3er.

Encuentro de J venes Investigadores en Ciencia y Tecnologa de Materiales

Concepcin del Uruguay, 12-13 de agosto 2010


DENDRONIZACIN DE POLMEROS SINTTICOS
MACROPOROSOS.

Gabriela Bertolotti y Daro Arra
1

Directores:
Marisa Martinelli
1
y Cecilia lvarez Igarzabal
1

Departamento de Qumica Orgnica IMBIV
1
Facultad de Ciencias Qumicas Universidad
Nacional de Crdoba Haya de la Torre y Medina Allende Ciudad Universitaria Cd. Postal 5000
Crdoba Capital Crdoba Argentina.

E-mail: bertolotti.gaby@gmail.com


RESUMEN

La cromatografa de afinidad es una tcnica que involucra la separacin, aislamiento y/o purificacin
de molculas biolgicas. Se basa en interacciones reversibles bioespecficas entre la molcula
biolgica de inters y una molcula denominada ligando especfico, unido a la matriz polimrica.
Uno de los tipos de polmeros que suelen utilizarse en esta clase de cromatografa son las barras
monolticas porosas. stas, estn constituidas por un polmero altamente entrecruzado, no
expandible, estable mecnicamente, hidroflico y derivatizable. Esta derivatizacin puede ser llevada
a cabo con molculas dendrticas, de distinta generacin, permitiendo aumentar la funcionalidad
qumica de dichas matrices.
El objetivo del presente trabajo es la dendronizacin de polmeros sintticos macroporosos, los cuales
presentan propiedades adecuadas para su uso como soportes para afinidad cromatogrfica,
combinando sus ventajas con la multifuncionalidad de los dendrones.
Se sintetiz el polmero macroporoso poli(N-acriloil-tris(hidroximetil)aminometano-co-
glicidilmetacrilato-co-N,N-metilenbisacrilamida) poli(NAT-GMA-BIS), con grupos funcionales
epxido, sobre el cual se realizaron reacciones de modificacin con etilendiamina (EDA) para
obtener el producto poli(NAT-GMA-BIS)-EDA. Posteriormente, se llev a cabo la dendronizacin
con molculas dendrticas de primera generacin (amina de Behera y Weisocianato, respectivamente)
siguiendo una metodologa graft-to. Los grupos ster terminales de los dendrones fueron
hidrolizados, de modo de obtener cidos carboxlicos, capaces de quelar metales.
Se lograron altos rendimientos de dendronizacin e hidrlisis de ambas matrices, quedando en curso
la quelacin de Cu
+2
, con el fin de estudiar sus comportamientos como soportes de IMAC
(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography).


PALABRAS CLAVE: afinidad cromatogrfica; barras macroporosas; polmeros dendronizados


1. INTRODUCCIN
Luego del descubrimiento de los polmeros, en la dcada del `20 [1], la ciencia se orient hacia la
modificacin de las propiedades del material polimrico, considerando dos clases de polmeros:
lineales y entrecruzados. Estos ltimos, pueden formar redes altamente entrecruzadas, por medio de
uniones covalentes, resultando materiales insolubles. Estas redes entrecruzadas se pueden clasificar en
expandibles u homogneas y en rgidas o heterogneas. Las redes rgidas son por lo general altamente
porosas, no expandibles, estables mecnicamente, hidroflicas y derivatizables. Estas caractersticas
Gabriela Bertolotti y Daro Arra

