T. Dumke, C. Saldivar, . Iuri!i", P. #er!a!de$, %. Trela, A. Pu""iarelli
Laboratorio de Microbiologa de Alimentos y Biotecnologa Dr. Fernando Benassi. Facultad de Ciencias Exactas, umica y !aturales"#ni$ersidad !acional de Misiones %#!aM&" ''(( )osadas, Misiones" mima*+ce,yn.unam.edu.ar -esumen: La leche es un alimento muy rico y variado en elementos nutritivos, constituyendo un excelente medio para el desarrollo de microorganismos indeseables que pueden acelerar su deterioro y disminuir el tiempo de vida til del alimento, pudiendo ocasionar enfermedades en los consumidores. Se puede contaminar durante la extraccin, manipuleo, almacenamiento, transporte y distribucin en malas condiciones higinicas. na inmediata y efectiva refrigeracin de la leche constituye una etapa muy importante! adem"s, para obtener un producto confiable es necesario emplear un tratamiento trmico adecuado como la pasteuri#acin que destruye la totalidad de la flora patgena y banal conservando las propiedades nutritivas y sabor de la leche natural. La venta de leche cruda creci en $isiones como forma alternativa de comerciali#acin en ferias francas, consecuencia del dficit de las industrias l"cteas que nuclea a los peque%os productores y absorbe este producto. &n vista de ello, se efectu un relevamiento de las leches que se comerciali#an como 'leche cruda(, comprobando que no cumplen con lo que establece el )digo *limentario *rgentino +)**, que proh-be la venta de productos en estas condiciones. Los ob.etivos del presente traba.o fueron, reali#ar el control de la calidad microbiolgica de la leche comerciali#ada para asegurar su inocuidad evitando as- &nfermedades /ransmitidas por *limentos +&/*,, y evaluar la me.or combinacin temperatura0tiempo apropiados para la destruccin de los microorganismos utili#ando una 'pasteuri#adora en bolsa( para peque%os productores, que es un equipo artesanal semiautom"tico, que cuenta con dispositivos electrnicos de control de temperatura y tiempo de exposicin para el precalentamiento y calentamiento de la leche en sachet. Se anali#aron muestras de 'leche cruda(, conservadas entre 1 y 234), procedentes de distintas ferias francas de la ciudad de 5osadas y del interior de la provincia! y muestras de leche cruda y pasteuri#ada siguiendo la combinacin de /emperatura0tiempo obtenidas de tres productores que poseen el equipo. La metodolog-a utili#ada est" basada en el )** y en el 6nternational )ommission on $icrobiological Specifications for 7oods +6)$S7,.Se reali#aron an"lisis microbiolgicos +recuento de 8acterias $esfilas, )oliformes y Esc.eric.ia coli, a 'leche cruda( en venta y a leche entera vacuna antes y despus de someterla al proceso de pasteuri#acin en bolsa, con el fin de corroborar su eficacia y correcto funcionamiento. *ntes de dicho tratamiento trmico se efectuaron pruebas fisicoqu-micas preliminares +ensayos de reductasa, acide# titulable, prueba del alcohol y densidad,. * la leche pasteuri#ada se reali# un seguimiento microbiolgico de 2 a 9 d-as. Los resultados globales de los an"lisis tanto fisicoqu-micos como los microbiolgicos nos otorgaron informacin acerca de la carga microbiana inicial de las muestras y luego de la pasteuri#acin artesanal se verific la aptitud de las mismas durante un periodo de tiempo preestablecido. Se concluye que el sistema de pasteuri#acin en bolsa, implementado correctamente, cumple con el ob.etivo para el cual fue dise%ado, aumentando la vida til del producto a partir de la reduccin de los microorganismos presentes en forma natural. 