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Rotinas Analticas

A porcentagem de recuperao e o grau de purificao da molcula alvo devem


ser observados em cada etapa do processo de purificao.
Rotinas associadas volumes, que levam quantificao de uma certa protena,
viabilizam a determinao de balanos de massa e das porcentagens recuperadas em
cada etapa do processo. Na atividade enzimtica ou antignica. uma quantificao
indireta obtida facilmente.
A atividade enzimtica a velocidade inicial da reao especfica catalisada
pela enzima, determinada em condies padronizadas de pH, temperatura, fora inica e
concentrao do substrato, ou seja, condies reprodutveis.
Uma unidade de atividade enzimtica a quantidade de produto liberado ou
substrato consumido (J/mol) em um minuto nas condies do ensaio. Ento, em cada
etapa do processo, determina-se a capacidade biolgica da molcula a qual, associada
aos volumes envolvidos, permite determinar a porcentagem recuperada.
Para qualquer mtodo de purificao, especificamente para um balano de
atividade enzimtica em um processo de extrao em duas fases aquosas, os seguintes
princpios so empregados, notando-se que a atividade enzimtica expressa
especificamente em relao a um volume, A (V/L).

Vi
nicial
refere-se ao volume de meio contendo enzima e impurezas, a ser submetido
extrao, e o termo a
inicial
representa a atividade enzimtica total contida no meio.

a
inicial
(u) = A
inicial
(U/L) X V
inicial
(L)

Logo aps o processo de extrao, a enzima distribui-se entre os volumes das fases
superior, V
fase superior
e inferior, V
fase inferior
em conformidade com sua solubilidade.

Determinao da atividade enzimtica, a, em cada fase

a
fase superior
(u) = A
fase superior
(U/L) x V
fase superior
(L)
a
fase inferior
( u) = A
fase inferior
(U/L) x V
fase inferior
(L)

Determinao das porcentagens recuperadas em cada fase, R
fase superior
e R
fase inferior'
(A
atividade enzimtica na fase considerada representada por a
1)
.

R(%) =

X 100

Determinao das perdas do produto (fsicas ou por desnaturao), as quais podem
ocorrer em qualquer etapa do processo de purificao.

a
perda
= a
inicial
- a
fase superior
- a
fase inferior


A molcula sendo uma enzima, a pureza em cada etapa define-se como sendo a
razo entre a atividade enzimtica e a massa de protenas totais, P (mg), tambm
conhecida como atividade especfica, Ae.

O aumento do grau de pureza, AP (%), d-se pela variao do valor de Ae.


A
ei
= atividade especfica em uma certa etapa do processo
A
e0
= atividade especfica inicial

Existem vrios mtodos para a determinao de concentraes totais de protena.
Dentre os quais: biureto-reagente alcalino de cobre; Lowry-Folin-Ciocalteau; absoro
de raios UV a 280nm (aminocidos aromticos) ou a 205-220nm (peptdeos); cido bis-
cincrnico; Bradford. Cada mtodo funda-se em princpios diferentes, por conseguinte
os resultados obtidos no so iguais e, ento, impossibilita comparaes.
Se uma nica metodologia fosse adotada, o resultado obtido somente expressaria
a verdadeira concentrao de protenas se a curva de calibrao fosse determinada com
soluo de protenas de composio idntica soluo alvo.
Uma rotina comum no acompanhamento de processos de purificao a
eletroforese. A mesma separa as protenas por ao de um campo eltrico que fora o
movimento das molculas eletricamente carregadas atravs de um gel de poliacrilamida
ou agarose. As protenas apresentam mobilidade em conformidade com sua carga total,
massa molecular e intensidade do campo eltrico. Segue-se a deteco, a qual
compreende a colorao das protenas distribudas sobre o gel, com o corante
"Coomassie Brilliant Blue", havendo a possibilidade do uso de outros corantes tambm.
O resultado a visualizao de uma sequncia de traos (bandas) azuis, onde
cada banda corresponde a uma protena. A massa molecular das protenas da amostra
pode ser estimada pela introduo de padres, o que tambm proporciona a
identificao da banda correspondente protena alvo. O nmero de bandas obtidas
relaciona-se pureza da amostra, assim a uma completa purificao corresponde uma
nica banda, relativa molcula alvo.
Rotinas destinadas a determinar as principais caractersticas das molculas
presentes no meio a ser purificado, tambm devem ser adotadas. Essa caracterizao do
meio dever nortear a seleo adequada de operaes do processo de purificao. Um
procedimento bsico consiste no fracionamento das protenas presentes no meio em um
sistema de gel filtrao preparativo, isto , um sistema capaz de processar volumes da
ordem de vrios mililitros. A aplicao de rotinas especficas para a deteco da
molcula alvo nas diversas fraes, associada determinao da concentrao de
protena total em cada frao, permite determinar a proporo em massa das molculas
que constituem impurezas.