hacen que las mismas sean requeridas como fase estacionaria en diferentes procesos cromatogrficos,
entre otros campos de aplicacin.
A principios de la dcada del 90 tres grupos de investigacin desarrollaron simultneamente sistemas
polimricos macroporosos continuos, en forma de barra [2-4], para eliminar el problema del flujo a
travs de los espacios interpartculas, que presentan las columnas para cromatografa, que utilizan
partculas como relleno. La gran ventaja que presentaron estos nuevos materiales, formando una barra
de fase contnua, fue la de incrementar la transferencia de masa por un transporte convectivo, ya que
en este caso la fase mvil es forzada a atravesar por todo el medio de separacin, a diferencia de los
soportes en forma de partculas en donde el mismo fluye por los espacios interpartculas [5].
Por otra parte, y ms recientemente, se desarrollaron los polmeros hiperramificados o dendrmeros.
Estos, son estructuras monodispersas, de alto peso molecular, con un punto de ramificacin en cada
unidad monomrica partiendo de un corazn multifuncional. Poseen un estricto control de la
arquitectura molecular como as tambin una alta complejidad estructural. En su parte ms externa
poseen una alta densidad de grupos funcionales que pueden ser modificados para controlar las
propiedades de la macromolcula resultante.
Idealmente, los dendrmeros son estructuralmente perfectos, y constituyen especies monodispersas con
dimensiones bien definidas, superficies y cavidades. Estas caractersticas los hacen interesantes para
numerosas aplicaciones como transporte y liberacin controlada de drogas, catalizadores quirales
macromoleculares [6], entre otras.
A pesar de todas las ventajas y cualidades que presentan los dendrmeros, su sntesis es muy tediosa y
costosa, dificultando la obtencin de nuevas familias dendrticas. Una alternativa para poder
aprovechar las caractersticas de los dendrmeros, y que est ganando gran inters en la ltima dcada,
es su incorporacin a polmeros, dando origen a interesantes alternativas estructurales, conocidas hoy
con el nombre de polmeros dendronizados o dendrigraft [7-9]. Una de las propiedades que presentan
es la facilidad de sufrir modificaciones qumicas internas o superficiales, que promueven su
adaptacin hacia usos especficos, tales como la cromatografa de afinidad, agentes de liberacin
controlada de medicamentos, herbicidas, macrocatalizadores, entre otros.
Existen tres tipos de estrategias sintticas para generar polmeros dendronizados [6]. En la estrategia
Graft From se incrementa la generacin del dendrn a partir de un grupo reactivo de la cadena
polimrica. El inconveniente que se presenta es que no se logra una sntesis completa de cada
generacin adems de resultar difcil la separacin de los subproductos de la mezcla de reaccin. En la
estrategia Graf To los dendrones ya formados se unen al polmero en un solo paso. Son reacciones
difciles de lograr con alto grado de conversin debido a problemas conformacionales principalmente.
Por ltimo, en la estrategia del Macromonmero, se une un grupo polimerizable a los puntos focales
de dendrones previamente sintetizados y luego se polimerizan estos macromonmeros. La gran
ventaja de esta tcnica es que el grado de dendronizacin es del 100 %. La desventaja ms importante
es que el impedimento estrico disminuye notablemente la velocidad de polimerizacin y el peso
molecular del producto.
En el presente trabajo de investigacin, se llev a cabo la dendronizacin de polmeros tipo barras
monolticas porosas (redes macroporosas no expandibles), siguiendo una metodologa graf-to, con
el fin de obtener materiales con potenciales aplicaciones en cromatografa de afinidad.

2. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
2.1 Sntesis de polmeros macroporosos [10]
2.1.1 Sntesis de poli(N-acriloil-TRIS(hidroximetil)aminometano-co-glicidilmetacrilato-co-N, N-
metilenbisacrilamida), poli(NAT-GMA-BIS)
Para llevar a cabo la sntesis de las barras polimricas macroporosos, los monmeros monovinlicos
N-acriloil-TRIS(hidroximetil)aminometano (NAT) y glicidil metaccrilato (GMA), y el agente
entrecruzante N, N-metilenbisacrilamida (BIS) (30:30:40, en moles) fueron disueltos en un tubo de
ensayo en una mezcla de polimerizacin formada por dimetilsulfxido (DMSO) y polietilenglicol
6000, en un bao de agua a 70 C. Una vez disueltos los monmeros, se purg la mezcla con N
2
, luego
se agreg el iniciador radicalario 2,2-azobisisobutironitrilo (AIBN) y se agit vigorosamente.
Inmediatamente, la mezcla de polimerizacin fue trasvasada a una jeringa de polipropileno (molde
Gabriela Bertolotti y Daro Arra

elegido) y la reaccin se llev a cabo en un bao de aceite a 70 C por 24 horas. Finalmente, los
soportes obtenidos se cortaron en discos y se los purific con metanol en un equipo de Soxhlet. Se
almacen en frasco color caramelo con etanol 20% a 4 C [10]. Los grupos epxido de la matriz se
cuantificaron por retroceso con HCl en piridina [11].

