D 1015601

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
Facultad de Farmacia
Departamento de Bioqumica Y Biologa Molecular II
HOMOLOGIA ESTRUCTURAL Y FUNCIONAL ENTRE LAS FAMILIAS
PROTEICAS DE LAS CHAPERONINAS Y DE LAS SUBUNIDADES a
DEL COMPLEJO F-ATPAsA
Memoria que presenta el Licenciado
D. Agustn Aleonada Rodrguez
para aspirar al grado de DOCTOR en FARMACIA
Madrid, Marzo 1993
DIRECTOR DE ESTA TESIS:
Prof. Dr. D. Jos Manuel Cuezva Marcos
LICENCIADO ASPIRANTE AL GRADO DE DOCTOR
Agustn Alconada Rodrguez
Jos Manuel CuezvaMarcos, Profesor Titular del Departamento
de Biologa Molecular de la Universidad Autnoma de
Madrid.
Certificaque Agustn Aleonada Rodrguez ha realizado bajo mi
direccin el trabajo Homologa Estructural y Funcional
entre las Familias Proteicas de las Chape roninas y de las
Subunidades a del Complejo Fj-ATPasa
Considera el trabajo realizado satisfactorioy apto para ser
presentado comoTesis Doctoral en laFacultad de Farmacia
de Universidad Complutcmse de Madrid.
Y para que conste donde proceda, expide el presente
certificado en Madrid, el veinticuatro de Marzo de mil
novecientos noventay tres.
Jos Manuel Cuezva Marcos
El trabajo presentado en esta Memoria ha sido realizdo en el Departamento dc
Biologa Molecular, Centro de Biologa Molecular, de la Universidad Autnoma dc
Madrid (Enero 1989-Abril 1993) con fondos provistos por la Direccin General de
Investigacin Cientfica y Tcnica, proyectoPM89-0061, y por la Comunidad Autnoma
de Madrid, proyectos C150/90 y C032/92.
Durante este periodo, el Licenciado D. Agustn AlconadaRodrguez ha disfrutado
de una Beca predoctoral de Formacin de Personal Cientfico e Investigador del
Ministerior de Educacin y Ciencia (Enero, 1989 - Diciembre, 1992) y de un contrato
asociado al proyecto C150/90 de la Comunidad Autnoma de Madrid (Enero 1993 -
Abril 1993).
Parte de los resultados presentados en este trabajo han sido publicados en las
siguientes revistas y libros:
Luis, A.M.; Alconada, A. y Cuezva, J.M. Tite a regulalory subunil of lite mitocitondrial
Fi -ATPase L v a heat-sitock prole/ti. Idenhfical/on of lwo it/gitly-conserv ed amino acid
sequences atnong tite a-subunits and molecular chaperones (1990) J.BioLChem 265
77 13-7716.
Alconada, A. y Cuezva,J.M. A chaperonin prorein module inv olv ed in recognilion of
interactiv e prole/ti surfaces? (1993) TIBS 18 81-82
Santarn,J.F.; Alconada,A. y Cuezva,J.M. Examinal/on of process/ng of lite ral/v er
mitochondrial Fi-ATPase f3-subun/t precursor prole/ti by highresoluion 2D-gel
electropitoresis (1993) J.Biochem. 113 129-131
Cuezva,J.M.; flores, A.1., Santarn,J.F. y Alconada,A. Molecular chaperones and he
biogenesis of initochondria and peroxisornes (1993) BioLCeil. en prensa.
Cuezva,J.M.; Alconada,A.; lzquierdo,J.M.; Luis,A.M.; Ostronoff,L.K.; Marn, A. y
flores, A.!. Tite unknown ubiquiy of mitochondrial FI-ATPase a-subun/t. A stress
protein inv olv ed in organelle biogenesis. (1991) En: Recent Advances in cellular and
molecular biology. (Wegmann,R.J., Wegmann, MA., eds) Peeters Press, Blgica.
Por ltimo, estos resultados se han presentado como comunicaciones en un
Congreso Nacional y tres Congresos Internacionales.
AGRADECIMIENTOS
Deseo expresar mi ms sincero agradecimiento a Pepe Cuezva por haberme
brindado la oportunidad de colaborar en su lnea de investigacin y por haberme
enseado, entre otras muchas cosas, a perseverar en el trabajo y a no desanimarme
cuandolas cosas se ponan cuesta arriba.
Agradezcoa todos los compaeros de laboratorio (por orden de aparicin: Ana
Luis, Margarita Chamorro, Carmen Valcarce, Jos Mara Izquierdo (Ji), Ana Cenarro,
Carmen Blanco, LucianaK. Ostronoff, Ana Marn, Ana flores, Javier Ricart y Antonio
Liras) por haber contribuidoa crear un ambiente agradable de trabajo. As mismo, me
gustara reincidir en mi gratitud hacia aquellas personas que han colaborado ms
directamente conmigo (Ana Marn, Ana Cenarro, Carmen Blanco y Javier Ricart),
aportando ideas, manos y, sobre todo, mucha ilusin; y a Margarita Chamorro, a pesar
de su esfuerzo diario por ventilar el laboratorio, por ayudarme en todo lo posible.
Megustara expresar mi gratitud a todo el personal de laboratorio 460, por haber
contribuido a que nuestra estancia en lacuarta planta fueramucho ms llevadera.
Agradezco:
Al Dr. M. Benito, por haber aceptado ser el Tutor de estaTesis.
Al Dr. J. Ortn y a todo su equipo, por haberme admitido temporalmente en su
laboratorio y por iniciarme en la tcnicas de DNA recombinante.
Al Dr. L. Blanco, por suayuda en los alineamientos mltiples de secuencia.
Al Dr. J. Vandekerckhove, por su indudable esfuerzo e inters en solucionar
nuestros problemas con p57.
Al Dr. i.F Santarn, por la realizacin de los geles bidimensionales presentados en
este trabajo.
A todo el personal de los distintos servicios tcnicos del Centro de Biologa
Molecular (fotografa, ordenadores, instrumentacin, animalario, mantenimiento)
por haber contribuido entre todos a que el trabajo saliera adelante.
A Pedro Gonzlez y Carmen San Martn por su inestimable ayuda en el
procesamiento de las muestras de microscopia electrnica. Un recuerdo muy
especial para Pedro Gonzlez, que por desgracia no ha podido ser testigo del final
de este trabajo, en el que puso mucha ilusin y esfuerzo.
Al los sufridores diarios del pollo (Pepa, Pedro, Maria Jos, Manolo, Brbara)
por contribuir diariamente, con su buen humor, a que pudiera desconectar durante
un rato de los agobios del trabajo.
Quiero agradecer a mis padres, a quienes va dedicada esta Tesis, por haberme
apoyado y animado constantemente y porque, muy probablemente, sin su ayuda no
hubiera sido capaz de llevar este trabajo a su fin.
Finalmente, agradezco a Gema por sus buenos consejos, por saber escuchar mis
problemas, por su compaa, por haberme soportadoen los malos momentos, por darme
nimos cuando ms lo necesitaba y por otras muchas cosas que ella sabe bien y que se
resumen en una: por haberme alegrado enormemente la existencia.
ABREVIATURAS
ams Estabilidad alteradade mensajeros
ATP
BSA
CTP
DMEM
DTT
EDTA
EGTA
Hepes
HPLC
h sp
IEF
IgG
kDa
KLH
MIM
MPP
NEPHGE
PEP
Pipes
PMSF
PVDF
RE
rpm
RSBP
SDS
SDS-PAGE
TBS
TCA
TEMED
TFA
Tris
Adenosn trifosfato
Albmina de suero bovino
Citosntrifosfato
Mediode Eagle modificadopor Dubeicco
Ditiotreitol
cido etiMndiaminotetractico.
Acido etilnglicol~bs~(annno-eteO-tCtraflCtKO
cido N-2-hidroxietil-N-2piperaznetanolsulfniCo
Cromatografalquida de alta eficacia
Protenade estrs trmico
Isoelectroenfoque.
InmunoglobulinaG
kilodalton
Hemocianinade Megathuracrenulata
Membrana interna mitocondrial
Proteinaprocesadorade matriz
Electroforesis de no equlibrio en gradientes de pH
Protena activadoradel procesamiento
Piperacina-N,N-bis (2-etano-cidosulfnico)
fluoruro de fenilmetil sulfonilo
Polivinil difluorideno
Retculo endoplsmico
revoluciones por minuto
Protena de unin a lasubunidad de Rubisco
Dodecil sulfatosdico
Electroforesis en geles de poliacrilamida-SDS
Tris 10 mM, pH 7,5, NaC 0,15M
cid triclornactico
N,N,N,N tetrametilendiamida
Acdo tnfluoroactico
Tris (hidroximetil)-aminOmetaflO
INDICE
NDICE GENERAL
Pgina
1. REVISION BIBLIOGRAFICA 23
1.1. Estrs celular 23
1.1.1. Agentes inductores de la respuesta a estrs 23
1.1.2. Alteraciones en las clulas sometidas a estrs 25
1.1.2.1. Alteraciones estructurales 25
1.1.2.2. Alteraciones bioqumicas 26
1.1.2.3. Fenocopias 27
1.2. Protenas de estrs 28
1.2.1. Protenas de estrs de bajo peso molecular 30
1.2.2. Protenas de estrs de 60 kDa (chaperoninas) 30
1.2.2.1. Clasificacin y caractersticas generales 31
1.2.2.2. Mecanismo de accin de las chaperoninas 37
1.2.3. Protenas de estrs de 70 kDa 39
1.2.3.1. Clasificacin de las protenas de estrs de 70 kDa 40
1.2.3.2. Estructura de las hsp70s 46
1.2.3.3. Mecanismo de accin de las hsp7os 47
1.2.3.4. Cooperacin funcional entre las protenas de estrs de 48
60 y 70 kDa en el plegamiento polipeptdico
1.2.4. Protenas de estrs de 90 kDa 50
1.2.5. Otros chaperones moleculares 50
1.3. Importacin dc protenas a la mitocondria 54
1.3.1. Precursores proteicos mitocondriales 56
1.3.2. Sntesis de precursores y estabilizacin de stos en el
citosol 56
1.3.3. Interaccin con receptores de la membranaexterna
mitocondrial 57
1.3.4. Canales de transiocacin de protenas 59
1.3.5. Transporte y maduracin de precursores en lamatriz mitocondrial. 59
1.3.6 Transponede precursores a distintos compartimentos
submitocondriales 61
INDICE
1.3.6.1. Transporte de precursores a la mcmbranaexterna 61
mitocondrial
1.3.6.2. Transporte de precursores al espacio 62
intermembrana
1.3.6.3. Transportede precursores a la membrana interna
mitocondrial 64
1.4. ATPasas transiocadoras de iones 65
1.4.1. Aspectos generales 65
1.4.2. Clasificacin de ATRasas transiocadoras de iones 66
1.4.2.1. P-ATPasas 68
1.4.2.2. V-ATPasas 69
1.4.2.3. F-ATPasas 72
1.4.3. Evolucin de las ATPasas translocadoras de iones 77
1.4.3.1. Hiptesis endosimbionte 81
1.4.3.2. Desarrollo del sistema de citomembrana en clulas
eucarotas 82
1.5 Bibliografa 85
2. INTRODUCCION 111
3. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 125
4. MATERIALES Y METODOS 135
4.1.1. Animales de experimentacin, lneas celulares y cepas
bacterianas 135
4.1.1.1. Ratas 135
4.1.1.2. Conejos 135
4.1.1.3. Drosophula 135
4.1.1.4. Lineas celulares 135
4.1.1.5. Cepas bacterianas 135
INDICE
4.1.LG. Vcctorcs de donacin 136
4.1.2. Productos 136
4.2. Mtodos 137
4.2.1. Fraccionamiento subcelular de hgado de rata 137
4.2.1.1. Homogeneizado de hgado 137
4.2.1.2. Aislamiento de mitocondrias 138
4.2.1.2.1. Por centrifugacin diferencial 138
4.2.1.2.2. Por gradiente de sacarosa 138
4.2.1.2.3. Por gradiente de Nycodenz 138
4.2.1.3. Aislamiento de peroxisomas 139
4.2.1.3.1. Por gradiente de sacarosa 139
4.24.3.2. Por gradiente de Nycodenz 139
4.2.1.4. Fraccionamiento submitocondrial 139
4.2.1.4.1. Solubilizado mitocondrial 139
4.2.1.4.2. Obtencin de mitoplastos 140
4.2.1.4.3. Obtencin de vesculas de MIM 140
4.2.1.4.4. Purificacin parcial de F1-ATPasa 140
4.2.1.5. Preparacin de fraccin citoslica 141
4.2.2. Preparacin de matriz de eritrocitos de rata 141
4.2.3. Tratamiento de choque trmico de larvas de Drosopit/la
/iyde/ 141
4.2.4. Determinacin de actividades enzimticas 142
4.2.4.1. Actividad citocromo c oxidasa 142
4.2.4.2. Actividad catalasa 142
4.2.5. Fraccionamiento electrofortico de protenas 143
4.2.5.1. SDS-PAOE 143
4.2.5.2. Electroforesis bidimensional 143
4.2.5.2.1. lsoelectroenfoque/SDS-PAGE 143
4.2.5.2.2. NEPHGE/SDS-PAGE 143
4.2.5.3. Visualizacin de las protenas fraccionadas 144
4.2.5.3.1. Tincin con azul de Coomassie 144
4.2.5.3.2. Tincin con plata 144
4.2.5.3.3. Fluorografa 144
4.2.5.3.4. Autoradiografla 144
4.2.6. Generacin de anticuerpos 144
4.2.6.1. Anticuerpos contra pptidos sintticos 144
INI)ICI 1
4.2.6.3. Anticuerpos contracl polipptido de 60 kDa
inmunoprecipitado por el anticuerpo anti-FI -ATPasa 147
4.2.6.2. Anticuerpos purificados por afinidad 147
4.2.7. Anlisis inmunolgico dc protenas 150
4.2.7.1. Western blot 150
4.2.7.1.2. Transferencia a PVDF 150
4.2.7.1.3. Inmunodeteccin de protenas 150
4.2.7.2. Inmunoprecipitacin 151
4.2.7.2.1. Inmunoprecipitacin directa 151
4.2.7.2.2. Inmunoprecipitacin con protena A-
sepharosa 152
4.2.7.3. Cromatografa de inmunoafinidad 152
4.2.8. Anlisis peptdico de protenas y microsecuenciacin 152
4.2.8.1. Digestiones con proteasa VS 152
4.2.8.2. Digestiones con tripsina 153
4.2.8.3. Digestiones con N-cloro succinimida 153
4.2.8.4. Digestiones con bromuro de ciangeno 155
4.2.8.5. Anlisis de los fragmentos peptidicos mediante HPLC
en fase reversa 155
4.2.8.6. Microsecuenciacin 156
4.2.9. Tratamiento con endoglicosidasas de polipptidos
inmunoprecipitados 156
4.2.10. Estudios de plegamiento proteico 157
4.2.11. Anlisis mediante electroforesis bidimensional del procesamiento
de precursores mitocondriales 157
4.2.12. Tcnicas de microscopia 158
4.2.12.1. Microscopia de inmunofluorescencia 158
indirecta
4.2.12.2. Microscopia electrnica 158
4.2.13. Purificacin de cidos nucleicos 159
4.2.13.1. Aislamientode RNA de hgado de rata y RNA poli 159
A
4.2,13.2. Aislamiento de DNA plasmdico 159
4.2.13.3. Aislamiento de DNA del fago Xgtll 159
4.2.14. Electroforesis de cidos nuclelcos 159
4.2.14.1. Electroforesis de RNA 159
4.2.14.2. Electroforesis de DNA 159
INI)ICI 1
4.2.15. Manejo de genotecas dc cDNA dc hgado de rata 160
4.2.15.1. Sntcsis dc una genoteca de cDNA de hgado de
rata 160
4.2.15.2. Screening de una genoteca de expresinde cDNA
de hgado de rata 160
4.2.16. Anlisis de mensajeros 161
4.2.16.1. Northern blot 161
4.2.16.2. Marcaje de cDNAs 161
4.2.16.3. Hibridacin 162
4.2.17. Secuenciacin de DNA 162
4.2. 18. Anlisis asistido por ordenador de secuencias de protenas y
cidos nucleicos 162
4.2.18.1. Anlisis de estructura de protenas 162
4.2.18.1.1. Estmetura primaria. Alineamientos 162
4.2.18.1.2. Estructura secundaria 163
4.2.18.2. Anlisis de secuencia de cidos nucleicos 164
5. RESULTADOS 171
5.1. Caracterizacinde la relacinevolutiva entre chaperoninas y subunidades
a de las F-ATPasas 171
5. 1. 1. Homologaestructural entre lafamilia proteica de las subunidades
a del complejo F1-ATPasa y la familia de las chaperoninas 171
5.1.1.1 Identificacin de 2 regiones aminoacdicas altamente
conservadas entre ambas familias 171
5.1.1.2 Alineamiento mltiple de secuencias de subunidades a y
chaperoninas 176
5.1.1.3. Prediccin y alineamiento de la estructura secundaria de
las chaperoninas y subunidades a 180
5.1.1.4. Verificacin del alineamiento mltiple de las
chaperoninas y subunidades a. Inferencia de una
secuencia consenso 184
5.1.2 Evidencias experimentales inmunolgicas que apoyan larelacin
evolutiva entre chaperoninas y subunidades a 186
{NI)ICL
5.1.2.1 Generacin dc anticuerpos contra las regiones
conservadas entre chaperoninas y subunidades a.
Identificacin dc protenas inmunoreactivas
5.1.2.2 Identificacin de protenas celulares inducibles por
choque trmico en larvas de D.melanogasterque
contienen uno de los dominios homlogos (DR-1) entre
chaperoninas y subunidades a
5.1.3. Implicaciones funcionales de laidentidad de secuenciaentre
chaperoninas y subunidades a
5.1.3.1 Identificacin del posible dominio de las chaperoninas
responsable del reconocimientode superficies proteicas
nt eracli vas
5.1.3.2. Evidencias experimentales de la capacidad del pptido
sntco DR-2 (regin VIII, Fig. 1> para interferir en los
procesos de plegamiento
5.1.4. Intento de
proteico 196
5.1.3.2.1. Capacidad dcl pptido DR-2 para interferir 196
en el plegamiento de protenas
desnaturalizadas
5.1.3.2.2. Efecto del pptido DR-2 sobre a solubilidad
de protenas nativas 201
clonajedel cDNA correspondiente a la subunidad adel
complejo F1-ATPasa mitocondrial 205
5.1.5. Implicaciones evolutivas de lahomologa funcional y estructural
entre chaperoninas y subunidades a 209
5.1.6. Identificacin y caracterizacin molecular del polipptido de 57
kDa, previamente consideradoa-F1-ATPasa, en localizaciones
extramitocondriales 219
5.1.6.1. Caracterizacin de lanaturaleza molecular de pS7:
donde sedemuestra que estaprotenacorresponde a
catalasa 220
5.1.6.1.1. Estudios de inmunomicroscopa electrnica e
inmunofluorescencia indirecta 220
5.1.6.1.2. Caracterizacinde laprotena inmunoreactiva
comn a mitocondrias, eritrocitos y
peroxisomas
5.1.6.1.3. Mapeo peptdico de p57
221
224
186
189
193
193
INI)ICI?
S.l.6.I.3.I. Proteolisis enzimticas.
Proteasa V8 y tripsina 226
5.1.6.1.3.2. Proteolisis qumicas.
Bromurode ciangeno y N-
cloro succinimida/urca 228
5.1.6.1.4. Microsecuenciacin de pptidos resultantes
de la digestin trptica de p57 229
5.1.7. Caracterizacin preliminar de lacatalasa de mitocondria de hgado 234
de rata
5.1.7.1. Caracterizacin de lacatalasa dc mitocondria de hgado
de ratacomo un protena propia de este orgnulo y no
como una contaminacin peroxisomal 234
5.1.7.1.1. Fraccionamiento
subcelular 234
5.1.7.1.2. Localizacin subcelular mediante
inmunomicroscopa
electrnica 237
5.1.7.2. Anlsis mediante electroforesis bidimensional de
catalasade mitocondria, eritrocitos y
peroxisomas 244
5.1.7.2.1 Identificacin de las isoformas de
catalasa 240
5.1.7.2.2. Estudio mediante electroforesis
bidimensional de laposible glicosilacin de
las isoformas de catalasa 244
5.1.7.3. La catalasa mitocondrial tiene una migracin
electrofortica ligeramente inferior (2 kDa) ala de
eritrocito y peroxisoma 246
5.1.8. Causas e implicaciones de laidentificacin de catalasainactiva en
la mitocondria de hgado de rata 248
5.2. Desarrollode un sistema experimental de alta sensibilidad que permitala
identificacin y caracterizacindel procesamientode precursores
mitocondriales 255
6. DISCUSION 265
IN[)ICII
7. CONCLUSIONES 281
8. BIBLIOGRAFIA 285
1. REVISIN BIBLIOGRFICA
REVThION BIBLIOGRFICA
1. REVISION BIBLIOGRAFICA
LI. ESTRS CELULAR
Una caracterstica esencial de todos los seres vivos es sucapacidad paradetectar y
responder a las variaciones en su entorno normal de crecimiento mediante una serie de
mecanismos complejos que garantizanel mantenimiento de lahomeostasia.
Anivel celular, los mecanismos que permiten la respuesta y/o el aclimatamiento a
cambios suaves en el entorno normal de crecimiento incluyen, a corto plazo, cambios
reversibles en la estructura y funcin de los enzimas, lo que a su vez puede alterar la
especificidad o direccionalidad de ciertas rutas metablicas y, a largo plazo,
modificaciones en el patrn de expresin gnica con la siguiente alteracin cualitativa y
cuantitativa del contenido proteico celular, mecanismo ste que contribuye a la exitosa
adaptacindefinitiva del ser vivo al nuevo entorno.
Sin embargo, cuandolas variaciones que un ser vivo experimenta en su entorno
normal de crecimiento son de tal magnitud que sobrepasan su capacidad fisiolgica de
respuesta, aparece otro tipo de respuesta celular, de igual o mayor importancia que la
anterior y que se conoce con el nombre genrico de respuesta al estrs. Este tipo de
respuesta aparece en todos los seres v iv os estudiados hasta la fecha y se encuentra
altamente conservadaa lo largo de la evolucin, tanto en cuanto asus mecanismos comoa
los componentes moleculares implicados.
A nivel celular, el principal componente de la respuesta al estrs lo constituye el
aumento rpido y preferencial en la expresin coordinada de un conjunto de protenas
conocidas genricamente como protenas de estrs, cuya funcin parece ser la de
proporcionar proteccin a la clula, a la vez que contribuir a recuperar las funciones
metablicas bsicas que se vieron afectadas durante el periodo de estrs. Ashburner y
Borner (1979), Craig (1985), Lindquist (1986), Subjeck and Shyy (1986) y Lindquist y
Craig (1988) han publicado revisiones exhaustivas sobreestetema.
1.1.1. Agentes inductores de la respuesta a estrs.
Aunque la respuesta a estrs fue inicialmente identificada como una serie de
alteraciones morfolgicas en respuesta a aumentos en la temperatura normal de
23
REVISIONBIBLIOGRFICA
crecimiento de ciertos organismos, se conocen en laactualidad multitud de situaciones
fisiolgicas y patolgicas capaces de desencadenar una respuestacelular semejante.
Todas estas situaciones pueden agruparse en las siguientes tres grandes
categoras:
1.- Situaciones de estrs ambiental: Este tipo de condiciones incluye el choque trmico
(Ritossa, 1964), exposicin de la clula a anlogos de aminocidos (Kelley y
Schlesinger, 1978; Hightower, 1980), a ciertos metales pesados (Levinson y col., 1980),
a algunos ionforos (Wu y col. 1981), a inhibidores de metabolismo energtico (Ritossa,
1962), ainhibidores de la sntesis de glicoproteinas (Poyssegur y col., 1977; Oldeny col.
1978), as como a la alteracin del pH del medio extracelular (Whelan y Hightower,
1985).
2.- Situaciones patofisiol~icas: Fiebre, hipertrofia, hiperoxia, inflamacin, isquema,
tratamientos con agentes antineoplsicos (Shaefer y col., 1988), infecciones virales
(Notarianni y Preston, 1982; Peluso y col., 1978) y expresin anormal de proto-
oncogenes y oncogenes (Morange y col., 1984; Peluso y col., 1978).
3.- Situaciones no estresantes: ciclo celular, factores de crecimiento, desarrollo y
diferenciacin (revisado por Morimoto y Milarski, 1990; y por Pauli y Tissieres, 1990).
El choque trmico fue el primer agente identificado capaz de promover la
respuesta al estrs (Ritossa, 1962. 1963, 1964). razn por la que ha constituido el
modelo experimental empleado tradicionalmente parael estudio de este tipo de respuesta
en distintos organismos. Por este motivo, los trminos respuesta a estrs y respuesta a
choque tnnico sonutilizados confrecuenciade formaindistintaenla literatura, y lagran
mayora de las protenas inducidas por estrs han sido denominadas protenas de choque
trmico (hsps).
A pesar de la naturaleza aparentemente dispar de todos los agentes capaces de
desencadenar la respuesta al estrs, muchos de ellos presentan como denominador comn
la capacidad de provocar alteraciones en la conformacin de protenas. Por esta razn, se
podraafirmar que el agente causante enltimo trmino de laaparicin de la respuestaal
estrs es la acumulacin intracelular de polipptidos estructuralmente anormales. Este
hiptesis se apoya en numerosas evidencias experimentales (Ananthan y col., 1986;
Kozutsumi y col., 1988; Edington y col, 1989; Parsell y Sauer, 1989; Goff y Goldberg,
1985).
24
REVISIONBIBLIOGRAFICA
1.1.2. Alteraciones en las clulas sometidas a estrs.
Las alteraciones bioqumicas y estructurales que aparecenen las clulas sometidas
a estrs han sido objeto de una activa labor investigadora. La mayor parte de los estudios
realizados eneste sentido han sido de naturaleza meramente descriptivay se han efectuado
en su mayor parte sobre clulas eucariotas en cultivo. Es importante considerar que la
aparicin de una alteracin determinada en una clula sometida a estrs puederesultar bien
de un efecto directo del estrs o bien ser debida a un mecanismo celular tendente a
compensar una alteracin previa, por lo que los datos obtenidos de la observacin directa
de laclula deben ser tomados con cautela.
1.1.2.1. Alteraciones estructurales.
En clulas de mamferos, el ncleo parece ser el orgnulo ms afectado por el
estrs, probablemente debido a la mayor susceptibilidad de los complejos cido
nucleico/proteina a sufrir desnaturalizacin y agregacin (Littlewood y col., 1987). Las
siguientes alteraciones soncaractersticas de los ncleos de clulas sometidas a estrs:
- Aparicin de los denominados grnulos pericromatnicos dispersos por todo el ncleo
(Heme y col., 1971), constituidos probablemente por agregados de pre-mRNAs no
procesados (Mayrand y Pedersen, 1983; Yost y Lindquist, 1986).
- En los nucleolos se produce una prdida y/o agregacinde los denominadoscomplejos
granulares, constituidos stos por prerribosomas y otros complejos ribonucleoproteicos
en formacin (Welch y Suhan, 1985; Neumann y col., 1984).
- Aparicin de filamentos cilndricos de actina que forman fibras densamente
empaquetadas y que atraviesan el nucleo de un extremo a otro (lida, 1986, Welch y
Suhan, 1985).
El citoplasma tambin sufre profundas alteraciones a causa del estrs, vindose
afectados principalmente los distintos componentes del citoesqueleto. As, se produce un
aumento aparenteen el nmero de microfilamentos de actina en repuestaa choque trmico
(Thomas y col., 1982), aunque se han descrito independientemente efectos totalmente
opuestos a consecuencia del mismo tipo de estmulo (Glass y col., 1985). Los filamentos
intermedios sufren una rpida redistribucin intracelular en respuesta a la hipertermia,
pasando de una disposicin fisiolgicaextendida por todo el citoplasma a una distribucin
25
anormal colapsada en tomo al ncleo (Welch y col., 1985; Thomas y col., 1982> . Se ha
sugerido que el mecanismoresponsable del colapsode los filamentos intermedios durante
el choque trmicoes la activacin de la protena quinasa dependiente de cAMP (PKA)
(Escribano y Rozengurt, 1988), puesto que se ha observado en clulas sometidas a estrs
la fosforilacin de 2 residuos en la molcula de vimentina, fosforilacin sta que puede
ser catalizada por la PICA (Lamb y col., 1989). Se desconocen por el momento las
implicaciones funcionales originadas por la alteracin estructural que sufren los
filamentos intermedios durante el choque trmico. Se ha observado la aparicin de
mitocondrias y polisomas asociados a los agregados perinucleares de filamentos
intermedios que se formanduranteel choquetrmico (Thomas y col., 1982).
Otros orgnulos que sufren profundas alteraciones estructurales durante el choque
trmico son el aparato de Golgi y las mitocondrias. El aparato de Golgi experimenta, en
respuesta al tratamiento hipertrmico, una fragmentacin dando lugar a un conjunto de
vesculas membranosas distribuidas por todo el citoplasma celular (Welch y Suhan,
1985). Sin embargo, no se ha demostrado de forma concluyente el que esta profunda
alteracin estructural conlleve disfunciones en la actividad secretora y de glicosilacin
proteicaenla clula estresada. Por otro lado, las mitocondrias de fibroblastos sometidos a
choque trmico aparecen hinchadas, con unas crestas muy prominentes y los espacios
intracrestales muy aumentados (Welch y Suhan, 1985). Este tipo de alteraciones
estructurales son muy semejantes a las producidas por agentes inhibidores del transporte
electrnico y de la fosforilacin oxidativa (Weinbach y Garbus, 1968; Buffa y col.,
1970).
1.1.2.2. Alteraciones bioqumicas.
Numerosos autores han estudiadoel efecto del tratamiento hipertrmico sobre la
composicin de la membrana plasmtica en clulas de eucariotas superiores. Sin
embargo, los resultados de los distintos grupos han sido contradictorios. Por un lado, se
ha sugerido que las clulas previamente hechas termotolerantes presentan un aumento en
el contenido de colesterol en la membrana plasmtica (Cress y col., 1982), mientras que
Anderson y Parker (1982) concluyeron que la termotolerancia no conleva cambios
apreciables en lafluidez y composicin de la membrana.
Sin embargo, laalteracin funcional de ciertos componentes de la membrana en
respuesta a choque trmico parecen ser mucho ms evidentes. As, por ejemplo, se han
demostrado(i) una alteracin de la actividad de laNa~fK~ ATPasa (Yi, 1979; Burdon y
Cutmore, 1982; Anderson y Hahn, 1985) originndose un aumentoen la concentracin
26
intracelular de K+ acompaado de una disminucin en la de Na+, (u) una disminucin en
la capacidad de binding del receptor del factor de crecimiento epidrmico (Magnum y
Fernie, 1981) y del receptor de insulina (Calderwood y Hahn, 1983), (iii) una reduccin
del nmero de antgenos de histocompatibilidad en la superficie celular (Mehdi y col.,
1984) y (iv ) un aumento en el transporte de hexosas al interior celular (Warren y col.,
1986).
Existen numerosos datos que indican que una consecuencia tempranadel choque
trmico es una disminucin rpida del pH intracelular (Weitzel y col., 1985) y un
aumento de los niveles intracelulares de calcio (Stevenson y col., 1986). La sugerencia
inicial de que el cambio en dichos parmetros podra ser responsable del aumentoen la
transcripcin de los genes que codifican paraprotenas de choquetrmico fue rebatidapor
Drummond y col. (1986) al demostrar que cambios en estos parmetros, en ausencia de
choque trmico, no originanactivacin transcripcional. En la actualidad, el significado de
la alteracin en el pH y en la concentracin de calcio intracelulares permanece
desconocido.
Otroefecto caracterstico de lahipertermia es la disminucinen la concentracin
intracelular de ATP (Leenders y col., 1974; Findly y col., 1983), efecto que parece estar
asociado a la alteracin estructural de lamitocondria. No resulta extraopor tanto que el
choque trmico vaya acompaado de una disminucin en la funcionalidad mitocondria]
(Christiansen y Kuama, 1969) y que la clula adquiera vias anaerobias para su
aprovisionamiento energtico. Como respuesta adaptativa paralela a estas alteraciones, se
ha observado que la expresin de dos enzimas glucolticas, enolasa y gliceraldehido-3-
fosfato deshidrogenasa, se ve aumentada durante el choque trmico (lida y Yahara,
1985).
1.1.2.3. Fenocopias.
Las fenocopias son anomalas no heredables del desarrollo inducidas por estrs
ambiental y que cursan con unas manifestaciones muy semejantes a las que aparecen en
ciertos mutantes para genes hometicos implicados en el desarrollo embrionario. Las
fenocopias se manifiestan nicamente cuandoel estrs se produce enetapas concretas del
desarrollo del organismo, y pueden ser inducidas tanto por la hipertermiacomo por la
exposicin a ciertos agentes qumicos (etanol). Aunque este fenmeno fue identificado
por primera vez en Drosophila (Goldschmidt, 1935), tambin se ha observado en
embriones de ave y de mamferos (Pleet y col., 1981).
27
1.2. PROTENAS DE ESTRS.
Las protenas de estrs constituyen una amplia familia de polipptidos presentes
en todos los organismos estudiados hasta la fechay cuyo denominador comn es que su
sntesis aumenta de forma drstica y preferencial durante una situacin de estrs
ambiental. La clasificacin de las protenas de estrs se puede efectuar en base a 2
criterios:
-Segn el agente inductor, hablamos de heat-shock proteins (hsp, protenas inducidas
por choque trmico) o de glucose-regulated proteins (grp, protenas inducidas por
deficienciade glucosa). El restode agentes inductores de larespuesta al estrs promueve
la sntesis de uno, otro o ambos grupos de protenas. De esta forma, en clulas de
mamferos, la exposicin a metales pesados desencadena una respuesta celular muy
semejante a la que aparece durante el choque trmico mientras que la hipoxia, el
tratamiento con jonforos de calcio o con inhibidores de la glicosilacin provoca la
induccin de las grps, de formaanloga a lo que sucede en una situacin de deficiencia
de glucosa.
-Segn similitud de secuencia y peso molecular, se distinguen 4 grandes familias de
protenas deestrs:
- Protenas de estrs de bajo peso molecular.
- Protenas de estrs de 60 kDa.
Las protenas de estrs de 60, 70 y 90 kDa se conocen genricamente como
chaperones moleculares. Este trmino fue propuesto inicialmente por Laskey (1978) para
ilustrar el papel de la nucleoplasmina en el ensamblaje de nucleosomas, y posteriormente
reinterpretado por Ellis y col. (1987) para hacerlo extensible a todas aquellas protenas
que intervienen en el plegamiento y ensamblajede otros polipptidos peroque no forman
parte del complejo funcional que resulta. Las protenas de estrs de 60 kDa se conocen
tambin como chaperoninas. Recientemente se han publicado varias revisiones
exhaustivas sobre el tema (Gething, 1991; Gething y Sambrook, 1992; Rothman, 1989;
Georgopoulos, 1992; Hart y col., 1992 y Kelley y Georgopoulos 1992. En la tabla 1.1
se muestra una relacin sistematizada de los chaperones moleculares identificados hastala
fechaen distintos organismos, as como de las protenas que cooperan constos.
28
R
E
V
I
S
I
O
N
B
I
B
L
I
O
G
R
F
I
C
A
e
e
e
e
O
t
o
O
O
)
C
O
c
E
.
O
.
-
~
~
~
o
.
I
E
~

S
>
~
Z
a
b
o
>
~
3
O
.
8
9
4
c
e
0
<
0
0
)
O
.
b
J
j
.
.
-
.
e
f
l
o
a
~
-
0
~
~
e
~
-
~
r
a
3
E
3
&
&
~
3
~
o
.
c
e
.
~
.
c
o
g
s
~
~
c
C
4
J
0
~
~
t
~
<
~
E
a
o
~
-
<
-
.
~
.
-
.
e
-
.
.
0
e
~
E
C
d
~
~
-
,
~
~
c
t
.
e
-
-
o
-
.
O
-
~
~
C
)
e
~
~
E
.
O o
O
-
.
)
o
e
3
O
8O
U
U U
-
~
-
-
c
o
L
L
L L
T
D
Z
Z
0 0 0 0
>
a
t
t
G
o
o
.
a a
a
e
-
<
-
>
e
r
~
~
-
2
.
0
,
r
n
Q Q
)
u
e
o
-
t
a
~
c
a
<
u
.
a
o o
o
~
-
5
e O
)
~
t
e
>
~
c
-
O
o 0
U
D
1
.
(
-
0
U
D
o
-
O
-
-
0
C
f
l
~
o
-
O
1
-
-
-
.
C
C
.
-
.
t
~
-
e
o
-
5
.
. .
~ ~
-
y
-
-
~
o
~
0
m
b
0
>
O
O
.
o
f
l
a
~
o
r
u
C
C
D
~
E
0
%
,
>
o
( ( (
(
0
(
(
-
0
- -
.
-
~
(
0
~
.
-
~
(
0
( (
(
(
(
-
0
-
~
(
0
f f f
f
a
0
(
-
0
(
0
C
O
<
0
0
0
u
.
.
~
C
O
o
L
t
t
<
t
u
-
.
C
C
o
O
e
-
o
o
*
0
0 O
.
o
O
a
j
e O
2
0
-
<
O
)
e
=
o
t
o e
e C
o -
a
e
o
O
o
-
>
-
~
o
o
o
->
-
z
~
o
e
S
E
o
e
o-->
O
s
o
-
O
Y
a
<
0
0
e
~
.
5
-
D
e
-
o
o
.
2
-
r
~
-
~
E
o
-)
5
e
O
O
o
a
o
E
-
o
e
-
C
C
)
c
E
O
-
g
0
0
o
-
E
O e
)
)
O
G
o
O o
->
E
O
(
<
2
o
0
>
0
O
o
C
O
a
b
e
-
n
8
5
<
0
0
c
E
O o
)
e O
<
0
8
0
0 4
>
e
O
C
o 0
(
0
E
S
-
E
4
>
4
>
C
O
o
a
-
O
o
-
C
O
e
o
)
5
-
O
O
e
C
o
C
O
o
0
O
0
.
0
o
t
o
O
S
)
2
9
C
O
O 9 o
a g O
O
-
o
o
&
E
e
O 0 O O
-
o
O
0 e
-
o 0 e
O O O 0 e
a 0 O O
-
8 0 o O a 0 o u C
D
8 O
-
O
C
O
u E o e
l
O &
O
.
0 O e
)
-
O 0
C
I
o E
1.2.1. Protenas de estrs de baje peso molecular.
Todos los organismos estudiados hasta la fecha contienen una o ms hsps de bajo
peso molecular. Aunque aparentemente constituyen un grupo heterogeneo de
polipptidos, pueden considerarse integrantes de una misma familia en funcin a (O
presentan una discreta similitud de secuencia, (u) poseen una estructura secundara e
hidrofobicidad semejante, (iii) manifiestanuna expresindiferencial en distintos estadios
del desarrollo, (iv) formanpartculas multimricas de gran tamao, algunas de las cuales
contienen RNA y (y) presentan una distribucin subeelular semejante. Se han identificado
protenas de esta familia en una gran variedad de organismos (ver Lindquist y Craig,
1988 y Welch, 1990).
