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IMPORTANCIA DE LOS RIESGOS ASOCIADOS EN LA FORMACIN DE


BIOPELCULAS EN EL AMBIENTE DE PROCESAMIENTO DE ALIMENTOS
Vzquez Celestino D., Garca Almendrez B., Arvalos Snchez, M., Regalado Gonzlez C.
Departemento de Investigacin y Posgrado en Alimentos. Facultad de Qumica.
Universidad Autnoma de Quertaro
RESUMEN
Las biopelculas son comunidades microbianas que se adhieren a las superficies por la secrecin
de polmeros extracelulares. El desarrollo de las biopelculas consta de tres fases, adhesin,
formacin de EPS y formacin de microcolonias, las cuales se pueden observar a lo largo de 5
das. Se utilizaron biopelculas de L. lactis UQ2 en placas de vidrio para estudiar el desarrollo de
las biopelculas por tcnicas microbiolgicas, microscpicas y moleculares, finalmente se evalu
un antimicrobiano para conocer su efectividad sobre las bacterias formadoras de la biopelcula.
INTRODUCCIN
Las biopelculas son complejas comunidades de microorganismos viables y no viables rodeados
por sustancias polimricas extracelulares (EPS) ancladas a una superficie (Carpentier y col.,
1993, Wimpenny y col., 1993). Las EPS pueden contener polisacridos, protenas, fosfolpidos,
cidos nucleicos (Costerton y col., 1981, Sutherland, 1983) y son producidas por los mismos
microorganismos, formado una matriz adherente en donde estos quedan atrapados,
proporcionando proteccin por que concentran las sustancias nutritivas, previniendo el acceso de
antimicrobianos, secuestrando metales y toxinas, y previniendo el desecamiento (Carpentier y
Cerf, 1993). Las biopelculas estn altamente organizadas en comunidades, y su formacin
incluye 3 pasos: adhesin inicial, formacin de la microcolonia y formacin de EPS seguido de la
maduracin (R.A.N. Chmielewski, J.F. Frank y Zhu y otros 2008). Las biopelculas, en la
industria de alimentos, se generan por una incorrecta sanitizacin, debido a la acumulacin de
materia orgnica y la presencia de agua (Boulange-Peterman and others 1993). Debido al
problema que representan las biopelculas en las industrias de alimentos, en este trabajo se
estudi la formacin de stas sobre vidrio utilizando como modelo L. Lactis UQ2 mediante
tcnicas microbiolgicas, microscpicas y moleculares; debido a que las bacterias en biopelculas
son ms resistentes a los desinfectantes, se ret a las biopelculas de L. Lactis UQ2 al quinto da
de su formacin para observar el efecto del agua activada, como un mtodo alternativo para la
desinfeccin de superficies en las industrias de alimentos.