2.1.2 Sntesis de poli(NAT-GMA-BIS)-etilendiamina: reaccin de aminacin.
Los discos poli(NAT-GMA-BIS) (Figura 1) fueron lavados con agua y buffer fosfato 0,5 M pH 8,00.
Para llevar a cabo la unin de la diamina, los discos fueron transferidos a una solucin de
etilendiamina (EDA) (0,114g/mL) preparada en el buffer de reaccin. La reaccin se llev a cabo a
40 C durante 48 horas. Finalizada la reaccin, los discos con grupos amino, poli(NAT-GMA-BIS)-
EDA (Figura 2), fueron lavados exhaustivamente con el buffer de reaccin, hasta obtener resultado
negativo en las aguas de lavado, con el test del cido trinitrobencensulfnico [12] (test del TNBS para
grupos aminos). Finalmente, los discos se lavaron con agua y se los almacen en una solucin de
etanol al 20% a 4 C [10]. Los grupos amino de la matriz fueron identificados cuantitativamente, por
retroceso, con HCl [13].



2.2 Unin de dendrones comerciales a los polmeros sintetizados.
2.2.1 Obtencin de poli(NAT-GMA-BIS)-Behera [14]
La matriz poli(NAT-GMA-BIS) (200 mg) fue hinchada en agua y colocada en una solucin de 15 mL
de Na
2
CO
3
2 M conteniendo 53,1 mg de amina de Behera (Figura 3) disuelta. La relacin de moles de
epxido: dendrn fue 2:1. La reaccin se llev a cabo durante 36 horas a 60 C. El producto (Figura 4,
I) fue lavado con agua y CH
2
Cl
2
varias veces. Para evaluar la unin del dendrn se cuantificaron los
grupos epxido que no reaccionaron [11].
Posteriormente, las matrices fueron colocadas en cido frmico 85%, a 50 C durante 35 horas, con
agitacin, para hidrolizar los grupos ter-butilo del ster (Figura 4, II) [15]. Luego de concentrar al
vaco, las matrices fueron lavadas varias veces con agua y secadas en estufa.




H
N
O
N
H
O
O
CH3
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
N
H
OH
O
O
O
O
O
O
R
R
R
R =(I) ter-butilo,(II) OH
Figura 4: Estructura de poli(NAT-GMA-BIS)-Behera(I)
y poli(NAT-GMA-BIS)-Behera hidrolizado (II).
H2N
O
O
O
O
O
O
Figura 3: Amina de Behera
Figura 1: Estructura del polmero
poli(NAT-GMA-BIS).
H
N
H
N
O O
N
H
O
HOH2C
HOH2C
HOH
2
C
N
H
O
O
O
CH3
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
CH3
O
O
O
O
O
O
H3C
H
N
O
CH2OH
HOH2C
HOH
2
C
H
N
O O
H
N
H
N
O
N
H
O
O
CH3
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
CH3
O
O
H
N
H
N
O
N
H
OH
NH2
H
N
OH
NH2
Figura 2: Estructura del polmero
poli(NAT-GMA-BIS)-EDA.
Gabriela Bertolotti y Daro Arra


2.2.2 Obtencin de poli(nat-gma-bis)-EDA-Weisocianato [16]
La matriz poli(NAT-GMA-BIS)-EDA (200 mg) fue hinchada en 7 mL de solucin de N,N-
dimetilacetamida conteniendo 0,01 mL de laurato de dibutilestao (catalizador) y se agregaron 57 mg
del dendrn Weisocianato (Figura 5). La relacin de moles de amino: dendrn fue 1:2. La reaccin se
llev a cabo en atmsfera de N
2
durante 36 horas a 60 C. El producto (Figura 6, I), fue lavado con
CH
2
Cl
2
varias veces. Se sec a 50 C hasta peso constante. La cuantificacin del grado de
dendronizacin se realiz por titulacin de los grupos aminos que no reaccionaron [13].
La hidrlisis de los grupos ter-butilo del ster (Figura 6, II) se realiz de igual manera que con la
matriz anterior [15].



3. RESULTADOS Y DISCUSIN
La especificidad y selectividad en un proceso de purificacin como la cromatografa de afinidad, estn
gobernadas por el tipo y nmero de interacciones que se establecen entre el soporte y el analito, por lo
tanto resulta de inters evaluar el efecto de un ligando multifuncional (dendrn) sobre el polmero, su
capacidad para quelar iones metlicos y su eficiencia en la purificacin de mezclas de protenas.