La mayor parte de las protenas de bajo peso molecular de distintas especies
presentan cierta semejanza de secuencia con la a-cristalina (Bloemendal y col., 1972),
una protena localizada en el cristalino en forma de agregados de alto peso molecular.
Dado que las protenas de estrs dc bajo peso molecular sepresentan habitualmente como
oligmeros, se ha sugerido que la semejanza de secuencia entre ambas familias de
protenas puede constituir la base estructural de la capacidad de ambas familias para
formar homoligmeros. Existen pocos datos referentes a la funcin de esta familia de
protenas. Estudios recientes han demostradoque la u-cristalina puedefuncionar como un
chapern molecular (Horwitz, 1992).
1.2.2. Protenas de estrs dc 60 kDa (chaperoninas).
Esta familiacomprende un amplio grupo de polipptidos conocidos gcnricamentc
como chaperoninas (Hemmingsen y col., 1988) y caracterizados por ser estructural y
funcionalmente homlogas a la protena GroEL de E.coli y por estar presentes en todos
los procariotes y en mitocondrias y cloroplastos de clulas eucariotas (MeMullin y
Hallberg, 1987; McMullin y Hallberg. 1988). Las caractersticas comunes de esta familia
de protenas son las siguientes:
- Presentan una alta homologa de secuencia (en tomo al 50% de identidad aminoacdica
entre2 chaperoninas cualesquiera(Gupta, 1989).
- Aunque seexpresan de forma constitutiva, son inducidas en respuesta a choque trmico
(Ellis, 1990), al aumento en el contenido intracelular de protenas en estado no nativo
(Parsel y Sauer, 1989) y a infecciones bacterianas (Buchmeier y Hcffron, 1990).
30
caracterstica esta ltima que las conviene en potentes antgenos en distintos tipos de
infecciones (Young y col., 1988), as como las hace potencialmente capaces dc
desencadenar procesos autoinmunes (Young y col., 1990).
- Todas ellas presentan una estructura homooligomrica, compuesta por 2 anillos de 7
subunidades de aproxiamdamente 60 kDacadauna (cpn60) (Martel y col., 1990; Pushkin
y col., 1982). La chaperonina de cloroplastos (Rubisco Subunit Binding Protein)
constituye una excepcin yaque contiene cantidades equimolares de 2 subunidades (a y
j3), altamenterelacionadas (Hemmingseny Ellis, 1986). Las chaperoninas de procariotes
y mitocondrias interaccionan funcionalmente con otra protena de 10 kDa(cpn 10) que se
purifica en forma de homoheptmero con simetra de orden 7. Las subunidades cpnl0
presentan ciertahomologa de secuenciacon una regin central (aminocidos 100-250) de
las subunidades cpn0 (Martel y col., 1990).
- Todas las chaperoninas estudiadas ligan ATPcon gran afinidad pero presentan una dbil
actividad ATPasa, que enalgunos casos puede verse modulada en presencia del sustrato
polipeptdico y del componente cpnl0.
- Todas ellas parecen estar implicadas en laestabilizacinconformacional de intermedios
de plegamiento que aparecenenla clula, tanto de forma fisiolgica (transporte a travs de
membranas, plegamiento, ensamblaje) como de forma patolgica (heat-shock,
glicosilacin deficiente). De hecho, se han establecido sistemas experimentales de
renaturalizacin proteica in v itro en los que las distintas chaperoninas funcionan de forma
semejante.
1.2.2.1 Clasificacin de las protenas de estrs de 60 < Da
Chaperoninas bacterianas
.
Fueron identificadas inicialmente en la dcada de los 70 en base a que mutaciones
en sus genes codificantes eran capaces de bloquear el crecimiento y propagacin de los
fagos X (Georgopoulos y col., 1973), T4 (Georgopoulos y col., 1972). T5 (Zweig y
Cummings, 1973) y 186 (Hocking, 1982).
El complejo nativo y funcional segn se aisla del citosol bacteriano tiene un
coeficiente de sedimentacin de 25S y consta de 14 subunidades organizadas en formade
2 anillos de 7 subunidades cadauno en torno a un eje de simetria de orden 7 (Hendrix,
1979). GroELcoepera funcionalmente tanto ir v i.n (Tilly y Georgopoulos. 1.982) como
31
ti v itro (Chandrasekar, 1986) con la protena GroES (cpn 10), una protena de 10 kDa
que aparece en forma nativa como un anillo homoheptamrico (Chandrasekar, 1986), y
que se encuentra codificadajunto con el gen de GroELen el opern GroE, de donde sc
transcriben conjuntamente como un mRNA bicistrnico (Hemmingsen y col., 1988). La
estequiometrade GroEL y GroES en la holochaperonina funcional es de 1:1 (Langer y
col., 1992b). GroES interaccionade fonna asimtrica con uno de los poos del complejo
formado por GroEL, originando un acusado cambio conformacional en el poo opuesto
(Langer et aL, 1992b). Una orientacin semejante de GroEL con respecto a GroES se ha
observado en la holochaperonina de Thermus termophilus (Ishii et al., 1992).
GroEL es una protena abundante que representa el 2 %del contenido proteico
celular total en condiciones basales, mientras que tras un choque trmico pasa a constituir
el 16% (Neidhart y col., 1981).
Aunque las protenas GroE fueron identificadas inicialmente como necesarias para
la morfognesis de distintos fagos, estudios posteriores demostaron que estas protenas
resultan esenciales para la viabilidad celular (Wadae Itikawa, 1984; Fayet y col., 1989).
Las funciones descritas para las protenas GroE son las siguientes:
1.- Son necesarias para la morfognesis de distintos bacteriofagos. Ambas protenas se
requieren para el ensamblaje de la cabeza del fago X (Friedman y col., 1984), la cola
del fago T5 (Tilly y Georgopoulos, 1982) y la cabeza del fagoT4 (Georgopoulos y
col., 1972).
2.- Replicacin del DNA: Se ha demostradoque la sobreexpresin de protenas GroE es
capaz de suprimir fenotipos termosensibles asociados a mutaciones en protenas
implicadas en la interaccin con DNA (Fayet y col., 1986; Jenkins y col., 1986;
Ruben y col., 1988), lo que sugiere la existencia de interacciones funcionales entre
estas protenas y GroES, aunque no se han encontrado evidencias concluyentes al
respecto.
3.- Translocacin de protenas: Se han podido identificar complejos binarios estables entre
GroEL y distintos precursores de secrecin (pre ji-lactamasa, cloranfenicol acetil-
transferasa) en extractos celulares de E.coli (Bochkareva y col., 1988). Estos
complejos tambin han podido ser reconstituidos ti v itro a partir de UroEL y de los
precursores proOmpA y prePhoE purificados (Lecker y col., 1989). Dichas
asociaciones pueden ser revertidas en presencia de ATP (Bochkareva y col.. 1988).
32
REVISIONBIBLIOGRHCA
Adems, la sobrecxpresin de GroEL en E.coli facilita la exportacin de protenas de
fusin con g-galactosidasa(Phillips y Silhavy, 1990).
4.- Plegamiento y ensamblaje de protenas oligomricas. Aunque no existen evidencias
directas de que GroEL pueda promover el plegamiento y ensamblaje de protenas
endgenas de E.coli ti v iv o, se ha demostrado que la reconstitucin de Rubisco
dimrico y hexadecamrico a partir de sus subunidades expresadas en E.coli es
mucho ms eficiente en aquellas cepas en las existe simultanamente sobreexpresin
de GroELy GroES (Goloubinoff y col., 1989b). Por otro lado, la sobreexpresin de
estas proteinas permite corregir multitud de fenotipos termosensibles en
S.typhimurium y E.coli debidos a mutaciones en genes codificantes tanto para
enzimas de distintas rutas biosintticas como para protenas estructurales (Van Dyk y
col., 1988). Aunque existen varias hiptesis para explicar estos efectos supresores,
parece razonablesuponer que la protena GroE est involucrada en el ensamblaje de
polipptidos, de forma que protenas mutantes que no pueden adquirir una
conformacin funcional, son capaces de plegarse correctamente en presencia de un
exceso de GroEL.
Chaneroninasde cloronlastos (Protena de unin a lasubunidad de Rubisco)
.
Fue identificada inicialmente por Barraclough y Ellis (1980) en un estudio sobrela
sntesis y ensamblajede laprotena RuBisCo, protena presente en todos los organismos
auttrofos encargada de catalizar la fijacinfotosinttica del C02 (Ellis, 1979). LaRBSP
(Rubisco Subunit Binding Protein) apareca asociada no covalentemente a las
subunidades mayores de Rubisco antes del ensamblaje de stas para formar el oligmero
funcional.
A diferenciade lo que ocurre en otras chaperoninas que contienen un nico tipo de
subunidad de 60 kDa, la RSBP contiene de dos clases de subunidades de 60 kDa, la a
(61 kDa) y la [3(60 kDa) (Hemminsgsen y Ellis, 1986). de secuencia altamente
conservada (identidad aminoacdica del 50%), por lo que probablemente derivan de un
nico gen ancestral (Martel y col., 1990). Tanto la subunidad a como la j3 estn
codificadas en el genoma nuclear (Hemmingseny col., 1986). La estructura cuaternaria
de la RBSP, a semejanza de lo que ocurre en otras chaperoninas. esdc tetradecmero con
una disposicin en 2 anillos de 7 monmeros, en el que la disposicin de las subunidades
a y [3en los anillos es desconocida. Slamente se han identificado homlogos de la
protena GroES en cloroplastos de cebada (Hartman y col., 1992a).
33
La RBSP muestra una ligera induccin en respuesta al choquetrmico. La nica
evidencia a favor de la implicacin de RBSP en la biognesis del cloroplasto,
independientemente del ensamblaje de rubisco, se reduce a la identificacin de varios
polipptidos asociados a esta protena tras su importacinal cloroplasto (Lubben y col.,
1989). Sin embargo, RSBP puedereemplazar a GroEL/ES en ensayos de reconstitucin
ti v itro de Rubisco de R.rubrum (Goloubinoff y col., 1989a), as como las protenas
GroEpueden promover laformacin de oligmeros activos de rubisco cuandolos genes
de GroEL y GroES y de las subunidades grandes y pequeas de Rubisco de A.nidulans
son coexpresadas en E.coli (Goloubinoff y col., 1989b). Estos hallazgos evidencian la
existencia de una homologa funcional importante entre ambas chaperoninas, hecho no
sorprendentesi tenemos encuenta que GroEL de E.coli y RBSP de T.aestivumpresentan
una identidad aniinoacdicadel 46%.
Chaneroninas mitocondriales
.
El anlogo mitocondrial de GroEL (hsp60) fue identificado inicialmente por
McMulliny Hallberg (1987) en lamitocondriade Tetrahymena rermophia. Estos mismos
autores demostraron posteriormente la presencia de anlogos inmunolgicamente
relacionados conestaprotenaen lamitocondriade otras especies (McMulliny Hallberg,
1988). El clonaje y secuenciacin del gen de hsp6o de cerev isiae (Reading y col.,
1989; Johnson y col., 1989) mostr la existencia de un 54% y un 45% de identidad
aminoacdica con GroEL y la subunidad a de RBSP (Hemmingsen y col., 1988).
respectivamente. La posterior disponibilidad de clones de esta protena de otros
organismos (Jindal y col., 1989; Picketts y col., 1989; Peralta y col., 1990) ha
confirmado la existencia de un grado de conservacin semejante (identidad prxima al
60% entre las hsp0 de 2 especies cualesquiera). Hsp6O se expresaconstitutivamente
aunque se inducede 2 a 3 veces en respuesta achoque trmico (Cheng et al., 1989).
La hsp0 nativa se encuentra en la matriz mitocondrial en forma de
homodecatetrmero constituido por 2 anillos con simetria radial de orden 7 y con un
coeficiente de sedimentacin de 20S (McMullin y Hallberg, 1988; Hutehinson y col.,
1989). La chaperonina mitocondrial de clulas de mamferos aparece en forma de un
nico anilloheptamrico (Viitaneny col., 1992). El anlogo mitocondrial de GroES se ha
identificado en clulas de hgado bovino y de rata (Lubben y col., 1990), de hepatoma
(Hartmann y col. 1992b) y en semillas de cebada (Hartmann y col., 1992a) como una
protena de 9, 10 y 12 kDa, respectivamente. En clulas de mamferos, cpnl0 se
encuentra en formanativa como un oligmero de 65 kDa(Hartmann y col.. 1992b) o 45
34
kDa (Lubben, 1990), lo que sugiere una disposicin homoheptamrica semejante a la
descrita para GroES.
Hsp6O es una protena esencial para laviabilidad celular en levaduras, ya que la
inactivacin de su gen resulta letal a cualquier temperatura (Reading y Hallberg, 1989).
Las primeras evidencias sobre el papel funcional de hsp60 en la mitocondria fueron
obtenidas mediante el estudio de una cepa mutante (mif4) que expresa una forma
termosensible de hsp60 (Cheng y col., 1989). Estas clulas son incapaces, a la
temperatura restrictiva, de ensamblar los complejos macromoleculares mitocondriales, a
pesar de que las subunidades aisladas son correctamentetranslocadas y procesadas. Esta
alteracin se ha demostrado tanto para los polipptidos dirigidos hacia la matriz
mitocondrial (ornitina transcarbamilasa y FL-ATPasa (Cheng y col., 1989); y la propia
hsp60 (Cheng y col., 1990> ) como para aquellos dirigidos al espacio intermembrana
(protena Fe-S de Rieske y citocromo b2) (Cheng y col., 1989), que son incapaces de
alcanzar su destino submitocondrial final.
Por otro lado, se ha demostrado laimplicacin directa de hsp60 en el plegamiento
de protenas enla matriz mitocondrial (Ostermann y col., 1989). Se ha encontradoque en
mitocondrias carentes de ATP en la matriz, tratadas con NEM o incubadas a baja
temperatura, existe una asociacinfsicaentre hsp6O y distintos precursores desplegados.
La adicinde ATPrevierte esta asociacin a lavez que permite la liberacin del precursor
en una forma parcialmenteplegada (Ostermann y col., 1989). Por otro lado, la asociacin
entre hsp60 y precursores mitocondriales no parece ser exclusiva de aquellos polipptidos
codificados por el genoma nuclear, puesto que tambin se ha observado que ciertos
polipptidos codificados por el genomamitocondrial cosedimentany coinmunoprecipitan
con hsp0 (Prasad y col., 1990; Hallberg, 1990). En eucariotas superiores, las nicas
evidencias con respectoal papel funcional de cpn60 lo constituyenla demostracin de la
capacidad de los oligmeros de hsp60 de promover el plegamiento de Rubisco ti v itro
(Viitanen y col., 1992b) y la interaccin de hsp6O con el producto del oncogenras (Ikawa
y Wember, 1992) y la identificacin de interacciones transitorias entre el anlogo de
hsp60 de clulas de mamferos (hsp58) (Mizzen y col., 1989) y precursores
mitocondriales recin sintetizados (Mizzeny col., 1991).
La expresin del gen de hsp0 de levadura est regulada en respuesta a una gran
variedad de condiciones fsicas y metablicas. As, hsp60 se induce 4-5 veces cuando las
clulas son transferidas a un medio conglicerol o etanol como nicafuente de carbono. El
homlogo de hsp60 en la mitocondria de maiz muestra una expresin 3 veces superior en
embriones que en telidos adultos (Prasad y Hallberg, 1989). En cucariotas superiores se
35
REVISIONBIBliOGRFICA
han identificado 6 pseudogenes de hsp6o y un nico gen carente de intrones (Venner y
col., 1990).
Chaperoninas citoslicas
.
La identificacin en el citosol de clulas eucariotas de molculas semejantes a
cpn0 sugiere laexistencia en este compartimento de una maquinariaproteica responsable
del plegamiento y ensamblaje de polipptidos semejante a la presente en bacterias,
cloroplastos y mitocondrias.
La primera evidencia en este sentido fue proporcionada por Gupta (1990) al
identificar ciertas homologas de secuencia entre distintas cpn60s y la protena TCPl
(Tailless Complex Polypeptide 1) de distintos organismos. Esta protena se ha visto
implicada en defectos del desarrollo embrionario y en la maduracin estructural y
funcional del esperma (Silver y col., 1979). La confirmacin definitiva al respecto fue
proporcionada por Trent y col. (1991) al identificar la protena de heat-shock ms
abundante en el citosol de la arqueobacteria Sulfolobus shibatae (TF55) como un
chaperon molecular con actividad ATPasa, capaz de interaccionar con polipptidos
desnaturalizados y que presenta una gran similitud de secuencia con TCP- 1. TF55 se
encuentraen forma de oligmeros resultantes de laasociacin de 2 anillos toroidales de 8
9 monmeros cada uno.
En clulas eucariotas, se ha demostrado que TCP- 1 se encuentra en el citosol
comoun complejo heteromrico de 800-950 kDa (Lewis y col., 1992) y que interacciona
con la molcula de 3-tubulina promoviendo la adquisicin por parte de sta de una
conformacin resistente a proteasas y competente para su ensamblaje (Yaffe y col.,
1992), lo que parece explicar el importantepapel de TCP-l enla biognesis de la tubulina
ti v iv o (Ursic y Culbertson. 1991). Por otro lado, se ha purificado de reticulocitos de
conejo un complejo de 800 kDacapaz de catalizar el plegamiento ATP-dependiente de la
molcula de j3actina (Gao y col., 1992) y constituido por 7 polipptidos de 55-68 kDa.
uno de los cuales es inmunoreactivo frente a un anticuerpo contraTCP- 1. Este complejo
parece ser el mismo que el identificado por Yaffe y col. (1992). En testculo bovino,
TCP-1 aparece como un anillo hetero-oligomrico de 970 kDa (TRiC) que es capaz de
promover el plegamiento ATP-dependiente de luciferasay tubulina en ausencia de ningun
otro factor proteico (Frydman y col., 1992).
36
REVISIONBIBL iOGRFICA
1.2.2.2. Mecanismo de accin de las chaperoninas.
La mayor parte de los conocimientos actuales disponibles acercadel mecanismo
de accin de las chaperoninas a nivel molecular se ha obtenido mediante el desarrollo de
sistemas de plegamiento y/o ensamblaje ti v iti-o con GroEL/S purificadas y polipptidos
sustrato artificialmente desnaturalizados, en los que las transiciones estructurales del
polipptido sustrato son monitorizadas mediante determinacin de la variacin en la
fluorescenciaintrnseca, o indirectaasociada a una sondafluorescente, de lasensibilidad a
proteasas o de laactividad enzimtica.
El nmero de protenas para las que se ha descrito recuperacin con xito de su
estructura nativa y actividad enzimticatras su desnaturalizacin artificial e incubacin con
GroEL y GroES ha crecido enormemente en los ltimos aos. Hasta la fecha, se ha
demostrado renaturalizacinmediadapor GroE en: Rubisco dimrico de origen procariota
(Goloubinoff y col., 1989a; Viitanen y col., 1990), citrato sintasa (Buchner y col., 1991;
Zhi y col., 1992), rodanasa (Martin y col.. 1991; Mendoza y col.. 1991), dihidrofolato
reductasa (Martin y col., 1991; Viitanen y col., 1991), triptofanasa (Mizobata y col.,
1992), glutamina sintetasa (Fisher y col.. 1992), f3-lactamasa (Laminet y col., 1990),
distintos enzimas termoflicos (Taguchi y col., 1991), 6-hidroxi-D-nicotina oxidasa
(Brandsch et al., 1992) y el propio GroEL (Lissin et al., 1990). Por otro lado, se ha
comprobado que GroEL formacomplejos estables con aproximadamente lamitad de las
proteinas solubes en estado desnaturalizado de E.col (Viitanen y col., 1992a). Adems,
se ha comprobado que el rendimiento en la produccin de polipptidos heterlogos
recombinantes activos en cepas de E.coli genticamente manipuladas es muy superior
cuando en estas mismas cepas existe co-sobreexpresin simultanea de distintos
chaperones (Wynny col., 1992; Lee y Olins, 1992, Goloubinoff y col., 1989b).
Todos estos estudios indican que la capacidad de GroEL/S de promover el
plegamiento y ensamblaje de ditintos polipptidos artificialmente desplegados de muy
distinto origen. Sin embargo, no existen evidencias concluyentes que demuestren la
capacidad de GroELde replegar agregados proteicos. La comprensin de los mecanismos
moleculares implicados en el plegamiento de polipptidos mediado por chaperoninas
requiere (i) definir la conformacin en la que el sustrato polipptidico se encuentra
asociado a GroEL y (u) caracterizar los distintos intermedios de reaccin que aparecen
durante el proceso de plegamiento.
El anlisis de Jafluorescencia intrnseca de distintos polipptidos unidos a GroEL
de Ibrmaestable muestra que los sustratos presentan una conformacin intermedia entre cl
3,7
estado nativo y la conformacin absolutamente desplegada. Estos resultados llevaron a
los autores a sugerir que los polipptidos unidos a GroEL presentaban una conformacin
semejante a la denominada molten globule. Este tipo de estado conformacional fue
identificado inicialmente como un intermedio cintico tanto del proceso de
desnaturalizacin con agentes suaves como durante la renaturalizacin de distintos
polipptidos (ver revisiones de Creighton, 1990 y Van der Goot y col., 1992). El estado
molten globule se caracteriza por (i) presentar un contenido en elementos de estructura
secundaria semejantes al de la conformacin nativa, (u) contener algunos residuos
inaccesibles al solvente, (iii) presentar una elevada flexibilidad en las cadenas laterales,
(iv) poseer una compactacin prximaa la del estado nativo y (y) no mostrar transicin
trmica tras el calentamiento.
Lanaturaleza de los elementos estructurales del sustrato que son reconocidos por
GroELes desconocida. Se ha demostradoque GroEL puede interaccionar con el pptido
c de laglicoproteina del VSV (virus de la estomatitis vesicular) (Landry y col., 1992) y
con un fragmento proteico correspondiente a una a-hlicede la regin amino terminal de
la rodanasa nativa (Landry y Gierasch, 1991b), y que en ambos casos, el pptido
adquiere una conformacin de a-hlice al unirse a GroEL, segn se demuestra mediante
espectroscopia de resonancia magntica nuclear bidimensional (Landry y col., 1992;
Landry y Gierash, 1991b). Adems, un examen detallado de las estructuras terciarias de
protenas cuyo plegamiento/ensamblaje es catalizadopor GroEL muestra que toda ellas
contienen a-hlices expuestas al solvente (Landry y Gierasch, 1991a). Sin embargo, se
ha demostradounin a y renaturalizacin catalizada por GroEL de un fragmento Fab de
una inmunoglobulina, que carece por completo de estructura secundaria de a-hlice
(Schmidt y Buchner, 1992). El hecho de que GroEL parezca reconocer regiones con
estructura secundaria definida en sus sustratos polipptidicos constituye un hecho
diferencial con respecto a hsp70, que aparentemente interacciona con regiones
polipptidicas deplegadas (Landry y col., 1992).
Aunque la estructura cuaternaria del oligmero de hsp6O presente una simetria
radial de orden 7, no se ha demostrado interaccin simultnea de ms de 1 2
polipptidos por cada molcula de GroEL (Lecker y col., 1989; Laminet y col., 1990;
Martin y col., 1991). Esta estequiometra parece indicar que los protmeros de GroEL
dan lugar a laformacin de un nico sitio activolocalizadoen el centro de lamolculao
bienque an existiendo 14 sitios activos, lainteraccin simultneade un nmero elevado
de sustratos se vea limitada por impedimento estrico (Hendrix, 1979). En este ltimo
caso, un polipptido parcialmente plegado podra interaccionar con el oligmero a travs
de varias regiones expuestas. GroEL es capaz de unir hasta 14 molculas de ATP
38
REVISION BIBLIOGRAFICA
(Bockhareva y col., 1992), cuya hidrlisis se produce siguiendo una cintica de
cooperativdad positiva (Bockhareva y col., 1992).
La transicin estructural desde un intermedio en el estado de molten globule
asociado a GroEL hasta una molcula funcional requiere de la intervencin de GroES y
ATP. Enausencia de GroES, la hidrlisis de ATPpor GroEL conduce a laliberacin del
sustrato que puede sufrir una renaturalizacin espontnea (p.ej. dihidrofolato
reductasa)(Martin y col., 1991) o bien una agregacin irreversible (p.ej. rodanasa)(Martin
y col., 1991). Sin embargo, cuando GroES seencuentra presente, la actividad AlPasa de
GroEL aparece fuertemente modulada, de forma que se produce una liberacin gradual
del sustrato (Martin y col., 1991), que conduce finalmente a la renaturalizacin del
mismo. Se han descrito ensayos de plegamiento in v iti-o en los que GroEL es
funcionalmente reemplazable por hsp60 de mitocondrias de levadura (Goloubinoff y
col., 1989a) o de mamferos (Viitanen y col.. 1992a) o por RBSP (Goloubinoff y col.,
1989a). La protena GroEL sefosforila reversibleniente duranteel choque trmico lo que
origina un cambio en sus propiedades que resulta en que la liberacin ATP-dependiente
del sustratoocurre en ausencia de GroES (Sherman y Goldberg, 1992)
1.2.3. Protenas de estrs de 70 kDa.
Esta familia comprende un amplio grupo de protenas localizadas tanto en
organismos procariotas como en distintos compartimentos de clulas eucariotas. Los
estudios iniciales sobre estas protenas proporcionaron las primeras evidencias sobre el
posible papel de las protenas de estrs en larecuperacin de las alteraciones morfolgicas
inducidas en laclula porel tratamiento de estrs.
Las caractersticas generales de esta familiade protenas sepueden resumir en:
1.-Seexpresan de forma constitutiva.
2.-Alta similitud de secuencia entre los distintos miembros de la familia (50% de
identidad aminoacidica), siendo la semejanza superior en los 2/3 N-terminales que en
el resto de la protena.
3.-Todas son capaces de unir y/o hidrolizar ATP, estando esta actividad regulada por
otros factores proteicos.
39
4.-Aunque presentan una induccin diferencial en respuesta a distintos tipos de estrs,
todas ellas son inducidas en ltimainstanciacomo resultado del acmulo intracelular
de protenas desnaturalizadas.
5.-Requieren de otras protenas de estrs para desempear su funcin.
1.2.3.1 Clasificacin de las protenas de estrs de 70 < Da
Protenas de estres de 70 kDa en orocariotes <DnaK)
.
Fue identificada inicialmente como el producto de un gen necesario para la
replicacin del fago X(Friedman y col., 1984), aunque su funcin resultaesencial parala
viabilidad celular (Georgopoulos, 1989). Las mutaciones en el gen que codifica para
DnaK se manifiestan de forma pleiotrpica, dando lugar a cepas termosensibles que
presentan alteraciones severas en la sntesis de DNA y RNA, defectos en las rutas
proteolticas y sobreexpresin de otras protenas de estrs incluso a temperaturas no
restrictivas.
Se han descrito las siguientes funciones paraDnaK:
- Mantener precursores proteicos en una conformacin competente para la
translocacin e impedir su agregacin. Se ha demostrado que DnaK es capaz de unirse a
protenas eucariotas cuando stas se sobreexpesan en E.coli (Clarke y col., 1988).
Adems, la sobreexpresin de DnaK permite detectar asociaciones transitorias entreeste
polipptido y protenas de fusin con laeZ(Philips y Silhavy, 1990), facilitando la
exportacin de estos productos. En general, la funcin de mantener los precursores en
una conformacin competente para la translocacin a travs de membranas parece ser
desempeada fundamentalmente por otro chaperon, SecB, de formacolateral por trigger
factor y GroEL (Lecker y col., 1989), y slo excepcionalmente por DnaK (Philips y
Silhavy, 1990).
- Inicio de la replicacin del DNA del bacteriofago X durante el ciclo ltico de
infeccin. En este caso. DnaK coopera con otras 2 protenas de estrs de E.coli, DnaJ y
GrpE, en la liberacin de la protena P del fago X del complejo preprimosomal inactivo
paraas facilitar la accin desenrrolladora de DnaB (Georgopoulos, 1990). DnaK tambin
cooperacon DnaJ paraactivar laprotena iniciadoraRepA y permitir su unin al origen de
replicacin del plsmido Pl (Wickner y col., 1991).
40
- Renaturalizacin de protenas inactivadas por choque trmico. DnaKes capaz de
reactivar de forma ATP-dependiente la RNA polimerasa de E.col desnaturalizada
previamente por tratamiento hipertrmico (Skowyra y col., 1990). Se ha comprobado
tambin que la renaturalizacin ti v iv o de la protena represora X ci857 requiere de la
presencia de DnaK, DnaJ y GrpE funcionales (Gaitinaris y col., 1990).
- Autoregulacin de larespuesta a choque trmico. DnaK ha sido calificada como
el termmetro celular (Craig y Boss, 1991) dada su capacidad de regular la
disponibildad de 032, la subunidad que confiere a la RNA polimerasa la especificidad
para la transcripcin de los genes que constituyen el regulon heat-shock, en funcin del
contenido intracelular en protena desnaturalizada. En condiciones basales, un alto
porcentaje del total celular de 032 se encuentra asociado a DnaK (Liberek y col., 1992),
estando por tanto bloqueada la transcripcin a partir de promotores dependientesde032
(Straus y col., 1990).Tras el choque trmico, DnaKes movilizada y pasa a unirse a los
sustratos por los que presenta mayor actividad (superficies interactivas en protenas
desnaturalizadas), liberndose entonces a32 con la consiguiente activacin de la
transcripcin de genes heat-shock (Straus y col., 1990). Estudios recientes han
demostrado la existenciade complejos biendiferenciados entre032 conDnak y GrpE y de
~32 con DnaJ, lo que sugiere que la activa transcripcin mediada por q32 puede ser
regulada diferencialmente por Dna.J y DnaKIGrpE(Gamer et al., 1992).
DnaK presenta una baja actividad ATPasa (1 molcula hidrolizada por cada 5
minutos) pero que puede ser estimuladahasta 50 veces por DnaJ (incrementa lahidrlisis
del nucctido) y por GrpE (acelerael recambio de los nucletidos unidos) (Gething y
Sambrook, 1992; Ang y col., 1991). Esta regulacin de la actividad ATPasa parece ser
necesaria para explicar la intervencin de DnaJ y OrpE en la liberacin de sustratos
unidos a DnaK y facilitar as el reciclajede DnaK hacia nuevos sustratos.
DnaKes capaz de autofosforilarse ti v tro tras incubacin con ATP (Zylicz y col.,
1983). La actividad ATPasa y la capacidad de autofosforilacinde DnaK son estimuladas
por iones Ca
2~ (Cegielska y Georgopoulos, 1989).
Proteinas de estrs de 70 kDacitoslicas
.
Este subgrupo comprende a los productos de los 4 genes Ssa (stress seventy)
(Ssal, Ssa2, Ssa3 y Ssa4) y los 2 genes Ssb (Ssbl y Ssb2) en levaduras y la forma
inducible (hsp72) y constitutiva (hsp73=hsc70) de la hsp70 encucariotas superiores.
41
REVISION BIBLIOGRFICA
Las funciones descritas paraestegrupo de protenas son:
- Translocacin de protenas a travs de membranas. En levaduras, la importacin
de protenas a la mitocondria y al retculo endoplsmico tanto ti v iti-o como ti v iv o
requiere de la presencia de hsp70s citoslicas (Deshaies y col., 1988; Chirico y col.,
1988; Murakami y col., 1988), as como de otros cofactores. Un papel semejante se ha
propuesto para la hsp70 de clulas eucariotas superiores (Zimmerman y col., 1988).
Adems, las protenas de estrs de 70 kDa citoslicas se han visto implicadas en el
transporte de protenas al ncleo (Imamoto y col., 1992; Shi y Thomas, 1992) y al
cloropasto (Waegeman y col., 1990). Dado que este requerimiento (al menos en el caso
de precursores mitocondriales) puede ser obviado cuando los precursores son
previamente desnaturalizados con urea(Chaco y col., 1988; Murakami y col., 1988), las
hsp70 parecen actuar promoviendo un relajamiento ATP-dependiente en la estructura
terciaria del precursor o disolviendo agregados de precursores no translocados. ti v iv o,
se ha observado la existencia de interacciones entre hsp7O y polipptidos citoslicos
recin sintetizados. Estainteraccin puede serrevenida enclulas normales tras adicin
de ATP, mientras que en clulas sometidas a distintos tipos de estrs, las interacciones
sonirreversibles (Beckmanny col., 1990).
- Recuperacin de las alteraciones producidas en la morfologa nucleolar
provocadas por choque trmico. Los estudios iniciales demostraron que el tratamiento
hipertrmico en distintos sistemas experimentales provocaban una translocacin de la
hsp70 desde el citosol hacia el ncleo, estando all asociada al nucleolo (Arrigo y col.,
1980; Velzquezy col., 1980; Velzquez y Lindquist, 1984), uno de los orgnulos cuya
morfologa se ve ms alterada durante el choque trmico (ver 1.1.2.1). La evidencia
concluyente sobreel papel protector de la hsp70 en el nucleolo fue proprocionada por
Pelhani (1984) al comprobar que la recuperacin de la morfologa nucleolar era mucho
ms rpida en clulas que expresaban altos niveles de hsp70 que en las controles.
- Despolimerizacin de las cubiertas de clatrina. La protena responsable del
desensamblaje de las cubiertas de clatrina mediantedesplazamiento de los triskeliones fue
identificada por Rothman y Schmid (1986) como una ATPasa que posteriormente
demostr ser idntica a la hsp70 citoslica de expresin constitutiva (hsc70 o hsp73)
(Ungewickel, 1985; Chappel y col., 1986). El mecanismo que permite la eliminacin
selectiva de los monmeros de clatuina en las vesculas endocticas implica cambios en las
concentraciones de Ca
2+ y K+ en las proximidades de la vescula, lo que provoca un
cambio conformacional en la cadena ligera de clatrina que expone un sitio de unin a
hsc70 (DeLuca-Flaherty, 1990).
42
- Degradacin lisosomal de protenas intracelulares. Prp73, una protena
probalemente idntica a hsp73, es capaz de interaccionar con ciertas regiones peptdicas
cuya funcin es lade dirigir al polipptido que las contiene hacia la degradacinlisosomal
cuando se retira el suero del medio de cultivo (Chiang y col., 1989). La reconstitucin ti
v iti-o del sistema de degradacin muestra que prp73 ejerce su funcin de forma ATP-
dependiente (Chiang y col.. 1989).
- Los productos de los genes Ssb 1 y Ssb2 interaccionan con ribosomas activos,
asociacin que puede ser revertida por puromicna. por lo que se ha sugerido la
implicacinde Ssbl/2p en el paso de polipptido naciente atravs del ribosoma (Nelson y
col., 1992).
Lareciente identificacin de homlogos de la protena DnaJ en el citosol de clulas
eucariotas (YDJl, 5151) (Caplan y Douglas, 1991; Atencio y Yaffe, 1992; Luke y col,
1991) sugiere la existencia de interaccionas funcionales entre stos y hsp70. De hecho, la
afinidad de Ssalp por un sustrato artificial est fuertemente modulado por YDJlp (Cyr y
col., 1992) y la importacinde protenas a la mitocondriaaparece fuertmente alterada en
mutantes termosensibles de YDJl (Atencioy Yaffe, 1992).
Proteinas de estrs de 70 kDaenel retculo endonlsmico
.
El retculo endoplsmico de clulas eucariotas contieneen su lumen una protena
de 78 kDa que fue descrita inicialmente como protena de unin a la cadena pesada de la
inmunoglobulina (BiP) (Haas y Wabl, 1983; Morrison y Scharf, 1975) y como glucose
regulated protein (grp78) Pouyssegur y col., 1977). En levaduras, esta protena resulta
de la expresin del gen Kar2, un gen implicado en la fusin nuclear tras la conjugacinde
2 clulas (Rose y col., 1989).
Las funciones descritas hasta la fecha para BiP son las siguientes:
- BlP est implicada en la retencin de protenas en e] retcu]o endoplsmico.
Todos los polipptidos que acceden a lavia exoctica deben adquirir suestructura nativa
en el retculo endoplsmico para poder ser eficientemente secretados (Rose y Doms,
1988). Se ha demostrado que BiP interaccionaen el lumen del retculo con polipptidos
que presentan una estructura no nativa, tanto en aquellos casos cuyo plegamiento se ve
impedido por una glicosilacin aberrante (Dorner y col., 1987; Hurtley y col., 1989;
Kassenbrock y col., 1988; Accili y col., 1992), como en aquellas protenas oligomricas
43
cuyos polipptidos integrantes se encuentranan en estado monomrico, como ocurreen
el caso de la cadena pesada de IgG (Bole y col., 1986; Haas y Wabl. 1983) o con la
glicoproteina del virus de la estomatitis vesicular (Hurtley y Helenius, 1989). Sin
embargo, mientras que RiP interacciona con los monmeros no ensamblados de protenas
oligomricas de forma transitoria, los polipptidos con glicosilacin alterada se mantiene
unidos a BiP de forma estable, por lo que probablemente nunca accedern a la via
exocitica, ya que sern degradados directamenteen el retculoendoplsmico.
- BlP parece intervenir de forma directa o indirecta en la translocacin de
precursores a travs de lamembranadel retculoendoplsmico. Evidencias en estesentido
provienen de la identificacinde precursores de la viasecretora en el citosol en mutantes
de levadura para el gen Kar2 (Vogel y col., 1990; Nguyeny col., 1991). Por otro lado, el
producto del gen 5EC63, una protena transmembrana del retculo, requerida para la
translocacin de precursores de la via secretora (Rothblatt y col., 1989), contiene un
dominio iunraluminal con homologa de secuencia con DnaJ, por lo que es posible que
existauna interaccin entre BiP y Sec63p de forma semejante a lo que ocurre en E.coli
entre DnaKy DnaJ para distintos procesos (ver 1.2.3.1).
Protenas de estrs de 70 kDaen la mitocondria
.
Se han identificado protenas de estrs de 70 kflaen la mitocondria de distintos
organismos (Leustek y col., 1989; Engman y col., 1989; Craig y col, 1989; Mizzen y
col., 1989). En S.cerev isiae, esta protena proviene de laexpresin del gen SSCI (Craig
1989), gen que resultaesencial paralaviabilidad celular (Craig y col., 1987). En clulas
de mamferos, se ha identificado una protena mitocondrial de 75 kDa que se induce en
respuesta a deficiencia de glucosa (grp75) (Mizzen y col., 1989). La protena Ssclp de
levadura presenta una alta similitud de secuenciacon DnaK, lo que apoyala hiptesis de
un origen endosimbionte de la mitocondria. Se ha identificado un anlogo de DnaJ en la
mitocondria de levadura (SCJI), pero su funcin permanece desconocida (Blumberg y
Silver, 1991).
