de onda de trabajo (Deteccin UV) :

- Mximo de absorcin
-Normalmente 190 a 210 nm 254nm para muestras desconocidas.

B. Concentracin de muestra y volumen de inyeccin :

-Hasta 100 g en 20 l.

C. Control del flujo, presin y tiempo de corrida :

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D. Determinar tipo y caractersticas de columna :
- Forma y dimetro de partcula
- Longitud de Columna
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- Longitud y tipo de fase ligada C4, C8, C18, CN, Phe
Bondapak CN
Bondapak Phe
Bondapak C18
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- Y la Marca (Fabricante ) ??
28
E. Establecer fase mvil de partida :

- Tipo de modificador orgnico (MeOH, ACN, THF)
- Proporcin modificador : agua (%)
- pH y aditivos
- Modo Isocrtico vs Gradiente

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- Determinacin del tipo de modificador orgnico:
30
Propiedades de solventes
habituales de HPLC
31
- Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:

1. Comenzar con concentracin media de modificador ?
2. Comenzar con concentracin alta de modificador ?
3. Realizar gradiente (Lineal 0 100% de modificador) y calcular composicin
para corrida socrtica ?.

32
- Determinacin de la proporcin agua - modificador orgnico:
33
. Ejercicio!
34
35
-Regulacin del pH de la fase mvil : Supresin Inica (Control de la Ionizacin)

a. Compuestos neutros (No ionizables)
b. Compuestos cidos o bsicos (Control de la ionizacin)

AH A- + H+
B + H2O BH+ + OH-
pH = pKa + log Cs / Ca
Cuidado con
la columna !!
36
37
- Mejorando el Tailing : (Columnas con base de Slica)
Muestra : Base Nitrogenada
Conc. : 0.05 y 5.0 mg/ml
Columna : C18
F.M. : Buffer MeOH (1:3)
pH = 7.0
Flujo : 1.0 ml/min.
Muestra : Base Nitrogenada
Conc. : 0.05 y 5.0 mg/ml
Columna : C18
F.M. : Buffer MeOH (2:3)
con TEA 30mM
pH = 3.0
Flujo : 1.0 ml/min.
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F. Resultados no satisfactorios ? Cromatografa de apareamiento inico (IPC)
Limitaciones :

- Generalmente uso de columnas C18.
- Principal modificador orgnico es MeOH. Solvente con mayor poder de
disolucin de sales.
- Los contraiones de apareamiento (alquilsulfonatos, tetraalquilamonio) son
difciles de remover. Modifican la selectividad de la columna.
-Las sales de tetraalquilamonio, complejan la silica gel aumentando su
solubilidad especialmente a pH alcalino.
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- Condiciones en Cromatografa de apareamiento inico (IPC)

Para Bases :

Fase mvil : agua MeOH (20:80) + Hexanosulfonato de sodio 5mM
pH : 3.0 - 4.0 con buffer 0.05 0.1M Fosfrico/Fosfato de amonio
Reducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendo
constantes el pH y la concentracin del contrain.
Para cidos :

Fase mvil : agua MeOH (20:80) + Hidrxido de tetrabutil amonio 5mM
pH : 7.0 7.5 con buffer de fosfatos
Reducir proporcin de Metanol hasta conseguir separacin manteniendo
constantes el pH y la concentracin del contrain.
40
G. Realizar inyecciones de prueba :

1. Inyectar estndar de analito (puede ser materia prima)
2. Inyectar cantidad suficiente para diferenciar de picos de posibles impurezas.
3. Reducir cantidad inyectada hasta tener una respuesta menor a 0.5UA para asegurar
trabajar dentro del rango lineal del detector UV, aunque esto deber verificarse
durante la validacin.
+
R
e
s
p
u
e
s
t
a

Tiempo
41
42
Una vez establecido un sistema apropiado
(columna, solvente, parmetros
instrumentales), se tiene un mtodo
preliminar que deber optimizarse para
mejorar al mximo la separacin
cromatogrfica.
43
Ajuste de los parmetros cromatogrficos :