A anlise eletrofortica da figura acima representa gel de eletroforese tpico
indicando a evoluo do acmulo da protena heterloga intracelular troponina C (TnC)
em Escherichia coli. esquerda do gel esto indicadas as massas moleculares dos
padres (kDa) e abaixo, o tempo de cultivo em horas.
Impurezas de massa molecular podem ser eliminadas por gel filtrao ou
ultrafriltrao. A massa molecular pode ser estimada por meio de uma curva de
calibrao com molculas de massas moleculares conhecidas no sistema de gel filtrao,
ou injetando-se no gel de eletroforese molculas de massa molecular conhecida
juntamente com as fraes obtidas na gel filtrao.
Uma forma simples de avaliar a solubilidade de protenas submet-las
precipitao com (NH
4
)
2
SO
4
. As protenas que pedirem menor concentrao do sal para
precipitarem totalmente, so as de menor solubilidade, podendo-se assim, ordenar as
molculas fracionadas na gel filtrao preparativa em uma ordem de solubilidade.
A cromatografia de troca inica muito utilizada, devido ao elevado poder de
resoluo e capacidade de processamento. Esta opo deve considerar a capacidade de
adsoro das molculas sobre uma determinada resina catinica ou aninica. Essa
capacidade determinada atravs de curvas de titulao eletrofortica. Com tal curva
determina-se a velocidade de migrao de uma protena, denominada mobilidade, em
um campo eltrico sob temperatura, tampo, composio do gel. Trata-se de uma
eletroforese conduzida em um gel que apresenta um gradiente de pH formado entre um
ctodo e um nodo, estando o ctodo sob valor de pH maior em relao ao anodo.
As protenas, por apresentarem carter anfotrico, tero carga positiva sob
valores de pH abaixo de seu ponto isoeltrico e carga negativa sob valores de pH acima
do ponto isoeltrico. Dessa forma, onde quer que as protenas estejam em relao ao
gradiente de pH, elas migraro em direo ao seu ponto isoeltrico em conformidade
com sua carga. Protenas com mobilidades eletroforticas, isto , distncias percorridas,
muito diferentes na regio de valores de pH abaixo do pl provavelmente sofrero
separao eficiente em uma resina trocadora de ctions.

O processo integrado de purificao

As etapas iniciais do processo de purificao compreendem as operaes
unitrias, destinadas remoo de clulas e seus fragmentos e concentrao da
molcula alvo, como mostrado na tabela a seguir.



Alguns critrios norteiam a escolha das operaes de clarificao e
homogeneizao. Grandes volumes de suspenses de leveduras so eficientemente
clarificados por centrifugao, enquanto que para volumes moderados de suspenses
bacterianas deve haver uma comparao entre a centrifugao e a filtrao.
Em contrapartida, microrganismos filamentosos so clarificados atravs de
filtrao convencional, devido reduzida velocidade de sedimentao destes
organismos de baixa densidade.
A modificao da estrutura de molculas um recurso importante para o aumento do
poder de resoluo de determinadas operaes de purificao e, consequentemente,
reduo do nmero de etapas envolvidas.
Como exemplo, um peptdeo humano de ao diurtica e hipotensiva, de apenas
2 kDa, foi modificado pela introduo da sequncia relativa a uma protena natural de E.
coli, a tioredoxina de 11.700 kDa, uma sequncia de 6 histidinas em seu gene
estrutural, constituindo uma molcula de fuso. A primeira modificao teve por
objetivo aumentar o nvel de produo intracelular do peptdeo e proteg-lo da ao de
proteases; a segunda modificao destina-se a tornar a molcula passvel de purificao
em processo cromatogrfico por afinidade com ons nquel imobilizados na matriz. A
molcula foi totalmente purificada unicamente atravs desse processo, aplicado fase
solvel das clulas rompidas.
Aps a purificao, foi necessria uma hidrlise efetuada por enzima especfica
sobre stio introduzido para este fim (stio de clivagem), a fim de se obter o peptdeo
somente. A adsoro em leito expandido tem sido cada vez mais adotada, pois
possibilita a reduo do nmero de etapas, uma vez que a captura de protenas se d a
partir de meios que contm partculas, procedimento que viabiliza a clarificao de uma
suspenso ou de um homogeneizado de clulas e a purificao da molcula alvo em
uma nica operao. Alm disso, a reduo do tempo de processamento diminui a
possibilidade de hidrlise da molcula alvo por ao de proteases, normalmente
presentes quando se trata de produtos intracelulares.
A caracterizao prvia do produto e impurezas, fundamental seleo das
operaes de purificao. Caractersticas inerentes s operaes tambm devem ser
consideradas. Na gel filtrao ocorre diluio significativa, isto , a concentrao das
molculas nas fraes coletadas menor que a concentrao no meio injetado na
coluna. Por essa razo, a gel filtrao empregada na ltima etapa de um processo de
purificao, pois do contrrio, acarretaria aumento do volume de meio a ser tratado ao
longo do processo. Ao final do processo, pode-se empregar a ultrafiltrao para ajuste
da concentrao. A cromatografia de troca inica, ao contrrio da gel filtrao, promove
o aumento da concentrao das molculas.