La hsp7O mitocondrial es necesaria parala translocacin de precursores a travs
de lamembrana interna mitocondrial (Kang y col., 1990), como parecen indicar (1) las
interacciones transitorias observadas esntre hsp70 y distintos precursores mitocondriales
en mutantes del gen SSCl (Kangy col., 1990; Ostermann y col, 1990) o enmitocondrias
aisladas y deenergizadas (Scherer y col., 1990) y (u) la deteccin mediantecross-linking
de complejos conteniendo hsp70, 1SP42 y precursores parcialmente translocados
(Scherer y col., 1990)). Lainteraccin entrehsp70 y precursores mitocondriales requiere
44
REVISIONBIBIIOGRHCA
de la hidrlisis de ATP para su finalizacin, y precede a la posterior asociacin de los
precursores con hsp60 (Manning-Krieg y col., 1991).
Protenas de estrs de 70 kDa en el cloroplasto
.
Se han identificado recientemente protenas de estrs de 70 kda en el estroma del
cloroplastode distintos organismos (Amir-Shapira, 1990; Marshall, 1990). Esta protena
resulta ser esencial para la integracin del precursor del LHC (light harvesting complex)
en la membrana del tilacoide (Yalovsky y col., 1992).
Una ilustracin esquemticade las funciones de las hsp70 en clulas eucariotas sc
muestra en la figura 1.1.
M 10
mANA
t~c~o.w?t
.,Whw7O
9%B~
ADP
ATP
N
Figura 1.1. Ilustracin esquemtica de las funciones de las protenas de
estrs de 70 kDa en clulas eucariotas. En la figura se muestra el papel funcional
dc las protenas de estrs de 70kDa en los procesos de plegamiento y transiocacin de
polipptidos nacientes a travs de membranas, reasociaciones moleculares, desensamblaje,
proteccin frente al estrs y recambio proteico. Segn Gething y Sambrook (1992).
AM
P.ordenotn
o dasenombloe
~ .- Degrodocido
Ij.cso~oI
45
REVISION131131 OGRFICA
1.2.3.2. Estructura de las hsp7Os.
La comparacin de secuencias de distintos miembros de la familia de las hsp70
muestran claramente (i) el alto grado de conservacin existente, tanto entre distintos
organismos comoentredistintos compartimentos de una mismaclula. (u) laexistencia de
secuencias N- o C-terminales responsables del targeting o retencin en distintos
compartimentos celulares y (iii) laexistencia de una mayor homologa en la porcin N-
terminal (450 aminocidos, 60% de la secuencia) que en el tercio C-terminal. El
tratamiento con proteasas de la hsc70 de clulas de mamferos (o clathrin uncoating
ATPase) da lugar a un fragmento N-tcrminal de 44 kDa queconserva laactividad ATPasa
pero desacoplada de la unin al sustrato (Chappell y col., 1987) y un fragmento C-
terminal que parece estar implicado en la unin a los sustratos polipeptdicos.
Dicho fragmento N-terminal ha sido cristalizado y su estructura terciaria
determinada hasta una resolucin de 2.2 A (Flaherty y col., 1990). Este dominio esta
formado por 2 lbulos con una profunda hendidura central donde radica el sitiode unin
del nucletido. Esta disposicin es muy semejante a la que aparece en 2 protenas con
actividad ATPasa, la hexoquinasa (Anderson y col., 1978) y laactina G (Kabasch y col.
1990).
La estructura terciaria de la porcin C-terminal no ha sido determinada hasta el
momento. Sin embargo, se han propuesto 2 modelos hipotticos basados en que (i) la
distribucin de elementos de estructura secundaria es muy semejante a la que presentan
los dominios al y a2 del MMC de clase 1 humano (Rippmann y col., 1991), (u) dicha
regin presentaciertogrado de homologa de secuenciacon laprotena de MMC de clase 1
de X.laev is (Flajnik y col., 1991) y (iii) la prediccin de estructura secundaria y los
perfiles de hidrofobicidad son muy semejantes a los del MMC de clase 1 (Flajnik y col.,
1991; Sadis y col., 1990). Estas semejanzas permitieron a 2 grupos el proponer un
modelo de estructura terciaria para cl fragmento C-terminal de la hscl0 basado en la
estructura tridimensional del MMC de clase 1 humano (Bjorkmann y col., 1987). Segn
este modelo, el sitio de unin al pptido se localizaen una hendiduraen laque aparecen
tanto residuos hidrofbicos como hidroflicos. Si la estructura terciaria de ambas
protenas es realmente semejante, entonces el polipptido sustrato de hsp70 debera unirse
en una conformacin extendida.
46
1.2.3.3. Mecanismo de accin de las hsp7Os
Aunque no se dispone de un conocimiento detallado de los mecanismos
moleculares implicados en la interaccin hsp7o-sustrato, los estudios realizados en los
ltimos aos han proporcionado numerosas evidencias sobre 2 aspectos esenciales para
entender la funcin de esta familia proteica: la interaccin del sustrato polipeptidico y la
actividad ATPasaacoplada a la liberacin de dicho sustrato.
1.- Interaccin con el sustrato: Las hsp70s no parecen reconocer secuencias
consenso definidas en los sustratos polipeptdicos, sino que interaccionan con un amplio
espectro de secuencias diana, lo que las permite participar en una gran variedad de
procesos celulares. Los estudios de unin ti v itro de BiP y hsc7o purificadas a
oligopptidos sintticos de longitud variable indican que la afinidad de la interaccin
pptido-hsp70 poda oscilar hasta en 3 rdenes de magnitud entre los distintos pptidos
(Flynn y col., 1989). Un estudio sistemtico posterior demostr que hsp70 se una
preferentemente a oligopptidos de 7 u 8 residuos, con preferencia por aquellos que
presentan residuos de cadena lateral aliftica en todas las posiciones, mientras que los
residuos de prolina y con cargaquedan excluidos (Flynn y col, 1991). Unaexcepcin a
este modelo parece ser la interaccin de la protena prp73 con los polipptidos destinados
a su degradacin lisosomal. En estecaso, lainteraccin de prp73 parece depender de una
secuencia determinada en susustrato polipeptdico.
El modelo propuesto por Pelham para explicar el mecanismo de accin de las
hsp70 se basa en que la afinidad de las regiones hidrofbicas del polipptidopor hsp70 es
mayor que la de aquellas entre si, permitiendo de estaforma que en aquellas condiciones
fisiolgicas (translocacin a travs de membranas, ensamblaje de monmeros) o
patolgicas (mutaciones, N-glicosilacin alterada. estrs trmico) en las que existe una
exposicin transitoriaal medio de regiones internas del polipptido, la unin con hsp7o
ocurra de forma preferencial con respecto a laagregacin irreversible.
Las evidencias disponibles sugierenque las hsp70 interaccionan simultneamente
con distintas regiones de un mismopolipptido, pero con acusadas diferencias en cuanto
a su afinidad, de forma que algunas de estas interacciones no son lo suficientemente
estables como parapoder ser detectadas experimentalmente.
2.-Actividad ATPasa. Aunque launin de las cadenas polipeptdicas desplegadas
a hsp70 es independiente de ATP, su liberacin requiere de la hidrlisis de ATP por
hsp70 (Flynn y col., 1989; Flynn y col., 1991; Leustck y col., 1989; Munro y Pelham,
47
1986) y probablemente de laintervencin de factores proteicos adicionales como DnaJ y
GrpE, que estimula la actividad ATPasade DnaK (Liberek y col., 1991). La hidrlisis de
ATP, al menos en el caso de BiP, parece ser regulada por Ca
2+ (Kassenbrock y Kelly,
1989). La unin de ATP a hsc7ofavorece la conformacin monomrica, mientras que la
unin con ADP promueve la dimerizacin de la protena (Schmid y col., 1985; Carlino y
col., 1992). Dado que la afinidad de hsp70 por ADP es aproximadamente 6 veces mayor
que por ATP, y que el complejo hsp7O-ADP interacciona con mayor afinidad con
polipptidos deplegados que hsp7O-ATP, se propuso que la liberacin del sustrato
polipeptdico requiere de un intercambio de ADP por ATP en el sitio de unin de
nucletido en hsp7O, acompaado simultnea o posteriormente de la hidrlisis de ATP
(Palleros y col, 1991). En efecto, los polipptidos desplegados estimulan la actividad
ATPasa de hsc70 mediante un aumento en la velocidad de recambio de ADP por ATP
(Sadis y Hightower, 1992).
1.2.3.4. Cooperacin funcional entre las protenas de estrs de 60 y 70 kDa en el
plegamiento polipeptdico.
Estudios ti v iti-o con distintos chaperones moleculares purificados y polipptidos
artificialmente desplegados han permitidocaracterizar los mecanismos moleculares que
permiten a un polipptido desplegado alcanzar una conformacin funcional, mediantela
interaccin secuencial con distintos chaperones (Langer y col., 1992a). En esencia, el
polipptido desplegado es reconocido por DnaK, que coopera con DnaJ para mantener
dicho polipptido en un estado conformacional carente de estructura terciaria. Esta
protena es posteriormente transferida aGroEIJES por medio de lainteraccin conOrpE
y la hidrlisis de ATP. GroEL acta catalticamente en la generacin de laconformacin
nativa. Estos estudios iii v itro han llevado a proponer modelos hipotticos paraexplicar el
plegamiento proteico in v iv o en el citosol bacteriano (Fig. l.2A) yen lamitocondria (Fig.
1.2B). La existencia en la matriz mitocondilal de protenas de estrs de 70 (Kang y col.,
1990) y 60 kDa (Cheng y col., 1989), as como la presencia en dicho orgnulo de un
homlogo de DnaJ (Blumberg y Silver, 1991) sugiere laexistencia de una ruta semejante.
De hecho, se ha comprobado que precursores proteicos mitocondriales interaccionan
secuencialmente en lamatriz de esteorgnulo con hsp7o y hsp60 (Manning-Krieg, 1991)
(Fig. l.2B).
48
A
1
Mg-A T P ~ Mg ATE
8
8-.
Mg-MP
DnaJ. GpE?
t
[~]
GroE
GroES
B
Figura 1.2 Modelo hipottico de la funcin secuencial de hsp7O y hsp6O
en el plegamiento proteico ut vivo.
(A) Plegamiento en el citosol bacteriano. En este caso, la interaccin secuencial del
polipptido naciente con DnaK, GrpE/DnaJ y GroEL/ES y la hidrlisis a lo largo del
proceso de 2 molculas de ATP son necesarias para el plegamiento del polipptido recin
sintetizado. (B) Plegamiento en a matriz mitocondrial. Los precursores protelcos
mitocondriales son mantenidos en una conformacin desplegada competente para la
transtocacin por medio de su interaccin con las hsp7o citoslicas. Estos precursores
interaccionan con la hsp7o mitocondrial tan pronto como comienzan a atravesar la
membrana interna de este orgnulo. La libemcin de hsp7O y la transferencia a hsp0
requiere de la hidrlisisde ATP, y muy probablemente, de la interaccin con los homlogos
mitocondriales de DnaJ y GrpE. El plegamiento hasta una conformacin funcional se
produce en la superficie de hspO con la intervencin de hspo y requiere de ATP.Segn
Hartl y col. (1992).
CITOSOL
MP Gr A~
ME
Mg ATP
-1 - hom4logos
ct-fl~7O
49
1.2.4. Protenas de estrs dc 90 kDa.
Se han identificado protenas de estrs de 87-92 kDa en todos los organismos
estudiados hastala fecha, aunque no aparecen de forma tan abundante como las hsp70.
Se han identificadomiembros de esta familia en E.coli (HtpG) (Bardwell y Craig, 1987),
en Drosophila (hsp83) (Blackmann y Meselson, 1986), en S.cerev isiae (hsc83, de
expresin constitutiva y hsp83, de muy baja expresin basal pero altamente inducible)
(Lindquist y Craig, 1988). En clulas de vertebrados, existe al menos un representante
citoslico (Welch, 1990) caracterizado por ser la protena de estrs de mayor expresin
constitutiva y un homlogo en el retculo endoplsmico denominado grp94 o
endoplasmina (Pouyssegur y col., 1977; Lee y col., 1984; Mazzarella, 1987).
Las hsp9o citoslicas interaccionan in v iv o con gran nmero de componentes
celulares, incluyendo pp60src (el producto del oncogn src) (Brugge y col., 1981); y
distintos polipptidos resultantes de laexpresin de oncogenes retrovirales (yes, fps, fgr,
fes), la mayor parte de los cuales parecen tener actividad tirosina quinasa (Brugge, 1986).
Tambin se ha demostrado interaccin de hsp9O con el factor eIF-2a de la traduccin
(Rose y col., 1987) y con caseina kinasa II (Rose y col., 1987). Todas estas asociaciones
parecen ser necesarias paramantener el sustratoen un estado inactivo. Deespecial inters
resulta al asociacin de hsp9O con el receptor de hormonas esteroideas (Catelli y col.,
1985; Snchez y col., 1985). El receptor recin sintetizado se asocia a hsp90 en una
conformacin parcialmente plegada (complejo SS/9S) incapaz de activar latranscripcin
(Dalman y col., 1989). La unin de la hormona esteroidea promueve la disociacin de
hsp90 pasando el receptor a suforma transcripcionalmente activa (complejo 4S).
Hsp9O es capaz de promover la renaturalizacin itt v irro de fragmentos Fab y de
citrato sintasa de forma independiente de ATP (Wiech y col., 1992), aunque puede unir
ATPde formacatin dependiente y sufrir autofosforilacin(Csrmely y Kohn, 1991).
1.2.5. Otros chaperones moleculares.
SecB y SRP.
SecB facilita lasecrecin de protenas en E.coli a travs de un doble mecanismo.
Por un lado, mantiene el precursor en una conformacin desplegada competente para su
translocacin (Kumamoto, 1991) y por otro lado, permite el targeting del precursor a la
membrana plasmtica mediante su interaccin especficay de alta afinidad con SecA, otro
componente de la maquinaria de tranglocacin que acopla la hidrolisis de ATP a la
50
REVISIONBIBLIOGR PICA
translocacindel precursor a travs de la membranacooperando con el complejo SecY/E
(1-lart y col., 1990a). SecB es un oligmero formado por 4 subunidades idnticas de 16
kDa (Watanabe y Blobel, 1989), por lo que presenta mltiples sitios de unin al sustrato.
Cuando todos los sitios de unin a sustrato se encuentran ocupados, el complejo sufre un
cambio conformacional que provoca la exposicin al medio de una regin altamente
hidrofbica (Randall, 1992).
En clulas eucariotas existe una maquinariaanlogaresponsable del targeting de
protenas de laviasecretora hacia el retculo endoplsmico. Los componentes moleculares
de este sistema incluyen la SRP (signal recognition particle), protena que se une a la
presecuencia de los precursores de la la exoctica de formacotraduccional bloqueando
reversiblemente la elongacin (Walter y Blobel, 1981) y su receptor en la membrana del
retculo, la docking protein (Connolly y Gilmore, 1989), que permite el reinicio de la
elongaciny la translocacindel precursor a travs de lamembrana del retculo. El resto
de componentes implicados en la translocacin del precursor a travs de la membrana del
retculoen eucariotes son an vagamente conocidos (Rapoport, 1991). Se ha descrito la
existencia de un complejo ribonucleoproteico en E.coli semejante a laSRP (Ribes y col.,
1989). cuya funcin permanecedesconocida.
Triggerfactor
Trigger factor es una protena muy abundante en citosol de E.coli cuya funcin
parecer ser la de estabilizar precursores para su translocacin a travs de la membrana
(Crooke y Wickner, 1987; Lecker y col., 1989), de forma semejante a como funciona
GroEL (Guthrie y Wickner, 1990). Sin embargo, aunque se ha demostrado una
interacin directa entre trigger factor y el precursor proOmpA in v iv o, sta resulta en
una inhibicin de la secrecin de dicho precursor (Guthrie y Wickner, 1990). Por tanto
parece ser que el nico factor citoslico implicado en laexportacin de precursores de
E.coli es SecB, a pesar de la mayor abundancia de trigger factor y GroEL. El
fundamento bioqumico de este hechoradica en que SecB puededirigir el precursor hacia
la membrana gracias a su afinidad por SecA, mientras que los otros chaperones son
incapaces.
Presequence binding factors.
Su existencia fue sugerida inicialmente cuando se oberv que el transporte de
procursores aislados a mitocondria y a microsomas requera de la presencia de factores
citoslicos (Argan y col., 1983; Miura y col., 1983; Ohta y Schatz, 1984; Randal y
51
Shore, 1989). Dos de estas protenas se han purificado a partir de lisados de reticulocitos
de conejo. Una de ellas aparececomo un oligmerode 5.5S compuestopor unidades de
50 kDa que es capaz de unirse a la presecuencia del precursor mitocondrial de la OTC,
impidiendo su plegamiento prematuro y agregaciny facilitando su transporte al interior
de la mitocondria (Murakami y Mori, 1990; Murakami y col., 1990). Esta protena se
denomina PBF (presequence binding factor) y es necesaria para la importacin de algunos
(aspartato amino tranferasa, ornitina transcarbamilasa, malato deshidrogenasa) pero no de
todos los precursores mitocondriales (tiolasa) (Murakami y col., 1992). Otra protena
citoslica de 28 kDa tambin parece ejercer una funcin semejante ya que anticuerpos
contraella bloquean la importacin de algunos precursores mitocondriales (Ono y Tuboi,
1990).
Nucleoplasmina.
Fue inicialmente descrita por Laskey y col., (1978). La nucleoplasmina es una
protena cida, termoestable, altamente fosforiladay pentamrica (Earnshaw y col., 1980)
cuyas funciones parecenser: (i) intervenir enel ensamblaje de los nucleosomas (Dilworth
y Dingwall, 1988) y (u) estabilizar el pool intracelular de histonas que aparecen en
determinadas etapas del desarrollo (Woodland y Adamson, 1977).
PapD
PapD es una protena presente en el espacio periplsmico de las cepas patgenas
de E.coli capaces de producir nefritis. Estas cepas se caracterizan por presentar unos pili
especiales denominados Pque permiten a la bacteriaadherirse a residuos de digalactsido
presentes en la superficie de las clulas que recubrenel tracto urinario (Norgren y col.,
1984). Los pili se forman a partir de ensamblajes macromoleculares (1000 subunidades)
de 4 protenas estructurales (PapA, PapE, PapFy PapG) (Lindberg y col., 1987). Todas
estas protenas son codificadas en un nico opern que adems, contiene informacin
para 2 protenas adicionales, PapC que forma un canal en la membrana externa de la
bacteria y PapD que forma complejos con al menos 2 protenas estructurales (PapG y
PapE) antes de su emsamblaje definitivo en el pilus y que parece ser necesaria para
asegurar el plegamiento y ensamblaje post-traduccional de los componentes del pilus
(Hultgren y col., 1989).
PapD es un chaperon atpico en el sentido de que no requiere ATP para su
funcin, es de menor tamao que el resto de chaperones conocidos y desempea
funciones muy concretas. La estructura terciaria contiene 2 dominios globulares formados
52
cada uno de ellos por j3-lminas antiparalelas. Ambos dominios delimitan una regin
hidrofbica flanqueada por residuos cidos y bsicos (Holmgren y Brandon, 1989). Cada
dominio muestra una topologa semejante a la fraccin constante de la molcula de
inmunoglobulina G. Estudios de mutagnesis dirigida indican que laregin interglobular
contiene probablemente el sitio de unin a las subunidades del pilus (Slonm y col.,
1992).
53
1.3. IMPORTACIN DE PROTENAS A LA MITOCONDRIA.
Aunquela principal funcin de lamitocondriaes el aprovisionamiento energtico
de laclula eucariota mediante lafosforilacin oxidativa, tambininterviene en la sntesis
de metabolitos clave para el funcionamiento celular (amino cidos, grupo hemo,
pirimidinas, etc), lo que hace a este orgnuloesencial para el funcionamiento de la clula
eucariota, incluso en condiciones anaerobias. Por este motivo, el conocimiento de los
mecanismos responsables de la biognesis niitocondrial ha constituido un problema
esencial desde los comienzos de la biologacelular y an hoy enda representa un activo
campo de investigacin a nivel mundial. Por esta razn, y porque dos de los objetivos
fundamentales del trabajoaqu presentado han sido, por un lado, la identificacinde una
familia de protenas mitocondriales posiblemente implicadas en la biognesis de dichos
orgnulos y por otro, el estudio del procesamientode ciertos precursores mitocondriales,
consideramos interesante el anajizar de formasomera los conocimientos actuales que se
disponen sobre el tema, centrndonos principalmenteen la importacin de protenas a la
mtocondria. Revisiones sobre otros aspectos de la biogneis mitocondrial (replicacin,
transcripcin y traduccin del genoma mitocondrial, regulacin de su actividad ,etc) han
sido editadas recientemente(Attardi y Schatz, 1988; Grivel, 1989).
La mayora de las protenas mitocondriales (ms del 95%) son codificadas por el
genoma nuclear y sintetizadas como precursores en polisomas citoslicos. Estos
precursores sonespecficamente dirigidos a lamitocondriay transiocados hastasu destino
submitocondrial final donde pasarn a fomar parte de complejos multiproteicos
funcionales. El proceso global que lleva a lasntesis del precursor hasta suincorporacin
en lamitocondriapasa por las siguientes fases:
-Sntesis de precursores y estabilizacin de stos en el citosol.
-Interaccin con receptores de lamembranaexterna mitocondrial.
-Insercin de los precursores en la membrana externa, seguida de transiocacin a
travs de la membrana interna.
-Interaccin con hsp7O mitocondrial para finalizar la translocacin total del
precursor de forma ATP-dependiente.
-Eliminacin proteoltica de las presecuencias mediante metaloproteasas
localizadas en lamatriz.
-Transferencia de las protenas importadas desde hsp7 hacia hsp6o donde se
produce el plegamiento de forma ATP-dependiene.
-Ensamblaje de las protenas importadas en los complejos multiproteicos
funcionales.
54
Cada una de las etapas anteriormente enunciadas ser analizadas con ms detalle,
as como los componentes moleculares especficos implicados en cada una de ellas. Un
modelo hipottico de larutageneral de importacinde precursores proteicos ala matriz de
la mitocondria se muestraen la figura 1.3.
Polipptidos precursores
4,.,.
444,
Figura 1.3. Ilustracin esquemtica sobre la posible ruta general de
importacin de precursores polipeptidicos a la matriz mitocondrial y los
componentes moleculares requeridos para dicho proceso. A la derecha se
indican las distintas etapas en las que se puede dividir conceptuahnente el proceso global de
importacin. Se indican adems las denominaciones alternativas propuestas por distintos
gmpos para protenas de funcin aparentemente equivalente identificadas en cerev isiae y
N.crassa. Adaptada de Pfanner y Weinzierl (1992).
MOM 9
+ATP
55
1.3.1 Precursores proteicos mitocondriales.
La mayora de los precursores mitocondriales se sintetizancon una extensin N-
terminal cuya funcin es la de dirigir el precursor a lamitocondriamediante lainteraccin
con receptores de la membranaexterna mitocondrial y que posteriormente soneliminadas
en el interior de la mitocondria por proteasasespecficas. Estas presecuencias soncapaces
de dirigir protenas citoslicas a la mitocondria (Hurt y col., 1984; Horwich, 1985; Emr y
col., 1986) e inclusomantienen su funcin despus de perder partede sus amino cidos
(Hurt y col., 1986; Keng y col., 1986).
Las presecuencias de targeting a la matriz no presentanevidentes homologas
entres, a excepcin de un predominio de residuos bsicos e hidroxilados, y una ausencia
casi completa de residuos cidos (Von Heijne. 1986; Von Heijne y col., 1989), y de la
presencia en algunos precursores de un residuo de Arg en la posicin -2 con respecto al
inicio de la protena madura. Esto parece indicar que el reconocimiento de los pre-
pptidos por los receptores mitocondriales parece depender de la presencia de estructuras
de orden superior ms que de regiones con secuencias consenso en laestructura primaria.
As, anlisis tericos asistidos por ordenador (Von Heijne y col., 1989) y estudios
biofsicos con pptidos sintticos (Roise y col., 1986; Roise y col., 1988) indican que
muchas presecuencias mitocondriales tiende a adquirir estructura de a-hlice anfiflica. De
hecho, muchas secuencias artificiales y aleatorias no implicadas en el targeting
mitocondrial son capaces de promoverel transporte de precursores a la mitocondria (Hurt
y col., 1986; Allison y schatz, 1986; Hurt y Schatz, 1987; Baker y Schatz, 1987;
Vassarotti y col., 1987; Banroques y col., 1987; Bibus y col., 1988; Bedwell y col.,
1989; Lemire y col., 1989), aunqueen general funcionande forma poco eficiente.
1.3.2. Sntesis de precursores y estabilizacin de stos en el citosol.
Los precursores mitocondriales se sintetizan en condiciones normales en
polisomas libres y son importadas de forma post-traduccional tanto itt v iv o (Reid y
Schatz, 1982a y b) como in v itro (Maccechini y col., 1979), aunque el bloqueo de la
elongacin de la sntesis proteica con cicloheximida permite la copurificacin de
polisomas y mitocondrias (Suissay Schatz, 1982).
Dado que los polipptidos en estado nativo no pueden atravesar las membranas
mitocondriales (Eilers y Schatz, 1986; Chen y Douglas, 1987; Schleyer y Neupert,
1985), las clulas han desarrollado un conjunto de factores proteicos capaces de prevenir
el plegamiento prematuro de los precursores mitocondriales en el citosol. Estos factores
56
incluyen varios miembros de la familia de las hsp7O (ver Seccin 1.2.3.), que resultan
necesarios tanto itt v iv o como itt v itro para laestabilizacinde precursores mitocondriales
de secrecin (Chirico y col., 1988; Desahies y col., 1988; Murakami y col., 1988). En
otros sistemas, la disociacin de los complejos formados entre hsp7O y su sustrato
polipeptdico requiere ATP (Rothman y Schmid, 1986), por lo que parece que el ATP
extraniitocondrial es necesario paragarantizar el funcionamiento de hsp70 y mantener al
precursor en una conformacindesplegada competente para su translocacin. De hecho,
la desnaturalizacin previa del precursor conurea permite su importacinen ausencia de
factores citoslicos (Chineo y col., 1988).
Adems de las hsp70, la importacin de precursores mitocondriales en levadura
requiere al menos de otra protena citoslca caracterizada por ser sensible a agentes
alquilantes de residuos sulfidillo (N-etil maleimida) (Murakami y col., 1988). Otros
factores citoslicos necesarios para la eficiente importacin de precursores a la
mitocondria han sido purificados de reticulocitos de conejo y se han denominado
genricamente PBF (presequence binding factors) (ver Seccin 1.2.5.), ya que se unen
especficamente a las presecuencias de los precursores. Las PBF incluyen una protena de
50 kDa, presente en la clula como una partcula de 5.5S (Murakami y Mori, 1990;
Murakami y col., 1990), y otra de 28 kDa (Ono y Tuboi. 1990).
No todos los precursores requieren de factores citoslicos para su importacin itt
v iti-o, as, la 3-oxoacil-CoA tiolasa no parece interaccionar con PBF (Murakami y col.,
1992), a diferencia de otros precursores que si lo hacen (Murakami y col., 1992). El
precursor artifical pCOXIV-DHFR(constituido por la presecuencia de lasubunidad IV de
la citocromo oxidasa fusionada a la dihidrofolato reductasa de ratn) no requiere de
factores citoslicos para su importacin itt v itro (Eilers y Schatz, 1986) y varios
precursores destinados al espacio intemembrana de la mitocondria [citocromo c
(Nicholson y col., 1988) y adenilato quinasa (Magdolen y col., 1987)] no requieren ATP
para sutranslocacin. lo que parece sugerir una importacin independiente de hsp70.
1.3.3 Reconocimiento de los precursores por receptores de la membrana
externa mitocondrial.
La importacina la mitocondria de la mayora de los precursores es inhibida tras
el tratamiento de la mitocondria con proteasas (Riezman y col., 1983) o anticuerpos
contra protenas de la membrana externa mitocondrial (Zwizinski y col., 1984; Ohba y
Schatz, 1987). lo que hizo suponer la existencia en la membrana externa mitocondrial de
57
polipptidos receptores de los precursores mitocondriales (Zwizinski y col., 1984; Pfaller
y col., 1988).
En mitocondrias de N.crassa, dos protenas perifricas de la membranaexterna
que presentan grandes dominios hidroflicos expuestos al citosol han sido identificadas
como receptores para distintos precursores. Se trata de MOM19 (mitochondrial outer
membrane de 19 kDa) que parece ser el receptor de la mayora de precursores que llevan
presecuencia amino terminal (Slner y col., 1989; Steger y col., 1990), y de M0M72
que funcionacomo receptorparael translocador de nucletidos de adenina, protena de la
membrana interna mitocondrial, que carece de presecuencia procesable (Slner y col.,
1990). Las especifidades de ambos receptores no sonexclusivas ya que el translocador de
nucletidos de adenina puede ser importado a travs de MOMl9 con baja eficiencia y
precursores normalmente importados mediante MOM19 pueden tambin usar M0M72.
La importacin de MOM19 es independiente de receptores en la membrana externa
mitocondrial ya que interaccionacon un componenteposterior de la rutade importacin
(M0M38) (Schneider y col., 1991). El receptorde M0M72 parece ser MOM19 (Sllner
y col., 1990).
En S.cerev isiae, se ha identificado una protena de 70 kDa (Mas7Op) que se
encuentraen lamembrana externa mitocondrial y expone al citosol un dominio hidroflico
de 60 kDa (Hase y col., 1984; Rase y col., 1983). Esta protena es necesaria para la
importacin itt v iti-o de precursores con presecuencia (subunidad 13 del complejo Fi-
ATPasa) o sin ella (translocador de nucletidos de adenina). Estudios itt v iv o con
mutantes de delecin de esta protena (Hines y col., 1990) indican que la importacin de
todos los precursores analizados se encuentra alterada, sugiriendo as un papel receptor
mucho ms amplio.
El uso de anticuerpos antiidiotipo contra un pptido correspondiente a una
presecuencia de un precursor mitocondrial ha permitidola identificacin de una protena
de 32 kDa en S.cerev isiae (Pain y col., 1990) que interacciona con precursores unidos a
la superficie mitocondrial. Adems, anticuerpos obtenidos contra estaprotena inhiben la
importacin itt v iti-o de varios precursores. Sorprendentemente, la secuencia de esta
protena es idnticaa ladel translocador de fosfato, una protena de lamembrana interna
mitocondrial (Phelps y col., 1991). El significado de estaaparente bifuncionalidad no est
claro.
58
1.3.4 Canales de translocacin de protenas.
La importacin in v iti-o de precursores en mitocondrias aisladas incubadas a baja
temperatura, o en ausencia de potencial de membrana, resulta en la acumulacin de
intermedios de translocacinen los que los precursores mitocondriales se encuentran
atravesando las 2 membranas quedando suextremo N-terminal enla matriz mitocondrial
(Rassow y col., 1989; Schelyer y Neupen, 1985; Vestweber y Schatz, 1988). Estos
precursores pueden ser solubiizados por tratamientoconurea o enmedio bsico(Pfanner
y col., 1987a; Sztul y col., 1988> , lo que sugiere que estn asociados a un canal
hidroflico y no directamente anclados en los fosfolpidos de la membrana. La
composicin de este canal hidroflico de lamembranaexterna mitocondrial (denominado
GIP por General Insertion Protein) en mitocondrias de N.crassa ha sido estudiado
mediante cross-linking de precursores parcialmente translocados y posterior
inmunoprecipitacin. El primer componenteidentificado fue M0M38, que se encuentra
asociada a los receptores MOML9 y M0M72 en forma de complejo de alto peso molecular
(Kiebler y col., 1990). Otros componentes identificados posteriormentehan sido MOM7,
MOM8, M0M22 y MOM3O (Slner y col., 1992). En mitocondrias de S.cerev isiae se
identific inicialmente una protena de 42 kDacon un 40% de identidad aminoacidicacon
M0M38 y que es esencial para laviabilidad celular (Baker y col., 1990). Esta protena se
denomin 15P42 (por impon site protein of 42 kDa) y parece constituir el homlogo
funcional de M0M38. El resto de componentes del impon site de S.cei-ev isiae han sido
recientemente identificados y presentan un patrn de polipptidos muy semejante al de
N.crassa (Moczko y col., 1992).
El diametrode estos canales proteicos no es conocido conexactitud, pero se sabe
que son capaces de permitir la translocacin de complejos protena-DNA (Vestweber y
Schatz, 1989), cuyo dimetro es de aproximadamente 20 A.
Hasta lafecha. slamente se ha identificado una protena de45 kDacomo posible
componente del canal de translocacin de protenas de la membrana interna mitocondrial
(Scherer y col., 1992).
1.3.5 Transporte y maduracin de precursores en la matriz mitocondrial.
La mayor parte de los precursores cuya localizacin submitocondrial final es la
matriz de la mitocondria se sintetizan con una presecuencia N-terminal procesable que
permite la interaccin con el receptor de la membrana externa. Estos precursores son
posteriormenteinsertados a travs de canales de naturalez proteica y una vez en la matriz,
59
interaccionan sucesivamante con hsp70 y hsp60 y son procesados para eliminar la
presecuencia (ver Figura 1.3). Las presecuencias amino-terminales de todos aquellos
precursores que la contienen son eliminadas en la matriz mitocondrial mediante una
metaloproteasa. Esta proteasa es un heterodmero soluble de 100 kDa que ha sido
purificada de levadura (Yangy col., 1988), N.ci-assa (Hawlitschek y col., 1988) e hgado
de rata (Kleiber y ccl., 1990; Ou y col., 1989). La proteasa de N.crassu est constituida
por 2 subunidades, MPP (matrix processing peptidase) y PEP (processing enhancing
protein), de las que MPP es la que posee la capacidad cataltica, mientras que PEP
incrementa considerablemente la actividad proteoltica de MPP (Hawlitschek y col.,
1988). Las secuencias de las 2 subunidades son muy semejantes tanto en S.cerev isiae
como enN.crassa (Pollock y col., 1988; Jensen y Yaffe, 1988; Witte y col., 1988). En
levaduras, la inactivacin o deleccin de cualquiera de las 2 subunidades resulta
incompatible con laviabilidad celular (Baker y Schatz, 1991).
Algunos precursores sufren un doble procesamiento en la matriz cuyo objetivo
parece ser el conseguir el conecto extremo amino, ms que promover el sorting
posterior a otro compartimento mitocondrial. Este tipo de doble procesamiento se ha
demostrado para la malato deshiodrogenasa (Kalousek y col., 1988) y la ornitina
transearbamilasa (Sztul y col., 1987). Laprimera reaccin proteolticaes catalizadapor la
metalo proteasa de la matriz, dando lugar as a una forma intermedia cuyo octapptido
amino-terminal presenta la secuencia consenso FXXSXXXX (Hendrick y col., 1989).
Laformacin de la protena maduraes catalizadapor ladenominadapeptidasa intermedia
mitocondrial (MIP), que elimina el octapptido amino-terminal (Isaya y col., 1991). MII
es una protena monomrica de 75 kDa cuya actividad es dependiente de cationes
divalentes (Kalousek y col., 1992). La secuencia de MIP de hgado de rata presenta
ciertas homologas con una subclase de metalo-endopeptidasas implicadas en la
degradacin de pptidos bioactivos (Conlin y Miller, 1992), segn se ha descrito
recientemente (Isaya y col., 1992). Todos los precursores en los que seha propuesto un
doble procesamiento en la matriz mitocondrial presentan un residuo de arginina en la
posicin-10 con respecto al inicio de laprotena madura(Hendrick y col., 1989).
A medida que el precursor atraviesala membranainterna mitocondrial y aparece
en la matriz, se une al representante mitocondrial de la familia de las hsp7o, como
demuestra el hecho de que precursores autnticos, as como precursores artificiales
bloqueados en los canales de importacin, pueden ser unidos covalentemente o co-
inmunoprecipitados junto con mt-hsp70 (Kang y col., 1990; Scherer y col., 1990). La
funcin de mt-hsp70 parece ser la de facilitar la translocacincompletadel precursor hacia
la matrizmitocondrial. De hecho, lainactivacin de estaprotena provoca el bloqueode la
60
importacin itt v iti-o, quedando el precursor atravesando las 2 membranas mitocondriales
(Kang y col., 1990). La unin de precursores a hsp70 es revertida por la hidrlisis de
ATP (Manning-Krieg y col., 1991), por lo que se piensa que el requerimiento
intramitocondrial de ATP para una importacin eficiente de precursores es debido a la
actividad de mt-hsp70 (Hwang y Scahtz, 1989). Mt-hsp7o est codificada por el genoma
nuclear (Craig y col., 1989) y resulta esencial para la viabilidad celular (Craig y col.,
1987).
La mitocondria de todos los organismos estudiados contiene en su matriz un
miembro de la familia de las chaperoninas denominada hsp60 o cpn6o (McMullin y
Hallberg, 1987; McMullin y Hallberg, 1988) (ver Seccin 1.2.2.). Esta protena es
necesaria parael ensamblaje final de los complejos multienzimticos de la matriz y de la
membrana interna mitocondrial (Cheng y col., 1989), as como para el plegamiento de
precursores mitocondriales (Ostermann y col., 1989). Los monmeros de 60 kda estn
codificados por un gen nuclear cuyadeleccin resulta incompatible con la vida (Cheng y
col., 1989).
Todas las etapas anteriormente enunciadas constituyen la via por defecto parala
importacin de precursores a la matriz mitocondrial. Sin embargo, la translocacin de
precursores a otros compartimentos mitocondriales puede requerir de etapas adicionales
(p.ej. precursores del espaco intermenbrana) o bien puede detenerse en un paso
intermedio, compartiendo slo parte de la maquinaria proteica con la ruta general de
importacin (p.ej. precursores de membranaexterna o algunos de membranainterna).
1.3.7 Transporte de precursores a distintos compartimentos
submitocondriales
1.3.7.1 Transporte de precursores a la membrana externa mitocondrial.
La biognesis de las protenas de la membrana externa mitocondrial es con
diferencia uno de los aspectos menos conocidos de la importacin de protenas a la
mitocondria. Algunos precursores de la membrana externa mitocondrial carecen de
presecuencia N-terminal y no requieren de potencial electroqumico en la membrana
interna para su ensamblaje (Freitag y col., 1982; Gasser y Schatz, 1983; Mihara, 1982).
Tal es el caso de la porina (Hamajima y col., 1988), M0M38/1SP42 (Baker y Schatz,
1990) y M0M72 de N.crassa (Kiebler y col., 1990). Parece probable que las protenas de
membranaexterna compartan con otros precursores mitocondilales las primeras etapas de
61
la translocacin, como demuestra el hecho de que una sustitucin conservativa de un
residuoen una protenade lamembranaexternaprovoque un redireccionamiento de staa
la matriz (Hase y col., 1984), y por otro lado, de que la introduccin de una regin
hidrofbicacerca del extremo amino de la presecuenciade una protena de matrizorigine
la retencin de staen lamembrana externa (Nguyen y col., 1988).
Otros precursores de lamembrana externa mitocondrial (p.ej. el receptor Mas7Op
de S.cerevisiae) presentan tpicas presecuencias N-terminales de targeting a la matriz
mitocondrial, pero son retenidos en la membrana externa por medio de una regin
hidrofbica que solapa parcialmente con la secuencia seal (Hase y col., 1984; Hurt y
col., 1985). Sin embargo, esta teora no explica como otros precursores con una
presecuenciacompuesta por unasecuencia seal hidrofflica tpica seguidapor una serie de
residuos hidrofbicos selocalizanen el espacio intermembrana. Lasustitucin enMas7Op
de la primera porcin de lapresecuencia por la presecuenciade un precursor localizadoen
la matriz, da lugar a una orientacin invertida localizndose el extremo amino orientado
hacia el citosol (Li y Shore, 1992).