5alabras claves: pasteuri#acin, leche, microorganismos, calidad. INTRODUCCIN /odo alimento destinado al consumo humano debe ser principalmente inocuo y nutritivo. La leche contiene los nutrientes necesarios para desarrollar los principales procesos vitales del ni%o y del adulto: crecimiento, osificacin, denticin, conservacin de la masa sea, entre otros +:amn, et al! ;339,. 5ero al mismo tiempo es un caldo de cultivo natural para el desarrollo de distintos microorganismos, pudindose encontrar bacterias causantes de enfermedades transmitidas por los alimentos. La pasteuri#acin constituye un tratamiento trmico efica# para conservar los nutrientes y eliminar todos los patgenos presentes en la leche. &sta operacin puede llevarse a cabo a distintas combinaciones de temperatura y tiempo, siendo las mas comunes la L/L/ +9<=) durante <3 minutos,, >/S/ +?;=) durante 21 segundos, y */ +2<3=) durante ; segundos,. nos de los factores para la eleccin del mtodo a utili#ar dependen de la cantidad de leche a procesar. La leche cruda es una forma alternativa de comerciali#acin en las ferias francas de la provincia de $isiones, adem"s de otros productos naturales y artesanales! el )digo *limentario *rgentino +)**, proh-be la venta al pblico +*rt. 119bis0 :es ;;?3, 2@.A.B<, teniendo mayor exigencia con los par"metros microbiolgicos en la leche cruda certificada que la leche pasteuri#ada +/abla 2,. 5or esta ra#n surge la necesidad de adaptar una tecnolog-a efica# de pasteuri#acin para peque%as escalas de traba.o. La pasteuri#adora manual en bolsa para peque%os productores ayuda a me.orar la calidad de la leche +)at"logo de 5royectos )eC6/ec, ;323,, por tal motivo se estudi el desarrollo de bacterias aerobias mesfilas totales, coliformes y la presencia de Esc.eric.ia coli de leches antes y despus de pasteuri#ar, teniendo como referencia los par"metros establecidos por el )** +ver /abla 2,. /abla 2: 5ar"metros $icrobiolgicos especificados en el )**. Leche )ruda )ertificada *rt.11?0 +:es ;;?3, 2@.A.B<, Leche 5asteuri#ada *rt. 11B0 +:es $Sy*S D=3@?, ;B.32.AB, 8acterias mesfilas Do contener m"s de 23.333 bacterias mesfilas por cm < en el momento de su recepcin por el consumidor $enos de 13.333 bacterias mesfilas por cm < en los meses de abril a septiembre inclusive y $enos de 233.333 por cm < en los meses de octubre a mar#o inclusive 8acterias coliformes Do m"s de 23 bacterias coliformes por cm < $enos de 13 por cm < Esc.eric.ia coli *usencia *usencia ATERIALES & 'TODOS Muestras Se traba. con muestras de leche cruda que fueron obtenidas al a#ar de las mesas de expendio en ferias francas de las #onas sur y centro de la provincia de $isiones. Las mismas fueron adquiridas en botellas de pl"stico transparente de distintas capacidades e inmediatamente refrigeradas hasta el momento de procesarlas. Luego de ser pasteuri#adas en bolsas, se mantuvieron refrigeradas en heladera entre 1023 4) durante el per-odo de an"lisis. An/lisis Fsico"umicos %)**0 $&/ECELEFG* *D*LG/6)* E76)6*L, 5:EC)/ES LH)/&ES: L&)>&. :evista del 6nstituto Dacional de 7armacolog-a y 8romatolog-a0, Se reali#aron an"lisis f-sico0qu-micos preliminares a las leches crudas, como ser: ensayos de reductasa, acide#, prueba del alcohol y densidad. )rueba de reductasas0 &sta tcnica determina cualitativa e indirectamente el contenido total de bacterias viables, bas"ndose en la capacidad que tienen las bacterias de reducir las sustancias colorantes del reactivo *#ul de metileno en presencia de en#imas reductasas. &sta reduccin depende del nmero y actividad de bacterias que contienen la leche y la relacin es inversamente proporcional al tiempo de reduccin del colorante y la cantidad de bacterias presentes: $ala calidad: decolora en menos de 2 hora :egular: