MATERIALES Y MTODOS

Microorganismos y medios de cultivo .

Veintin cepas (pertenecientes a 19 especies de microorganismos , incluyendo
bacterias acidfilas, quimioautotrficas , mixotrficoas, acidfilos
obligatoriamente hetertrofos , y uno acidfilo archaeon ( Ferroplasma
acidiphilum [ Fp . acidiphilum ] fueron utilizados en el presente estudio ( Tabla 1 ).
Los medios de cultivo utilizados variaban en composicin dependiendo de los
requisitos nutricionales de los diferentes acidfilos , sales comunes y la mezcla de
elementos traza ( 40 ) se utiliza en todo el estudio ( elementos traza no se
incluyeron cuando se aadi extracto de levadura al medio de cultivo ).
Quimioauttrofos se cultivaron de forma rutinaria en medio que contena 20 mM
de hierro ferroso ( pH 1.7 a 2.2 , dependiendo del pH ptimo para el crecimiento )
y oxidantes de azufre que no oxidan hierro ( At. thiooxidans y At. caldus ) fueron
crecidos en un medio similar en el que el azufre elemental ( 5 % , peso / volumen )
sustituido sulfato ferroso . Oxidantes de hierro mixotrficos y heterotrficos se
cultivaron rutinariamente en un medio lquido que contiene 10 a 20 mM
suplementado con hierro ferroso 0,02 % ( peso / volumen ) de extracto de
levadura ( a pH 1,8 a 2,0 ) .
Acidfilos se cultivaron en medio basal, sales traza suplementado con Glucosa 5
mM ms extracto de levadura al 0,001 % ( acidiphilum SJH y Acidobacterium
capsulatum [ Ab . capsulatum ] o 5 mM de fructosa ( Acidocella PFBC ) .
Los valores de pH de estos medios se ajustaron a 2.5 ( Acidiphilium SJH y
Acidocella PFBC )o 3.0 ( Ab. capsulatum ) segun sea el caso.
Por ltimo, el archaeon Fp . acidiphilum , que no poseen una pared celular , se
cultiv en un medio de crecimiento de mayor potencial osmtico que contiene
50 mM de sulfato ferroso, sulfato de potasio 50 mM , 0,02 % ( peso / volumen ) de
levadura
extraer y sales basales ( pH 1,5 ) .
L. ferriphilum , At. ferrooxidans y At. caldus eran cada cultivadas en biorreactores
de 2 litros con un volumen de trabajo de 1,0 litros ( Electrolab Ltd. Reino Unido) en
el que se mantuvieron el pH y la temperatura a la niveles predeterminados . En el
caso de L. ferriphilum , el medio de crecimiento que contena 5 % ( peso /
volumen ) de pirita ( Strem Chemicals , Newburyport , MA ) , el pH y la
temperatura se mantuvieron a 1,7 y 37 C, respectivamente . At. ferrooxidans y At.
caldus se cultivaron en 5 % ( peso / vol) de azufre elemental ( VWR , Reino Unido)
a pH 2.5 y 30 C ( At. ferrooxidans ) o 45 C ( At. caldus ) . Todos los biorreactores
fueron aireados ( 1 litro/ min ) y se agit a 150 rpm . Las muestras fueron retiradas
en intervalos regulares para medir las concentraciones de hierro ferroso y total (
pirita ) o sulfato (cultivos de azufre ) , carbono orgnico disuelto (COD ) y cido
gliclico, el nmero de clulas planctnicas de fase . Despus de que los cultivos
de biorreactor haba estado corriendo por entre 10 y 13 das, se sometieron a un
"pH shock ", que involucr a una rpida disminucin del pH del cultivo (hasta pH
1,0 , terminado dentro de 10 min ) por adicin automtica de cido sulfrico 1 M .
Este tratamiento era diseado para imitar el fallo ocasional de control del pH en
biominera tanque agitado
TABLA 1 . Bacterias y arqueas acidfilas utilizados en el presente estudio