Un tercer tipo de mecanismo de targeting a lamembranaexterna mitocondrial es
el empleado por la monoamino oxidasaB. Esta protena contiene una seal de targeting
cerca de su extremo carboxilo (Mitoma e Ito, 1992) y su insercin en la membrana
externa itt v iv o requiere ubiquitina (Zhuang y McCauley, 1989).
1.3.7.2 Transporte de precursores al espacio intermembrana.
Podemos encontrar al menos 3 tipos de mecanismos distintos y excluyentes para
el transporte de protenas el espacio intermembrana de lamitocondria.
El primero es el empleado por el citocromoc (Nicholson y col., 1989), adenilato
quinasa (Magdolen y col., 1987) y citocromo c hemo liasa (Lil y col., 1992),
caracterizadopor ser independiente de la presencia de ATPen el exterior de la mitocondria
y de potencial electroqumico, y porque los precursores de citocromo c carecen de
presecuencias procesables. Sin embargo, mientras que el precursor del citocromo c no
requiere de ningncomponentede la membranaexterna mitocondrial, pues interacciona
directamente con lacitocromo c hemo liasaque acta como receptor de alta afinidad en el
espacio intermembrana (Stuart y Neupert, 1990), el precursor de la citocromo c hemo
liasa es importado al espaciointermembrana a travs de su interaccin con MOMl9 y
M0M38 (Lil y col., 1992).
62
El segundo mecanismo descritoes el empleado por el precursor del complejo Fe-S
del complejo ubiquinol:citocromo c reductasa. Esta protena es translocada por completoa
la matriz y posteriormente integradaen el complejo bcl por un mecanismo desconocido
(Fu y col., 1990; Hart y col., 1986).
El tercer mecanismo alternativo parael transporte al espacio intermembrana es
aquel empleado por los precursores que contienen una secuenciaseal compuesta por una
presecuencia tpica de targeting a la matriz seguida por una serie de residuos
hidrofbicos. Podemos encontrar ejemplos de este tipo de precursores en la citocromo c
peroxidasa (Kaput y col., 1982), ctocromo cl (Sader y col., 1984), citocromo b2
(Guiard, 1985) y laisoenzimamitocondrial de la creatinaquinasa(llaas y Strauss, 1990).
Se han propuesto los 2 modelos siguientes para explicar el targeting de este tipo de
precursores:
1.- La regin hidrofbica acta comouna secuencia stop-transfer, de formaque el
precursor comienzaa sertranslocado a travs de la membranainterna mitocondrial hasta
que su extremo N-tcrminal alcanza lamatriz donde laprimera parte de la presecuenciaes
eliminada. La regin hidrofbica de la presecuencia impide la posterior translocacin del
resto del precursor permaneciendo steen el espacio intermembrana donde se elimina la
segunda parte de la presecuencia por medio de la proteasas mitocondrial del espacio
intermembrana (Hurt y Van Loon, 1986; Nguyen y col., 1988, Van Loon y Schatz,
1987).
2.- El modelo denominado de sorting conservativo implica que el precursor es
translocado totalmente a la matriz mitocondrial donde pierde la primera porcin de la
presecuencia e interacciona con hsp60. La interaccin de la forma intermedia del
precursor con hsp6O impide el plegamiento prematuro de aquel en la matriz y facilita su
re-exportacin posterior hacia el espacio intermembrana, por un mecanismo reminiscente
de la secrecin proteica al espacio periplsmico en procariotes, empleando la regin
hidrofbica de la presecuenca como secuencia seal (Hart y Neupert, 1990; Hartl,
1987).
Tanto el modelo de stop-transfer (Glick y col., 1992) como el de sorting
conservativo (Koll y col., 1992) se encuentran apoyados por numerosas evidencias
experimentales. Laprincipal diferenciaentre ambos mecanismos radicaen que el modelo
de sorting conservativo suponeque existe una interaccin directa de la formaintermedia
del precursor con hsp60 en la matriz, y que es requerido ATP en dicho compartimento.
Sin embargo, ambos modelos permiten explicar el hecho de que la eliminacin de la
63
regin hidrofbica de la presecuenciadetermine la localizacin del precursor en la matriz
mitocondrial (Van Loon y col., 1987).
1.3.7.3 Transporte de precursores alo membrana interna inirocondrial.
Se han identificado 2 mecanismos para explicar el targeting de los distintos
precursores a la membrana interna mitocondrial. Por un lado, el translocador de
nucctidos de adeninaes sintetizado sin presecuenciaprocesable, Se ha comprobadoque
la informacin necesaria para su targeting radica en regiones internas de la protena
(Pfanner y col., 1987b; Smagula y Douglas, 1988). Este precursor interacciona
inicialmente con M0M72/Mas7Op (Slner y col., 1990), pero no con hspo, por lo que
se supone que es translocado directamente a la membrana interna de la mitocondria,
donde se anda mediante 3 pares de hlices anfifflicas (Klingerberg y col., 1989). Este
mecanismo parece sercompartidopor otros precursores de la membrana internaque estn
estructural y funcionalmente relacionados con el transiocador de nucletidos de adenina,
como son, la protena desacoplante del tejido adiposo marrn (Liu y col., 1990), el
transportadorde oxocetoglutarato y el transportador de fosfato de levadura (Murakami et
al., 1990) y de mamferos. Este ltimo se sintetiza con una presecuencia N-terminal
(Runswick y col., 1987), pero que puede ser eliminada sin alterar de forma sustancial la
eficacia de suimportacin itt v iti-o (Zaray col., 1992).
Otros precursores del espacio intermembrana siguen una suene de sorting
conservativo, puesto que son translocados totalmente a la matriz para insertarse
posteriormente en la membrana interna. Este mecanismo ha sido observado para el
precursor de la subunidad IV de la citocromo oxidasa (Maarse y col., 1984) en levadura y
para el precursor de la subunidad 9 del complejo FO de N.crassa (Mahlke y col., 1990).
Todas estas protenas presentan regiones altamentehidrofbicas cuyafuncin puede ser la
de facilitar el paso a travs de la bkapalipdica o lade actuar comouna secuencia stop-
transfer.
64
REVISIONBIBlIOGRFICA
1.4. ATPasas TRANSLOCADORAS DE IONES.
1.4.1. Aspectos generales.
En trminos globales, el metabolismo energticocelular resulta del balance entre la
sntesis de ATP y de todos aquellos procesos endergnicos cuyos requerimientos
energticos soncubiertos por esta molcula(biosntesis de macromolculas, transporte de
iones en contra de gradientes osmticos, generacin de potenciales elctricos y/o
qumicos a travs de membranas, emisin de luzen organismos bioluminiscentes, trabajo
mecnico, etc).
Sin embargo, el ATP no es proporcionado como tal por la naturaleza, sino que
debe ser sintetizado por la clula a partir de ADP y fosfato mediante un proceso
endergnico. La fuenteinicial de energa de los seres vivos lo constituyenlas reacciones
acopladas de oxidoreduccin entre un donante reducido y un aceptor oxidado cuyo
potencial redox es lo suficientemente elevado como paraque la transferenciadeelectrones
entre ambas molculas proporcione laenerga necesaria para la sntesis de una molcula
de ATP a partir de ADP y fosfato, procesoconocido como fosforilacin oxidativa. Los
organismos auttrofos son capaces de obtener electrones de alto nivel energticoa partir
de la energa lumnica (fottrofos) o de compuestos inorgnicos (quimiolittrofos),
mientras que los organismos hetertrofos necesitan de compuestos orgnicos de mayor
complejidad paraeste fin.
El mecanismo por el que se produce el acoplamiento entre la cadena
transportadora de electrones y lasntesis de ATP fue propuesto inicialmente por Mitchell
(1974) bajo el nombre de teora quimiosmtica. La base de estatransduccin energtica
radica en que el flujo de electrones a travs de una cadena de aceptores/donadores est
obligatoriamente acoplado a la translocacin simultnea de protones a travs de una
membranabiolgica, dando lugar as a laaparicin de un potencial electroqumicode una
magnitud similar al potencial redox entre 2 eslabones de la cadena transportadora de
electrones. El potencial electroqumico de membrana as generado es empleado
posteriormente para lasntesis de ATP por medio de complejos proteicos especializados
capaces de acoplar ambos procesos.
Dado el papel fundamental que los gradientes de protones desempean en la
transduccin de energa, no resulta sorprendente que todas las clulas dispongan de una
superfamilia de enzimas especializadas en generar gradientes de protones mediante la
65
REVISION ~
hidrlisis de ATP porun lado, y de sintetizar ATPa expensas de la fuerzaprotonmotriz,
por otro. Estas enzimas, conocidas genricamente como ATPasas translocadoras de
iones, aparecen en todos los organismos estudiados hasta la fecha, presentan un alto
gradode similitud estructura] y de secuencia, y probablemente aparecieronen laevolucin
de formamuy temprana, caractersticas todas ellas indicativas del papel fundamental que
estas protenas despeanen labiologa celular.
1.4.2. Clasificacin de las ATPasas transiocadoras de iones.
Todas las AlPasas transportadoras de iones identificadas pueden ser agrupadas
en tres grandes categonas que se conocen como P-, y F-ATPasas.
La familia de las ATPasas tipo P incluye todas aquellas cuyafuncin requiere de
la formacin de intermedio fosforilado. Dentro de este grupo se incluyen la Na~/K~-
ATPasa (Shull y col., 1985), la Ca
2~-ATPasa (James a al., 1988) y la H~-ATPasa
(Goffeau y Slayman, 1981) de la membrana plasmtica de clulas eucariotas , la Ca2~-
ATPasa del retculoendoplsmico (MacLennan y col., 1989) y la K~-ATPasa de clulas
cucariotas (Perlin y col. 1985).
Las ATPasas tipo Vcomprenden todas aquellas que se encuentran asociadas a las
membranas de los orgnulos que constituyen el sistema de citomembrana de clulas
cucariotas (lisosoma, vacuolas de plantas y hongos, endosomas, vesculas recubiertas de
clatrmna y vesculas sinpticas) y en las membranas plasmticas de arqueabacterias. Todas
las V-ATPasas originan una acidificacin limitada en el interiordel compartimento al que
estn asociadas medianteel transporte de protones a su interior acoplado alahidrlisis de]
ATP, a excepcin de las presentes en arqueobacterias, que se encargan de la sntesis de
ATP (verrevisiones de Al Awqati, 1986; Pedersen y Carafoli, 1987a y b; Nelson, 1991,
1992a y b).
Las ATPasas tipo Fse encuentranen lamembrana plasmtica de eubacterias, en la
membrana interna de las mitocondrias de cllulas eucariotas y en la membrana de los
tilacoides en cloroplastos. Se encargan de la sntesis de ATP a expensas de la fuerza
protnmotriz existente entre los dos compartimentos delimitados por la membrana en la
que se encuentran, aunquebajociertas circunstancias pueden funcionar comobombas de
protones dependientes de ATP (ver revisiones de Al Awqati, 1986; Pedersen y Carafoli,
1987a y b; Nelson, 1991, 1992a y b).
66
REVSIONBIBLiOGRFICA
En el panorama global del metabolismo energtico celular, las F-ATPasas
funcionan obligatoriamente en la direccin de sntesis de ATP. proporcionando energa
que es transformada en trabajo porlas dems ATPasas, que funcionan exclusivamenteen
la direccin de hidrlisis de ATP.
La tabla 1.2 muestra las caractersticas de cada una de las familias de ATPasas
anteriormente indicadas.
T abla 1 .2 Resume!x dc las caractcr(sticas bioqu<micas y estructurales dejos 3 ti~s dc A T Pasas translocadoras de tones.
Sustralos L C,IaCO S
P-A T Pasas V-A T Pas~as F-A T PA SaS
Na*K*ICa+/1~1*
1 iCa$Dtdfl
covalenle Si Ns, No
L ocalizacin Membrana plasmtica.
Membrana RE.
Mucosa gstoca.
Membrana de las vesculas de] sistema
dc citomembrana dc clulas cucariotas,
Membrana plasmtica arqucobacicrias
Membrana interna mirocondrial.
Membrana l,lacoidc&
Membrana plasmtica cubactenas.
L uacin T ransiocacinde iones T ransiocacinde protones S<ntcss de A T P
Inhibidores
especficos
Vanadato
D CCL )
NEtA
D CCO
cl-
NO ,
O ligomicina
D CCD
A zA da
Composiciny
tstequiometrta
~ A 3 72
B3 57
C 44
D 3 4
E 26
~3 50
y
3 1
20
1 5
Subunidad cataltica <~ A
67
1.4.2.1. P-ATPasas.
La principal caracterstica diferenciadora de esta subclase de ATPasas
translocadoras de iones es que son fosforiladas durante el ciclo de reaccin mediante la
adicincovalente del y-fosfato del ATPa un residuode Asp altamenteconservado enla
secuencia de todas las ATPasas (Nishigaki y col. 1974; Dane y col. 1981). Laformacin
del intermediofosforiladoconileva una modificacin conformacional de laprotena, como
demuestra laalteracinen el espectrode dicroismo circulary enlafluorescenciaintrnseca
(Dupont, 1976) as comoen la resistencia aproteasas (Benaim y col. 1986). Todas las P-
ATPasas son inhibidas por vanadato, un anlogoestructural del fosfatocapaz de sustituir
a steen el centroactivo de laenzima (Macara, 1980).
Desde el punto de vista estructural, las P-ATPasas estn constituidas por una
nica subunidad, denominada a, de 70-100 kDa que contiene el sitio de fosforilaciny
los dominios implicados en la translocacin de iones. La Na+/K+~ATPasa de la
membranaplasmtica de clulas eucariotas contiene adems una subunidad ji de 55 kDa
de funcindesconocida.
La comparacin de las secuencias entre los distintos miembros de esta familia
(Shull y col., 1985; Kawakami y col., 1985; MacLennan y col. 1985; Serrano y col.
1986) indica la existencia de un alto grado de conservacin enla estructura primariade la
distintas ATPasas, por lo que probablemente derivan todas ellas de un nico antepasado
comn. Esta similitud de secuencia es mxima en torno al sitio de fosforilacin, cuya
secuencia es ~ que se encuentra presente en la
Na+/K+~ATPasa, la H+~ATPasa de la membrana plasmtica y las K+~ATPasas
bacterianas, por lo que es posible que todas las P-ATPasas compartan el mismo
mecanismo de accin. Segn el modelo de estructura terciaria propuesto para la Ca
2+~
ATPasa del retculo sarcoplsmico. basada en datos bioqumicos y en la secuencia de
aminocidos, esta protena presentara 10 dominos transmembrana. Tanto los sitios de
fosforilacin, como de unin a ATP y de unin a Ca2+ se localizaranen un dominio
globular situado en el lado citoslicode la protena (MacLennan y col., 1985).
Se deconoce si el acoplamientoenergtico entrelaformacin de aminoacil-fosfato
y la translocacin inica se produce de forma directa, esto es, existe interaccin directa
entre el ion y el grupo fosfato o de forma indirecta, en cuyo caso la formacin del
intermedio fosforilado provocara un cambio conformacional que a su vez inducira la
translocacin del ion. Aparentemente, en aCa=+~ATPasa,el sitio de fosforilacin parece
estar alejado del sitio de unin al ion (MacLennan y col. 1985). Las P-ATPasas contienen
68
sitios dc unin al ion de alta y bajaafinidad, localizados respectivamente en la superficie
citoslica y en segmentos de membranaorientados hacia el lado luminal (MacLennan y
col. 1985). Se ha propuesto que la fosforilacin de la enzima provoca una translocacin
de los iones desde sitios de alta a baja afinidad. Las P-ATPasas presentan dos regiones
transmembrana altamente conservadas (H3 y H4) que se encuentran entre el sitio de
fosforilacin y los sitios putativos de unin a iones (MacLennan y col. 1985; Shull y col.
1985; Kawakami y col. 1985). Se ha sugerido la posibilidad de que estas regiones estn
implicadas en el acoplamientoenergtico (Shull y col. 1985).
1.4.2.2. V-ATPasas.
Se encuentran asociadas a la membrana de los orgnulos que constituyen el
sistema vacuolar de las clulas eucariotas y en la membrana plasmtica de
arqueobacterias. Funcionan exclusivamente como bombas de protones ATP-
dependientes, provocando una acidificacinlimitada enel interior de lisosomas, vacuolas
de plantas y hongos, endosomas, vesculas recubiertas de clatrina y vesculas sinpticas
(Nelson, 1989, 1991).
Desde el punto de vista estructural, estn formadas por dos sectores bien
diferenciados, el sector V, cataltico, hidrofflico y que contiene el sitiode uninde ATP
y el sector VO, altamente hidrofbico, que se encuentraintegrado en la bicapa lipdica y
funciona como canal de protones. Ambos sectores son funcionalmenteinterdependientes,
de forma que la regin V solubilizadacarece de actividad ATPasa (Moriyama y Nelson,
1989a) y el sector yOes incapaz de translocar protones tras laeliminacinde Vi (Beltran
y Nelson, 1992). El sector V est compuesto por cinco subunidades denominadas
A,B,C,D y E, con una estequiometria del tipo A3B3CDE (Hg. 1.4) y con pesos
moleculares que oscilan entre 70 kDa (A) y 26 kDa (E) (Nelson, 1989, Moriyama y
Nelson, 1989c). La ATPasa de grnulos cromafines contiene subunidades de 140, 70,
57, 41,33 y 16 kDay la ATPasapresenteen las vesculas recubiertas de clatrinacontiene
subunidades de 116, 70, 58. 40 y 34 kDa, lo que sugiere la existencia de componentes
an no caracterizados. Hasta la fecha, el nico componente identificado en el sector VO es
el denominado proteolipido o protena de unin a DCCD, una protena de 16 kDa
altamente hidrofbica soluble en cloroformo/metanol y aparentementeresponsable de la
unidireccionalidad funcional de las V-ATPasa (Moriyama y Nelson, 1988). En algunas
preparaciones de VO se ha identificado un polipptido de 20 kDa muy hidrofbico
(Moriyama y Nelson, 1989b).
69
Figura 1.4. Modelo de la composicin, estequlometra y dimensiones de las
ATPasas de tipo E y y .
(A) Distribucin de subunidades en las F- y V-AlPasas. Como modelo de F-ATPasa se ha
elegido la de E.coli, cuya composicin es bien conocida (a3[33y8Eab~c
2qQ). El modelo de
V-ATPasa se ha elaborado en base a los polipptidos identificados en preparaciones de
ATPasas vacuolares de distintos organismos. La subunidad adel sector de membrana en la
V-ATPasaes hipottica (segn Nelson y ccl., 1991).
(B) Dimensiones de los sectores solubles de las AlPasas de tipo Fy y obtenidos mediante
estndios de microscopia electrnica. El tamallo medio y ladesviacin estandar vienen dados
en nm (segnDschiday Bowman (1992)).
Las V-ATPasas son inhibidas por DCCD, KNO3, KSCN y NEM, siendo este
ltimo agente un inhibidor altamenteespecfico de este tipo de ATPasas. A diferenciade
las P-ATPasas, no requieren la formacin de un intermedio fosforilado, sino que ligan
ATP con gran afinidad.
Las procesos fisiolgicos en los que se encuentra involucrada esta familia de
ATPasas son consecuencia directa de su capacidad para acidificar distintos
compartimentos intracelulares. As, las V-ATPasas son esenciales en los siguientes
procesos biolgicos:
1.- Funcionalidad selectiva de enzimas lisosomales. El pH cidode los lisosomas
desnaturaliza las protenas captadas medianteendocitosis, lo que facilita su degradacin
por los enzimas lisosomales que. a su vez, presentan una actividad mxima a pH cido.
70
Esta caracterstica proporcionaproteccina laclula en caso de rupturalisosomal, ya que
el pH relativamente alcalino del citosol inactiva las proteasas. Adems, muchos
zimgenos pancreticos son inactivos a pH cido, lo que impide su activacin
intralisosomal. Se ha descrito que ciertos mutantes incapaces de acidificar el lumen
lisosomal presentan alteraciones en la capacidad de glicosilar protenas (Robbins y col.
1984> , loque sugiereque las glicosil- transferasas tambin requieren de PH cido para su
funcin.
2.- Unin de ligandos, disociacin y transporte. La captacin de protenas
mediante endocitosis mediada por receptor se encuentra regulada por el pH ya que la
unin ligando-receptor es sensible a pHcido. De esta forma, el ligando interacciona con
su receptor en la membrana plasmtica y no se disocia hasta que se ha producido la
intemalizacin y la consiguiente acidificacin en e] endosoma, lo que permite la
distribucin posterior del ligando a su compartimento de destino y el reciclaje del
receptor. Este mecanismo se ha demostrado para los receptores de LDL y transferrina
(Goldstein y col. 1985) y parael transporte transepitelial de IgGporel epitelio intestinal
neonatal (Rodewald y Kraehenbuhl, 1984). La endocitosis mediada por receptor es
empleada por distintos virus y toxinas para acceder al interior celular. As, la toxina
diftrica (Sandvig y Olnes, 1980), la exotoxina de Pseudomonas y el virus de la gripe
entran enlaclulapor estemecanismo.
3.- Transporte de solutos. Las V-ATPasas resultan fundamentales para la
captacin de aminas biogncas y aminocidos por parte de grnulos de secrecin y
vesculas de almacenamiento. La H+~ATPasa resulta necesaria para la captacin y
almacenamiento de catecolaminas en los grnulos cromafines (Beers y col. 1982), de
serotonina en los grnulos de almacenamiento plaquetario y de acetilcolina en las
vesculas sinpticas (Tol y Howard, 1980).
Un aspecto aparentementecontradictorio referente a la funcin y secuencia de las
ATPasas de tipo V lo constituye por un lado la alta conservacin en su composicin y
secuencia de los polipptidos que la integran, y por otro su diversidad funcional al
proporcionar a cada orgnulo su pH interno ptimo. Esta cualidad puede ser explicada
por varios mecanismos: (i) la presencia en lamembrana de muchos orgnulos de canales
de cloruro que pueden contrarrestar parcialmente lamodificacin en el pH intraluminal a
expensas del potencial de membrana, (u) la diferente capacidad tamponadora del
contenido intraluminal en los distintos componentes del sistema vacuolar, y (iii) la
existencia de distintas isoformas para algunas de las subunidades de laV-ATPasas, lo que
permite modular laactividad.
71
La disposicin espacial de los sectores Vi y VO, segn fue determinada
inicialmente por microscopia electrnica de grnulos cromafines bovinos (Kanaseki y
Katoda, 1969; Schmidt y Winkler, 1982) muestra una estructura globular anclada a la
membrana a travs de un tallo (Fig. 1.4). Una disposicin espacial muy semejante se ha
encontrado en las membranas vacuolares de N.crassa (Bowmann, 1989) y plantas
superiores (Dschida y Bowmann, 1992 y referencias incluidas). Esta estructura es muy
semejante a la de las ATPasas de tipo F. Estudios recientes de microscopia electrnica
sobre la ATPasa vacuolar de N. crassa han permitido estimar las dimensiones del
complejo (Dschida y Bowman, 1992). As, el sector Vi es una esfera de 10 nm de
dimetro y cuyotallo conector tiene 6.6 nm de alto por 3.1 mix de dimetro (Fig. 1.4).
Este mismo estudio (Dschida y Bowman, 1992) ha permitido identificar unas
proyecciones basales conectadas atravs del talloque no aparecen en las F-ATPasas.
1.4.2.3. F-ATPczsas.
Se localizan en la membrana interna mitocondrial, en la membrana de los
tilacoides y en la membrana plasmtica de cubacterias. Estas ATPasas funcionan muy
prximas al equilibrio termodinniico, por lo que pueden catalizar la sntesis de ATP a
expensas del gradiente de protones o bien generar una fuerza protonmotriz de forma ATP-
dependiente (ver revisiones de Cross, 1981; Wang, 1983; Hatefi, 1985; Futai y col.
1989; Pederseny Carafoli, 1987a y b; Amzel y Pedersen, 1983).
En general, en presencia de una adecuada fuerza protonmotriz y con cantidades
suficientes de ADP y fosfato, las F-ATPasas sintetizan ATP. Sin embargo, cuando la
respiracin est limitada por falta de oxgeno o la fotosntesis por falta de luz, las F-
ATPasas pueden consumir el Al? existente para generar un gradiente de protones. En
cloroplastos, existe un mecanismo que inhibe la hidrlisis de ATP en la oscuridad,
evitando as la desaparicin del ATPgenerado durante lafase lumnica. Este mecanismo
requiere de la subunidad E del sector F y del sistema redox proporcionado por la
tiorredoxina (Jagendorf y col. 1991). La ATPasa tipoF mitocondrial tambin contiene un
inhibidor de la actividad ATPasa que puede bloquear laactividad de hidrlisis de ATE del
complejo, aunque su funcin no es tan evidente como la del cloroplasto (Futai y col.
1989; Senior, 1990; Penefsky y Cross, 1991).
72
Laestructura de laF-ATPasaconsta de dos sectores:
- Fi. Puede ser aisladoen forma soluble con actividad ATPasa y est compuesto
por cinco subunidades (a, 3, y, 8 y E) que aparecen con una estequiometra del tipo
a333y8e. Sus pesos moleculares rondan los 50-60 kDa para las subunidades a y 13, 30-
36 kDa para la subunidad y y menos de 20 kDa para las subunidades 8 y E. Esta
distribucionaparece de formaconstante en las F-ATPasas de mitocondrias, cloroplastos y
bacterias. Las nicas subunidades absolutamente conservadas entrelas distintas especies
son las subunidades a, 13 y y. La subunidades 8 de E.coli y cloroplastoson equivalentes
entre s y a su vez equivalen a la OSCP (oligomycin sensitivity conferring protein) del
complejo mitocondrial bovino. Por otro lado, la subunidad E de L coli y cloroplastos
equivale a lasubunidad 8 del complejo mitocondrial, mientras que la subunidad e de este
ltimocarece deequivalente en los complejos de E.coli y cloroplastos.
- FO. Es la parte del complejo encargadade la translocacinde protones y, como
tal, seencuentra formando un canal a travs de labicapa lipdica. A diferencia del sector
VO de las V-ATPasas, la eliminacin de Fi convierte a FO en un canal pasivo de
protones. Lacomposicin de estesector varamucho entre las distintas especies. As, en
E.coli est compuesto por tres subunidades (a, b y c), presentes en una estequiometrla de
ab2c6-lO (Fried y col. 1981). En cloroplastos aparecen cutro subunidades (1, II, III y
IV) (Pick y Raker, 1979; Nelson, 1980; Suss, 1980). En mitocondrias de hgado de rata
el sector FO consta, al menos, de cinco subunidades (Pedersen y Carafoli, 1987a), y de
ocho en mitocondrias de corazn bovino (Stiggall y col. 1978). El nico polipptido
absolutamente conservado en todos los complejos FO estudiados hasta la fecha es el
proteolpido o protena de unin a DCCD, representado por la subunidad c de E.coli, la
subunidad III de cloroplastos y la subunidad 9 del complejo de levaduras y corazn
bovino. Esteproteolipdo es una protena integral de membrana de 8 kDa.
Estudios de microscopia electrnica han permitido visualizar una estmctura del
complejo F-ATPasasemejante a la descrita anteriormente para las V-ATPasas, consistente
en un dominio globular de 90 de dimetro anclado en la membrana a travs de un tallo
conector de 30 A de dimetro y 40k de longitud (Fig. 1.4). La cristalizacindel sector
F ha permitidoobtener informacin sobre la estructura cuaternaria de dicho fragmento
hasta una resolucin de 3.6 A mediante el empleo de difraccin de rayos X (Bianchet y
col. 1991). Este estudio permiti identificar una simetra de orden 3 en el sector F,
estando cada elemento constituido por por un dmero a13. La interaccin entre las
subunidades a y 3 parece producirse a travs de regiones equivalentes entre ambas
subunidades y podra resultar en la formacin de un sitio cataltico (Williams y Coleman,
73
1982) o implicar una interaccin de un sitio regulador en la subunidad a con un sitio
cataltico en lasubunidad [3(Verburgy Allison, 1990).
La actividad del complejo ATP-sintasa puede ser inhibida por DCCD,
oligomicina, venturicidina, cadmio y agentes mercuriales.
A pesar de las investigaciones exhaustivas que se han efectuado sobre las F-
ATPasas, el mecanismo de accin de estas enzimas no ha sido an resuelto. El sector FI
parece contener al menos tres sitios de unin a ATP de baja afinidad (Cross y Kalin,
1982), localizados en las subunidades 13 (Khananshivili y Gromet-Elhanan, 1984) o en
las interfases a-13 (Williams y Coleman, 1982). Tambin se ha descrito la existencia de
tres sitios de unin a nucletidos de alta afinidad (Harris y col. 1977; Harris y col, 1973),
que puedencorresponder a sitios reguladores en las subunidades a y 13. Sin embargo, el
hecho de que anlogos fotoactivables de nucletidos marquen especficamente la
subunidad 13 (Garin y col., 1986) y de que algunas subunidades 13 aisladas catalicen la
hidrlisis de ATE sugiere que los sitios catalticos se localizan en la subunidad 13. Enel
sector Fi tambin seencuentran 3 sitios de unin a fosfato inorgnico y al menos un sitio
de uninpara oxianiones.
Laidentificacin de las regiones aminoacdicas y residuos de la subunidad 13 del
complejoFl-ATPasa implicadas en launin e hidrlisis de Al? seha efectuadomediante
2 aproximaciones:
1.- Comparacin entre las secuencia de subunidades 13 de distintos organismos y
las de otras protenas que unen o hidrolizan ATP y cuyaestructura terciaria es conocida.
2.- Marcaje covalente de la subunidad 13 con anlogos fotoactivables de
nucletidos de adenina e inhibidores especficos manDados isotpicamente.
Ambas estrategias han permitidoidentificar una serie de residuos y regiones de la
protena implicados en la unin de nucletidos de adenina y que se detallan en la figura
1.5.
La identificacin de regiones homlogas en las secuencias de 13-F1-ATPasa y
adenilato quinasa y la existencia en dichas regiones de residuos covalentemente
modificables por anlogos de ATE permitieron a Duncan y col., (1986) proponer un
modelo especulativode la estructura terciaria del dominio de unin de nucletidos de la
74
1 50 100
Atpb_~ovin
Atpb_Human MLG FVG RVAAAPASG ALRRLTPSASLPPAQLLLRAAPTAVR?VRDYAAQTSPSPKAG AMG RZVAVZG AVVDVQFOEG LPPILYALEVQG RZ TRLVLEVA
Atpbnat
101 150 200
Atpbaovin QI1LG~STVRTIAMDGTECLVRGQXVLDSGAPIRIPVGPETLGRIMNVIGEPIDERGPIKTKQFAAIBAEAPEFVE8SVEQEILVTGIKVVDLLAPYAXGG
Atpb Boina QHLGESTVRTIAJ4DGTEGLVRGQKVLDSGAPIxIPVGPETLGRIMNVIGEPIDERGPIKTKQFAPIHAEAPEFMEMSVEQEILVTGIXVVDLLAPYAXGC
Atpbflat QELGESTRTIM4DGTEGL?GQXVLUSGAPIIIPVGPETLGRIMNVIGEPIDERGPIKTICQIAPIHAEAPE?IEMSVEQEILVTGIKVVDLLAPYAXGG
201 250 300
Atpb_Bovin _______
Atpb_Human _______ _______
AtpbRat _______
a b c d
301 350 400
Atpb_Bovin ~LflPNIFPFT0AGSEVSALLGRIP5AVGYQPTLAT0MGTMQERIT.ZnKGSITSV0AI YVPABDLTDPAPATTFAHLPATTVLSRAIAELGIYPAVUP
Atpb_Human ~IDNIYRFT0AGSEVSALLGRIPSAVCY0PTLATDHGTMQERIT~TXKGSITSV0AIYVPADDLTDPAPA?tEAHLDATTVLSRAIAELGIXPAVDP
Atpbnat
eL g h
401 450 500
Atpb_Bovin LDSTSRIMDPNIVGSEEYOVARGVQKILQDYKSLQDI IAILGMDELSEEDKLTVSRARKIQRFLSOPYQVAEVFTGEtGKLVPLKETIRGFQQILAGflU
Atpb_Human LOSTSRIMDPNIVGSEHTDVARGVQKILQDYICSLQDIIAILGMDELSEEDKLTvSPAflIORFLSOPYQVAZVflGHMGKLVPLflTIKGFQQILAGEYO
AtpbRat LOSTSRIMDPN IVGSEHXDVARGVQKILQDYKSLODIIAILGKDELSEEDKL?VSRARKIORFLSQPFQVAEVFTGHMGKLVPLKZTIKGFOOILAGDYD
i
501 529
Atpb_Sovin HLPEQAFYMVGPIEEAVAKADKLMEHS.
Atpb_Human HLPEQAYYMVGPIEEAVAXADKLMEHSS
AtpbRat HLPE0AFYMVGPIEEAVARADKL.~EEEGS
Figura 1.5. Localizacin de las regiones y residuos que se encuentran
implicados en la interaccin de nucletidos de adenina en las subunidades
3 de las ATPasas de tipo F. Estos fueron identificados mediante (i) caracterizacin de
residuos homlogos en otras protenas queunen ATP y (u) marcaje covalente con anlogos
de nucletidos fotoactivables. Las secuencias que seindican son las descritas por Runswick
y Walker, (1983), Obra y Kagawa (1986) y Garboczi y col., (1989)para las subunidades J3
del complejo FI-Alpasa de mitocondria de hgado de rata, bovina y humana
respectivamente, indicadasen ese ordenpor su codigo de accesoen SwissProt. Los residuos
implicados en la interaccin con ATE se muestran subrayados y en negrita. (a) la regin
consenso GXXXGKT (X = cualquier aminocido) conocida genricamente como P-loop
(Saraste y col., 1990) aparece en un gran nmero de protenas que unen e hidrolizan ATP
(adenilato quinasa, miosina) y GTP (p2lras, factores de elongacin); fue identificada en las
~-Fl-ATPasasmediante comparacin de secuencias con otras protenas que unen ATE
(Walker y col., 1982; Saraste y col., 1990, Duncan y col., 1986). Adems, el residuo de
lisina en posicin 155 puede ser marcado covalentemente con Nbf-CI (Andrews y col.,
1984). (b) el residuo de asprticoen posicin 181 es modificado covalentemente por DCCI)
(Yoshida y col., 1982). (c) el residuo de inetionina en posicin 214 es esencial para la
actividad ATPasa, segn se ha demostrado mediante estudios de mutagnesis en [3-Pl-
ATPasa de E.coli (Noumi y col., 1984). (d) laregin de secuenciaRX3G3H4 (X= cualquier
residuo, 1-1 = aminocido hidrofbico) aparece absolutamente conservada en varios enzimas
que utilizan ATE (a y 3-Fl-ATPasas, translocador de nucletidos de adenina, adenilato
quinasa, fosfofructoquinasa) (Walker y col., 1982> . (e> laregin en tomo al residuo de
treonina 291 se encuentra absolutamenteconservado conrespecto alas P-ATPasas (Pedersen
y Carafoli. 1987), aexcepcin del residuo de treonina 291, que en las P-ATPasas aparece
como asprtico. siendo ste precisamente el residuo que se fosforila durante el ciclo
cataltico. (O lalisina en posicin 294 semarca con8-azido ATP (llollemans y col., 1983).
(g) latirosina enposicin 304 puede ser covalentemente modificada por Nbf-CI (Andrews y
col., 1984) y 8-azido ATE <Hollemans y col., 1983). (lo) La tirosina en posicin 338 puede
sercovalentemente modificada por 2-azidoATP (Garin y col., 1986) y por FSBI (Bullough
y Auison, 1986). (i) La tirosina en posicin 361 es marcada por ESBA (Bullough y
Allison, 1986).
75
Figura 1.6. Modelos hipotticos propuestos para la estructura terciara del
dominio de unin de nucctidos en 13-El-ATPasa.
A- Modelo basadoen lahomologa de secuenciade [3-Fl-ATPasay adenilato quinasa y en la
prediccin deesinienira secundaria dela subunidad 13 (Duncan y col., 1986). La molcula de
ATE (fondooscuro) esta colocadaen una hipotticahendidura, de forma semejante a como
acune en laadenilato quinasa.
II- Modelo basado en la semejanza entrelaestructura terciaria de laadenilato quinasa y la
prediccin de estructura secundaria de la 13-F1-ATPasa y en los datos obtenidos de
experimentos de marcaje por afinidad de la subunidad 3 con inhibidores espcticos y
anlogos de sustrato. Segn Vogel y Cross (1991)
subunidad 3 de E.coli, empleando como base estructural la estructura tridimensional
conocida de laadenilato quinasa. Dichomodelo se indicaenla figura 1 .6A.
Independientemente, Vogel Y Cross (1991) hanpropuesto otromodelo parcial de
la estructura terciaria del sitio de unin de nucletidos en la subunidad 13, basndose
principalmente enla similitud existente entre laestructura secundaria tericade la porcin
central de la subunidad 13 y laestructura tridnensional conocida de laadenilato quinasa y
en los estudios de marcaje con anlogos de nucletidos e inhibidores. En este modelo
(Fig. 1.B), se propone que los sitios catalticos de adenilato quinasa y J3-F1-ATPas son
equivalentes, de forma que los sitios de unin de ATP y AMP en la quinasa son
76
considerados equivalentes a los sitios cataltico (izquierda en la figura 1.68) y no
cataltico (derecha en figura l.6B) de unin de nucletidos, respectivamente, en la
subunidad 13. En el esquema mostrado en la figura 1.68, la orientacin de todos los
residuos hastaTyr-31 1 se ha efectuado en base a laestructura tridimensional de adenilato
quinasa, mientras que el resto de residuos se han dispuesto de acuerdo con los datos de
marcaje por afinidad de la subunidad 13. Una explicacin detallada del significado
funcional de cada residuo mostrado en este modelo (Fig. 1.68> ha sido proporcionada
por Penefsky y Cross (1991).
Las subunidades a tambinson capaces de unir ATP, lo que origina profundos
cambios conformacionales en la protena (Dunn y col., 1980; Senda y col., 1983).
Se desconoce el mecanismoexacto por el que el flujo de protones a travs del
complejo FOF se acopla a la sntesis de ATP. Las evidencias disponibles sugieren que
las molculas de ADP y fosfato se unen a los sitios catalticos (de baja afinidad) en el
complejo F y, mediante el ataque nucleoflico del oxgeno 13 del ADP a la molcula de
fosfato, se produce la sntesis de una molcula de ATP (Cross, 1981). Este proceso
parece ocunir de forma espontnea, ya que se ha demostrado que la variacin de energa
libre de Gibbs en el proceso de sntesis de ATP a partir de ADP y fosfato unidos al
complejo Pl es prcticamente nulo (Boyer, 1973). Ladisociacin del ATP del complejo
Pl ocurre a consecuencia de un cambio conformacional enla protena, originado por el
flujo de protones a travs del FO. Uno de los mecanismos hipotticos paraexplicar la
sntesis de ATP es el conocido como mecanismo binding change o modelo rotacional
(Boyer, 1979). Este modelo supone que en cada ciclo de reaccin, una vez que se ha
producido la sntesis espontnea de ATP, el paso de protones a travs del complejo
provoca una rotacin de 1200 en la regin a3133, con respecto a la porcin y&, de forma
que la orientacinrelativa de la subunidad 3 con respectoa las subunidades minoritarias
del complejo determina un cambio en sus afinidades relativas por ATP y por ADP y
fosfato, provocando la liberacin del ATP y la unin con nuevas molculas de ADP y
fosfato (Boyer. 1989).