MATERIALES Y MTODOS
1. Microorganismo y condiciones de crecimiento
Lactococcus lactis UQ2 fue provista por la Divisin de Investigacin y Posgrado en Alimentos,
UAQ. La bacteria se encontraba en conserva a -70C en chaquiras de cristal. Su activacin se
realiz en 5 mL de caldo MRS por 18 horas a 30C; al finalizar el tiempo de incubacin, el caldo
con la cepa se centrifug a 11000 rpm por 5 minutos (10000g), posteriormente se retir el
sobrenadante y se resuspendieron las clulas en 5 mL de buffer de fosfatos (50 mM, pH 7) y se
centrifug nuevamente para lavar las clulas a las mismas condiciones, el precipitado
nuevamente se resuspendi en 5 mL de buffer de fosfatos (50 mM, pH 7).
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2. Desarrollo de las biopelculas
Para el crecimiento de las biopelculas se utilizaron portaobjetos marcados (2.54 cm x 2.54 cm);
tres portaobjetos fueron colocados en cajas petri y esterilizados en autoclave por 15 minutos,
121C y 15 psi. Una cara del portaobjetos fue preacondicionada con una solucin de L-lisina
0.1mM por 5 min, se retir el exceso y posteriormente fue inoculada con 100 L del cultivo
centrifugado y se dispers en el rea de tratamiento con un asa de platino estril. Los portaobjetos
inoculados fueron lavados cada 24 horas con 10 ml de buffer de fosfatos (50mM, pH 7.0) y
alimentadas con 100 L de caldo MRS. Los portaobjetos fueron colocados en recipientes
plsticos estriles cerrados hermticamente para mantener una humedad relativa de 100%. Se
almacenaron a 30C.
3. Cintica de crecimiento de las biopelculas
El desarrollo de la biopelcula se llev a cabo por 5 das; cada da se hizo el recuento de las
clulas formadoras de la biopelcula y se observaron en el microscopio (Zeiss Axioskope 40).
3.1 Recuento de clulas
El recuento de las clulas de hizo por la tcnica de extensin por superficie. Los portaobjetos se
lavaron con 10 mL de solucin salina y las clulas se recuperaron por frotacin con un hisopo
hmedo estril que se introdujo en un tubo con 10 mL de solucin salina, se homogenizaron en
vortex por 1 minuto y se hicieron diluciones seriadas. En una caja petri con agar MRS se
colocaron 100 L de la dilucin correspondiente y se extendieron con una varilla de vidrio
estril. Las cajas se incubaron por 24 horas a 30C y se contaron con ayuda de un cuenta colonias
(Leica).
3.2 Tincin con cristal violeta y observacin en el microscopio
Se coloc cristal violeta (2g cristal violeta, 20mL etanol, 0.8g oxalato de amonio, 80mL dH
2
0)
hasta cubrir el rea del portaobjetos marcada, se dej reposar a temperatura ambiente durante 1
minuto y posteriormente se enjuag con agua destilada hasta quitar el exceso de colorante. Los
portaobjetos teidos se observaron en un microscopio (Zeiss Axioskop 40) con luz blanca.
3.3 Hibridacin fluorescente in situ (FISH)
Las biopelculas de L. lactis UQ2 fueron formadas como se menciona anteriormente. Las clulas
fueron fijadas con formamida al 3.7% en buffer de fosfatos (PBS, pH 7.2) por 12 h a 4C y
lavadas dos veces con PBS. Se almacenaron en una solucin de PBS/etanol (1:1) por 1 h a
-20C. Las clulas fueron deshidratadas por inmersin durante 3 min en soluciones de etanol al
50%(v/v), 80%(v/v), 95%(v/v), respectivamente y se dejaron secar a temperatura ambiente. Las
biopelculas se incubaron por 30 min a 46C en condiciones isotnicas. La sonda utilizada fue
Stcr493 (5GTT AGC CGT CCC TTT CTG G-3) (Sigma Genosys, Woodlands, TX, USA)
etiquetada con fluorescena, de la cual 9 L [8L de buffer de hibridacin (100mM de Tris pH 7,
0.9 NaCl y 0.1% SDS):1 (50ng/L)] y se incub por 2 horas a 46C. Las biopelculas se
enjuagaron con 5 mL de la solucin de lavado (1mL de Tris pH 8 y 7.75mL 4M NaCl aforado a
50mL con dH
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0) precalentada a 46C y posteriormente se sumergieron en esa solucin por 20
min. Las biopelcula se dejaron secar a temperatura ambiente y se almacenaron en oscuridad. Se
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observaron en el microscopio electrnico de fluorescencia (Zeiss Axioskop 40) a una longitud de
onda de 495nm a 520nm y con un filtro azul (FITC).
3.3 Efecto del agua activada y mtodo de la gota (Miles y Misra)
Las biopelculas de L. lactis UQ2 fueron formadas como se menciona anteriormente. Se utiliz
agua activada DESY

con una concentracin de oxidantes de 500ppm, pH de 6.5 a 7.5 y REDOX


de +800 hasta +1000 mV. Las biopelculas de L. lactis al quinto da de su formacin, fueron
sumergidas en 15 ml de agua activada DESY

por tiempos de 60 s, 5 min, 30 min y 45 min; al


finalizar el tiempo de tratamiento las clulas se recuperaron por frotacin con un hisopo hmedo
estril que se introdujo en un tubo con 10 mL de solucin salina, se homogenizaron en vortex por
1 minuto y se hicieron diluciones seriadas. La tcnica utilizada para el recuento de las clulas fue
mtodo de la gota (Miles y Misra), la cual consiste en dividir la caja petri en 3 sectores, cada una
tendr tres gotas de 20L de la dilucin correspondiente.
RESULTADOS y DISCUSIN
1. Cintica de crecimiento de las biopelculas
En la tabla 1, se muestran las unidades formadoras de colonia de
L. lactis UQ2 a lo largo de 5 das. Se puede observar que no se
muestra un aumento significativo entre los das, esto se debe a
que los microorganismos se adhieren al primer da y continan
as hasta el quinto da. En la figura 1a. se observa la primera
etapa de formacin de la biopelcula, las clulas planctnicas se
adhieren a la superficie de la placa de vidrio; en la figura 1b se muestra que las clulas adheridas
comienzan a crecer y formar el EPS; en la figura 1c y 1d, observamos la tercera etapa de
formacin de la biopelcula en la cual las clulas adheridas comienzan la formacin de la
microcolonia, debido a que se encuentran protegidas por los EPS y finalmente en la figura 1e se
muestra la microcolonia madura, esto es la ltima etapa de formacin de la biopelcula.

a) b) c) d) e)
Figura 1. Tincin con cristal violeta de biopelculas de L. lactis UQ2. Proceso de formacin de la biopelcula en un periodo de 5
das. a) Da 1, b) da 2, c) da 3, d) da 4, e) da 5.