3.1 Sntesis de polmeros macroporosos.
La sntesis del polmero base, poli(NAT-GMA-BIS), se llev a cabo de acuerdo al procedimiento
previamente realizado en el grupo de investigacin [10]. La caracterizacin se llev a cabo por
porosimetra de intrusin de mercurio, microscopa electrnica de barrido (SEM) y por espectroscopia
IR [10]. En el espectro IR se distinguen las siguientes bandas: entre 3700 y 3100 cm
-1
una banda ancha
correspondiente a la vibracin de tensin O-H de los alcoholes superpuesta con la de tensin N-H de
la amida secundaria; a 1723 cm
-1
aparece la banda de vibracin de tensin C=O del grupo ster, a 1651
cm
-1
la seal de tensin C=O del grupo amida (banda I), a 1535 cm
-1
la seal de tensin simtrica N-
C=O del grupo amida (banda II) y a 1262 y 800 cm
-1
se encuentran las seales correspondientes a la
vibracin de tensin asimtrica y simtrica del anillo del grupo epxido. La seal correspondiente a la
vibracin de deformacin del anillo se superpone con la banda ancha que se encuentra entre 770 y 400
cm
-1
correspondiente a la vibracin de deformacin fuera del plano N-H del grupo amida.
Adems, se llev a cabo la cuantificacin de los grupos epxido. El resultado obtenido fue 1,28 mmol
epxido/ g polmero seco. Este valor result menor que el valor terico (1,91 mmol epxido /g polm.
seco), teniendo en cuenta la cantidad de GMA empleado en la sntesis, por lo que se concluy que no
todos los grupos epxido se encuentran accesibles qumicamente.
Posteriormente, se uni EDA al polmero poli(NAT-GMA-BIS) con el fin de obtener una red con
grupos aminos terminales como punto reactivo, poli(NAT-GMA-BIS)-EDA [10].
La identificacin por IR mostr las mismas seales que el polmero poli(NAT-GMA-BIS) excepto las
asignadas al grupo epxido, indicando que la unin de la etilendiamina (EDA) fue efectiva. Las
seales correspondientes a las vibraciones de tensin y deformacin N-H de los grupos aminos se
encuentran solapadas con las bandas anchas entre 3700 y 3100 cm
-1
(vibracin de tensin OH de
alcohol y NH de amida) y entre 770 y 400 cm
-1
(vibraciones de deformacin NH de amida fuera del
plano).
H
N
O
N
H
O
O
CH3
CH2OH
CH2OH
CH2OH
O
N
H
OH
H
N
H
N
O
R
R
R
O
O
O
R=(I) ter-butilo, (II) OH
Figura 6: Estructura de
poli(NAT-GMA-BIS)-EDA-Weisocianato (I)
y poli(NAT-GMA-BIS)-EDA-Weisocianato hidrolizado (II).
Figura 5: Weisocianato
NCO
O
O
O
O
O
O
Gabriela Bertolotti y Daro Arra

La cuantificacin de grupos aminos dio como resultado 0,77 mmol amino/g polmero seco, lo que
representa un rendimiento del 60% de reaccin. Sobre estos grupos amino se llev a cabo
posteriormente la reaccin de dendronizacin.
Cabe destacar que entre las caractersticas ms importantes del soporte macroporoso base,
previamente caracterizado, se destacan: gran tamao de poros, volmenes de poros alrededor de 1
mL/g, porcentaje de porosidad superior al 50% y al mismo tiempo un rea de superficie especfica
considerable para ser qumicamente modificada. Todo esto lo convierte en precursores de soportes
adecuados para cromatografa de afinidad.