1.4.3. Evolucin de las AlPasas transiocadoras de iones.
Al igual que ocurre con otras familias proteicas esenciales para la viabilidad
celular, las ATPasas presentan un alto grado de conservacin evolutiva, probablemente
debido a la poca variabilidad estructural impuesta por el requerimiento de una
conformacin plenamente funcional. El clonaje y secuenciacin de cDNAs
77
correspondientes a las subunidades de las 1-, y- y F-ATPasas de diversos organismos ha
proporcionado valiosa informacin sobre las distintas etapas evolutivas de estas
protenas, as como sobre la evolucin de los tres grandes reinos de seres vivos
(eubacterias, arqueobacterias y eucariotas).
Es lgico suponer que la aparicin de la primera clula o progenote separadadel
medio externo por un sistema de membrana fuera acompaada de la aparicin simultnea
de una protena encargada de mantener constante la composicinqumica intracelular a
expensas del consumo energtico. Esto hace pensar que la aparicin de las ATPasas
translocadoras de iones fue realmente un evento temprano en laevolucin, e incluso se ha
sugerido que todas las protenas que unen y/o hidrolizanATP provienen de un ancestro
comn (Pedersen y Carafoli, 1987b; Saraste y col. 1990).
Un examen superficial de las caractersticas estructurales y funcionales de las
ATPasas de tipo P, V y E indica claramente que las F- y V-ATPasas estn ms
relacionadas entre si que cualquiera de ellas con las P-ATPasas. La comparacin de
secuencias de las P-ATPasas con distintas subunidades de las F-ATPasas no revela
homologas significativas, a excepcin de un octapptido central que contiene el residuo
de Asp fosforilable en las P-ATPasas y que se encuentra absolutamenteconservado enlas
subunidades 3 de las F-ATPasas a excepcin del Asp fosforilable que est sustituido por
una treonina (Garboczi y col. 1988). Sin embargo, la sustitucin del residuo de Thr por
Asp en la subunidad 13 de E.coli no confiere a stasensibilidad a vanadato, ni promueve
la formacin de un intermedio fosforilado (Noumi y col. 1988).
El clonaje y secuenciacin de los genes codificantes paralas distintas subunidades
de las ATPasas de tipo F y V ha permitido observar la existencia de homologas
significativas entre las subunidades A y B de las V-ATPasas y las subunidades 13 y a de
las F-ATPasas, respectivamente, llegndose a sugerirque estas cuatro protenas derivan
de un nico gen ancestral. La posterior secuenciacin de los genes codificantes para las
subunidades mayoritarias (a y ji) de la ATPasa de la arqueobacteria acidotennofiica
Sulfolobus acidocalcariuro mostr una alta homologa de secuencia con las subunidades
A y B, respectivamente, de las ATPasas de tipo V (SUdhof y col., 1989; Gogarten y col.,
1989).
La comparacin detallada de las distintas secuencias muestra una mayor
proximidad por un lado entre las subunidades A de las V-ATPasas y las 13 de las E-
ATPasas. La diferencia de tamao entre las subunidades 13 de las ATPasas de tipo F y las
A de las ATPasas de tipo V (aproximadamente 20 kDa) radica en la presencia en estas
78
REVISION BiBLIOGRFICA
ltimas de una insercin N-termnal de 150 aminocidos de funcin desconocida. La
introduccin de esta insercin permite alinear ambas familias con un 62% de residuos
idnticos. Por el contrario, el alineamiento de secuencias correspondientes a las
subunidades a de las F-ATPasas y 8 de V-ATPasas permite encontrar un 25% de
residuos idnticos.
Esta relacin de similitudes de secuencia ha permitido a Nelson (l992a y b)
proponer un modelo paraexplicar la evolucin molecular de las ATPasas de tipo y y F
(Fig. 1.7A). Segn este, laAlPasa ancestral tendra una estructura hexamticaresultante
de la expresin de un nico gen. Este gen sufrida una duplicacin dando lugar a dos
genes que evolucionaran por separado, dando lugar por un lado a las subunidades
catalticas (13-Fi y A-y), y por otro a las reguladoras a-Fi y B-V). La posterior
especializacin de las subunidades catalticas y reguladoras para dar lugar a las ATPasas
de tipo y y F seorigin con laincorporacin a los complejos de otras subundades (C, D
y Een V-ATPasas y y, 8 y E en F-ATPasas) que presentan nula homologa entre s y con
otros componentes del complejo (Nelson y col. 1990).
El sector de membrana de las proton-ATPasas probablemente sufri un proceso
evolutivo separado. Como marcador de dicho proceso se ha estudiado el proteolipido o
protena de unin a DCCI). que aparece en el sector FO de las F-ATPasas y en el sector
VO de las V-ATPasas de arqueobacterias (Deuda y col. 1990) como un polipptido de 8
kfla mientras que el sector VO de las V-ATPasas de cucariotas presenta una masa
molecular de 16 kDa(Mandel y col. 1988). El cursode acontecimientos que condujeron a
ladistribucin actual del proteolpidohan sido propuestos por Nelson (1992a y b). Segn
esteautor, el gen del proteolpido ancestral erasemejante al que actualmentecodificapara
el proteolpido de las F-ATPasa.s. Este gen sufriuna duplicaciny fusin para dar lugar
al gen que codifica para el proteolpido presente en las V-ATPasas de eucariotas. El
correspondiente gen de arqueobacterias aparentementesesepar del gen ancestral antes de
la duplicacin (Nelson, 1992) (Fig. 1.78). Se desconocen Las caractersticas de la
ATPasaancestral, pero dadalamayor sensibilidad al 02 de las V-ATPasas, se piensaque
el sector cataltico de las V-ATPasas precedi al de las F-ATPasas, y que este evolucion
a partir del primero mediante laprdidade un fragmento N-terminal de 120 amino cidos
y la sustitucin de los residuos de cisteina por otros menos sensibles al oxgeno. La ms
probable fuerza selectiva para esta evolucin fue la transicin de la atmosfera primitiva
desde un ambiente altamente reductor a un entorno oxidativo a consecuencia de la
aparicin de los primeros organismos fotosintticos generadores de 02.
79
GencalalIlico arhces ~a~
701 <0
Ouclcacio gnice
701<0
Stt.ridad ~ Subunided A Subajnidad E
de F.ATpasa de V.ATPasa de V-ATPasa
m
53 1 <0 701 <0 571 <0
Subunidad y Subunidad C
3 01 <0 401 <0
B
F-ATPesa de
subactene.
CD
O NO
YNN*
F.ATPasa de F.ATPasa
dooplstos rnitocondel
CD CD
81 <0 81 <0
Gen aricesiral
de pmteollpido <F-ATPaSa)
CD
8 NO Duphcacidr, gn~ta
V-Awasa de
anueobectorias
CD
lCD
8 lCD
Fjsio
g~ca
1 6 kD
4
V.ATPasa de
auca, OUS
1 61 <0
Figura 1.7. Modelo para explicar el origen evolutivo de los distintos
componentes de las H+~ATPasas, deducidos a partir de comparacin de
secuencias entre las subunidades homlogas de los distintos tipos de
ATIasas. (A) Evolucin divergente de los genes codificantes para las subunidades
caalfticas y reguladoras de las y- y F-ATPasas mediante procesos de duplicacin gnica.
(B) Evolucin del proteolpido de las V-ATPasas de eucariotes y arqueobacterias y de las E-
ATPasas. Segn Nelsony col. (1992)
El examendetallado de las secuencias de las subunidades A y B de las ATPasas
de tipo y y de las subunidades ay 13 de las de tipo F muestrala conservacin de residuos
importantes para la actividad biolgica. As, el motivo P-loop consenso de unin a
nucleotidos (GX4GKT) y la regin EYFRD se encuentran absolutamente conservados
entre las subunidades ji de las F-ATPasas y las A de las V-ATPasas. El residuo de
tirosina en la posicin 297 en la subunidad 1 3 de E.coli, implicado en la unin a NBD-CI
apareceen las subunidades Ade las V-ATpasas como una serna, por lo que la inhibicin
de laactividad ATPasade las V-ATPasas por NBD-CI puede ser debida a una interaccin
de los grupos sulfhidrilo de esteagente qumico con residuos de cisteinaprximos al sido
de unin de ATP (Zimniak y col. 1988; Moriyamay Nelson, 1987).
A
Sbunidad a
de F-ATPasa
651 <0
80
La comparacin de las estructuras, funciones y mecanismo de accin de las
AlPasas de tipo F y y de bacterias y orgnulos de distintos organismos ha
proporcionado valiosa informacin sobre el posible origen evolutivo de la clula
eucariota. En concreto, el supuesto origen endosimbionte de mitocondrias y cloroplastos
y el origen del sistema de endomembrana de las clulas eucariotas han sido
reconsiderados en base a los resultados obtenidos a partir de este tipo de anlisis
comparativo de secuencias.
1.4.3.1. Hiptesis endosimbionte.
El origen de mitocondrias y cloroplastos a partir del establecimiento de una
relacin de endosimbiosis entre una forma primitiva de eubacteria y el protocucariote fue
propuestoinicialmente en base a las numerosas semejanzas existentes entre eubacterias,
cloroplastos y mitocondrias (secuencias de rRNA, maquinaria de transcripcin y
traduccin). Estas semejanzas seextienden tambin a la estructura y mecanismo de accin
de las F-ATPasas de eubacterias y orgnulos eucariotas. As, la estructura de las F-
ATPasas es muy similar en todos los organismos estudiados y su funcin y mecanismo
de accin resulta tan conservada que permite el intercambio de subunidades entre los
complejos de distintos organismos sin prdida de la funcionalidad (Richter y col. 1986;
Futai y col. 1980; Takeda y col. 1982; Hsu y col. 1984).
Se ha sugerido que los cloroplastos proceden evolutivamente de bacterias
similares a las actuales cianobacterias (Thorne, 1977; Gray y Doolittle, 1982; Wallace,
1982; Gray y col., 1984) y que las mitocondrias evolucionaron a partir de bacterias rojas
fotosintticas semejantes a las bacterias rojas del tipoRhodospirillum rubrum (Dickerson,
1980; Woese. 1980; Yang, 1985). Esta hiptesis, inicialmente propuesta en base a la
comparacin de secuencias de los RNAs 165 de distintos organismos, se ha visto
reforzada al estudiar la organizacin de los genes que codifican para las distintas
subunidades del complejo F-ATPasa. As, en cianobacterias, los componentes del
complejo FOFl-ATP sintasaestn codificados en dos operones, el atpl que contiene los
genes que codificanpara laprotena 1 y las subunidades a, c. b, b, % a y 8. y el atp2 que
contiene los genes de las subunidades 13 y E. El genoma de cloroplastos de clulas
superiores presenta una distribucin semejante con laexcepcin de las subunidades b
(equivalente a lasubunidad II). y y 8, que estncodificadas enel genoma nuclear. De esta
forma, aparecen dos unidades transcripcionales codificantes para las subunidades IV (a),
III (c), 1(b), y y a por un lado, y 13 y E por otro. Laidentificacinen organismos actuales
de pasos intermedios en la evolucin podra ayudar a confirmar esta hiptesis. As, por
81
ejemplo, se ha demostradoque lasubunidad 8 del complejo F-ATPasaest codificadapor
el genoma del cloroplasto en Odontella sinenesis (Pancic ycol. 1991).
Los genes que codificanparalas subunidades del complejo FOF1-ATP sintasa en
R.rubrum estn organizados en dos operones, uno de ellos (atpl) que codifica para las
subunidades del sector FO (a, c, b y b) y otro (atp2) codificante para las subunidades del
sector Fi (8, a, y, 13 y E). El genoma mitocondrial en mamferos y levaduras contiene
unicamente algunos de los genes que codifican paracomponentes del sector FO. As, en
levadura el genoma mitocondrial codifica para la subunidad 9 (proteolpido), subunidad 8
y subunidad 6, mientras que en mamferos solo son codificados en el genoma
mitocondrial las subunidades 6 y 8. Estopuede explicarse suponiendo que el operonatp2
fue transferido al nucleo como una unidad. Sin embargo, el genoma mitocondrial de
plantas codifica para la subunidad a (Braun y Levings, 1985), lo que puede ser
simplemente un reflejo de un paso intermediode laevolucin o bien el resultado deque
este gen fuera reintroducido en el genoma mitocondrial, hiptesis plausible dada la alta
capacidad de recombinacin del genomamitocondrial en plantas (Attardi y Schatz, 1988).
El gen codificante parael proteolpido del sector FO se localiza en el nucleo de las
clulas de mamferos (Mahlke y col. 1990) y de N.crassa (Viebrock y col. 1982). Sin
embargo, el genomamitocondrial de N.crassa contieneun gen potencialmente capaz de
codificar para el proteolpido (subunidad 9), peroque no es transcripcionalmentc activo
(van denBoogart y col. 1982), lo que puede representar un paso evolutivo intermedio.
En conclusin, la hiptesis del origen endosinibionte de mitocondrias y
cloroplastos se ve apoyada por las semejanzas estructurales y funcionales existentes entre
las ATPasas de tipo Fde orgnulos y de eubacterias actuales. En cualquier caso, existeun
acuerdo general sobre la secuencia de procesos que siguieron al establecimiento de la
relacin de endosimbiosis. Estos fueron: (i) la prdida de rutas metablicas comunes y e]
consiguiente desarrollode transportadores para los metabolitos esenciales aportados por
el hospedador, (u) transferencia de genes desde el genonia del orgnulo al nucleo y
desaparicin de genes redundantes y (iii) desarrollo de un mecanismoespecfico para el
transporte de protenas al interiordel orgnulo.
1.4.3.2. Desarrollo del sistema de endomembrana en clulas eucariatas.
El citoplasma de las clulas eucariotas contiene una gran variedad de estructuras
delimitadas por membranas biolgicas. Entre estas se incluyen los orgnulos con funcin
metablica (mitocondrias, cloroplastos, microcuerpos) y cl denominado sistema de
82
citomembrana o vacuolar, que comprende el retculo endoplsmico liso y rugoso, el
complejo de Golgi, grnulos de secrecin, endosomas, lisosomas, vesculas de
almacenamiento y transporte, vacuolas y elementos de lamembrana nuclear. Todas estas
estructuras se consideran incluidas en un nico sistema en base a su capacidad para
establecer conexiones directas o indirectas entre sio con la membranaplasmtica mediante
procesos de fusin/fisin. Este sistema de citomembrana constituye, junto con la
membrana plasmtica, un orgnulocomplejo, implicado principalmente en procesos de
intercambioentre laclulay su entorno.
El origen evolutivo del sistema de citoniembranade las clulas eucariotas ha sido
muy debatido, dado que sus ancestros evolutivos, las clulas procariotas, carecen por
completo de este tipo dc estructuras. Se ha sugeridoque este sistema tiene su origen en
una membrana plasmtica ancestral de tipo procariote. que a travs de sucesivos procesos
de expansin. invaginacin, vesiculacin y diferenciacin, dieron lugar a un sistema de
citomembrana como el que conocemos hoy en da (Leey Hong., 1987; Cavalier-Smith.
1987; Zillig. 1987; Jones y col., 1987). Una fuerteevidenciaa favor de esta hiptesis lo
constituye el hecho de que algunas de las funciones desempeadas por los distintos
integrantes del sistema de citomembrana, son realizadas por los organismos procariotes
en la proximidad de la membrana plasmtica. Ejemplos de este tipo de funciones son el
transporte molecular e inico, latranslocacin de protenas y glicsidos, el ensamblajede
lpidos, el anclaje del cromosomadurante lareplicacin del DNA (ver de Duve, 1990 para
una discusin exhaustiva sobreel tema).
La existencia de ciertas homologas entre las arqueobacterias y las clulas
eucariotas (ambos tipos de clulas emplean opsinas como pigmentos fotoactivables, usan
dolicolfosfato como transportador de restos glicosio, contienen genes interrumpidos por
intrones, presentan caractersticas comunes en su maquinaria traduccional, y las
arqueobacterias tienen protenas semejantes a la actina y a las histonas) ha permitido
sugerir que las clulas eucariotas estn ms cercanas evolutivamentea las arqueobacterias
que a las eubacterias (Fox y col. 1980; Kaine y col. 1983; Daniels y col. 1985). La
presencia exclusiva de ATPasas de tipo y tanto en el sistema de citomembrana de
eucanotas comoen la membranaplasmtica de las arqueobacterias, refuerza lahiptesis
de que la clula eucariota procede evolutivamente de las arqucobacterias, a la vez que
proporciona una evidencia adicional a favor del hipottico origen del sistema de
citomembrana de las clulas eucariotas atravs de la diferenciacin e internalizacin de la
membranaplasmtica de sus ancestros evolutivos.
83
La cuestin que se plantea inmediatamente es por que las arquebacterias han
mantenido las y-ATPasas como enzimas encargadade lasntesis de ATP, mientras que
en las clulas cucariotas, la V-ATPAsas funcionan exclusivamente n sentido contrano.
Los estudios con Sulfolobus acidocalcarium han permitido proponer una solucin parcial;
las V-ATPasas son las nicas ATPasas compatibles con la vida en condiciones tan
extremas. S. acidocalcarium habita en ambientes con pH prximos a 2 y debe bombear
protones contra gradientes de 4 unidades de pH. por lo que una ATPasa con una
estequiometria de tres protones por cadamolcula de Al? slo podrafuncionar a un pH
extracelular igual o inferior a 3 trabajando prximo al equilibrio termodinmico. Por el
contrario, las V-ATPasas, cuya estequiometra protn/ATP es de 2, pueden generar un
gradiente de 4 unidades de pH y por tanto vivir a pH 2.
La presencia de y-ATPasas en el sistema vacuolar de clulas eucariotas se ha
interpretado no slo como la consecuencia lgica de la proximidad evolutiva entre
arqucobacterias y eucariotas, sino como un mecanismo de seguridad para impedir la
acidificacin excesiva de los compartimentos intracelulares. La principal caracterstica
diferenciadora de las y-ATPasas de arqucobacterias y eucariotas es la presencia en estas
ltimas de un proteolpido de 16 kDa, resultante de la duplicacin del gen que codifica
para el proteolpido de 8 kDa presente en aquellas (Fig. l.7B). La permeabilidad del
sector yO se ha correlacionado con la presencia del proteolpido, de forma que el
proteolpido de 16 kDa presenta una permeabilidad pasiva a protones superior a la del
proteolpido de 8 kDa, originando as una y-ATPasa menos eficaz, que slo puede
funcionar unidirecccionalmente en la hidrlisis de ATP para generar un gradiente de
protones. Adems la existencia de isoformas para las distintas subunidades de las y~
ATPasas confiere a estas una diversificacin funcional que las permite desempear
papeles especficos y especializados en los distintos orgnulos donde se encuentra.
Se puede considerar por tanto, que las proton-ATPasas estn desempeando y,
muy probablemente, van a desempear en el futuro un importante papel a la hora de
establecer las relaciones evolutivas entre las distintas familias de organismos. El clonaje y
secuenciacin de genes codificantes para las subunidades de las proton-AlPasas de otros
organismos contribuir sin duda a descifrar los complejos mecanismos responsables de la
diversificacin celular y de lageneracin del amplio espectro de organismos existentes en
la actualidad.
84
1.5. BIBLIOGRAFA
A cciIi, D ., Kadowaki, T., Kadowak , H., Mosthaf, L., Ullrich, A. y Taylor, S.l.
(1992) Irnmunoglobulin heav y chain-binding protein binds o misfolded mutant insulin
receptors with muahions in he enracellular domain J.Biol.Chcm. 2~2:586-590.
Al Awqati, Q. (1986) Proton-translocauing ATPases Annu.Rcv.Ccll Biol.2:179-99.
Allison, D.S. y Schatz, 6. (1986) Artificial mitochondrial presequences
Proc.Natl.A cad.Sci.USA B3 901 1 -901 5.
Amir-Shapira, D., Lcustek, T., Dalle, E., We sshach, H. y Brot, N. (1990) Hsp7O
proeins, similar o Escherichia ccli DnaK, iii ch/crep/ass ant! mochonra of Eug/ena gracilis
Proc.NatI.Acad.Sci.USA ~J~: 1 749-1 752.
Anizel, L.M. y Pedersen, P.L. (1983) Troten ATPAses: Siructure ant! mechanism
Annu.Rev.B ochem. 2:801-824.
Ananthan, J., Goidbcrg, A.L. y Voellmy, R. (1986) Abnormal preteins serv e os eukaryotic
stress signais ant! trigger11w activ ation oflzea shock genes Sdcnce 232:522-524.
Anderson, C.M., Stenkamp, R.E. y Stetz, T.A. (1978) Sequencing a protein y x-ray
crysa//ography. IL Re.finement of yeast hexokinase fi co-ordinales ant! sequence al 2.1 A
resoluzion J.Mol.Biol. 123.:15-33.
Anderson, R. y Haho, G.M. (1985) Dfferentia/ effects of hypertherrnia en he Na+-K+-ATPase
of Chinese harnsterov ary ce/ls Radiat.Rcs. 102:314-323.
Anderson, R.L. y Parker, R. (1982) Ana/ysis of memnbrane lipid compesition of rnarnmalian
ce/ls during he dev e/opment of hermoto/erance
Intj.Radiat.Biol.Relat.Stud.Phys.Chem Mcd. 42:57-69.
Andrews, W.W., Hill, P.C. y Allison, W.S. (1984) Jdentfication of (he essential tyrosine
residue in he 3 subunil of bev ine hear mitechondrial FI-ATPase thai is mo&fied y 7-chlere-4-
nitrotl4CJbenzofurazano J.B ol.Chcm. 22:8219-8225.
Ang, O., Liberck, 1<., Skowyra, D., ZyI cz, M. y Gcorgopoulos, C. (1991) Rielo gical
role ant! regulation of he univ ersal/y censerv ed heat shockproeins J.Biol.Cheni.2~:24233-
24236.
Argan, C., Lusty, CJ. y Sborc, G.C. (1983) Membrane ant! cytoso/ic cempenenis affecting
transpon of he precursor for ornithine carbarnylransferase mio nziochondria J.Biol.Chem.
2~B:667-6670.
Arrigo, A.P., 1?akan, S. y Tissiercs, A. (1980) L ocalization of he heal shock-induced
proteins in Drosophila mnelanogaster issue culture ce/ls Dev.Biol. Za:86-103.
Ashburner, M. y Bonner, .J.J. (1979) The induction of gene aciv y in Drosophila y heal-
shock Ccli 11:241-254.
Atencio, 0.1. y Yaffc, Mi. (1992) MASS, a yeast hornolog of DnaJ inv o/v ed in
mitochondrial prolein impon Mol.Ccll.Biol. fl:283-291.
Attardi, 6. y Schatz, 6. (1988) Biogenesis of mitochondria AnnuRcv.CeIl Biol. 4.:289-
333.
Avital, 5. y Gromet-Elhanan, Z. (1991) Exiraclien ant! pur4fcalion of he 3-subunit and an
activ e a$-core complex frern he spinach chlerep/ast CFOFJ-ATP synlhase LBioI.Chcm.
2~:7067-7072.
Avni, A., Avital, 5. y Groniet-Elhanan, Z. (1991) Reactiv ation of he ch/oroplast CFI-
ATPase 3 subunil y trace ameunis of he CFi a subunj suggess a chaperonin-/ike aciiv ity for
CFJa J.Biol.Chem. 2~:7317-7320.
Bakcr, A. y Schatz, 6. (1987) Sequences from a prokaryotic genome or (he mouse dihydrofe/ate
reductase gene can resto re he impon of a runcated precursor protein mio yeas mitochondria
Proc.NatI.Acad.Sci.USA k:3 117-3121.
Baker, K.P., ScbancI, A., Vestwebcr, 0. y Schatz, 6. (1990) A yeas mitochont! rial
euler mernbrane pretein essentia/for proxein impon ant! cel v iability Nature 24a:605-609.
Bakcr, K.P. y Schatz, 6. (1991) Mitechendrial preteins essential for v iabi/iy mediate pretein
impon mo yeas mitochondria Nature 34Q:205-208.
Banroques, .L, Perea, J. y Jacq, C. (1987) Ffficient sp/icing of lwo yeast mitochondnial
introns contro//ed ya nuclear-enceded maturase EMBOJ. : 1085-1091.
85
Bardwell, J.C. y Craig, E.A. (1984) Major ea: shock gene of Drosophita and he Escizerichia
cali hea-inducible dnaK gene are homologaus Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:848-852.
Bardwell, J.C. y Cralg, E.A. (1987) Eukaryozic Mr 83,000 hear sl ock protein has a homologue
iii Escizerichia cali Proc.NatkAcad.Sci.USA 84:5177-5181.
Barraclough, R. y Ellis, RJ. (1980) Progein synhesis in chioroplasis. IX: Assembly of new/y-
synthesized targe subunjis ita ribulose bisphosphae carboxylase in isolated miad pca
chioroplasis Biochim.Biopbys.Acta ~D&: 19-31.
Beckniann, R.P., M zzen, L.A. y Welch, W.J. (1990) Ineraction of Hsp 70 wih New/y
synthesized Proteins: Impficationmsforproteinfolding ami Assembfy Science 248:850-854.
Bedwell, D.M., Strobel, S.A., Vun, K., Jongeward, C.D. y Enir, S.D. (1989)
Se quence and sruciural requiremenis of a mitochondrial prorein impon signal defined by
saturallan cassette maagenesis Mol.Cell.B ol. 2:1014-1025.
Beers, M.F., Carty, S.E., Johnson, R.G. y Searpa, A. (1982) 11+-ATPase and
cazecholamine transpon in chromaffln granules Ann.N.Y.Acad.Sci. 4Q2: 116-33.
Beltrn, C., Kopecky, J., Pan, Y.C., Nelson, H. y Nelson, N. (1992) Cloning and
mutational analysis of he gene encoding subunj C of yeast v acuolar H(+>-ATPase
J.B ol.Chem. 22:774-779.
Beltrn, C. y Nelson, 1% (1992) Tize nenibrane sector of v acuolar 11+-A TPAse by itself is
impermeable o protons Acta Physlol.Scand. (en prens)
Bena m, G., Clark, A. y Carafol, E. (1986) ATPase adtiv ity and Ca2+ transpon by
reconstituxed tryptic fragmens of he Ca2+ pump of he erythrocyte plasmo membrane Ccli
Calcuni 2:175-186.
Bianchet, M., Ysern, X., Hullihen, 3., Pedersen, P.L. y A nzel, L.M. (1991)
Milochani! rial ATP synthase. Qualernay ana/ysis of he Fi nloiety al 3.6 A determined by X-ray
dffracion analysis J.Biol.Chem. 2~6:21 197-21210.
Bibus, C.R., Lemire, B.D., Suda, K. y Schatz, C. (1988) Mutations resoring impon of a
yeasx mirochondnial protein wih a nonjunclionol presequence J.Biol.Chem. 23: 13097-13102.
Bjorkman, P.J., Saper, M.A., Samraoui, B., Bennet, W.S., Strominger, J.L. y
Wiley, WC. (1987) Structure of Ihe human class histocompatibiliy afligen, HL A-A2
Nature 322:506-512.
Blacknian, R.K. y Meselson, M. (1986) Interspeczfic nucleotide sequence comparisons used o
idenQy regulaory ami sirucruralfearures of he Drosophila hsp82 gene J.Mol.B ol. 188:499-
515.
Bloemendal, H., Berns, T., Zweers, A~ Hoenders, H. y Benedetti, E.L. (1972) Tize
sae ofaggregaion of -crysallin detected afier large-scale preparation by zonal centrifugation
Eurj.B ochem. 24:401-406.
Blumberg, II. y Silver, P.A. (1991) A homologue of he bacenial heat-shack gene DnaJ ha:
alers pratein soning in yeasl Nature 342:627-630.
Bockhareva, E.S, Lissin, N.M., Flynn, C.C., Roth nan, J.E. y Girshovich, A.S.
(1992) Poshiv e cooperaiv i:y in he funclioning of molecular chaperone GroEL
J.Biol.Chem. 2~L6796-6800.
Bochkareva, E.S., L ss n, N.M. y Cirshovch, A.S. (1988) Transien: association of newly
synthesized unfoldedproteins wih he heai-shock GroEL proteins Nature336:254-257.
Bole, D.C., Hendersbot, L.M. y Kearney, I.F. (1986) Positranslalional assaciation of
immunoglobulin heav y chain binding prolein wh nascen heav y chains in nonsecreting ami
secrehng hybridomas J.Cell Biol. IDZ: 1558-1566.
Bownian, B.J., Dschida, W.J., Harris, T. y Bowman, E.J. (1989) The v acuolar ATPase
of Neurospora crassa conains an FJ-like siruclure J.Biol.Chem. 2~4:156O6-15612.
Boyer, P.D. (1979) Tite binding-change mechanism of A?? synthesis. En: Membrane
boenergetics PP 461-479 (Lee. C.P.. Schatz, O. y Emster, L. eds.) Addison-Wesley,
Reading, Massachusetts.
Boyer, P.D. (1989) A penspectiv e of he binding change mechan ism for ATP syndzesis FASEB
3.12164-2178.
Boyer, P.D., Cross, R.L. y Momsen, W. (1973) A new cancep for energy coupling in
oxidativ e p/zosphorylaion based on a molecular explanation of he oxygen exchange reaction
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2Q:2837-2839.
86
Brandsch, R., Bichier, y., Schniidt, M. y Buchoer, 3. (1992) GroE dependence of
refalding and holaenzyme formation of 6-hydraxy-D-nicoine oxidase J.Biol.Chem.
2~2:20844-20849.
Braun, C.J. y Levings, C.S.II1. (1985) Nucleotide sequence of he F1-ATPaseasubunir gene
from maize mitochomiria Plant Physiol. 29571-577.
Breen, G.A.M. (1986) Bov ine liv er cDNA clones encoding a precursor of he a-subunut of tite
mioctzondrial ATP synhase complex Blochem.B ophys.Res.Cownmun. 15Z264-269.
Brugge, S.S. (1986) Ineracion of he Raus sarcoma v irus protein pp60src with tite cellular proteins
ppSO ant! pp
9O Curr.Top.Microhiol.Innnunol. .121:1-22.
Brugge, 3.5., Erikson, E. y Erikson, RL. (1981) Tite specific interaction of he Raus
sarcoma v irus transfarming protein, pposrc. with twa ce/lular pro:eins Ceil 25fl63-72.
Buchmeier, N.A. y Heffron, F. (1990) Induction of Salmanella stress proreins upon infection
of macrapitages Science 248:730-732.
Buchner, 3., Schmidt, M., Fuchs, M., Jaenicke, R., Rudolph, R., Schndd, E.X. y
Kiefhaber, T. (1991) GroE facilitares refolding of citrale synthase by suppressing
aggregation Bioche nistry 3Q: 1586-1591.
Buffa, P., Cuarriera Bobyleva, V., Muscatello, U. y Pasquali l4onchetti, 1. (1970)
Conformational changes of mitochondria associaed with uncaupling of oxida:iv ephosphorylohan
in v iv o ami in v itro Nature 22fr272-274.
Bullough, D.A. y Allison, W.S. (1986) naciv aion af he bov ine hear mitocitondrial FI-
ATpase by S-p-fluorosulfonyl[SHJinosne is accampaned by modification of tyrosine 345 in a
single fi subunur J.Bol.Cheni. 21: 14171-14177.
Bullough, D.A. y Allison, W.S. (1986) Titree copies of tite fi subuni mus be modified la
achiev e complete inactiv ation of he av ine mirochondrial FI-ATpase y 5-p-
fluorobenzoyladenosine J.Biol.Chem. 2t5722-5730.
Burdon, R.H. y Cutunore, M.M. (1982) Human hea: shock gene expression and tite modulation
o/plasmo membrane Na+-K+ AlPase activ ity FEBS Lett. .14Q:45-48.
Calderwood, S.K. y Hahn, C.M. (1983) Titermal sensitiv ity ami resisiance of insulin-receptor
binding BiocIui n.Biophys.Acta 2j:1-8.
Caplan, AJ. y Douglas, M.G. (1991) Characterization of YDJI: a yeas homologue of tite
bacterial dnai protein J.CeIl Bici. 111:609-621.
Canino, A., Toledo, II., Skaleris, O, DeLisio, It, Weissbach, H. y Brot, N. (1992)
nteracions of v er GRP78 ni! esciterichia coil recombinan GRP7S witit A?!: mu/tiple .rpecies
md disgggregation Proc.Nati.Acad.Sci.USAB2:2081 -2085.
Catelli, M.G., Binan, N., Jung-Testas, 1,, Renoir, J.M., Baulieu, E.E., Feramisco,
J.R. y WeIch, WJ. (1985> TIte conimon 90 kD protein componen: of nan-trasnformed
85 steroid receptors isa ea: shockproein EMItO3.4:3131-3137.
Catelli, M.G., Radanyi, C., Renoir, 3., Binan, N. y Baulien, E.E. (1988) Definilion
of donioin of hsp90 interacting with sieroid recepors J.CeIl.Biochemn. SnuuL.12D:276.
Cavalier Smith, T. (1987> Tite origin of eukaryot c ant! archaebacterial ce/ls
Ann.N.Y.Acad.Sci. .5fl%17-54.
Cegielska, A. y Ceorgopoulos, C. (1989) Funcijonal donwins of he Esciterichia col dnaX
eat shockpro:ein as rev ealed y mutationol ana/ysis J.BioLChem.24:21122-21130.
Chandrasekar, C.N., TIlly, U, Woolford, C., Hendrix, R. y Ceorgopoulos, C.
(1986) Purification ni! properties of he groES morphogenetic prolein of Esciterichia cali
J.Biol.Chem. 21:12414-12419.
Chappell, T.C., Konforti, B.B., Sehunid, S.L. y Rothunan, J.E. (1987) Tite ATPase
Core of Claritrin Uncoating Protein ,J.Biol.Cheni. 2~2:746-751.
Chappell, T.G., Welcb, WJ., Schlossman, D.M., Palter, I(.B., Sehiesinger, M.J. y
Rothnian, 3-E. (1986) Uncowing ATPase is a member of he 70 kiladalton familiy of stress
pz-oteins Ccli 45:3-13.
Chen, W.3. y Douglas, M.C. (1987) Tite role of protein siructure in tite mitochondrial impofl
paUiway. Unfolding ofmitochondrially bound precursors is required/or membrane transacation
J.Biol.Chem. 2215605-15609.
Cheng. M.Y., Han-ti, Fil. y Horwich, A.L. (1990) Tite murochondrial chaperonin hspO is
requiredfor Us own assemnbly Nature 348:455-458.
87
Cheng, M.Y., Hart, F.LJ., Martin, J, Poliock, R.A., Kalousek, E., Neupert, W.,
Hallberg, E.M., Hallberg, R.L. y Horwich, A.L. (1989) Mitochondrial hea-shac/c
protein hspdo is essen:ial for assembly of proeins imponed tao yeast mitochomiria Nature
332:620-625.
Ch ang, H.L., Terlecky, S.L. Piant, C.P. y Dice, J.F. (1989) A Role for a 70-
Kl/ada/ion leal Schock Prasein in L ysososmat Degnadation of Iniracellular Pro:eins Science
24fr382-385.
Chineo, W.J., Waters, C. y Blobel, C. (1988) 70K heai shock related proteins siimulate
protein ransiocatian bao ,nicrosomes Nature332:805-810.
Chnistiansen, E.N. y Kuamnia, E. (1969) Rifecis of termal ineatment oit iuitochondria. ram,
v er ant! ascites ce/ls Acta Physlol.Scand. 2~:472-484.
Clarke, CF., Cheng, K., Frey, A.B., Stein, R., H nds, P.W. y Levine, A.i. (1988)
Purjficauion of comp/eres of nuclear oncogene p
53 wih rar ant! Esciterichia cali heal shock
proeins: in v itro dissociation of hsclo ami dnaKfrom murine p53 by A?! Mol.Cell.Biol.
H: 1206-1215.
Conlin, C.A. y Miller, C.C. (1992> Cloning ini! nucleotide sequence of opdA, tite gene
encoding oligopephdase A iii Sa/monet/a typhimurium J.Bacten ol. 124:1631-1640.
Connolly, T. y Cilmore, R. (1989) Tite signal recognition paniicle receptar mediates he O?!-
dependent displacemen ofSR! ftom ihe signal sequence of tite nascenipolypeptde Ccli 2:599-
610.
Copeland, C.S, Donis, R.W., Bolzan, E.M~ Webster, RC. y Helenius, A. (1986)
Assembly of influenza hemagglutinin tnimers ami iis role in inirace/lulan iransponi J.CcIl
Biol. 12:1179-1191.
Craig, EA. (1985) Tite heat-shock response CRC Cnltitev.Biochem. 1t239-280.
Cralg, LA. y Gross, CA. (1991> Is hsp7o he ce//iJar ihenmometer? Trends Biochem.Sci.
1:135-140.
Craig, KA., (ranier, 3. y (osie Smithers, 3. (1987) SSCJ, a member of tite 70-Ata heat
shock protein nultigene family of Saccharomyces cenev isiae, is essenhal for gnowih
Proc.Natl.Acad.Scl.USA 84:4156-4160.
Craig, EA., (ranier, 1., ShIliing, J~, Washburne, M.W., Holmes, 5., Sndthers,
3M. y Nicolet, C.M. (1989> SSCI, an Essential me nber of he Yeas HSP7O Multigene
Family, Encades a Mitochondrial Protein MoI.Cell.Biol. 2:3000-3008.
Creighton, T.E. (1996) Protein folding Biochemj. 22fr1-16.
Cress, A-E., Culver, P.S, Moon, T.E. y Cerner, E.W. (1982> Correla:ion between
anwunrs of ce/luan membrane componens ant! sensiv iry lo hypenhermia iii a v ariety of
mnammau an cdl mes in culture Cancer Res. 42:1716-1721.
Crooke, E. y Wickner, W. (1987) Trigger factor: a soluble protein thai fo/it pro-OmpA into a
membrane-assembly-compeent fon ProtNatLAcad.ScI.USA 84:5216-5220.
Cross, R.L. (1981> Tite mechanism ant! regutarion of ATP synthesis y FI -A TPases
Annu.Rev.Bochem. 5Q:681-714.
Cross, LL. y Naln, CM. (1982) Adenine nucleotide binding sites on beef hear FI-ATPase.
Ev idence for fliree excitangeable sites bar are disUnct fnom titree noncataly:ic sites
J.Biol.Chem. 252:2874-81.
Csenmely, P. y Kahn, CR. (1991) Tite 90-Ata hea: shock prowin ( sp-90) possesses an A?!>
binding site md auophosphorylating ac:iv ity LBiol.Cheni. 2~:4943-4950.