462 N ~ ANCUCHEO Y JOHNSON APL . ENVIRON . MICROBIOL .
Se retiraron muestras antes y despus cultivos fueron sometidos a este choque de
pH para medir los parmetros mencionados anteriormente y tambin el nmero
de bacterias totales y viables.
Crecimiento de Fp . acidiphilum el At. caldus medio libre de clulas . Cuatro das
despus de la medicion de pH de A . caldus cultura biorreactor se redujo a 1.0 y
el reactor fue drenado , las clulas bacterianas del azufre residual se eliminaron
por centrifugacin ( 15000 fuerza centrfuga relativa , 15 min ) , seguido por
filtracin a travs 0.2 M de tamao de poro de celulosa de filtros de membrana
de nitrato ( Whatman , Reino Unido).
Alcuotas de cuatrocientos mililitros fueron dispensadas en tres matraces cnicos
estriles de 1 litro, y esterilizados por filtracin, sulfato ferroso ( 1 M , pH 2,0 ) se
aadi a una concentracin final de 20 mM . Dos de los matraces se inocularon
con 10 ml de una creciendo activamente la cultura de Fp . acidiphilum (cepa
BRGM4 ) , y el tercer matraz se utiliz como un control no inoculado . Los cultivos
se incubaron con agitacin ( 150 rpm) a 37 C , y se extrajeron muestras cada 2
das para determinar la concentraciones de DOC , cido gliclico , y el hierro
ferroso y para determinar el total de nmero de clulas .
El cribado procariotas acidfilos para la sensibilidad al cido gliclico . El acidfilo
procariota enumerados en la Tabla 1 se probaron para el crecimiento en la
presencia de diferentes concentraciones de cido gliclico . Se prepararon Cinco
mililitros en Botellas universales 20 - ml usando los medios lquidos descritos
anteriormente . El cido gliclico es aadido a estos cultivos para obtener una
concentracin final de 0.1 , 0.5, 1.0 , 2.5 y 5.0 mM . Con el fin de evaluar las
sensibilidades relativas de estos acidfilos a cido actico , cultivos que
contienen las mismas concentraciones de cido actico se prepararon de forma
simultnea , y cultivos libres de cidos orgnicos se prepararon como controles .
Estos cultivos se incubaron a 30 o 37 C durante un mximo de 10 das, y positivo
o negativo crecimiento se determin sobre la base de los cambios en el nmero
de clulas y , en el caso de hierro - oxidante procariotas , sobre la base de la
produccin de hierro frrico . Metabolismo de cido gliclico por procariotas
acidfilas . El mixotrfico y acidfilos hetertrofas que figuran en la Tabla 1 se
evaluaron para determinar su
capacidad de metabolizar el cido gliclico. Los cultivos positivos de la
proyeccin de toxicidad experimento que contena 0,1 mM de cido gliclico se
usaron como inculos en todos los casos .
Acidophiles mixotrfico se subcultivaron en un medio lquido ( alcuotas de 10 ml
en botellas universales ) que contiene 0,1 mM de cido gliclico y el hierro ferroso
10 mM (ms sales basales y oligoelementos ) a pH 1,9 , y la heterotrficas hierro de
reduccin bacterias se subcultivaron en el mismo medio pero sin adicin de hierro
( pH 2,5 para Acidocella PFBC y Acidiphilium SJH y pH 3,0 para Ab . capsulatum ) .
la cultivos se incubaron a 30 o 37 C durante un mximo de 20 das , y las
muestras fueron retirado a intervalos regulares para medir las concentraciones de
cido gliclico .
Controles no inoculados Tambin se prepararon con el fin de tener en cuenta
cualquier gliclico cido pierde por evaporacin o por medio abiticos .
Para los acidfilos que mostraron una aparente capacidad para metabolizar
cido gliclico ,
Se realiz un segundo experimento , en el que el curso temporal de cido
gliclico remocin fue registrada . Los cultivos se inocularon en 20 ml de medio de
crecimiento ( como se describe anteriormente ) en matraces cnicos de 100 ml
duplicados , que se incubaron ( en 30 o 37 C ) y se agit a 150 rpm . Se retiraron
muestras cada 2 das para medir la concentracin de cido gliclico .
Las tcnicas analticas . La concentracin de cido gliclico se midi por el ion
cromatografa ( IC ) utilizando un cromatgrafo de iones Dionex IC25 equipado
con un Columna IonPac AS- 11 equipado con un detector de conductividad (
Dionex Inc. , Estados Unidos ) y ocasionalmente por una tcnica colorimtrica ( 6 )
. El protocolo de IC utilizado separacin habilitado de cidos gliclico y pirvico y
fue utilizado habitualmente excepto cuando excesivamente altas
concentraciones de sulfato ( de la oxidacin microbiana de azufre elemental en
biorreactores ) impidi la separacin adecuada de glicolato y sulfato . El carbono
orgnico disuelto se midi usando un LABTOC DOC analizador (contaminacin y
monitoreo de procesos , Reino Unido). concentraciones de hierro ferroso se
midieron usando el ensayo colorimtrico ferrozina ( 29 ) , y concentraciones de
sulfato se midieron usando una tcnica turbidimtrico ( 27 ) . la cantidad de hierro
total se determin por cromatografa inica usando un Dionex 320 cromatgrafo
inico equipado con una columna CS5A IonPac y una absorbancia AD25
detector. Se midi el pH con un electrodo combinado de fase ( VWR , Estados
Unido ) acoplado a un 50 metros pH Accumet ( Cole - Palmer , Vernon Hills , IL ) .
Las clulas microbianas se enumeraron usando una cmara de recuento Helber
marcado con Sentencia Thoma ( Hawksley , Reino Unido) y se ve con un Leitz
Labolux microscopio de contraste de fase (a un aumento de 400 ) . Bacterias
viables se enumerados por las clulas en placas en medios slidos selectivos ( 16 )
.