decolora entre 2 y < horas Iptima calidad: decolora a partir de las < horas Densidad0 1e determin por aerometr-a, utili#ando un lactodens-metro. Los valores de densidad normales se encuentran entre 2,3;B a 2,3<@ gJl a una temperatura de 214) +)**, *rt 111, )rueba del alco.ol %Coagulaci2n&" Se determina con *lcohol al 9BK vJv. Cetermina la aptitud de la leche a ser sometida a un tratamiento trmico como ser la pasteri#acin. Los valores de esta prueba son del tipo binario, es decir: L7loculaM SG J DE. Ce haber floculado, la leche no se debe pasteuri#ar. &ste mtodo se basa en que el agregado de alcohol provoca la precipitacin de las micelas cuando la leche es poco termoestable, es decir el alcohol simula la accin del calor. )rueba de acide30 La acide# de la leche es valorada mediante el agregado de DaE> hasta vira.e a la fenolftaleina. Cetermina la acide# de la leche expresada en 4C +grados Cornic,. &n una leche normal los valores de acide# de se encuentran entre 2@ y 2B4 Cornic +equivalente a 3,2@ a 3,2B g. *cido l"cticoJ233cm<, +)**, art 111,. )on este ensayo podemos detectar si la leche se encuentra acidificada o agriada. Si se encuentra "cida demuestra una mala conservacin ya que ste es producido por el metabolismo de las bacterias acido l"cticas. Si se encuentra alcalina podemos relacionar a leches mast-ticas. Se utili# el mtodo de acide# titulable. An/lisis Microbiol2gicos 5ara los recuentos bacterianos se siguieron los procedimientos de 6nternational )ommission on $icrobiological Specifications for 7oods +6)$S7,, y procedimientos nacionales del )digo *limentario *rgentino +)**,. Se reali#aron diluciones seriadas con *gua 5eptonada al 3,2K +23 02 , 23 0; , 23 0< , 23 0@ , con la finalidad de diluir la flora microbiana de la muestra, para poder efectuar su posterior recuento microbiolgico. Los resultados se expresaron en nmero de unidades formadoras de colonias por mililitro +7)JmL,. -ecuento de Bacterias Aerobias Mes2+ilas %BAM,: Se utili# como medio de cultivo el *gar para :ecuento en 5lacas o 5)* +5late )ount *gar,, que se incubaron a <14), durante @B horas. -ecuento de Coli+ormes totales y Coli+ormes +ecales0 Se reali# con *gar Nioleta :o.o y 8ilis +N:8*,, incubando a <14 ) durante 2B0 ;@ horas +)oliformes, y a @@4 ) durante ;@hs +)oliformes fecales,. Las colonias ro.as caracter-sticas se repicaron en caldo $ac )onOey para observacin de acide# y gas. Esc.eric.ia coli0 Las colonias sospechosas en el agar N:8* desarrolladas a @@4), se repicaron en caldo &) incubando a @14), reali#ando siembra en agar &$8 y prueba del 6$Ni) para su confirmacin. RESULTADOS & DISCUSION An/lisis Fsico"umicos &stos an"lisis se reali#aron solamente a las leches crudas, para controlar el estado inicial de las muestras. )rueba de reductasas &n la 7igura 2 se observa que de las muestras anali#adas, el 13K presentaron buena calidad higinica, porque no produ.eron decoloracin del reactivo durante m"s de < horas +;21 minutos,. $ientras que de las muestras restantes: ;1K resultaron de mala calidad porque decoloraron antes de transcurrida la hora y otras ;1K de calidad regular. 