Cyr, D.M. y Douglas, M,C. (1991) Early ev en:s in he transpon: of proteins mio mitocitondria.
Impon competition by a mitochonnial presequence J.Biol.Chem. 2&21700-21 708.
Cyr, D.M, Lun, X y Douglas, M.G. (1992) Reguiation of sp70 funetion y a eukaryotc dnai
homolog .1.Biol.Cheni. 2~2:20927-20931.
Dahnan, F.C., Bresnick, E.H, Patel, P.D, Perdew, G.H, Watson, S.J.J. y Pratt,
W.B. (1989) Direc ev idence thai tite glucoconticoid receptan ms to hsp9O at or nean tite
termination of receptor transation in v itro I.Biol.Chem. 2g4: 19815-19821.
Dame, J.B. y Scarhorough, C.A. (1981) Ident icauion of tite phosphorylated intermediate of tite
Neurospona plasma membrane 11+-ATPase as /3-aspany/ pitospitate JBioLChem. 25~: 10724-
10730.
88
Danleis, C.J., Cupta, R. y Doolittle, W.F. (1985) Transcription and excision of a large
inron in e RNA Trp gene of arz archaebacerium, Halo acterium v olcanui J.Biol.Cheni.
20:3 132-3 134.
del Valle, R, Soto, U, Necochea, C. y Leighton, F. (1988) Detection of arz ATPase
activ ity in rat liv er peroxisomes B ochentfliophys.Res.Cornmun. flfi: 1353-1359.
DeLuca Fiaherty, C., McKay, D.B, Parham, P. y Hill, B.L. (1990) Uncaaring protein
(hsc7o) bint!s a conformaionally labile domain of clatitrin ligh: chain L Ca to siimulate A?!>
hydrolysis Cdl ~2:875-887.
Denda, It, Konishi, 3., Hajiro, K., Oshima, T., Date, T. y Yoshida, M. (1990)
Siructure of an ATPase operon of an acidothermophilic archaebacteriuni, Sulfolobus
acidocaldarius J.Biol.Chem. 2~:21509-21513.
Deshales, RJ., Koch, B.D., Washburne, MW., Cra g, E.A. y Schekman, 11. (1988)
A subfamilyof stress prateins facilitates translocauion of secretory and mitochondrial precursor
polypeptides Nature 332:800-805.
Dickerson, R.E. (1980) Ev olution ami gene transfer iii purple photosyntheiic bacteria Nature
283:210-212.
D lworth, SM. y D ngwall, C. (1988) Chromain assembly in v itro and in v iv o Bioessays
2:44-49.
Domen-, A..>., Bole, DC. y Kaufman, RJ. (1987) Tite relaiionship of N-/inked g/ycosylaion
ant! heav y chain-binding protein association with tite secrelion of g/ycoproteins ,LCell RbI.
iD5:2665-2674.
Douuna, A.C, Veenhuis, M., Waterham, H.R. y harder, W. (1996) Immunocytochemical
deternuinaion ofhe peroxisomal ATPase ofyeasis Yeast6:45-51 -
Drumniond, LA., McClure, S.A~ Poenie, M., Tsien, LV. y Steinhardt, ItA.
(1986) L arge changes in iniracellular pH ami calcium obsened during heat shock are not
responsible for tite inductian of ea shock proteins in Drosopitila me/anogaster
MoI.CelI,Biol. fr:1 767-1775.
Dschida, WJ. y Bowman, BJ. (1992) Siructure of he v acuolar ATPase from Neuraspora crassa
os determined by e/ecu-oit microscopy I.Blol.Chem. 262:18783-18789.
Duncan, T.M., Parsonage, D. y Senior, A.E. (1986) Structure of he nucleotide-binding
domain in he J3-subunut of Escherichia cali FI-A TPase FEBS Lett. 208:1-6.
Dunn, S.D. (1980) A?!> causes a large change in he conformation of tite isolated a subuni of
Escl erichia coli FI ATPase JBioLChem.25~:11857-11860.
Dupont, Y. (1976) Fluorescence sudies of tite sarcop/asmic reticulum ca/cium pump
BiocheniBiophys.Res.Commun. 21:544-546.
Eamnshaw, W.C, Honda, B.M, Laskey, R.A. y Thomas, 3.0. (1980) Assembly of
nuc/eosomes: tite reacrion inv olv ingXJaev is nucleoplasmin Cdl 21:373-383.
Edlngton, BN, Whelan, &A. y Hightower, L.E. (1989) inhibition of heai shock (sress)
protein induction y deuerium oxide ant! glycerol: additional supporifor he abnormal protein
itypothesis of induction J.Cell Physiol. lfl:219-228.
Eilers, M. y Schatz, C. (1986) Binding of a spec(fic ligan inhibits import of a purijed precursor
protein mio mitachondria Nature 322:228-232.
Ellis, RJ. (1979) Tite nos abumianz~ protein in he world Trends Biochem.Sci. 4:241-244.
Ellis, RJ. (1987) Proreins as molecular chaperones Nature 32a:378-379.
Ellis, 11.3. (1996) Tize molecular clzoperone concept Sem.Cell Iliol. 1:1-9.
Ellis, 11.3. y van der Vies, SM. (1991) Molecular chape rones AnnuRevBiochem.
6Q:321-347.
Emr, D, Vassarotti, A., Garrett, ., Cellen-, B.L., Takeda, M. y Douglas, MIL
(1986) The amino terminus of he yeast FJ-ATPase f3-subuni: precursor functions os a
mutachondrial impon signal J.Cell Biol. 102:523-533.
Engman, WM., lCfrchhoff, L.V. y Donelson, I.E. (1989) Molecular cloning of mtp7o. a
mirochondrial member of ihe hsp7ofamuly Mol.Cell.BioI. 2:5163-5168.
Escribano, 3. y Rozengurt. E. (1988) Cyclic AM!> increasing agents rapidly stimulate v imentin
phosphorylation in quiescen cultures of Swiss 3T3 ce/ls J.Cell Physiol. 132:223-234.
89
Fayet, O., Louarn, J.M. y Ceorgopoulos, C. (1986) Suppression of tite Escizerichia cali
dnaA4 mutation y amp/zfication afilie groES ant! groEL genes MoLGen.Cenet. 2D2
t:435-
445-
Fayet, O., Ziegelhoffer, T. y Ceorgopoulos, C. (1989) Tite groES ant! groEL tea: shock
gene produc:s of Escitericitia ccli are essentia/ for acterial growth al ol temperatures
J.Bacteriol. 12.1:1379-1385.
FIndIy, R.C~ ClUbes, RJ. y Sbulman, R.C. (1983) Itt v iv o phosphorus-3 nuclear
rnagnetic resonance rev eals /owered A?!> during heat shock of Tetrahymena Science 212:1223-
1225.
Fisher, M.T. (1992) Promotion of ihe in v itro renaturation of dodecameric g/uamine synhe ase
ftom Esciterichia co/i in tite presence of GroEL (chaperonin-60) ami A?!> Biochendstry
31:3955-3963.
Flaherty, K.M.., Flaherty, Ci. y McCay, O.K (1990) Three-dimensianal sructure of he
ATPasefragmen of a 10khea-shnck cagnateprotein Nature 346:623-628.
Flajnlk, Mi?., Cane, C, Ku-amer, 1 y Kasahara, M. (1991) Which carne firs, MHC
c/ass or c/ass II? Immunogenetcs 31295-300 -
Fiynn, CC., Chappell, TG. y Rothman, J.E. (1989) Peptide binding ant! release by
pra:eins imp/icated os cata/ysts of pratein assemb/y Science 245:385-390.
Flynn, (LC., Poh, 3., Fbocco, MS. y Rothman, 1-E. (1991) Peptide-binding specificiy
ofhe mo/ecu/ar chaperone lid Nature 353:726-730.
Fox, G.E., Stackehrandt, E., Hespeil, LB., Cibson, 3., Maniioff, 3., Dyer, TA.,
Wolfe, 11.S., Bakh, W.E, Tanner, 11.5., Magrum, Li., Zablen, LB,
Blakemore, R., Cupta, R, Bonen, L, Lewis, B.J., Stahl, D.A., Luehrsen,
(.11., Chen, KN. y Woese, C.R. (1980) The phy/ogeny of prokaryoies Science
202:457-63.
Freitag, II., Janes, M. y Neupert, W. (1982) Riasynthesis of mitochandrial porin ant!
insertion mio tite auter mitacitondria/ membrane of Neurospora crassa Eur.3.Biochem.
126:197-202.
Fried, P, Bienhaus, lt, Hoppe, 3. y Schairer, HU. (1981) T it e
dicyclohexy/carbodiim de- inding protein cofA?!> iynhasefrom Eseherichia co/jis no: sujficieni
o express arz efficient 11+ conduction Proc.NatLAcad.Sc.USA2S~6643-6646.
Friedman, 0.1., Olson, E.R, Ceorgopoulos, C., Tilly, U, Herskowitz, 1. y
Banuett, F. (1984) neract ons of bacteriapitage ant! host macromo/ecules in tite growth of
bacteriopitage /am da Microbiol.Rev. 48:299-325.
Frydman, J~, N mmesgern, E., Erdjument-Bromage, H, Walt, 1.5., Tempst, P. y
Hartl, F.U. (1992) Funcion in protein folding of TRjC, a cytosolic ring comp/ex contain ng
TCP-I ami strucurally re/ated subanis EMBO1- 11:4767-4778.
Fu, W., lapa, 5. y Beattle, D.S. (1990) Import of tite iran-sa/fur protein of tite cytochrome
b.cl comp/ex mo yeast mitocitondria J.Biol.Chem. 265: 16541-16547.
Furst, It y Solioz, M. (1985) Formation of a fi-asparryl phosphate incermediate y he v anadate-
sensitiv e A7Pase of Sireptococcusfaeca/is LBioLChem. 260:50-52.
Futal, M., Kanazawa, II., Takeda, K. y Kagawa, Y. (1980) Re cons lUnion of ATPase
from he iso/ated subunjis of coup/ ng factor FI s of Escherich a co/ ami thermophi/ic octerizan
PSS Biocheun.BbopbysResComniun. 9fi:221-34.
Futal, M., Naunil, T. y Maeda, M. (1989> A?! synihase (11+-A TPase): resu/ts by combined
biochemical ami molecular biological appraaches Anrn .RevBiochem. 5!:111-36.
Gaitinaris, CA., Papavassil ou, A.C, Rubock, P., Slverstein, S.J. y Cottesman,
ME. (1990) Reconsjiution of denotured lambda repressor requi res heat shock proteins Cel
61:1013-1020. (Abslrac)
Gamer, 3., Bujard, H. y Bukau, B. (1992) Physical inieraction between heal shock proteins
i)naK, Dna.I, ami OrpE ami tite bacteria! ea: shock :ranscripionfactor sigma 32 Cdl 62:833-
842.
Cao, Y., Thomas, J.O., Chow, itt., Lee, G-H. y Cowan, N.J. (1992) A Cytoplasmic
Citaperonin That Ca:alyzes f3-Ac:in Fold ng Cdl 62:1043-1050.
90
Carboczi, D.N., Fox, AM., Gerring, S.L. y Pedersen, P.L. (1988) Tite /3 subuni of ra:
liv er mi tochondria/ ATt> synuitase: cDNA cloning, amino cid sequence, expression inEscitericitia
cot, ami siructural retaionsitip a adenylate kinase Biochemistry 22:553-560.
Garin, 1, Boulay, F., Issartel, LP., Lunardi, t y Vignais, P.V. (1986) den:ification
ofamino acid residues pitotolobe//ed with 2-azidola-32!J adenosine triphospha:e in tite /3 subunit of
eefheart mitochondrial AT!>ase Biochendstry 25:4431-4437.
Casser, S.M. y Sehatz, G. (1983) mport of praeins mio mitochondria. ti v itro siudies on tite
biogenesis afilie auter membrane J.BboI.Chem. 25~:3427-3430.
Ceorgopaulos, C. (1992) Tite emergence of chaperone machines Trends BiochemSci.
11:295-299.
Georgopoulos, CP., Ang, O., Liberek, K. y Zylc, M. (1990) Properties of tite
Esciterichia cali lea: shock proteins ni! Titeir Role in Bacteriopizage L ambda Growth. En:
Stress Proteins In Biology and Medicine PP 191-221 (Morimoto, R.I, Tissi&es. A. y
Georgopaulos, C. ed&) CadSprng Harbaur Laboratory Press, New York.
Ceorgoponlos, CP., Hendrx, R.W., Casjens, Sil. y Kaiser, A-O. (1973) Ho st
participation in bacteriaphage lambda head assembly LMoLBiol. 2:45-60.
Georgoponlos, C.P., Hendrix, ICW, Kaiser, A.D. y Wood, WB. (1972) Role of he
hast cel in bacteriopitage morpitogenesis: effects of a bacterial mutation on T4 head assemb/y
Nature New Biol. 232:38-41.
Ceth ng, MJ. (1991) Molecular chaperones: indiv idualisis or graupies? CurrOp n.CeII RbI.
3:610-614.
Ceth ng, M.L, McCanimon, K. y Sambrook, 1. (1986) Expression of wi/d-type ami mutan:
forms of influenza hemaggluiinin: he role affa/ding in intrace//u/ar transpon Ccli 46:939-950.
Ceth ng, MJ. y Sambrook, 3. (1992) Protein folding in tite ce/l Nature 355.:33-45.
Glass, 3.11., OeWltt, RG. y Cress, A-E. (1985) Rapid loss of stress fibers in Chinese
hamster ov ary ce/ls afler hyperthermia Cancer Res. 45:258-262.
Glick, 8.5., Brandt, A., Cunningham, K, Miller, S., Hailberg, RL. y Schatz, C.
(1992) Cytochrames cl ami b2 Are Sorted a he Intermembrane Space of Yeast Mitachandria
y a Stop-:ransfer Mechanism Ccli 62:809-822.
CoK, 8-A. y Coldberg, A.L. (1985) !>rot!uc:ion of a normal proteins in L ca/i stimulaes
:ranscrip:ian of ion ami oher iteat-shock genes Cell4J587-595.
GotTeau, A. y Slayman, C.W. (1981) The proon-ranslacating AT!>ase of he fungal plasma
membrane BiochimBiopbys.Acta ~32:197-223.
Cogarten, LP., Klbak, II., Oittrich, P., Taiz, L, Bowman, EJ., Bowman, ej.,
Manolson, M.F., Poole, R.J., Date, O., Oshima, T., (onish, 1., Denda, K. y
Yoshida, M. (1989) Ev otutian of tite v acuolar 11+-AT!>ase. Imp/icauions for tite origins of
eukaryoies Proc.NatLAcad.Sci.USA 8fr6661-6665.
Goldschm dt, 11. (1935) Gen und Ausseneigenschaf. 1. (Untersuchung an Drosopitila)
ZlnduktAbstammungs Vererbungsl. ~9.:38-131.
Coldstein, LL., Brown, M.S., Anderson, R.C., Russell, O.W. y Schneider, WJ.
(1985) Receptor-met!iaed endocytosis: cancepis emerging from tite L DL receptor system
AnnuRevCell Biol. 1:1-39.
Colouhinoff, P., Christeller, J.T., Catenby, A.A. y Lorimer, C.H. (1989)
Reconstitutionof activ e dimenc ribulose bisphasphate carboxy/asefroman unfo/ded grate t!epent!s
arz twa chaperonin prateins ni! Mg-A?!> Nature 342:884-889.
Golouhlnoff, 1., Catenhy, A.A. y Lorimer, C.H. (1989) GroE heat-sitock proteitis
promote assemb/y of foreign prakaryotic nibulose bispitospitate carboxy/ase oligomers in
Esciterichia cali Nature 332:44-47.
Cray, M.W. y Doolittle, W.F. (1982) Has tite endosymbiont hypothesis been prov en?
MicrobiokRev. l: 1-42
Cray, MW., Sankoff, O. y Cedergren, R.i. (1984) On tite ev o/utionary t!escen of
organisms ami argane/les: a global phylogeny asedana high/y conserv ed sructural core in small
su uni ribosamal RNA Nucleic Acids Res. 12:5837-5852.
Griveil, L.A. (1989) Nuc/eo-miochondria/ inerac:ions in yeast mitochondrial biogenesis
Eur.J,Biochem. T h2~: 477-93 .
91
Cu ard, B. (1985) Siruc:u re, expressian ant! regulation of a nuclear gene encoding a mitochondrial
protein: he yeasi L f +>-lactate cytochrame c redactase (cytachrorne 2) EMBOJ. 4:3265-3272.
Gupta, LS, (1990) Sequence ami structural homo/ogy beween a mause T-comp/ex protein TCP-I
ant! tite chaperaninfami/y of bacerial (GrOEL , 60-S Ata heas shock antigen) ami eukaryotic
prateitis Biochem.Int. 2Q:833-841.
Gupta, R.S, P cketts, DJ y Ahmad, 5. (1989) A nov el ubiquitaus pratein chaperonin
suppars tite ent!asymbioic arigin of mitochant!rion ant! plan ch/oroplas:
Biocheni.Biophys.Res.Commun. Th2:780-787.
Guthr e, B. y Wickner, W. (1990) Trigger factor depletion or ov erpraducion causes t!efectiv e cel
div ision but daes no b/ockprotein expon J.Bacterbol. 122:5555-5562.
Haas, IG. y Wabl, M. (1983) Jmmunoglobulin heav y chain bint!ing pratein Nature 3D:387-
389.
Haas, R.C. y Strauss, A.W. (1990) Separate nuclear genes encat!e sarcomere-specfic ant!
ubiquitaus human mitachondrial creatine kinase isoenzymes J.Biol,Cheni. 2~:692 1-6927.
Hallberg, RL, (1990) A mitochandrial chaperanin: geneiic, biachemical, ant! molecular
characterisics Sem.Cell Biol. 1:37 -45.
Hamajima, 5., Sakaguchi, M., Mihara, K, Ono, 5. y Sato, R. (1988) Botit amino- and
carboxy-erminal partiotis are requiredfar insertion of yeast parin mio tite auter mitochondrial
mem rane 1.Biochem. 104:362-367.
Harris, DA., Radda, C.K. y Siater, E.C. (1977) Tightly ouni! nucleatides of tite energy-
iranst!ucing ATPase, ant! iheir role in axidauiv e phosphoryl ilion. II? The beefheart mitochomirial
system Biochim.Bbophys.Acta 452:560-572.
Bar ls, lILA,, Rosing, 1~ Van de Stadt, R.J. y Siater, E.C. (1973) Tigiz: inding of
adenine nucleotides to beef-heari mitochondrial AT!>ase Biochim.B ophys.Acta 314:149-153.
Hart, E.U., Lecker, 5., Sehiehel, E., Hendrick, 3.1>. y W ckner, W. (1990) Tite
bint!ing cascade of SecB ta SecA ta SecY/E mediates preprotein :argeting to tite E. cali plasma
membrane Ccli 63169-279.
Hart, E.U., Martin, Y y Neupert, W. (1992) Protein fa/ding ti ihe cel: tite ro/e of molecular
chaperones hsp7o ant! hspo Annu.Rev.Bbophys.Bbomol.Struct. 21:293-322.
art!, E.U. y Neupert, W. (1990) Pratein sorting to mitochondria: ev alutionary conserv atians of
falt!ing ant! assembly Sc ence 242:930.938.
Hart, E.U., Ostcrmann, 1., Gulard, B. y Neupert, W. (1987) Succesgiv e transacation
ma ami aul of tite mitochondrial marix: targeting ofprateins to tite intermembrane space by a
bipartite signalpeptide Ccli 51:1027-1037.
Harl, E.U., Schmidt, E., Wachter, E., Weiss, U. y Neuper, W. (1986> Transpart mio
miioclzont!ria ami intramitochondria/ soring of he FeIS protein of ubiquinol-cy:ochrome c
redactase Ccli 42:939-951.
Hartinan, 0.3., Dongan, 0., Hoogenraad, N.J. y Hoj, P.B. (1992) Hea shock proteins of
arley mitocliamiria ami ch/oroplas:s. Iden~fcatian of organellar hsp 10 ant! 12: puta uv e
citaperonin 10 homologues FEES Len. 205:147-150.
Hartman, 0.3., Hoogenraad, NS., Condron, R. y Hoj, P.B. (1992) It!entzfication of a
mammalian 10-Ata heat shock pratein, a mitachomirial citaperonin 10 homologue essential for
assistet! fo/t!ing of rimeric ornititine transcarbamoylase ti v itra Proc.NatI.Acad.Sci.USA
a2:3394-3398.
liase, T., Muller, U., Rieznian, U. y Schatz, G. (1984) A 70-lcd protein of tite yeasi
mitocitondrial auter inembrane is targeted ami anchored v io jis extreme amino terminus EMBO
1.3:3157-3164.
fiase, T., Rieznian, H., Sida, K. y Schatz, G. (1983) Impon of proteitis tilo mtochondria:
nucleoilde sequence afiliegenefara 70lcd protein of tite yeas: mitocitomirial auter membrane
EMBO 1.2:2169-2172.
Hatefi, Y. (1985) Tite mitachondrial electron iranspor: ami oxidativ e phosphorylaion system
Annu.Rev.Biochem. 54:1015-69.
Hawlitschek, C., Schneider, fi., Schmdt, E., Tropschug, M., Hart, E.U. y Neupert,
W. (1988) Mitochondrial protein impon: identijication ofprocessing peptidase ami of PE!, a
processing enhancing pratein Cdl 2:795-806.
92
Reine, U,, Sverak, L., Kondrat ck, J. y Bonar, R.A. (1971) Tize behav ior of HeL a-S3
ce/ls under the iniluence ofsupranormal temperatures I.Ultrastruct.Res. 34:375-396.
Hemmingsen, S.M. y Ells, 3. (1986) !>urfication ami properties of ribu/osebisphosphate
car oxylase large subunit bint!ing protein Piant Phys oI. Bfl:269-276.
Hemmingsen, SM, Wooiford, C., van der Vies, S.M., ThIy, K., Dennis, D.T.,
Georgopaulos, CP., Hendrix, RW. y Ellis, R.J. (1988) Hamolagous p/ant and
bacteralprateins chaperone otigameric pratein assembty Nature 333:330-334.
Hendrick, 1.1>., Hodges, P.E. y Rosenberg, LE. (1989) Su rv ey of amino-terminal
proeolyic cleav age sites ti mitochondrial precursor prateins: leader peptides c/eav et! y twa
masrix proteases sitare a bree-amino acid motif Proc.NatLAcad,Sc .USA B~:4056-4060.
Hendrmx, R,W. (1979) Purfication ami properties of groE, a has: pratein inv o/v et! in bacteriapitage
assem /y J.Mol.B ol. 129375-92.
H ghtower, L.E. (1980) Cultured animal ce/ls expased o amino cii! analogues ar puromycin
rapit!/y synhesize sev eral polypeptides i.CeIl Physioi. 102:407-427.
Mines, V., Brandt, A., Cr ffiths, O., Horstmann, il., Brutsch, U. y Schatz, 6.
(1990) Protein import mio yeast mitochandria is acce/eratet! y ihe auter membrane protein
MAS7O EMBO 3.90191-3200.
Hocking, S.M. y Egan, J.B. (1982) Genetic stut!ies of co/ipitage 186. L Genes asgociated wi:h
phage morphogenesis I.Virol. 44:1056-1067.
Hollemans, M., Runswlck, M.3., Fearnley, I.M. y Waiker, LE. (1983) The sites of
tabeling ofhe /3-subun: of av ine mochandrial FI-ATpase with 8-azido-ATP J.Biol,Chem,
258:9307-93 13.
Hoimgren, A. y Branden, C.I. (1989) Crystal structure of chaperone protein !>apD rev eals an
intmunoglabulinfold [see comments7 Nature 342:248-251.
Horwich, A.L., Kalousek, E., Mellman, 1. y Rosenberg, L.E. (1985) A leader peptide is
suificien: ta direc mitochondrial imponof a chimeric protein EMBO3.4:1129-1135.
Horwitz, 1 (1992) a-crysa/lin can function as a molecular chaperon Proc.Natl,Acad.Sci.USA
82: 10449-10453.
Hoyt, DW., Cyr, WM., Gierasch, L.M. y Douglas, MilL (1991) Interaction of peptit!es
carresponding o mitochondrial presequences wi:h membranes I.Biol.Chem. 26:21693-21699.
[ su, S.Y., Senda, M., Kanazawa, fi., Tsuchiya, T. y Futal, M. (1984) Comparison of
FI s of axidativ e phosphorylatian from Esciterichia cali ant! Sa/monella yphimurium ami
demonstratian of interchangeability of titeir subunits Biochemistry 23:988-993.
Hultgren, S.J., Lindberg, E., Magnusson, 6., Kihlberg, 1., Tennent, J.M. y
Normark, 5. (1989) TIte PapO adhesin of uropafhogenic Esciterichia cot consains sepa rase
regionsfor receptor binding ni! for tite incorporation into he pilus Proc.Natl.AcadSci.USA
B:4357-4361.
Hurt, E.C., Coldschmidt Ciermont, M., Pesoid Hurt, B,, Rochaix, J.D. y Schatz, 6.
(1986) A mitochondrial presequence can transpon a chlaroplast-encot!et! protein into yeas:
mitochondria LBiol.Chem. 261:11440-11443.
Hurt, E.C., Muller, U. y Schatz, 6. (1985) The firs twe/v e amino acit!s of a yeas
mitochondrial auser membrane pratein can direc a nuclear-cocled cytochrame oxidase subunj a he
mitachondrial inner membrane EMBO 3. 4:3509-3518.
Hurt, E.C., Pesoid Hurt, B. y Schatz, C. (1984) Tite amino-terminal regan of an imparted
mitochont!rial precursor polypep:ide can direc cytoplasmic dihydrofo/ate ret!ucase ita the
mitochondrial matrix EMItO 3.3:3149-3156.
Hurt, E.C. y Schatz, 6. (1987) A cytosolic protein contains a cr-yptic mitochont!rial targeing
signal Nature 325:499-503.
Hurt, E.C. y van Loon, A.P.M.C. (1986) How praeins fint! mi:ochant!ria ni!
intramitochondrial campartments? Trends Biochem.Sci. 11:204-206.
Hurtley, S.M., Bole, DC., Hoover Litty, H., Helenius, A. y Copeland, C.S. (1989)
Interactions of mnisfolded influenza v irus hemagglutinin with imiing protein (Di!>) J.CeII
Rial. 1D821 17-2126.
Hurtley, S.M. y Helenius, A. (1989) Pratein oligomerization in he endap/asmic re:icu/um
Annu.Rev.Cell Biol. 5:277-307 -
93
Hutchinson, E,G., Ticheiaar, W,, Hofhaus, 6., Weiss, U. y Leonard, K.R. (1989)
Ii!ent4fication ant! e/ec:ron microscopicana/ysis ofa citaperonin aligomerfrom Neurospara crasga
mitochont!ria EMBO1.8:1485-1490.
wang, 5,37. y Schatz, 6. (1989) Translocation of prateitis across he mitochondrial inner
membrane, bu: not into the auter membrane, requires nucleaside tripitospitates in he matrix
Proc.Natl,Acad.Sci.USA 8:8432-8436.
ida, 1-1. y Vahara, 1. (1985) Yeas: ea: shock proein of Mr 48,000 is arz isoprotein of eno/ase
Nature 315:688-690.
lida, U, ida, U, y Yahara, L (1986) Heat shack induction of intranuclear actin rods in cu/turet!
mammalian ce/ls Exp.Cell Res, lg5:207-215.
Ikawa, 5. y Weinberg, R.A. (1992) An interaction between p2lras ami hea: shock protein
hspO, a chaperonin Proc.NatkAcad.SciAJSA Ba:2012-2016.
Imamoto, N., matsuoka, Y., Kurihara, T., Kohno, K., Miyagi, M, Sklyama, E.,
Okada, Y., Tsunasawa, 5. y Yoneda, Y. (1992) Antibot!ies against 70-kV itea: shock
cogitare protein inhibir medaiet! nuclear impon of karyophilic proteitis l.CeU Bbol. Ifl:1047-
1061.
haya, 6., Kalousek, E., Fenton, WA. y Rosenberg, L.E. (1991) Cleav age of precursors
by tite mitochondrial processing pepildase requires a compatible maure protein oran intermediase
octapeptide J,CelI Biol. jfl:65-76.
Isaya, C, Kalousek, F, y Rosenberg, L.E. (1992) Sequence analysis of ra: initochandrial
intermediate peptidase: Similarity a zinc meta//opeptidases ami :0 a putativ e yeast homologue
Proc.Natl.Acad.Sci.USA Bi-8317-8321.
Ishii, N., Taguchi, II., Sum, M. y Yoshida, M. (1992) Structure of hola-chaperonin
s:udiei! with e/edran microscopy. Oligomeric cpnl0 arz op oftwa layers of cpn6o rings with twa
stripes each FEBS Lett,292:169-174.
Jagendorf, A.T., McCarty, R.E. y Rohertson, D. (1991) Coupling factor camponents:
strucure ant! futiction. En: The Pbotosynthetic apparatus: molecular biology and
operation PP 225-254 (Bogorad, L. y Vasil, I.K. eds.> Academie Press, San Diego.
James, P., Maeda, M., Fischer, R., Vena, A.K., Krebs, J., Penniston, 3.37. y
Carafoli, E. (1988) Identification ami primary structure of a calmodulin int!ing domain of
tite Ca2+-AT!>ase of human erythrocyes J.Biol.Chem. 22:2905-2910.
Jenkins, A.J., March, J.B., Oliven, I.R. y Masters, M, (1986) A DNA fragment
containing he groE genes can suppress mutariotis in tite Escherichia cali dnaA gene
MoI.CenCenet. 202:446-454.
Jensen, RE. y Yaffe, Mi>. (1988) Impar: of proteins bito yeast mitochondria: tite nuclear
MAS2 gene encades a componen: of tite pracessing protease :hat is homologaus to tite MAS]-
encot!ed subunit EMBO 1.2:3863-3871.
lindel, 5., Dudani, A.K., Singh, B., harley, A.B. y Gupta, LS. (1989) !>rimary
structure of a human mitacitondrial pratein homologaus to the bacteria! ant!plaN chaperanitis ami
to tite 65-kiloi!alton nzycobac:eria/ antigen Mol.CelI.Biol. Q:2279-2283.
Johnson, R.B., Fearon, K., Mason, 1. y Jindal, 5. (1989) Cloning and characterization of
tite yeas citaperonin HSP6O gene Cene 84:295-302.
Iones, W.J., Nagle, DP.I. y Whitman, W,B. (1987) Metitanogetis ant! tite div ersi:y of
archaebacreria Microbioi.Rev. 51:135-77.
Kahsch, W., Mannherz, H,C., Suck, O, Pai, E.F. y Holmes, K.C. (1990) Atomic
strucure oftite actin:DNase1 comp/ex Nature 262:37-44.
Kaine, 11,1>., Gupta, U. y Woese, Cii (1983) !>utativ e introtis ti tRNA genes of
prokaryotes Proc.Natl.AcadSci.USA 811:3309-3312.
Kalousek, E., Hendrick, .1.1> . y Rosenberg, LE. (1988) Twa mitochondrial matrix
proteases act sequentially ti he pracessing of manimalian matrix enzymes
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7536-7540.
Kalousek, E., Isaya, C. y Rosenherg, L,E. (1992) Ra: liv er inermet!iate peptidase (MI!>):
pur~fication ami inutial characterization EMBO3. 11:2803-2809.
Kanaseki, 37. y Kadota, K. (1969) The v esicle ti a baske:. A morpitolagical stut!y of tite coated
v esicle isolatedfrom tite nerv e endings afilie guinea pig brain, witit specia/ reference a tite
mechanism of membrane mav emens J,Cell Itiol. 42:202-220.
94
Kang, P-J., Ostermane, 3,, Shlling, 3., Neupert, W., Craig, E.A. y Pfanner, N.
(1990) Requiremen: for hsp7o in he mitochont!ria/ marix for transacation and folding of
,pecursarproreins Nature348:137-143.
Kaput, J., Goltz, 5, y Blobel, C. (1982) Nucleotide sequence of he yeast nuclear gene for
cy:oclzrame c peroxt!ase precursor. Futictianal implicatiotis of he pre sequence for pTotein
transpor: ita mitochondria LBiol.Cbem. 2521:15054-8.
Kassenbnock, C.K,, Garca, P.D., Walter, 1>. y Kelly, LB. (1988) Heav y-chain binding
pratein recognizes aberrantpalypeptides :rans/ocatet! ti v itra Nature 332:90-93.
Kassenbrock, CK. y Kelly, LB. (1989) Interactian of heav y chain binding protein
(Bi!>/GR!>78) wih adenine nucleotides EMItO 3. 8:1461-1467.
Kawakami, K., Noguch, 5., Noda, M., Takahashi, H., Ohta, T., Kawamura, M.,
Nojima, fi., Nagano, K., Hin-ose, T., Inayania, 5. y et al, (1985> Primary
structure of he a-su unu ofTorpedo californica < Na+ + K+>AT!>ase dei!ucet!fromcDNA sequence
Nature 316:733-736.
KeIIey, P.M. y Schlesinger, M.J. (1978) Tite effect of amino acM indagues ant! heat shock on
gene expressian hz chicken embryofibroblass Cel 15:1277-1286.
Keliey, W.L. y Ceorgopoulos, C. (1992) Chaperones ana pratein fo/t!ing CurrOpin.Ceil
Biol, 4:984-991.
Keng, 37,, Alan!, E. y Guarente, L. (1986) Tite une amino-terminal resit!ues of delta-
amino lev ulinoate syntitase t!irec: fi-galac:asit!ase mio tite mitochondrial matrix MoI.Cell,Itiol.
6:355-364.
Khananshivili, O. y Cromet-Elhanan, Z. (1984) Demonstration of twa imiing sites for Ab!>
an tite isa/caed fi-subunit of he Rhodospirillum rubrum RFOF-AT!> synitase FEBS Lett.
128:10-14.
K ehler, M., Pfaller, 11., Solner, 37., Cn tTiths, O., Honstuiano, fi., Pranner, N, y
Neupert, W. (1990) It!ent ficaian of a mitochandrial receptar comp/ex required lar
recognition ami membrane insenion afprecursorproeins Nature 348:610-616.
(ni, PS., Boje, O. y Arvan, 1>. (1992> Transien: Aggregation of Nascen: Thyroglobu/in in
tite Endoplasmic Reticuluniz Relaionship o tite Molecular Chaperone BiP J.Celi Biol.
118:541-549.
Kleiher, J., Kalousek, F., Swaroop, M. y Rosenbeng, L.E. (1990) Tize general
mitachondrial matrix processing pro:ease fram rol liv er: strucural characterizatian of tite catalytic
subunit Proc.Natl.AcatScl.USA 817978-7982.
Klingerberg, M. (1989) Molecular aspeas of (he adenine nucleotide carneT froni nziiochon4ha
Arch.Biochem.Biophys. 22Q: 1-14.
Koll, H., Guiard, B,, Rassow, 3.,
Mart!, E.U. (1992) > 4 ntifoli!ing
Mitocitondrial Marix wih Expon o
Ostermann, 3., Horwich, A.L., Neupent, W. y
Activ ity of itspo Cmipies Prote n Impon it/o he
the Intermembrane Space Ccli ~8:1163-1I75.
Kozutsumi, Y., Segal, M., Nornilngton, K., Gething, MJ. y Sambrook, 3. (1988)
Tite presence ofmalfoli!edpra:eins iii tite endoplasmic reticu/um signals tite induction ofglucose-
regulatedpratens Nature 332:462-464.
Kumamoto, CA. (1991) Molecular chaperones ami pratein tratis/acation across tite Esciterichia coil
inner membrane MoI.Microbiol. 5:19-22.
Kusukawa, N., Vura, 37., Ueguchi, C., Akiyama, Y. y Ito, K. (1989) Cifecs of
mutatiatis un itea-shock genes groEL arz protein expon in esclierichia cali EMItO 3. 8:3517-
3521.
Lamb, NJ., Fernandez, A., Feramnisco, J.R. y Welch, WJ, (1989> Modulatian of
v imentin conaining intermediase filament disributian ant! phosphorylaian in /iv ing flbroblasts
y tite cAM!>-depeni!en protein kinase J.Ceil Biol. 108:2409-2422.
Lamlnet, KA., Ziegelholfer, T., Georgopoulos, CP. y Pluckthvn, A. (1990) Th e
Escitericitia cali tea: shock prot~eins GroE ami GroES modulate he falding of :he f3-lactanzose
precursor EMMO 3.2:2315-2319.
Landry, SJ. y Cierasch, L.M. (1991) Recognution of nascen polypepht!es for targeting ami
falding Trends B ochein.Sci. 16:159-163.
Landry, Sj. y Cierasch, L.M. (1991) Tite citaperonin GraEL binds a polypeptide in an a-itelical
conformation Biochemistry 3Q:7359-7362.
95
Landry, 54., Jordan, R., McMacken, R. y Gierasch, L.M. (1992) Different
confarmationsfor he same palypep:it!e bound o chaperones DnaK ant! GroEL Natune 35.5:455-
457.
Langer, 37., Lu, C., Echois, fi., Fianagan, J, Rayen, M. y Hart, E.U. (1992)
Succesiv e action of DnaK, DnaJ ant! GraU long he patitway of chaperane-mediaet! protein
fo/ding Nature 35~:683-689.
Langen, 37., Pfeifer, G., Martin, .1, Baumeister, W. y Hart, E.U. (1992) Chaperon in-
mediared proteinfalt!ing: GroES binds o one en of he GraU cylinder, which accomodates he
protein su strate within 5 central cav iy EMIliO J. j:4757-4765.
Laskey, R.A., Honda, B.M., Milis, A.O. y Elnch, J.T. (1978) Nucleasomes are
assemblet! y an acit!ic prateinwhich tuis histones ami transfers :lzem to DNA Nature 225:416-
420.
Leckcr, S., LIII, E., Zegelhorfer, 37,, Ceorgoponlos, Ci., Bassfond, P.JJ.,
Kutnamoto, C.A. y Wlcknen, W. (1989) Titree pure citaperone proteitis of Esciterichia
cali--SecA, triggerfactor ami GroEL --form soluble comp/eres wih precursor proteins in v itro
EMBO 3. &:2703-2709.
Lee, A,S,, Bel!, J. y Ting, 1. (1984) Biocitemical characterizatian of tite 94- ant! 78-tilodalan
glucose-regulated prateitis ti itamsterfibroblasts J.Biol.Chem. 252:4616-4621.
Lee, C.K. y Hong, J. (1987> Enzyme reaction it a membrane cel couplet! with electropitotesis
Ann.N.YAcad.Sci. 5fl:499-510 -
Lee, .LH., Garbocz , D,N., Thomas, P.J. y Pedersen, PL, (1990) Mitachant!rial A?!>
synthase, cDNA cloning, amino acid sequence, ov erexpression ant! properties oflite ras liver a
subunit BioI.Chem. 26fr:4664.4669.
Lee, S.C. y Olins, .0, (1992) Effect of ov erpraductian of itea: shock chaperones GroESL ami
DnaK on human procollagenase productian it Escherichia cali i.BioI.Chem. 22:2849-2852.