- Resolucin (R)
- Capacidad (k)
- Eficiencia (N)
- Selectividad ()
44
45
Formula de calculo basada en
el grafico.
1. Resolucin :
R = (t2 t1) .
(W2 + W1)
Formula dependiente de los
tres factores :

- Capacidad (k)
- Eficiencia (N)
- Selectividad ()
R = ( 1). . N . k .
(1 + k)
46
tn , tiempo de retencin del pico de inters
T0 , tiempo de volumen muerto
k varia simplemente ajustando la fortaleza de la fase mvil
2. Regulacin de la capacidad (k) :
k = (tn t0).
t0
Para fase reversa :

- A mayor proporcin de agua mayor k, o sea mayor retencin
- A mayor proporcin de modificador menor k (MeOH, ACN, THF)
- Cambios de pH en la F.M. no modifican tr de compuestos neutros
- Cambios de pH en la F.M. producen grandes cambios en el tr de
compuestos disociables.
- En IPC tr aumenta con la concentracin y longitud de la cadena alqulica
47
La resolucin no varia linealmente
con k sino con k/(1 + k) de modo
que un aumento en la retencin
produce significativos cambios en la
resolucin solo si k<6.
Rangos de k apropiados :

- 2< k<6 , sistemas con 2 a 3 seales
- 2< k<10 , sistemas con 4 a 8 seales
- 0.5< k<20 , sistemas muy complejos
2. Regulacin de la capacidad (k) :
R = ( 1). . N . k .
(1 + k)
48
Pico k
1 1.7
2 3.0
3 4.4
4 6.2
Pico k
1 2.8
2 5.6
3 9.3
4 14.6
2. Regulacin de la capacidad (k) : . Ejercicio !
49
N , platos tericos
tn , tiempo retencin del pico ensimo
wtan , ancho del pico tangencial
3. Regulacin de la eficiencia (N) :
N = 16(tn / wtan).
N aumenta de varias formas :

- Disminuyendo el caudal
- Utilizando columnas mas largas
- Columnas con partculas de menor dimetro
- Acoplando columnas
- Aumentando la temperatura
- Columnas nuevas o regeneradas
- Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos
50
La resolucin no varia linealmente
con la eficiencia (N) sino con su raz
cuadrada (N).
N N
10000 100.0
20000 141.4
40000 200.0
R = ( 1). . N . k .
(1 + k)
51
Aumentar N :

- Disminuyendo el caudal
- Utilizando columnas mas largas
- Columnas con partculas de menor dimetro
- Acoplando columnas
- Aumentando la temperatura
- Columnas nuevas o regeneradas
- Menor longitud de tuberas y menores volmenes muertos
52
4. Regulacin de la selectividad () :
Coeficiente del factor de capacidad de un par de picos
= k2 / k1.
Agotadas las variaciones de k y N, si la resolucin no es la adecuada se
intenta un cambio de selectividad.
Implicaciones :

Modificaciones importantes en el sistema cromatogrfico con resultados que
pueden ser imprevistos (mejores o peores).

1. Fase mvil
2. Columna
53
4. Regulacin de la selectividad () : . Mejorando la fase mvil
Triangulo de
selectividad de
solventes propuesto
por Snyder segn el
tipo y magnitud de
interaccin
54
Fuerza de elucin de fase mvil:
Metanol
(Grupo II)
Acetonitrilo
(Grupo VI)
Cambio de selectividad
F , Fuerza total de la fase mvil
Fi , Fuerza del solvente i
i , Fraccin en volumen del solvente i
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Solvente
Fuerza de
elucion
Agua 0.0
Metanol 2.6
Acetonitrilo 3.2
Tetrahidrofurano 4.5
56
F F.M. = FMeOH MeOH + FH2O H2O
FMeOH . MeOH
ACN = F MeOH MeOH
F ACN
FACN .ACN
=
ACN = 2.6 x 70
3.2
F.M.
MeOH - H2O
(70:30)
F.M.
ACN - H2O

Cambio de selectividad
ACN = 56.88
(57:43)
57
Efecto del
modificador orgnico
sobre la resolucin y
seleccin de una fase
mvil ternaria en
base a los resultados.
59
60

GRACIAS POR TU ATENCION Y
EXCELENTE DISPOSICION !!


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