7igura 2: 5rueba de reductasas Densidad &n la 7igura ; se observa que las medidas de la densidad de la leche se encontraron entre 2,3;9 y 2,3<1, donde hay muestras que est"n fuera de rango. na leche cuya densidad no se encuentra dentro de este rango, da cuenta de una posible adulteracin +una dilucin del producto con agua, o desnatado,, lo cual es considerado fraude, por lo que es importante este ensayo, aunque puede dar densidad normal una leche desnatada y aguada, en estas condiciones no se revela el fraude por si sola. 7igura ;: Censidad de la leche cruda )rueba de alco.ol 7igura <: 5rueba de alcohol Do flocularon 7locularon &l ;1 K de las muestras coagul, por lo que no pudieron ser sometidas al tratamiento trmico +7igura <,. Acide3 &n la 7igura < se puede ver que los resultados de acide# variaron entre 29 y <<=C, ?1K de las muestras superaron el limite superior establecido por el )**, lo cual indica desarrollo de acido l"ctico como producto final de degradacin de las prote-nas. na elevada acide# refle.a una posible deficiencia en el manipuleo, conservacin inadecuada y en algunos casos atribuibles a un animal enfermo. 7igura @: *cide# titulable An/lisis Microbiol2gicos &stos an"lisis se reali#aron a las leches antes y despus de pasteuri#ar, utili#ando el tratamiento trmico a 9< =) durante <3 minutos. &n el caso de la leche cruda, la presencia microbiana influye sobre su calidad, dependiendo por un lado de la higiene mantenida en el proceso de obtencin de la leche, y por otro lado del estado sanitario de la vaca. +Spreer, 2AA2,. -ecuento de Bacterias Aerobias Mes2+ilas0 Las bacterias aerobias mesfilas son consideradas en general como organismos indicadores de calidad. Los recuentos altos de grmenes viables indican materias primas contaminadas, limpie#a y desinfeccin no correcta o condiciones inadecuadas de temperatura y tiempo durante la produccin o conservacin del alimento +8ryan, 2AA;, n nmero elevado de estos microorganismos indican que el producto esta prximo a alterarse. &n el siguiente histograma +7igura 1, se representa el recuento de 8acterias *erobias $esfilas de leche cruda. 7igura 1: 8acterias mesfilas en leche cruda Segn el l-mite establecido por el )**, solamente el @1K de las muestras se encuentra por deba.o del m"ximo permitido. Los resultados variaron entre @3 y ;x23 B 7)Jml. &n la 7igura 9 se ve como disminuye considerablemente el recuento de 8*$, poniendo de manifiesto la efectividad de la pasteuri#acin como mtodo para aumentar la vida til de la leche, disminuyendo la carga microbiana. &l gr"fico representa el promedio de 8*$ de leches crudas +*5, y leches pasteuri#adas en d-as de conservacin a 1=). 7igura 9: /endencia de las 8*$ antes y despus de pasteuri#ar. Se observa que las leches pasteuri#adas, siguen una tendencia lineal creciente, en los d-as posteriores, estando en todo momento dentro de lo establecido por el )** para leches enteras pasteuri#adas. Los resultados variaron entre 2 y @3 7)JmL para el mismo d-a de reali#ada la pasteuri#acin +d-a 3,, mientras que en el ltimo d-a +C-a 9, el m"ximo de 7)Jml fue de <333, muy inferior a los valores exigidos por el )**. Coli+ormes totales y +ecales0 Las bacterias coliformes constituyen el grupo de enterobacterias m"s importante presentes en la leche cruda. Se encuentran distribuidas ampliamente en la naturale#a, por lo que son usadas como 'indicadores de contaminacin(, es decir que si est"n presentes en una cierta cantidad refle.an malas condiciones higinicas en las pr"cticas de traba.o. La Esc.eric.ia coli es un germen fecal, que habita en el intestino del hombre y animales. Su presencia en el alimento indica la posible presencia simult"nea de microorganismos patgenos ecolgicamente relacionados. )uando esta presente en grandes cantidades puede provocar diarrea, con un cuadro cl-nico especifico. +8ryan, 2AA;,. &n la 7igura ? se presenta un histograma del recuento de 8acterias )oliformes /otales de leche cruda, con una media de ;x23 @ 7)JmL, donde el B9K de las muestras super el l-mite establecido por el )** para el consumo directo. 