Leenders, U..]?, Kemp, A, Koninkx, J.F. y Rosing, 3. (1974) Changes in ce//u lar ATt>,
AD!> ami AM! /ev elsfallowing treatments affecting cel/ular respiration ami he activ ity of cer-tain
nuclear genes ti Drosapitila saliv ay glanuis ExpCell Res. 86:25-30.
Lendre, B-D., Fankhauser, C., Baker, A- y Schatz, 0. (1989) The mitochondrial targeing
function ofrandomly generated peptide sequences corre/ates with pret!ictet! itelical amp/ziphilicty
J.Biol.Chem. 264:20206-20215.
Leustek, T., Dalle, Ji., Amir-Shapira, D., Brot, N- y Weissbach, U. (1989) A member
of he hsp7o family is localized it mitochondria ant! resembles esciterichia cali DnaK
Proc,Natl.AcadSci.USA 8:7805-7808.
Levinson, W., Oppenmann, U y Jackson, 1. (1980> Transitian series metals ant! sulfhydry/
reagents induce tite synthesis of faur prateins in eukaryotic ce/ls BiochimBiophys.Acta
Lewin, ItA, (1976) !rocitlorophy:a as a proposet! new div ision of algae Natune 261:697-698.
Lewis, V.A., Hynes, GM., Zheng, O., Saihil, U. y WIlllson, K. (1992) T-camplex
polypeptit!e-1 is a subunit of a heteromeric panicle it tite eukaryotic cytasol [see camments]
Nature 32:249-252.
Li, i.M. y Shore, C.C. (1992) Rev ersal of he orientation of arz integral protein of he
mitochanuirial auter membrane Science 256:1815-1817.
Libenek, K., Calitski, 37.1>., Zyl cz, M. y Ceorgopoulos, C. (1992) Tite DnaK
chaperone moi!u/ates the heat sitack response of Esciterichia cali y binding o tite sigma32
ranscripion factor Proc.Natl.Acad,Scl,USA BQ:3516-3520.
Liberek, K., Marszalek, 3., Ang, D. y Ceorgopoulos, C. (1991) Esciterichia cali DnaJ
ant! (irpE hea shock prateitis join:ly s:imula e ATPase activ iy of DnaK
Proc.NatLAcadSci.USASB~2874-2878.
LIII, R., Stuart, R.A., Onygas, M.E-, Nargang, E-E. y Neupert, W. (1992) Import of
cytochtome c heme lyase into mitochondria: a nov el pathway into tite intermembrarte space
EMBO J. 11:449-456,
Lindberg, F., Lund, B., Johansson, L. y Normark, 5. (1987) L oca/ization of tite receptor-
binding protein ai!hesin a: tite tip ofhe bacterial pilus Nature 328:84-87.
Lindquist, 5. (1986) Tite heat-shack response Annu.Rev.Bocbeni. 55J:1151-1191.
Lindquist, 5. y Craig, EA. (1988) Tite hea:-sitock prateins Annu.Rcv.Cenct.22s631-677.
96
Lissin, NM, Venyaminov, S.Y. y Girshovich, A.S. (1990) < Mg-AT!>)-dependeni self-
assem ly ofmolecular chaperone GroEL Nature 348:339-342.
Littlewood, 37,0., Hancock, D.C. y Evan, G.I. (1987) Characterizatian of a lien: sitock-
inducet! insoluble comp/ex in the nuclei of ce/ls J.Cell Sci. 88:65-72.
Liu, X., Freeman, K.B. y Shore, G,C. (1990) An amino-terminal signal sequence abrogates
tite intrinsic membrane-:argeing infarmation of mitochondrial uncoupling protein
J.BioI.Chem, 25:9-12.
Lubben, T.H., Donaldson, C.K., Viltanen, P,V. y Gatenby, A.A. (1989) Many, bu:
no al, proteitis imported into citlorop/asts farm s:able complexes witit tite GraEL -related
chloroplast molecular chaperane Plant Ccli 1:1223-1230.
Lubben, T.H., Catenby, A.A., Donaldson, G,K, Lonimer, C,H. y Viitanen, P.V.
(1990) dentfication of a groES-lilce chaperonin in mitochondria titatfacilitates proteinfali!ing
Proc.Natl.Acad.ScIUSA 82:7683-7687.
Luke, M.M-, Sutton, A. y Arndt, K.T. (1991) Characterization of SISJ, a Saccharomyces
cerev isiae homologue of acterial i!naiproteins J.Cell Biol. 114:623-638.
Maarse, A.C., van Loon, A.P., Rieznian, 11., Gregor, 1-, Schatz, C. y Cnivel, L.A.
(1984) Subunit IVofyeast cytochrome c oxidase: claning ami nucleotide sequencing oftite gene
ami partial amino cii! sequencitg of the maturepratein EMIBOJ. 3:2831-2837.
Macana, I.C. (1980) Vanad um an elemen: ti search of a role Trends Biochem.Sci. 5:92-94.
Maccecchini, M.L., Rudin, Y., Blobel, C. y Schatz, C. (1979) Impart of proteins inta
mitochandria: precursor forms of the extramitochondria/ly mat!e FI-ATPase subunits ti yeast
Proc.Natl.Acad.Scl.USA 2~:343-347.
MacLennan, 0.11,, BrandI, C.J., Konczak, B. y Creen, N.M, (1985) Amino-acid sequence
ofa Ca2+ + Mg2+-depeti!ent ATPasefrom rabbit muscle sarcap/asmic reticuluin, t!educet!from its
camplementary DNA sequence Nature 31fr696-700.
Magdolen, Y., Oechsnen, U. y Bandlow, W. (1987) Tite complete nucleoit!e sequence of tite
gene coi!ing for yeast at!enylate kinase Curr.Genet. 12:405-411.
Magun, B.E. y Fennie, C,W. (1981) Effects of hyperthermia on binding, internalization ant!
t!egrat!a:ian ofepidermal growth factor Radat.Res. B~:133-146.
Mahlke, K., Pfanner, N., Martin, 3, Horwich, A.L., Hart, F.U. y Neupert, W.
(1990) Soring paititways of mitocitondrial inner membrane proteitis Eur.J.Biochem.
192:551-555.
Mandel, M., Moriyama, Y., [ nimes, 3.0., Pan, Y.C., Nelson, fi. y Nelson, N.
(1988) cDNA sequence encat!ing tite 16-tiJa protealipit! of chromaffin granules implies gene
duplicatian ti he ev a/urjan of 11+-ATPases Proc.NatLAcad,Sci.USA 85:5521-5524.
Manning Knieg, U.C, Scherer, P.E. y Schatz, G. (1991) Se que tilia 1 action of
mitochondrial chaperones itiprotein impon mio tite matrL EMBO3~19:3273-3280.
Manshall, 3.5., DeRocher, A.E., Keegstra, K. y VierI ng, E. (1990) Identification of
heal shock protein itsp7o homologues ti citlorop/asts ProcNatl,Acad,Sci.USA 82:374-378.
Martel, R,, Cloney, L.P., Pelcher, L.E. y Hemmingsen, S.M. (1990) Un que
coitipasition ofplastit! chaperanin-60: a tui 3 polypeptide-encot!ing genes are higlly div ergen:
Gene 94:181-187.
Martin, 3., Langer, 37., Boteva, R., Schramel, A., Horwich, AL. y Hart, F.U.
(1991) Chaperonin-mediated proteinfalding a: the surface of groEL thraugh a mo/ten globule-
lite intermet!iate Nature 352:36-42.
Mayrand, 5. y Pederson, 37. (1983) Heat shack alters nuclear ribanucleaprotein assembly iii
Drosapitila cels Mol.CelLBiol. 3:161-171.
Mazzanella, R.A. y Creen, M. (1987) ERp99, an abundant canserv ed glycoprotein of tite
eni!oplasmic reticulum, is itomologaus to tite 90-Ata heat-shock protein (hsp9o) ni! tite glucose
regulatet! protein (grp94) J.Biol.Chem. 262:8875-8883.
McMull n, T.W. y Hallberg, R.L. (1987> A normal mitachondrial protein is selectiv ely
syn:hesizet! ami accumulated t!uring itea: shack ti Te:raitymena titermopitila Mol.Cell.Biol.
2:4414-4423.
MeMullin, T.W. y Hallberg, RL. (1988) A higitly ev alutionarily conserv et! mitocitandria/
protein is s:ruc:urally re/caed to rite protein enecuied y tite Escitericitia ccli groEL gene
MoI.CeIl.BioI. a:371-380.
97
Mehdi, S.Q., Recktenwaid, 04., Smith, L.M., Li, C.C,, Anmour, E.P, y Hahn,
C.M. (1984) Effect of hyperthermia on murine cel surface his:ocompa:ibiliy an:igens
Cancer Res. 44:3394-3397.
Mendoza, J.M., Rogers, E., Lorimen, C.H. y Horowitz, P.M. (1991) Chaperon ns
facilitate the ti v itro falding of monomeric mitachondrial ritodanase .LBioI.Chem, 25: 13044-
13049.
Mihara, K., Blohel, O. y Sato, 11. (1982) In v itro synthesis ni! integration ita mitochandria
ofporin, a majar protein of the auter mitachondrial membrane of Saccitaromyces cerev isiae
ProcNatl.Acad.Sci.USA 29fl102-7106.
Mitchell, 1>, (1974) A chen osmotic molecular mecitanism for pra:an-translocating at!enos ne
tripitaspitatases FEBS Lett. fl: 189-194.
Mitoma, J. y Ito, A. (1992) Mitochondrial largeting signal of rat liv er monoamine oxidase B is
located it its car axy terminus I.Bioehem. 111:20-24.
Miura, 5., Amaya, Y. y Moni, M. (1986) A metalloprotease irzv o/v et! ti tite process ng of
mitochont!rial precursor prateins BochentBiophys.Res.Cotnmun. 334:1151-1159.
Miura, 5., Moni, M. y Tatibana, M. (1983) Transpor of orn :hine carbamoylransferase
precursor mw mitochondria. Stimu/a:ion by potassium ion, magnesium ion, ami a ret culocyte
cytosolic pratein(s) J.Biol.Chem. 258:6671-6674.
Mizobata, 37., Akiyama, Y., Ito, K., Yumoto, N. y Kawata, Y. (1992) Effects of tite
chaperanin GroE arz tite refoli!ing of trypapitanase from Esciterichia coli J.Biol.Chem.
262: 17773-17779.
Mizzen, L.A., Chang, C., Carrels, 3.1. y Welch, W.J. (1989) It!entificaian,
characterization, ami pur~fication of twa mammalian stress proteins presnd in mitochondria, grp
75, a member of tite sp 70 family ant! hsp 58, a homalog of tite bacterial groEL pratein
J.Biol.Chem. 24.:20664-20675.
Mizzen, L.A., Kabiling, A.N. y Welcb, W.J. (1991) Tite twa mammalian mitocitandrial
stress proteins, grp7i atid hsps8, trar siently in:eract witit new/y synthesized mitocitant!ria/
proteitis Cel Regulation 2:165-179.
Moczko, M., Dietmeier, K., Stillner, 1., Segui, B., Steger, H.E., Neupent, W, y
Pfannen, N, (1992) Iden4ficaian of tite miochont!rial recpetor comp/ex in Saccitaronzyces
cerev isiae EEBS Lett. SiQ:265-268.
Morange, M., Din, A., Bemsaude, O. y Babinet, C. (1984) A/teret! express on of ea:
sitock proteitis ti embryanal carcinoma ami mause early embryonic ce/ls Mol.Cell.BioI.
4:730-735.
Monimoto, R.I. y Milarsk , K.L. (1990) Expressiorz ant! Function of Vertebrate sp 70 Genes.
En: Stress proteins iii Biology and Medicine PP 232-359 (Morimoto, Rl, Tissires,
A. y Georgopoulos, C. eds.) Coid Spring Harbour Laboratoz-y Press, New York.
Moriyama, Y y Nelson, N. (1987) Nucleatide b nding sites ni! chemical mot!ijicatian of e
ch ramaifin granule pratan AT!>ase J.Bbol.Chem. 262:14723-14729.
Moniyama, Y. y Nelson, N, (1988) Tite v acuolar 11+-AT!>ase, a protan pump conrollet! y a
sl p. En: The ion pumps, structure, funetion and regulation pp 387-394 (Ste n,
W.D. eds.) Alan R. Liss, NewYork.
Moniyama, Y. y Nelson, N. (1989) L ysosamal H+-ranslocatirzg AT!ase itas a similar subunit
struc:ure o chramaffin granule 11+-ATPase compex Biochim.Biophys.Acta 9~ft241-247.
Moriyama, Y. y Nelson, N. (1989) H+-translacating AT!>ase in Golgi apparatus.
Characterization as v acuolar H+-ATPase ami jis subunit structures J.BioLChem, 264:18445-
18450.
Moriyania, Y. y Nelson, N, (1989) Cad inactiv atian of v acuolar proton-ATPases
J.Biol.Chem. 264:3577-3582.
Mornison, 5.1. y Scharff, M.D. (1975) Heav y citain-producing v ariants of a mause myeloma
ce//lite Inimunol. 114:655-659.
Munro, 5, y Pelham, H.R. (1986) An Hsp7O-lite pratein in tite ER: ii!ettity witit tite 78 ti!
glucase-regulatet!prateit ami immunoglabulin iteav y chain binding protein Ccl! 46:291-300.
Murakami, 11, Blobel, O. y Pain, 0. (1990) Isolatian ant! characterization of tite gene for a
yeast tizitocitotidrial impofl receptar Nature341:488-491.
98
Murakami, fi., Pain, O. y Biohel, C. (1988) 70-lcD Heat-Shack-relaet! Protein is One of a:
leas: Twa Distinct Cytasolic Facors stimulating pratein Impon inta Mitochondria J.CelI
Biol. 1Q2:205/-2057.
Murakaini, K. y Moni, M, (1990) Pur4fied presequence bint!ng factor (PB!) forms ti import-
co npe:ent comp/ex wi:h a punfied mitachondnial precursor pralein EMBO .1. 2:3201-3208.
Murakami, U, Tanase, 5,, Monino, Y. y Moni, M. (1992) Presequence Bint!ing Factor
dependen: ni! -independen litipor of prateitis ma Mitachandnia J,BioI,Chem. 2L703 119-
13122.
Murakami, K., Tokunaga, E., Iwanaga, 5. y Moni, M. (1990) Presequence Does No:
rev en: Fo!ding of a Purified Miroc/ oni!ria! Precursor Procein ant! lx Essenha! for Associarian
wiit a Re:icu!ocyte L ysate J.Bioche n. 108:207-214.
Neidhart, J.E., Phlllips, ItA., van Bogelen, ItA., Smith, M.W., Geongals, ,Y. y
Subramanian, A,R. (1981) Identity of tite 856.2 protein, rite A-pratein, att! tite groE gene
produc: ofEsciterichia cali J.Bacteriol. flj513-520.
Nelson, L, Mandiyan, 5., Nonm, T., Moniyama, Y., Miedel, M.C. y Nelson, N.
(1990> Molecular cloning of ciJA/A encoding tite C subunit of H(+)-AT!>ase from bav ne
citromaifin granules LBiol.Chem. 265:20390-20393.
Nelson, N, (1989) Sructure, molecular geneics, ant! ev olution of v acuolar H+-ATPases
.1.Boenerg.Biomembn. 21:553-571.
Nelson, N. (1991) Siructure ami p)zarmacology of Uze pro:anAT!>ases Trends Pharnxacol.Sci.
12:71-75.
Nelson, N. (1992) Organellar pro on-ATPases Curr.Opin.Celi Bbol. 4:654-660.
Nelson, N. (1992) Ev olutian of organellar protonATIases Biochim.Bbophys.Acta liflQ:109-
124.
Nelson, N., Nelson, H. y Scbatz, C- (1980) Biosynhesis ami assembly of tite proan-
translocaing adenasine tripitaspliatase complexfram c laroplasts Pnoc.NatLAcad.ScLUSA
22:1361-1364.
Nelson, N, y Taiz, L. (1989) TIte ev a/talan of H+-AT!>ases Trends BiochemScij4:113-
116.
Nelson, RJ., Ziegelboffer, T., Nicolel, C., Werner-Washburne, M. y Craig, EA.
(1992) TIte transation machinery ini! 70 ki! heat shock profein coaperate it protein synshesis
Ccli 62:97-105.
Neumann, D-, Scharf, K.D, y Noven, L. (1984) Heat-s ock induced changes of pian: ce!!
ultrastrucure ant! autoradiograpitie loca/izazion of.zea:-slzock proteins EurJ.Celi Biol. 34:254-
264.
Nguyen, M, Bel!, A.W. y Shore, C.C. (1988) Protein sarting etween mitocitondrial
membranes speczfiet! y posizion of tite stoptransfer domain J.Cell Dial. IQfi: 1499-1505.
Nguyen, 37.11., Law, 0.37. y WiIliams, 0.13. (1991) Biuding protein Bit> is required for
tranglocatian ofsecretory prazeitis mo tite ent!aplasmic reticulum ti Saccharomyces cerev isiae
Proc,NatI.Acad.Sci.USA B&: 1565-1569.
Nicholson, DM., Hergensbeng, C. y Neupcrt, W. (1988) Role of cytachrome c heme fyase
in he import of cytocitrame c into mttachondria J?Biol.Chem. 26%19034-19042.
Nicholson, O.W., Stuart, R.A. y Neupert, W. (1989) Biagenesis of cytochrome cl. Role of
cytochrome cl ente lyase ami of he wo protealytic processing steps duning nipa rl into
mitochondria JBioiChem. 264:10156-10168.
Nishigaki, 1, Chen, F.T. y Uokin, LE. (1974) Studies on he characterization of he
sadium-poassium transpon at!enosine niphosphatase. XV. Direc chemical characterizationofhe
acyl phasphate in he enzyme as an asparyl 3-phosphae residue 3.Biol.Chem. 242:4911-4916.
Nolta, K.V., Padh, U y Steck, TL. (1991) Acit!asames fram Dictyaselium. Inutial
biachemical characterizarian JiBiol,Chegn. 2~:18318 18323.
Norgren, M., Nonmark, 5., Lark, 0., Ofianley, 1>., Schoolnik, C., Faikow, 5.,
Svanborg Eden, C., Baga, M. y Ublin, B-E. (1984) Mutatiotis ti E cali cistrons
affecting adhesion o human ce/ls do not abolish Pap pilifiberformation EMBO J. 1:1159-
1165.
99
Notanianni, E.L. y Preston, C.M. (1982) Activ ation of ce//ular stress protein genes y herpes
simp/ex v irus temperasure-sensiv e mutants witicit av erproi!uce immediate ear/y po!ypep:ides
Virology .1.2%! 13-22.
Noumi, 37., Maeda, MI. y Futai, M. (1988) A itamalagous sequence between H+-ATPase
< FO!)) ami catiorz-transporting AT!>ases. Titr-2&I---Asp replacemeta in tite / 3 su un : of
Escitericitia coli FI changes its catalytic properUes j.Bioi,Chem, 2~%8765-8770.
Noumi, 37., Mosher, M.E., naton, 5, Futal, M. y Kanazawa, fi. (1984> A
phenylalanbze far serme substitution ti tite / 3 subunit of Esciterichia coli Fi -ATpase affects
dependence of lis activ ty on div a/em catiotis J.Biol,Chem. 252:10071-10075.
OMm, M. y Schatz, 0. (1987) Protein impon ita yeast mitochondria is inhibited y antibodies
raisedagains45kdproeins oit/te auter mem rane EMBO J.:2109-2115.
Ohta., 5. y Schatz, 0. (1984) A purified precursor polypeptide requires a cytosolic prateinfractian
for import bao mi:achoni!ria EMBO J. 3:651-657.
Olden, K,, Pi-att, R.M. y Yamada, K.M. (1978) Role of carbohyt!rates it protein secretian
ant! turnov er: effecis of :unicamycin on tite majar ce!! surface glycopro:en of chick embryo
fi ro lasts Cel 13:461-473.
Ono, U. y Tuboi, 5. (1990) Purificaion ant! Identzficatian of a Cytasalic Factor Required for
Impon of Precursors of Milochondrial Profeins ita Mitochondria Arch.Biochem.Biophys.
2811:299-304.
Ostenmann, J., Horwich, A-L., Neupent, W, y Hart, E.U. (1989) Protein Fo/ding in
mitochondria requires comp/exfarmation wi:h hs$0 ni! A?)> hydrolysis Nature 341:125-130.
Ostenmann, 3,, Voos, W., Kang, -1., Craig, E.A., Neupert, W. y Pfanner, N.
(1990) Precursor proteitis itt transil itrough mitocitondria! contact sites interac witit itsp7o in
tite matrix FEBS L eU. 222:281-284.
Ou, W-J., Ito, A., Okazaki, fi. y Omura, 37. (1989) Purtfication ant! characterizatian of a
processingproteasefrom ras liv er mitacitondria EMMO.>- &:2605-2612.
Pain, O., Murakami, U. y Biobel, G. (1990> Identification of a receptar for protein tupan
inta mitochomiria Nature 342:4.44-449.
Paileros, IXR, Welch, WJ. y Fink, A.L. (1991) iteradion of hsp7O with unfolded
proteitis: Effects of teitiperature ant! nucleatides on t e tineics of binding
Pnoc.NatlAcad.ScLUSA B&:5719-5723.
Panclc, .0., Strotmann, fi. y Kowallik, K.V. (1991) Tite delta subunit of tite chlaraplast
ATPase is plas:id-eticot!ed it the diatam Odontella sinensis EEBS Lett. 2S11:387-392.
Parseil, O A- y Sauner, RS. (1989) Induction of a hea: sitoct!ike response y unfolded protein
ti Eschenichia ca U: dependence att protein lev el no: protein degradation Cenes Dcv. 1:1226-
1232.
Panil, O. y Tissieres, A. (1990) Dev elopmental expression of ihe heat shack genes in
Drosopitila melanagaster. En: Stress proteins in biology and medicine PP 361-378
(Morimoto, R.1, Tiss ~res, A. y Georgoponlos, C. eds.) Coid Spring Harbor Laboratory PTeSS,
NewYork.
edn-sen, P.L. y Canafoli, E. (1987) Ion motiv e ATPases. L U iquity, properties, ant!
signtficance ta cel funcion Tnends Biochem.Sci. 12: 146-150.
Pedersen, P.L. y Carafoli, E. (1987) Ion motiv e ATPases. IL Energy coupling ant! wort
output Trends Biochem.Scl. 1.2:186-189.
Pelhani, HR.E. (1984) IJsp
7O accelerates he recov ery of nuclealar morphology afler heal shock
EMItO 3. 1:3095-3100.
Peluso, RW., Lamb, R,A. y Choppin, P,W. (197$) Infection with paramyxav ruses
stimula:es synthesis ofcellularpolypeptides iha: are a/sa sti,nulased ti ce/ls tratisformed y Raus
sarcoma v irus or depriv ed of glucose Proc.NatI.Acad.Sci.USA2.5:6120-4.
Penefsky, LS. y Cross, lii. (1991) Structure ant! mechanism of FOFJ-:ype ATt> syntahses
ant! ATPases. En: Advances u enzymology amI related aneas of molecular
biology PP 173-214 (Meiscer, A. eda) JohnWiley &Sons, New York.
Peralta, 0., Hartman, 0.3., Mclntosh, A.M, Hoogenraad, NJ. y fioj, P.B. (1990)
ciJA/A ant! deduced amino acid sequence of no: liv er preitsp6o (citaperonin-60) Nucleic Acids
Res. 1&7162.
100
Penln, 11.5., Latchney, L.R, y Senior, A.E. (1985> Inhibitian of Escheric ia cali 11+-
ATPase y v enturicidin, aligomycin ami ossamycin Biochim.Biophys.Acta B02.:238-244.
fallen, R., Steger, ILE., Rassow, 3., Pfanner, N. y Neupent, W. (1988) Impar:
pa ways of precursor prateitis tito mitachandria: mu/tiple recpetar sites are fo//owed by a
ca>nmon membrane insertion site I.Cell Biol. 1021:2483-2490.
fanner, N., [ ant), E.U., Cuiard, Ji. y Neupent, W. (1987> MitocItont!ria) precursor
prateitis are imported hrough a /tydraphilic membrane env ironmen: EurJ.Biochem. .162:289-
293.
fanner, N., beben, 1>, Tnopschug, M. y Neupert, W. (1987) The carboxyl-erminal
:wo-:hirds of t e ADP/ATP carneT palypept de contaitis sufficiet: infannation to direct
sr nsloca:ion bao mitochandria J.BiotChem. 262:14851-14854.
fanner, N. y Weinzierl, A. (1992) Mechanisms of mitochondrial pratein impar:
Int.J,Biochem. 24:65-69.
Phclps, A,, Schobent, C.T. y Wohlrab, H, (1991) Cloning atid characterization of tite
mitochondrial pliaspitate transpon protein gene from tite yeast Saccharomyces cerev isiae
Biochemistry 3Q:248 252.
Philips, GJ. y Silhavy, 374. (1990) Heat-shock proeins DnaK ant! GraEL facilitate expon of
L acZhy r d proteitis it E.co!i Nature 344:882-884.
Pick, U. y Racker, E. (1979) Purificatian ant! recanstitution of tite N,N-
dicyclaitexylcarbodiimide-sensitiv e ATPase complex fram spinach chloroplasts< ,LBIoI.Chem.
254:2793-2799.
Picketts, D.J., Mayanil, C.S. y Gupta, R,S. (1989) Molecular cloning of a Chinese
hamster mitacitondrial protein re/atedio ihe chaperoninfamily of bacterial ant!plant prateitis
I.Jiiol.Chem. 254:12001-12008.
Pleet, It, Graham, J.MJ. y Smith, D.W. (1981) Central nerv aus system ami facial defects
asiociated wih maternal hypertitermia atfour ta 14 weeks gestation Pediatnics 62:785-789.
Poflock, R.A., fiart, E.U., Cheng, M.Y., Ostcrmanu, J., fiorwich, A. y Neupert,
W. (1988) Tite process ng peptidase of yeast mitochondria: the twa co-aperaring campo nents
MP!> ant! t>EJ-> are struaur lly related EMBOJ. 2:3493-3500.
Pouyssegur, J, Shiu, RA. y Pastan, L (1977) induction of two nansformaion-sensitiv e
membrane polypephi!es in normal ftbroblass by a block in glycaprotein synthesis or glucase
depriv ation Ccli 11:941-7.
rasad, T.K., Hack, E. y Hallberg, R.L. (1990) Function of 1/te maize mitochandrial
chaperonin hsp6o: specfic associafion beween hsp
60 ant! new/y synthesized FI-ATPase a
subunuts MoI.Cell.Bbol. 1.11:3979-3986.
rasad, T.K. y fiallherg, R,L . (1989) Identficaton and metabalic charactenization of tite Zea
mays mitacitondnial hoinolog of lie Eschenichia cali groEL protein Plant MoI.BioI. .12:609
618.
Pushkin, A.V., Tsuprun, V.L., Solovjeva, N.A., Shubin, VN., Evstignneva, Z,G.
y Knetovich, W.L. (1982) High molecular weight pea leaf protein similar ta (he GroE
pratein of Eschenichia cali Biochim.Blophys.Acta 204:379-384.
Randall, L.L. <1992) Peptide bini!ing by chaperoute SecB: implications for recognitian of nonnativ e
strucure Science 252:241-245.
Randall, S.K. y Shore, G.C. (1989) Impon of a mutan mitochandnial precursor fajs ta respotid
o stimu/a:ion y a cytosohc factor EEBS Lett. 2511:561-564.
Rapoport, 37, (1991) t>rotein transpon acnass ihe endoplasmic reticulum membrane:facts, models,
mys:eries FASEJi 3. .5:2792-2798.
Rassow, 3., Cuiand, W, Wienhues, U., Herzog, y, Hart, E.U. y Neupert, W.
(1989) Transacatian arnes by rev ersible foli!ing of a precursor pralein imported inta
mirochandria. A means a quanhate ransacation cantact sites J.Cell Biol. Ji: 1421-1428.
Rassow, 3. y Pfanner, N. (1991) Mitachani!nial prepnoteins en raute from tite auter membrane o
site mier mnetnbrane are exposed a tite intermemnbrane space FEBS Lett. 223:85-88.
Reading, 11.5., Hallberg, R,L. y Myers, A.M. (1989) Charactenizatian of ihe yeast HSP6O
gene codingfara mitachoni!rial assemblyfacan Nature 332:655-659.
10I
Red, G.A. y Schatz, C. (1982) Import of proteitis into mitochondria. Extramitachandral paols
ano pos:-transla:ional import of mitochondrial protein precursors iii v iv o J.BioLCbem.
252:13062-13067.
Reid, G.A. y Schatz, ti. (1982) Impon of pnoeins bito mitochondria. Yeast ce/ls gnown in he
presence of car onyl cyanide m-citlarapitenylhydrazone accumulate massiv e amaun:s of some
mitocltondrial precursor polypeptides J.Biol.Chem. 252:13056-13061
Ribes, y., Rdmisch, K~, Giner, A., Dobberstein, E, y Tollervey, D, (1990) E.coli
4.SS RNA is part ofa ribonucleoproteinparticle ha: has praperties related o signo! recognutian
particle Ccli g3591-600.
Richter, M.L., Cromel Elbanan, Z. y McCarty, R.E. (1986) Recons:jiutian of tite 11+-
ATPase comp/ex of Rhodospinillum rubrum y Ihe fi subunit afilie chioraplas coupling factor 1
J.Biol.Chem. 261:12109-12113.
Riezman, fi, Rase, 37., van Loon, A.P., Gnivel, L.A., Suda, K. y Schatz, O.
(1983) Impar: of proteitis jedo mitochondnia: a 70 ti/ada/tan auter memn rane pratein with a
large carboxy-serminal deleilon is still transparted to tite auter membrane EMBO 3. 2:2161 -
2168.
Rippmann, E., Taylor, W.R,, Rotbbard, J.B, y Creen, N.M. (1991) A ypathetical
model fon tite peptide inding domain of itsp7o based arz tite peptide inaing domain of liL A
EMItO 3. IQ:1053-1059.
Ritossa, E. (1962) A new puffing pattern induced y temperature shock ami DN!> in Drosopitila
Experientia .fl:57 1-573.
Rltossa, E. (1963) New puffs induced y semperau re shock~ DNP ami salicyla:e in saliv ary
cisromosames of me/anogaster Drosophila mf. Service 32.:122-123.
Ritossa, E, (1964) Experimental activ ation of specific /oci ti po/ytene citromasomes of
Drasopitila Exp.Cell Res. 3.5:602-607.
Robhins, A.R., Oliven, C,, Bateman, J.L., Knag, S.S., Galloway, C.J, y Meliman,
1. (1984) A single mulation it Chinese hatuster ov ary ce/ls impalis boh Ga/g and endosomal
functions J.CeIl Biol. 92:1296-1308.
Rodewald, E. y Knaehenbuhl, 3 .1> , (1984) Recepto r-mei!iatet! transpon of gO J.Cell Biol.
92:1 59s 1 Ms.
Roise, D., Honvatb, S.J., Tomich, i.M., Richards, 1.11. y Schatz, G. (1986) A
chemical/y synhesizedpre-sequence of it imponed mitochar dnial protein canforman mphiphilic
ite/ix ant!per:urb natural ami art ficialpitaspitalipid ilayers EMBOJ. .5:1327-1334.
Roise, D., Theiler, E., Horvath, S.J., Tomich, J.M, Richards, tU., Allison, D.S.
y Schatz, 0. (1988) Amphiphilicity is esgernial far mitacitandnial presequence futictian
EMBO 3.2:649-653.
Rose, D.W., Wettenhall, R.E,, KudIicki, W., Kramer, 0. y Hardcsty, B. (1987) Tite
90-ti/odaltonpeptide of tite heme-regulated eIF-2 a tinase has sequence similarity witit tite 90-
ti/ada/tan tea: sitack protein Biochemistry 26:6583-6587.
Rose, J.K. y Donis, R.W. (1988) Regu ion of protein expor: from tite etdop/asmic reflculum
Annu.RcvCell Biol, t257-88.
Rose, MD,, Misra, L.M. y Vogel, 1.1>. (1989) KAR2, a karyogamy gene, is tite yeast
homolog of he mamniahan BiP/GRP7S gene [publishederraum appears ti Ced 1989 Aug 25;
58< 4):fal/owing 801] Cdl 2:1211-1221.
Rothblatt, JA., Deshajes, R.J., Sandens, S.L., Daum, 0. y Schekman, 11. (1989)
Mu/tiple genes are required fon praper insertion of secretory proteins ino he endoplasntic
reiculum in yeast J,Cell Biol. 102:2641-2652.
Rothman, JE. (1989) Polypeptide Chain &nding Prole ms: caalyss of Pratein Folding ant! nelated
pracesses ti Ce/ls Ccli 52:591-601.
Rothman, J.E. y Schmid, S.L. (1986) Enzymatic recycling of clatitrin from coased v esicles
Ccli 4~:5-9.
Ruben, S,M., VanOenBnink Wehb, S.E., Rejo, D,C. y Meyer, R.R. (1988)
Suppressian of tite Eschenicitia cali ssb-1 mutatian y ti al/ele of groEL
Proc.Natl.Acad.Sc .USA 85:3767-3771.
102
Runswick, M.J., PoweIl, S.J., Nynen, 1>. y Walker, JE. (1987) Sequence of he av ine
mitachondrial phosphae carnierpratein: structural ne/atiotiship to ADt>/ATt> ratislocase ami he
brown fa: mitochondria uncauplitig prosein EMBO3 :1367-1373.
Sadis, 5. y Hightower, L,E. (1992) Unfolded praeins stimulae chaperane flsc7O ATPase by
accelera:ing AD!>/ATP excitange Biochemistry 31:9406-9412.
Sadis, 5., Raghavendra, K. y fiightower, L.E. (1990) Secont!ary S:ruaure of tite
Mammalian 70-Kiloi!alton Hea-Sitock Cagnate Pratein Arza/yzed y Circular Dichroism
speczroscopy ini! Secondary &ruaure Prediction Bochemistry 22:8199-8206.
Sadler, 1., Suda, U, Schatz, G~, Kaudewitz, E. y Haid, A. (1984) Sequencing of he
nuclear genefor tite yeast cytocitramecl precursor rev eals an unusua/ly complex amino-terminal
presequence EMBO1.3:2137-2143.
Snchez, EM., Toft, 0.0., Schlesinger, MJ. y Pnatt, W.B. (1985) Ev idence thai he
90-lcDa phosphoprotein assaciated wih tite untroasformed L -cell glucocoruicoid receptor is a
munine hea: shock pratein 1.Blol.Chem. 260:12398 12401.
Sandvig, K. y Olsnes, 5. (1980) Dipht enia oxin enry into ce/ls is facilitated y low pH
J.Cell Biol. 82:828-832.
Sanaste, M., Sihbald, P.R. y Wittinghofer, A (1990) Tite P-laap-a cammon motif in
ATt>- ami GT!>-binding proteitis Tnends Blochem.Sci. 15:430-434.
Scherer, P.E., Knieg, U.C,, [ wang, S.T,, Vestweber, O, y Schatz, 6. (1990) A
precursor pratein pan:ly transacated ma yeast mitachondnia is auno to a 70 lcd mnitochont!nial
stress protein EMMO 1.2:4315-4322.
Scherer, P.E., Manning Knieg, U.C., Jeno, 1>., Schatz, G. y Horst, M. (1992)
dentificatian of a 4S-kDa protein at he protein impor: site of t1w yeast mitachondnial inner
membrane Proc.NatLAcad.ScLUSA 82:11930-11934.
Schleyer, M. y Neupert, W. (1985) Transpon of prateitis into mitocitondria: ransacational
nuermedicaes spannng contad sites bnween auter asid inner ,nembranes CeIl 43:339-350.
Schmid, s.L., Jinael, W.A. y Rothman, 1.E. (1985) ATt> catalyzes ihe sequestration of
clathrin t!uning enzymadc uncaating .r.Biol.Chem. 2W:10057-10062.
Schmidt, M. y Buchner, 3. (1992) Interaction of GroE wit arz AII-13-Pratein J.Biol.Chem,
262:16829-16833.
Schniidt, W., Winklcr, H. y Plattner, H. (1982) Adrenal chramaffin grautules: ev idence fon an
ul:rastrucural equiv alen: of tite proton-pumping .4Tt>ase EurJ.Cell Bid. 22:96-104.
Schneider, E. y Altendorf, K. (1987) Bactenial adertasine S-riphosphare synhase (FJFO):
punificationant! reconstitution ofFO complexes ant! biochemical ant!funclional charaderization of
heir subunits Microbol.Rev. 51:477-97.
Schneider, 11., SiIner, T., Dietmeier, K., Eckerskorn, C., Lottspeich, F., Trlzsch,
E., Neupert, W. y Pfanner, It (1991) Targeing of Master receptar MOMJ9 to
Mitochominia Sciencc254:1659-1662.
Senda, M., Kanazawa, fi., Tsuchiya, T. y Euta , M. (1983) Confarmational changes of
tite a subunt ofEscitenichia cali Fi -ATPase: ATt> changes tite rypsin sensihiv iy of tite subunis
Arch.Biochem.Biophys. 2211:398-404.
Senior, A.E. (1991) Tite pro:on-rasnlocating ATt>Ase of Esciterichia cali
Annu.Rev.B ophys.Chem. 12:7-41.
Serrano, 14., KielIand Brandt, M.C. y Eink, C.R. (1986) Yeas plasma membrane ATPase
is esgential fon grow:h ami itas itomalogy with (Na+ + K+), K+- ami Ca2+-ATPases Nature
319:689-693.
Shaefer, &L., Monimoto, 14.1., Theodorakis, N.C. y Seidenfeld, J~ (1988) Chemical
speczfttyfon induction of stress response genes y DNA-damaging drugs in human adenocarcinoma
ce/ls Carcinogenesis 20733-1738.
Shenman, M,Y. y Coldberg, A.L. (1992) Heat shack ti Eschenichia cali alters he pratein-
bini!ing properties afilie chaperonin GroEL y inducing rs pitosphorylatian Nature 352:167-
169.
Shi, Y, y Thomas, 3.0. (1992) TIte transpor: of protein mio the nucleus requires he 70-
kilodalan ea: sitack protein or i:s cywsalic cognate Mol.CelI.BioI. 12:2186-2192.
ShuII, (LE., Schwantz, A. y Lingrel, J.B. (1985) Amino-acid sequence of tit.e caalyric
subunit of lite <Na+ + K+)ATPase deducedfrom a complementwy DNA Nature 316:691-695.
103
Silver, EM., Artzt, K. y Bennet, D. (1979) A majar testicular cel protein spec fied y a
mouse TI: comp/ex gene Ceil 12:275-284.
Skowyra, O., Ceorgopoulos, C.P. y Zylicz, M. (1990) Tite E.co/i dizaK Gene t>roduct. tite
hsp7o Homo/og, Can Reactiv ate Hea:-Znac:iv aed RNA polymerase in an ATt> Hydralysis-
Dependen: Manner Cel ~2:939-944.
Slonim, L.N., Pinker, J.S., Bnnaden, C-I. y fiultgren, S.J. (1992) Interactiv e surface in
tite PapD citaperore c/eft is canse rv ed itt pilus chaperone superfamily ni! essenuial itt subunu
recognitian ami assembly EMItO 1. .1.1:4747-4756.