3.2 Unin de dendrones comerciales a los polmeros sintetizados.
Una vez purificados y caracterizados los polmeros macroporosos, se procedi a la dendronizacin de
los mismos, empleando dendrones comerciales (amina de Behera y Weisocianato), con el fin de
optimizar las condiciones de reaccin, para realizar, en etapas posteriores, la unin de dendrmeros de
segunda generacin.
El polmero poli(NAT-GMA-BIS),que contiene grupos epxido, se modific con amina de Behera. El
resultado obtenido fue 0,90 mmoles dendrn/g polmero seco, representando un 70% de
dendronizacin. Se realiz la identificacin del producto poli(NAT-GMA-BIS)-Behera por
espectroscopia de IR, y las seales ms relevantes fueron: 1715 cm
-1
(tensin C=O de ster), 1651 cm
-1

(tensin C=O de amida), 1542 cm
-1
(tensin simtrica N-C=O), 1455 cm
-1
(deformacin asimtrica de
-CH
3
, superposicin con deformacin simtrica de -CH
3
y deformacin de -CH
2
). A 880 cm
-1
se
observa una seal aguda, la cual corresponde a la vibracin de esqueleto de los grupos ter-butilo.
Luego se realiz la hidrlisis de los grupos ter-butilo, con el fin de obtener un dendrn con grupos
terminales cido en la superficie, capaces de quelar iones metlicos (Cu
+2
o Ni
+2
) y obtener as los
soportes adecuados para IMAC. En el espectro de IR se observ la desaparicin de la seal intensa a
1455 cm
-1
correspondiente a la deformacin asimtrica de -CH
3
, adems de la desaparicin de la seal
a 880 cm
-1
correspondiente a la vibracin de esqueleto de -CH
3
, indicando que la hidrlisis de los
grupos ster fue exitosa.
Por otra parte, el poli(NAT-GMA-BIS)-EDA, que contiene grupos amino, fue modificado con
weisocianato, que posee un grupo isocianato como centro reactivo. El resultado fue 0,71 mmol
dendrn/ g polmero seco, lo cual representa un 90% de rendimiento. El espectro de IR del polmero,
poli(NAT-GMA-BIS)-EDA-Weisocianato, mostr las siguientes seales de inters: 1713 cm
-1
(tensin
C=O de ster), 1648 cm
-1
(tensin C=O de amida, superposicin con tensin C=O del grupo urea),
1556 cm
-1
(tensin simtrica N-C=O, superposicin con deformacin C-N-H del grupo urea), 1456
cm
-1
(deformacin asimtrica de -CH
3
), 879 cm
-1
(vibracin de esqueleto de los grupos ter-butilo).
En este caso, tambin con el fin de obtener grupos cido en la periferia del dendrn, se llev a cabo la
hidrlisis de los grupos ster. El espectro de IR de poli(NAT-GMA-BIS)-EDA-Weisocianato
hidrolizado muestra la desaparicin de las seales a 1456 cm
-1
, correspondiente a la vibracin de
deformacin de -CH
3
, y a 879 cm
-1
, perteneciente a la vibracin de esqueleto de los grupos ter-butilo.

4. CONCLUSIONES
Se sintetizaron y caracterizaron matrices polimricas macroporosas, funcionalizadas con molculas
dendrticas sencillas, con potenciales usos como soportes para cromatografa de afinidad, teniendo en
cuenta las propiedades ya estudiadas de las matrices base.
La sntesis de los polmeros poli(NAT-GMA-BIS) y poli(NAT-GMA-BIS)-EDA se logr con una
buena reproducibilidad, respecto a los ya obtenidos previamente en el laboratorio de investigacin. Se
llev a cabo la unin covalente de diferentes dendrones, a fin de optimizar las condiciones de reaccin
para unir dendrmeros de mayores generaciones, en etapas posteriores.
Los porcentajes de dendronizacin para ambos polmeros fueron elevados, 70% para poli(NAT-GMA-
BIS)-Behera y 90% para poli(NAT-GMA-BIS)-EDA-Weisocianato, utilizndose condiciones de
reaccin muy simples, particularmente para el primer caso.
El mayor rendimiento de dendronizacin, obtenido para la sntesis de poli(NAT-GMA-BIS)-EDA-
Weisocianato puede deberse a un menor impedimento estrico en la reaccin entre la matriz y el
dendrn por la presencia de la etilendiamina que, adems de proveer al polmero del sitio reactivo, se
comporta como espaciador.
Gabriela Bertolotti y Daro Arra

Permanecen en desarrollo las etapas de quelacin de metales sobre las matrices dendronizadas, para
realizar en una etapa posterior el estudio del comportamiento como soportes para IMAC.

REFERENCIAS
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