2. Hibridacin fluorescente in situ (FISH)
La tcnica FISH es una alternativa a las tcnicas
tradicionales de cultivo para diferenciar los
microorganismos formadores de la biopelcula,
debido a que las sondas de oligonucletidos para la
deteccin in situ hibridizan selectivamente a cada
microorganismo; Por la especificidad en 16s rRNA
de la sonda utilizada, en la figura 2a y 2b, se
Tabla 1. Recuento de L. lactis UQ2 por
ES. Poblacin bacteriana durante el
proceso de formacin de la biopelcula.
Da UFC/mL
1 9.48E+06
2 8.23E+06
3 4.90E+06
4 2.15E+07
5 8.30E+07


a) b)
Figura 2. Hibridacin fluorescente in situ a 46C de
biopelculas de L. lactis UQ2 con sonda Strc493 en
portaobjetos de vidrio al quinto da.
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muestran biopelculas de L. Lactis UQ2. Los puntos brillantes que se observan en la figura 2a,
son las clulas bacterianas formadoras de la biopelcula y los materiales que se distinguen
alrededor de las clulas son los EPS formados por los mismos microorganismos de la biopelcula.
La figura 2b, muestra un agregado de clulas bacterianas que forman parte de la biopelcula,
adheridas a la placa de vidrio.
2. Efecto del agua electrolizada sobre la biopelcula de L. Lactis UQ2
Las sustancia antimicrobianas en el agua activada (AA., Desy),
representan es si compuestos tales como, hidroperxidos y perxidos
inorgnicos de vida corta, que priva a los microorganismo de
adaptacin y asegura un efecto microbicida. La tabla 2, muestra los
resultados del ensayo realizado sobre biopelcula de L. lactis UQ2 a
diferentes tiempos. El A.A.Desy, tiene un efecto antimicrobiano
sobre las pelculas de L. lactis UQ2, ya que en la tabla 2, se muestran
las unidades formadoras de colonias a diferentes tiempos en los
tratamientos y los controles respectivamente; el mayor efecto del
antimicrobiano fue a los 45min, ya que se observa una reduccin de
UFC/mL de 7 logaritmos.
CONCLUSIONES
Se logr estudiar el proceso de formacin de las biopelculas utilizando como modelo L. Lactis
UQ2. Las placas de vidrio son una adecuada superficie para estudiar el desarrollo de biopelculas,
ya que se mantenan en ptimas condiciones en cada uno de los tratamientos realizados.
Se pudo realizar la hibridacin de las clulas en las biopelculas de L. Lactis UQ2 por la tcnica
FISH, debido a que la sonda utilizada era especfica para este tipo de bacterias.

El agua electrolizada tiene un efecto antimicrobiano sobre biopelculas de L. lactis UQ2, ya que
se observaron reducciones en los diferentes tiempos de tratamiento. El mayor efecto del
antimicrobiano fue a los 45 min
REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Betancourth, M., Botero, J.E., Rivera, S.P., Biopelculas: una comunidad microscpica en
desarrollo, Colombia Mdica, 35, 34-39, 2004.
Brooks, J.D., Flint, S.H., Biofilms en the food industry: problems and potencial solutions,
International of Food Science and Technology, 43, 2163-2176, 2008.
Chmielewski, R.A.N., Frank, J.F., Biofilm formacin and control in food processing facilities,
Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 2, 2003.
Garca, B.E, Cann, I.K.O., Martin, S.E., Guerrero, I., Regalado, C., Effect of Lactococcus lactis
UQ2 and its bacteriocin on Listeria monocytogenes biofilms, Food Control, 19, 670-680, 2008.
Kim, C., Hung, Y.C., Brachett, R. E., Efficacy of electrolyzed oxidizing (EO) and chemically
modified water on different types of foodborne pathogens, International Journal of Food
Microbiology, 61,199-207, 2000.
Tabla 2. Efecto del agua activada
durante 60s, 5min, 30min y 45min
sobre biopelculas y recuento de L.
lactis UQ2 por MM.
Tiempo UFC/mL
60 s
AA 1.78E+05
Control 8.00E+07
5 min
AA 5.50E+06
Control 1.25E+08
30 min
AA 1.67E+06
Control 7.33E+07
45 min
AA > 50
Control 2.25E+07