7igura ?: >istograma de )oliformes totales de leche cruda. &n todas ellas hubo ausencia de E. coli. )on respecto a las muestras pasteuri#adas no hubo desarrollo de 8acterias )oliformes ni de E. coli, siendo ste otro indicador de los beneficios del tratamiento trmico. 7igura B: *ptitud de la leche antes y despus de pasteuri#ar. *.5.: *ntes de 5asteuri#ar. 5.: 5asteuri#ada. E$aluaci2n de tratamiento a 456C Se reali# el control microbiolgico para el tratamiento con ?;=), buscando la relacin tiempoJ temperatura adecuada! debido a que la metodolog-a industrial a esta temperatura es para 21 segundos por la transferencia de calor entregado por los equipos. )on esta pasteuri#adora artesanal en bolsa debimos aumentar el tiempo de tratamiento a 2 minuto cuando la carga microbiana de 8*$ fue de 23 1 7)JmL antes de la pasteri#acin! y al tiempo de ; minutos cuando la carga microbiana de 8*$ en leche cruda era superior a sta. Los resultados del control microbiolgico de las leches pasteuri#adas, las cuales se conservaron refrigeradas, fueron seme.antes al tratamiento con 9<=) J<3min. Sugerimos la adaptacin en este equipo de un sistema que contribuya a una me.or distribucin de calor durante el tratamiento. Las experiencias en sta se continan reali#ando. CONCLUSIN Cesde el punto de vista microbiolgico y en funcin de los an"lisis reali#ados, se comprob que 2@K de las leches crudas pueden ser consumidos sin ningn tratamiento trmico previo, porque se encuentran dentro de los l-mites aceptables por el )**. )on respecto a los ensayos f-sico0qu-micos, el ?1K de muestras estuvieron dentro del l-mite aceptable. Los datos arro.ados de las pruebas de densidad demostraron que la mayor-a de las muestras anali#adas no fueron adulteradas. La prueba de alcohol demostr que ?1K de muestras aptas para la pasteuri#acin, esta prueba resulta de f"cil reali#acin por los peque%os productores para conocer si la leche cruda es posible pasteuri#arla. &n el an"lisis de a#ul de metileno, el 13K presentaron buena calidad higinica, ;1K de mala calidad y ;1K de calidad regular! esta prueba nos da una r"pida informacin sobre la cantidad de bacterias presentes en leche cruda. )on la pasteuri#acin a 9<=) se observ una considerable disminucin en el nmero de microorganismos durante los d-as de conservaciones con adecuada refrigeracin, donde el recuento de microorganismos en los d-as posteriores aun se encuentra dentro de los l-mites establecidos en el cdigo. )on la pasteuri#acin a ?;=), el tratamiento fue efectivo al tiempo de ; minutos para una carga microbiana inicial +leche cruda, de 8*$ inferior a 23 9 7)Jml. Se contina investigando la relacin tiempo Jtemperatura ptima para este tratamiento. Se necesita m"s capacitaciones de 8uenas 5r"cticas de $anufactura +85$, a los productores para minimi#ar la carga microbiana inicial +leche cruda, y que ambos tratamientos sean efectivos logrando que la leche pasteuri#ada llegue al consumidor sin riesgos para la salud. (I(LIO)RA#IA :amn, *.D! Pimne#, $.8! :o.as $ocobono, $! )ravero, *.5. +;339,. Nalor nutritivo y calidad nutricional de leches y dulce de leche de cabra y vaca. :ev. /ecnolog-a L"ctea Latinoamericana. 6SSD 3<;B0@299. 5"g.: @B01;. )digo *limentario *rgentina +)**,. )ap. N666: *limentos L"cteos. *rt.111, 11? y 11B. Spreer, &. +2AA2,. Lactolog-a industrial: leche, preparacin y elaboracin. $"quinas, instalaciones y aparatos. 5roductos l"cteos. Segunda edicin. &spa%a. &d. *):686*. p @1. CumOe, /.! 6urinic, $.! 7ern"nde#, 5.! Saldivar, ).! /rela, N.! +;33A,. '5asteuri#acin manual de leche para peque%os productores. *n"lisis f-sico0qu-micos y microbiolgicos(. )eC6/ec. $nes, *rgentina. )at"logo de 5royectos )eC6/ec. +;323,. 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