Smagula, C. y Douglas, M.G. (1988) Mitochondnial sport of tite ADP/AT! carrier pratein ti
Saccitaromyces cerev isiae. Sequetices requiredfar receptor binding ant! membratie transacation
J.Biol.Chexn. 26%6783-6790.
Solner, 3 7 ., Pfallen, 14., Gnifflths, O., Pfanner, N. y Neupert, W. (1990) A
,nllochont!rial impon receptarfon se AD!>/AT!> camnier Ccli ~2:107-1 15.
Soliner, 37., Rassow, 3., Wledmann, M., Schlossmann, 1., Keil, P., Neupent, W y
Pfannen, Y. (1992) Mapping of tite protein impon machinery it tite mitochondrial auter
membrane y crasslinlcing of translocation intermediates Nature 35.5:84-87.
Siillner, 37,, Gnlftlths, G, Pfaller, R. y Neupert, W. (1989) MOMI9, an impar: receptar
fon mitachosidrial precursorproteitis Cdl 52:1061-1070.
Steger, H.F., Sollner, 37., Kiehler, M., Dietmeier, K.A., Pfaller, 14., Tnulzsch,
(.5., Tropschug, M., Neupent, W. y Pfanner, It (1990) Impon of ADP/ATP camnier
mio mitochondnia: twa receptors ac ita para/le J.Cefl Biol. 111:2353-2363.
Stevenson, M.A., Calderwood, 5.1<. y Hahn, G.M. (1986) Rapid increases in inosital
tnisp asphate ami intracellular Ca++ after heal shoclc Biochem.Biophys.Res.Commun.
.132:826-833.
Stiggall, O.L., Galante, Y.M. y Hatef, Y. (1978) Preparatian ami prapenties of art ATP-Pi
excitange comp/ex (complex V)from av ine heart mitoclaant!ria I.Biol.Chem. 22:956-64.
Stnaus, D., Walter, W. y Cross, C.A. (1990) DnaK, Dna), ami (irpE heat shack proteitis
negativ ely regulase seat shock gene expression by cantral/ing tite synthesis ant! sta ility ofsigma
32 Genes Dcv. 4:2202-2209.
Stuart, R.A. y Neupent, W. (1990) Apocyiochrame c: an exceptional mitochondrial precursor
protein using asa exceptianal impon pathway Biochimle 22:115-121.
Subjeck, 3.14. y Shyy, T.T. (1986) S:ress prateisis of mammalian ce/ls Am.j,Physiol.
12:250C1-C17.
Suissa, M. y Schatz, 0. (1982) Impon of prateizs ma mitochamiria. Transatable tuRNAs far
imported mitochondrial proteitis are presen infree os well os mitac/tondnia-baund cyioplasmic
palysames J.Biol.Chem 252:13048-13055.
Siidhof, T.C., Fnied, V.A., Stone, D.K., Jobnston, P.A. y Xie, X,-S. (1989) Human
endamembrate 11+ pump strongly resembles tite ATP-synthase of Archebacteria
Proc.Natl,Acad.Scl.IJSA S:6067-6071.
Siiss, K.-H. (1980) Identification of charaplas: thylacoid membrane polypepides. ATPase comp/ex
(CFi -CFO) ami light-harv esting chloropityll -protein (L HCP) comp/ex FEBS Lett. 1.12:255-
259.
Sztul, E.S., Biemesderfer, O., Caplan, Mi., Kashgarian, M. y Boyer, J.L. (1987)
L acalization of Na+,K+-ATt>ase asubunit (a tite sinusoidal md lateral bu: no: canalicular
membranes of rat hepaacyes J.CeII Iliol. .104:1239-1248.
Sztul, LS., Chu, 37,W., Strauss, A.W. y Rosenherg, L.E. (1988) Impon of tite malate
t!ehydrogenaseprecursor y mitochosidria~ Cleav age withiu leaderpeptide y ma:nix protease leads
lo formatian of intermediale-sizedform J.Biol.Chem. 2&3: 12085-12091.
Taguchi, 11., Konishi, .1., Ishii, Y. y Yoshlda, M. (1991) A c aperoniu from a
:hermophilic bacterium, Titermus :hemnwphilus, ha: cantrols refolt!ing of sev era1 thermopitilic
eszzymes .J.Biol.Chem. 2~:22411-22418.
Takeda, K., Hirano, M., Kanazawa, E., Nukiwa, Y., Kagawa, Y. y Eutai, M. (1982)
Hybnii! ATPases farmed from subunits of caupling factor FIs of Esciterichia cali ant!
thermoph lic bacienium t>SS J.Biochem. 91:695-701.
104
PEVISION BIBLIOGRFICA
Thomas, 43.1>., Welch, WJ., Mathews, M.B. y Feramisco, J.R. (1982) Molecular ant!
cellular effects of seat shaclc ami related treatmenis of mamma/ian tissue culture ce/ls Coid
Spnng fianhor Symp.Quant.Biol. 4:985-996.
Thorne, S.W., Newcomb, E.U. y Osn,ond, C.B. (1977) Identficahon of chlaraphyU it iii
exracs of prokaryaic algae byfluorescence spectroscopy Proc.Natl.Acad.Sci.USA 24:575-
578.
Tilly, K. y Georgopoulos, C. (1982) Ev idetace ca ihe twa Esciterichia cali groE
morphogenetic genepraducs ta:erac: in v iv o LBacteriol. iAQ:1082 1088.
Tol, L. y Howand, B.D. (1980) Ev idesice ita: si ATt>ase ami a protonmotiv e force function si
tite transpart of acetylcho/ine mio storage v esicles .iI.BioI.Cbem. 255; 1787-1789.
Trent, 1.0., Nimmesgenn, E., Wall, 3.5., Hart, E.U. y Horwich, A.L (1991) A
molecular chapeToneftom a hermophilie archaebacenium is relaxed w he euka.yohic protein 1-
comp/ex polypepide-1 Natune 354:490-493.
Ungewickell, E. (1985) TIte 70-Id mammalian seat shock proteins are struciural/y ami functionally
relared o he uncoating praein thai releases c!athnin from coatet! v esicles EMItO J. 4:3385-
3391.
Ursic, O. y Culbertson, M.R. (1991) Tite yeast /tomalag o mause Tcp-1 affects microtubule-
met!iatet! processes MoLCeltRiol. .11:2629-2640.
Vlcarce, C., Navanrete, R.M., Encabo, 1>., Loeches, E., Satrstegui, 1. y Cuezva,
J.M. (1988) Posauzl dev elapmesit of rau v er milochotadnial fundilans. Tite ra/es ofprotein
synhesis atad of adenine nucleatt!es J.Biol.Chem. 2~: 7 7 67 7 7 7 5.
van den Boogaart, 1>., Samallo, 1. y Agstenibhe, E. (1982) Similar genes far a
mitachondnial ATPase subusiut it tite nuclear ami miochondnial geutames ofNeurospora crassa
Nature 228:187-9.
van den Goot, F.G., Lakey, 1.11. y Pattus, E. (1992) Tite moleta globule intermediate far
pratein insertion or translocation titnough membranes Tnends Cel Biol. 2:343-348.
Van Dyk, T.K., Gatenhy, A.A. y LaRossa, R.A. (1989) Demanstration y genetic
suppressian of interacuian of GroEprot!ucts wiit many proteins Nature 242:451-453.
van Loon, AA., Brandli, A.W., Pesoid Hunt, Ji., Blank, O. y Schatz, (3. (1987)
Transpon ofprateins to he mitacitondnial intermembrane space: tite matnix-iargeting ami tite
soring damaitis ti lite cytacitrame cl presequence EMBO3 . :2433-2439.
van Loon, A.P. y Schatz, (3 . (1987) Trasisport of praeins o tite mitachondnial intermembrane
space: he saning damain ofhe cy:achrome cl presequence is a stap-trauisfer sequence specificfor
1w mitochondrial ter membrane EMBO J~:24412448.
Vassrotti, A., Chen, WJ., Smgula, C. y Douglas, M.G. (1987) Sequences dista! a
he mibocitandr al targeting sequences are necessaryfor he niaturation oftite Fi -ATPase fi-subunit
precursor in miiocitani!nia J,Bol.Chem. 2~2:41 1-418.
Velazqucz, J.M., DiDomenico, 2,3 y L ndquist, S. (1980) Intracellular lacalization of
iteat shoclc prateins in Drosapitila CeIl 211:679-689.
Velzquez, J.M. y Lndquist, 5. (1984) hsp7o: nuclear cancesitratian during env iranmenial
stress ant! cywplasm c sborage t!uring recov ery Ceil 3~:655-62.
Vennen, 3 7 .3 , Singh, Ji. y Gupta, 14.5. (1990) Nucleoide sequences ant! nov el strucrural
features of human asid Citinese itamster hsp6o < citaperonin) gene families DNA Cdl Jilol.
2:545-552.
Verburg, 1.G. y Allison, W.S. (1990) Tyrasine a 244 is deriv atized when he bov ine hear:
mitochandrial FJ-ATPase is inactiv ated wiuh 5-p-fluarosulfanyl enzoy/ethenaadenasine
JBiol.Chem, 2658065-8074.
Vestweben, O. y Schatz, 0. (1988) A chimenic mitachondrial precursor prairin with irtiernal
disulfide bridges bloclcs imponofautheuttic precursars sito mitochondria ant! allows quatatitation of
impon sites j.CelI Biol. 102.:2037-2043.
Vestweher, 0. y Schatz, (3 . (1989) DA/A-protein canjugates casi ener mitochondnia v ia tite
protein impon pai/tway Nature 238:170-172.
Viebrock, A., en, A. y Sebald, W. (1982) Tite imported prepratein of he proteo/ipid
subun : of he miochoni!rial ATP synitase frain Neurospora crassa. Molecular cloning ami
sequencing afilie IRA/A EMBO 3.1:565-571.
105
Viltanen, P.V, DonaIdson, O.K., Lorbuer, 0.11., Lubben, T.H. y Gatenby, A.A.
(1991) Comp/ex interactions between tite choperanin 60 molecular chaperone ami t!ihydrafalae
redactase Biochenistry 3Q:97 16-9723.
Viitanen, P.V., Gatenby, A.A. y Loninier, G.H. (1992) Purified citaperonin 60 (groEL )
interacs witit tite nonnauiv e siate of a multitude of Escliericitia cali proeins Pnotein Sci.
1:363-369.
Viltanen, P.V., Loninier, G.H., Seetharam, 14., Gupta, 14.5., Oppenheim, J.,
Thomas, LO. y Cowan, NS. (1992) Matumalian milochondrial chaperonin 60 funa ons
as a single toroidal ring I.Jiiol.Chem. 22:695-698.
Viltanen, P.V., Lubben, 37.H., Reed, 3., Goloub notf, 1>., OKeefe, 0.1>. y Lonimer,
G.fi. (1990) Chaperonin-faciliiated refolding of nibulasebispitospitate carboxylase ant! ATt>
hydnolysis l~citaperonin 60 (groEL ) are K+ dependein Biochemistry 22:5665-5671.
Vogel, 3.1>., Misra, L.M. y Rose, MO. (1990) L oss of BiP/GR!>78 futiction b/ocks
transacatian of secretory proteins ita yeast J.CeII Bici. .lifl:1885-1895.
Vogel, P.O. y Cross, R.L. (1991) Adenine nucleo:ide-binding sites ata mitocitondrial Fi
ATPase. ev idence for an at!enylate lcinaselike onieniatian of cata/yuic ami sioneatalytic sites
J.BioI.Chem. 2~L:6101-6l05.
von Hcijne, 0. (1986) Miiochont!rial targei ng sequences may form amphiphilic helices EMBO
3.50335-1342.
von l-Ieljne, 0., Steppuhn, 3. y Hernmann, 14.0. (1989) Domain sructure of mitocitamirial
ant! citaroplas arge:iutg peptii!es Eur.J.Biochem. ISQ:535 545.
Wada, M. y Itikawa, U. (1984>Participatian of Escherichia cot K-12 groE gene producs itt 1/te
synthesis of cellular DNA ami RNA J.Bacteniol. 152:694-696.
Waegemann, 1<., Paulsen, H. y SoIl, 3. (1990) Trauslaca:ion of praw ns ita isolated
chloropiasts requires cytasolicfactors te obain impon competence FEBS Lett. 261:89-92.
Walker, J.E., owell, S..J., Vias, 0. y Runsw ck, M.J. (1989) ATt> synihase from
av ine mitocitondria: complemeniary DNA sequence of tite impon precursor ofa iteart safan of
tite a subunit B ochcmlstny 2S:4702-4708.
Walker, J.E., Sanaste, M., Runswick, M.J. y Cay, NS. (1982) Distany related
sequences in he a- ami /3- subunius of A?! synthase, myosin, lcinases md otiter AT!>-requiring
esizymes anda comniota ,zucleo:ide binditgfold EMiBO L1:945-951.
Wallace, D.C. (1982) Sructure and ev alution of organe/le genomes M crobiol.Rev. A:208-
40.
Walter, P. y Blohel, 0. (1981) Translocahan of proteitis across 1/te endaplasmic net culum Hl.
Signal recognution protein (SR!>) causes signal sequence-dependen ami si:e-specific arrest of chain
elongatian ha: is released y micrasoinal membranes .LCell RbI. 91:557-561.
Wang, 3.11. (1983) Coupling of praton flux to tite hydralys s ni! syntitesis of ATt>
AnnuRev.JiiophytJiioeng. 12:21-34.
Wanren, A.P., James, M.H., Menzies, DE., Wdnell, C.C., Whitaker Dowling, 1>.A.
y Pasternak, C.A. (1986) S:ress induces an increased itexose uptalce in culared ce/ls
.J,CeII bysiol. 12a:383-388.
Watanbe, M. y Jilobel, 0. (1989) Cytoso/ic factor pur~fied fram Escitericitia cali 5 necessary
md sufficient for he export of a preprotein ant! is a itomatetramer of SecB
Proc.Nat.Acad.Sci.USAB:2728-2732.
Weinbach, EC, y Garbus, 3. (1968) Sructural citanges in mitochondra isiduced y uncoupling
reagen:s. Tite response ta praeolyic enzymes Biochemj. jflfr7 11-117.
Weitzel, 0., iltus, U. y Rensing, L. (1985) Similar dose response of ea: sitock protein
sysititesis ami intracellular pH change it yeast ExpCcIl Res. .152:252-256.
Welch, W.J. (1990> Tite mnammalian S:ress response: Cel Pitysiology ami Biochemistry of Stress
!>roteins. En: Stress Proteins in Jiology and Medicine PP 223-278 (Maniota. R.I,
Tissi&es. A. y Georgoponlos. C. eds.) Cad Spring Harbeur Laborauory Press, New York.
Welch, W.J. y Feramisco, 3.14. (1985> Disruptiosi of tite iliree cytoskeleta/ networks in
mamnialian cels does not affec:irariscription. tratis/ahion, or protein trans/acauiasi changes induced
y heat shoclc Mo.Ce.Ji oI. 5.: 1571-1581.
Welch, W.J. y Suban, 3.1>. (1985) Morphotogical srudy of 1/te manimalian sttess response:
chnracterizat an ofcitanges incy:oplastn c organelles, cytoskeletcn. ani! nucleoli, ami appearance of
106
intranuclear actin filamen:s in rafibroblas:s 0./ter heal-shock treatment J.Cell Biol. .121:1198
1211.
Whclan, S.A. y Hightowcr, LE. (1985) D~,fferetitial inductiot of glucose-regulated ami ea:
shock proteitis: effects of PH ant! stgfhydryl-reducing agents an citicken embryo ce/ls J.CeIl
Physiol. 125:251-258.
W ckncr, 5., Hoskins, 3. y McKenney, K. (1991) Functiosi of DsiaJ md DnaK as chaperones
ti origin-spec~fic DNA binding by RepA Nature35fl:165-167
Wiech, fi., Buchnen, 1., Zimmermann, It. y Iakoh, U. (1992) Hsp9O chaperones protein
folding ti v itro Nature 35S:169-170.
WiIliams, N. y Coleman, P.S. (1982) Exploritzg tite adenine nucleoide bint!isig sites mi
mitochomirial Fi-ATpase with a new pitoaaffinilyprabe, 3-O-(4-berzzay/)besizoyl at!enosine 5-
tnipitospitate J.Biol.Chem. 252:2834-41.
Wtte, C., Jensen, R.E., Yaffe, MP. y Schatz, 43. (1988) MAS), a gene essenial for
yeast mitochondnial assembly, encades a subunit of tite mitocitondnial processing protease
EMBO 3.2:1439-1447.
Wocsc, C.R., Gibson, 3 y Fox, G.E. (1980> Do genealogical paterns in purple
p/toosynhehic bacteria reflec interspec~fic gene tratisfer? Nature 2B3:212-214.
Woodlnd, 11.14. y Adamson, E.D. (1977) Tite syntitesis tui storage of histosies during tite
oagenesis of Xenapus laev s Dev.Biol. 2:118-135.
Woovetang, Ej., Wanders, RJ.A., Schutgens, R.B.H., Berden, J,A. y Tager, J.M.
(1990) !>ropenl~ies of tite AT!>ase activ iy assaciated with perox same-ennichedfractiotsfrom ra:
liv er: companison wi:h mitochondnial FOFJ-AT!>ase Biochm.Biophys.Acta iflS5.:6-1 1.
Wu, F.S., Park, Y.C., Roufa, O. y Martonosi, A. (1981) Selectiv e stimulatiosi of tite
synthesis of an 80,000-da/tan protein by calcium ianapitores J.JiioI.Chem. 256:5309-5312.
Wynn, R.M., Davie, 3.14., Cox, R.P. y Chuang, D.37. (1992) Citaperonitis groEL md
groES promote assemb/y of he:erotetramers (a 2 32) ofniamnialian mitocitondrial braticitedclzain
a-/ceta acid decarboxy/ase in Esciterichia cali J.JiioI.Chem. 262:12400-12403.
Yaffe, M,P, farr, G.W., Miklos, O., fionwich, A.L,, Sternlicht, M.L, y Sternlicht,
11. (1992) TCt>i comp/ex is a molecular citaperone in tuhulin biogesiesis Nature
32245:245-248.
Yaffe, M.P. y Schatz, (3. (1984) Twa nuclear mutatiosis ita: b/ack mutochondnial protein impon:
in yeast roc.Natl.Acad.Sci.USAaj:4819-4823.
Yalovsky, 5, Paulsen, H., Michael, O, Chtn s, P.R. y Nechushtai, 14. (1992)
Inv o/v ement of a citaroplas: IsIS!>70 hea: sitoclc protein ti tite integrahion of a protein (/igitt
itarv esting comp/ex pratein precursor) hito tite titylalcoid membrane
roc.Natl.Acad.Sci.USA B2.:5616-5619.
Yang, O., Oyaizu, Y., Oyaizu, U, Olsen, (3.1. y Wocse, CAL (1985) Mitocitondrial
onigitis Proc.NatI.Acad.Sci.USA BZ:4443-4447.
Yang, M., Jensen, R.E., Yaffe, M. ., Oppliger, W. y Schatz, (3. (1988) Impar: of
proteitis into yeas mitochondnia: he punzfiet! matrix processing pratease contaitis two subun rs
whicit are encoded y tite nuclear MAS) ami MAS2 genes EMBO3.2:3857-3862.
YI, P.N. (1979) Ce/hilar ion canten: cha>tges duning asid afler hypenhermia
Biochem.Biophys.Res.Comniun. 21:177-82.
Yosbida, M., Allison, W.S,, Esch, F.S. y Futai, M. (1982) lite specfity of carboxy/
group modificatian during tite inaciiv a:ian of he escitericitia cali Fi-ATPase witit dicyc/ohexy/
fl4Cjcarbaduim de J.BioI.Chemn. 252:10033-10037.
Yost, H.J. y Lindquist, 5. (1986) RNA splicing is internupted by ea: shock ami is rescued y
ea: sitock protein syntitesis Cel 4.5:185-193.
Young, O., lathigra, 14., Hendnix, It,, Sweetser, O. y Young, R.A. (1988) Stress
pro:e ns are immusie argeis ti /eprasy ant! tuberculosis noc.Nati.Acad.Sci.USA 85:4267-
4270.
Young, DB. (1990) Citaperanisis asid tite immune response Scm.Cel Rial. 1:27-35.
Zara, y., almier, F., Mahlke, K. y Pfanner, N. (1992) Tite cleav able presequence is no:
essentia/ fon impon ami assembly of tite pitaspitate camnier of ,na,nnhalian mitocitondnia bu:
enhances tite specfici:y ami! efficiency of impon: 3.BioI.Chem. 262:12077-12081.
1 07
Zhi, W., Landry, Si., Gierasch, L.M. y Srere, P.A. (1992) Renaturation of citrate
synthase: Influence ofdenaturan: amifolding ass san:s Protein Sci. 1:522-529.
Zhuang, Z. y McCauley, 14. (1989) Eibiquii is inv olv ed it tite in v i: no insentian of
monoamine oxidase B into mitochondnial auter membranes 3.BioI.Cbem. 264:14594-14597.
ZiIIig, W. (1987) Eulcaryot c traits in Arc/taebactenia. Could he eukanyotic cytoplasm itai>e anisen
ftam archaebacterial arigin? Ann.N.YAcad.Sci. 52:78-82.
Zimmenmann, R., Sagstetter, M., Lewis, M.3. y Pelham, HR. (1988) Se v esity-
Id/ada/tan ea: sitock prateins ami it adi!utional componet fram reiiculocyte /ysate simu/ate
impar: ofM13 procoat protein isita micrasomes EMBO 3. 2:2875-2880.
Zimniak, L., Oittnich, 1>., Gogarten, 3.1>., K bak, E. y Taiz, L. (1988) Tite cDNA
sequence of the 69-lcDa subuutit afilie carral v acuolar 11+-ATPase. Homo/ogy a tite /3-chain of
FOFJ-AT!>ases J.BioI.Chem. 261.9102-9112.
Zweig, M. y Cummlngs, 0.3. (1973) Cleav age of itead md tail proteitis t!uning bacteriopitage
Ti assem ly: selectiv e os: inv alv ement ita he cleav age of a tail protein .iI.Mol.B o. 8Q:505-
518.
Zwizinski, C., Schleyer, M. y Neupert, W. (1984) Praeinaceous receptors fon tite impar: of
mitocitondnial precursor proie ns .J.JiioI.Chem. 259:7850-7856.
Zyicz, M, Ang, O. y Georgopoulos, C. (1987) Tite grpE protein of Escitenicitia cali.
!>unficaion ant! propenies 3.Biol.Chcni. 262:17437-17442.
Zylicz, M., Lehowitz, J.H., McMaken, 14. y Georgopoulos, C. (1983) Tite dnaK
pratein ofEsciterichia cali possesses an ATPase ami! auop/tosphory/ating activ ity ami is essesitia/
si arz itt v itra DNA replicauion system Proc.NatI.Acad.Sci.USABD:6431-6435.
108
2. INTRODUCCIN
INTRODUCCIN
INTRODUCCION
El trabajo presentado enesta Memoriase engobla dentro de las aproximaciones
experimernales de 1 Lnea de Investigacin del Centro de Biologa Molecular que tiene
como objetivo general el estudio de los mecanismos moleculares y seales biolgicas
responsables de la biognesis mitocondrial en mamferos.
El estudio de labiognesis mitocondrial en mamferos tiene una granrelevancia
desde el punto de vista bsico y clnico, puesto que permite la caracterizacin de un
procesode vital importancia para comprender el funcionamiento de la clulaeucariotay
su patologa, a la vez que puede contribuir a desentraar las pautas y los niveles de
coordinacin en la expresin de los dos genomas que caracterizan a estos tipos celulares.
Por otro lado, aunqueel estudio de eucariotas superiores de momento no permiterealizar
una aproximacin experimental de genticamolecular y clsica, como ocurre enel caso de
los eucariotas inferiores (S.cerev isiae), factor decisivo a la hora de explicar el
desconocimiento que actualmentese tiene sobre este proceso en mamferos, resulta obvia
la necesidad del desarrollo de sistemas experimentales en estos tipos celulares que
permitan la caracterizacinde los mecanismos moleculares implicados en labiognesis
mitocondrial. Evidentemente, las diferencias existentes a este nivel entre eucariotas
superiores e inferiores (grado de compactacin y contenido gnico del genoma
mitocondrial, presencia en eucariotas superiores de seales neurohormonales que
controlen el proceso, existencia de isoformas proteicas, etc.) no permiten extrapolar
nuestroconocimientoactual en el campo de lalevadura parael caso de los mamferos. En
este sentido, el estudio de la actividad mitocondrial durante el desarrollo del hgado de
rata ha demostrado ser un modelo experimental idneo, en muchos aspectos, para la
caracterizacin de los mecanismos que controlanel proceso de biognesis mitocondrial en
mamferos.
En concreto, el estudio de la biognesis mitocondrial en mamferos debe
contemplar una sucesin de procesos altamente coordinados que incluyen la transcripcin
de los genes nucleares y mitocondriales, la traduccin de los mensajeros correspondientes
en cada uno de los compartimentos celulares mencionados, la estabilizacin de los
precursores proteicos en el citosol, su importacin al interior de la mitocondria y su
maduracin, plegamiento y, en el caso de protenas oligomricas, su ensamblaje con otras
protenas, momento en el que confluye laexpresin de los dos genomas que contribuyen
a la biognesis mitocondrial. Unarepresentacin esquemtica de los distintos procesos
anteriormente citados se incluye en la figura 2.1.
111
M]TOCGNDRIA
prr proteina
proteina proteina
o
DNA
COMPLEJOS
PROTEICOS
FIGURA 2.1. Representacin esquemaitica de los procesos moleculares implicados
en la biognesis mitocondnial. La transcripcin del DNA nuclear (1) genera el transcrito
primario o RNAhewrogneo nuclear, cuyo procesamiento (splicing) (2) da lugar al mensajero
maduro, que se exporta al citosol donde puede alinacenarse en fonna trasduccionalemente inacliva
(4) o bien incorporarse a la maquinaria traduccional (3) para dar lugar a] precursor proteico.
Posteriormente, estees importado ala mitocondria (5) donde sufre el procesamientoprotelitico y
eliminacin de la presecuencia (6). Por otro lado, el genoma mitocondrial se transcribe (7) y
traduce (8) para generar los distintos polipptidos que pasan aformar parte,juntocon las protenas
codificadas en el genoma nuclear, de los complejos proteicosmitocondriales (8), proceso este enel
que intervienendistintos chaperones moleculares yque requiere de la hidrlisis de ATP.
La biognesis mitocondrial en el hgado de rata durante el desarrollo postnatal
resulta de dos procesos claramente diferenciados en cuanto a su ocurrencia temporal,
aunque no necesariamentedistintos en cuanto a los mecanismos que lo controlan. Por un
lado, hay que considerar la proliferacin mitocondrial, o aumento en el nmero de
orgnulos por clula, un proceso continuo que abarca todo el periodo del desarrollo
(Aprille, 1986; Cuezva y col., 1990) y, por otro lado, la diferenciacin mitocondrial,
consistente en la adquisicin de las caractersticas ultraestructurales, funcionales y
moleculares que garantizan la plena funcionalidad del orgnulo (Valcarce y col., 1988;
Cuezva y col., 1990; 1993). Este proceso, a diferencia del anterior, sucede en el hgado
de rata exclusivamente durante la primera hora de vida postnatal. Precisamente por la
celeridad con que tiene lugar el proceso de diferenciacin mitocondrial, es por lo que
consituye un buen sistema experimental paraanalizar los mecanismos, factores y seales
D NA
lo
hnRNA
mRNP
n~RNA
pre-proteittzt
o
112
INTRODUCCIN
biolgicas que controlan la biognesis mitocondrial en mamferos. El proceso de
diferenciacin mitocondrial no es exclusivodel hgado en ese momento del desarrollo.
puesto que tambin se produce en el tejido adiposo marrn (Luis y Cuezva, 1989). La
diferenciacin mitocondrial en hgado de rata se producepor la accin sinrgica de dos
procesos: (i) un rpido aumento postnatal en las velocidades de sntesis de polipptidos
mitocondriales implicados tanto en funciones bioenergticas (Valcarce y col.. 1988;
Izquierdo y col., 1990) como metablicas (Serrano y col., 1989; Cuezva y col., 1993)
del orgnulo y (u) el aumento postnatal en las concentraciones intramitocondriales de
nucletidos de adenina (Valcarce y col., 1988; Aprille y Asimakis, 1980> . Este ltimo
proceso, independiente de la sntesis proteica (Cuervay col., 1990), es el responsable de
los cambios ultraestructurales que acontecenen el orgnulo durante la primera hora de
viday contribuye al aumento en laeficacia del acoplamiento energtico entre respiracin y
fosforilacin oxidativa, por disminuir la permeabilidad pasiva a protones de la membrana
interna mitocondrial (Valcarce y col., 1990) a consecuencia de los cambios
conformacionales que stos producen en el transiocador de nucletidos de adenina
(Valcarce y col., 1992).
Los trabajos realizados en nuestro laboratorio en los ltimos aos se han centrado
muy especialmente en el estudio de la biognesis mitocondrial en cuanto a los
mecanismos de regulacin de la transcripcin y traduccin de los genes nucleares
implicados en la biognesis mitocondrial (etapas 1, 2 y 3 en esquema 2.1), y slo ms
recientemente se han abordado aspectos relacionados con la expresin del genoma
mitocondrial (Ostronoff y col., en prensa). Los primeros estudios realizados en este
campo pusieron de manifiesto como durante la primera hora de vida se produce en las
mitocondrias de hgado de rata un aumento generalizado en la actividad especfica de
todos los complejos de lacadena de electrones y de lafosforilacin oxidativa (Valcarcey
col., 1988), como resultado de un aumento generalizado en las velocidades de sntesis de
protenas mitocondriales (Valearce y col., 1988). Cuando se estudi la expresin de I~-
Fl-ATPasa, protena elegidacomo marcadoradel proceso de diferenciacin mitocondrial,
se observ como la cantidad de esta protena se duplica durante la primera hora de vida
postnatal (Valcarce y col., 1988; Izquierdo y col., 1990), mientras que los niveles
estacionarios del mRNA paraestaprotena no sufran cambios en ese mismo periodo del
desarrollo (Izquierdo y col., 1990), lo que implica que la diferenciacin postnatal de la
mitocondria se encuentra regulada a nivel traduccional en el hgado de rata.
Posteriormente, se han podido identificar algunos de los niveles de regulacin
traduccional de la biognesis mitocondrial del hgado de rata (Luis y col., 1993). Esta
regulacin parece tener un componente general de activacin de la maquinaria
113
traduccional mediada pormodificaciones covalentes de los factores proteicos implicados
endichaetapa (Luis y col., 1993) y que seran los responsables del aumento generalizado
en la sntesis de protenas hepticas al que antes aludamos (Valcarce y coL, 1988), as
como un componente especfico de activacin para la traduccin de protenas
mtocondriales codificadas en el genoma nuclear, que incluye, al menos para f3-Fl-
ATPasa (i) la regulacin transcripcional y/o post-transcripcional de la disponibilidad del
mensajero, al menos mediante su almacenamiento en partculas de alta densidad
aparentemente inactivas paralatraduccin (etapa 4 en esquema 2.1) (Luis y col., 1993) y
(u) laexistencia de algunacaracterstica, ya sea intrnseca al mismo o caracterstica de la
poblacin de RNAs poliadenilados existentes en este momento del desarrollo, que los
hacen ms eficientes parasu traduccinen el citosol, tanto in vivo (Valcarce y col., 1988)
como en un sistema in vitro(etapa 3 en esquema2.1) (Luis y col., 1993).
La bondad del sistema experimental empleado para el estudio de la biognesis
mitocondrial queda puesta de manifiesto al habemos permitido identificar algunas de las
seales biolgicas implicadas endicho proceso. En concreto, medianteel desarrollo de un
modelo de hipotiroidismocongnitoen nuestro sistema experimental, hemos demostrado
laimplicaci6n de las hormonas tiroideas en laregulacinde la biognesis mitocondrial en
este momento del desarrollo (Izquierdoy col., 1990). En este sentido, cuando se analiza
la expresi6n del gen correspondiente a la protena marcadora (3-F1-ATPasa, se observa
que tanto la cantidad de protena como la del mensajero correspondiente se encuentran
significativamente disminuidos en neonatos hipotiroideos (Izquierdo y col., 1990), lo que
sugera un efecto de las homonas tiroideas sobre la transcripcinbasal del gen de IB-Fi-
ATPasa (etapas 1 y 2 enla fig. 2.1). En efecto, ladeterminacin en ensayos run-on de
las velocidades de transcripcin del gen de [3-FJ-ATPasaen ncleos aislados de animales
hipotiroideos demuestra que esta se encuentra muy disminuida con respecto a los
animales controles, y que la administracin de hormonas tiroideas en el momento del
nacimiento permite recuperar los niveles basales de transcripcin (Izquierdo y Cuezva,
enviado), demostrando as de formaconcluyente laparticipacin de estas hormonas en la
transcripcin basal, ya sea directa o indirecta, de los genes nucleares que codifican para
protenas mitocondriales. Por otro lado, el estudio de la expresin del genoma
mitocondrial (etapas 6 y 7 en fig. 2.1) eneste mismo sistema experimental revela que los
niveles estacionarios de mRNAs mitocondriales no sufren cambios durante esta etapa del
desarrollo, lo que sugiere un mecanismo de regulacin traduccional para laexpresin de
este genoma (Ostronoff y col., 1993; Ostronoff y col. en preparacin). De hecho, la
cuantificacin de las velocidades de sntesis proteica en orgnulos aislados demuestra
comostas sufren un aumento de 2 a 3 veces en esta etapa del desarrollo. Todos estos
114
INTRODUCCIN
resultados demuestran laexistencia de niveles de regulacin semejantes para laexpresin
de los dos genomas involucrados en la biognesis mitocondrial de la clula eucariota
superior, lo que parece indicar que el control de lacoordinacinde laexpresin de ambos
sistemas gnicos quiz dependa de seales nicas que afectena mecanismos moleculares
anlogos.
Resulta evidente a la vista de la actividad investigadora realizada en nuestro
laboratorio en los ltimos aos que en el estudio del proceso de biognesis mitocondrial
de mamferos quedaban por abordar aquellos aspectos que ocurren de forma post-
traduecional en la biognesis, y que en el caso de eucariotas inferores, se han
desarrollado de forma vertiginosa en los ltimos aos. Nos referimos concretamentea los
procesos de importacin, procesamiento y ensamblaje de los componentes proteicos que
definen la funcin mitocondrial. Es precisamente en este contexto y como primera
aproximacin de este grupo donde se encuadran los resultados que se presentan en esta
Tesis Doctoral.
Una de las etapas clave en el proceso de biognesis mitocondrial lo constituye el
plegamiento y ensamblaje de los polipptidos mitocondriales recin importados (etapa 9
en fig. 3.1). Este proceso, que parece ocurrir de forma espontnea in vitro, se encuentra
enormemente facilitado in vivo por la existencia de un conjunto de polipptidos
denominados chaperones moleculares y que, en el interior de la mitocondria, se
encuentran representados poruna subfamiia de protenas caracterstica de este orgnulo,
de cloroplastos y de clulas procariotas, conocidas genricamente como chaperoninas
(ver Revisin Bibliogrfica). En este sentido, una serie de resultados que se detallan a
continuacin hizo enfocar parte de los objetivos de esta Tesis al anlisis estructural y
funcional de una protena mitocondrial, la subunidad a del complejo F1-ATPasa, de la
que en la actualidad se sabe que desempea un papel de chaperoninaen este orgnulo.
Inicialmente, nuestrogrupo identific, en base a inmunoreactividad y migracin
electrofortica, la presencia de lasubunidad aen la matrizde los peroxisomas de hgado
de rata (Cuezva y col., 1990). Esta sorprendente localizacin para esta protena, que
adems contena una secuencia de targeting peroxisomal, nos hizo sospechar de la
existencia de una actividad funcional adicional a su ya conocida implicacin en la
fosforilacinoxidativa. Laexistencia de protenas mitocondriales con doble funcinno es
un hecho sorprendente, puesto que en los ltimos aos se han descrito varias protenas
mitocondriales implicadas tanto en la biognesis como en la funcin de este orgnulo
(Braun y col., 192; Sackmann y col., 1991; Bousquet y col., 1991; Schulte y col.,
115
INTRODUCCIN
1989). La doblelocalizacin subcelular de cz-F1-ATPasa en el hgado de ratay su posible
funcin de chapern molecular en ambas localizaciones, nos llev a investigar si esta
protena cumpla una de las caractersticas comunes a la mayora de los chaperones
moleculares, esto es, la capacidad de inducirse en respuesta a choque trmico.
Concretamente, empleando el modelo experimental de larvas de Drosophila, pudimos
observar mediante Western blot como un nico polipptido de 57 kDa (Fig. 2.2) se
induca enrespuesta a tratamiento de choque trmico (Luis y col., 1990). La cantidad de
a-F1-ATPasaen las larvas de Drosophila se duplicaba tras 15 minutos de tratamiento
hipertrmico para volver a recuperar suexpresin basal 60 minutos tras lafinalizacin de
la exposicin hipertrmica (Fig. 2.2> . Lacuantificacinde hsp7oen las mismas muestras
revel un grado de induccin semejante pero con una cintica de induccin
considerablemente distinta (fig. 3.2), puesto que requera de 45 minutos de choque
trmico paraalcanzar su nivel mximo de expresin. El grado de induccin encontrado
para a-F1-ATPasa en respuesta a choque trmico era muy semejante al descrito para la
chaperonina mitocondrial hsp60 (2-3 veces), tanto en levadura (Reading y col., 1989)
como en Tetrahymena rermophila (McMulIin y hallberg, 1987> y ligeramente distinto para
chaperoninas de otros orgenes (4-5 veces para GroEL (Neidhart y col., 1981) e
induccin casi imperceptible para RiBSP (l-Iemmingsen y col., 1990)). Estos resultados
quedaron realzados por la existencia de evidentes homologas entre las secuencias de
ambas familias proteicas (chaperoninas y subunidades a), lo que constituye el punto de
arranque de esta Tesis y los que dio lugar a un importante bloque de resultados que se
describen en las seccines 5.1.1 a 5.1.5. La hiptesis propuesta por nuestro grupo (Luis
y col., 1991) sobre el posible papel chaperonina de la subunidad a no slo se encuentra
apoyada por todoel conjunto de resultados presentados en estaMemoria, sino que, enel
curso de la realizacin de este trabajo, dos laboratorios han proporcionado de forma
independiente, evidencias concluyentes al respecto(Avni y col.. 1991; Yuan y Douglas,
1992).
Avni y col. (1991) observaron como cromatforos de Rhodospiriltum rubrwn de
los que se haba eliminado la subunidad IB del complejo F1-ATPasa medianteextraccin
conLiC podan ser reactivados tras laadicin de subunidades IB-Fl-ATPasa aisladas de
cloroplastos de tabaco y espinacas slamente cuando en el medio existan
simultanamente cantidades catalticas (5%) de subunidades aprocedentes de complejos
Fl-ATPasa de cloroplatos de espinaca o lechuga (Fig. 2.3). La ausencia de a-Fl-ATPasa
en dicho ensayo de reconstitucin heterlogo no impeda la unin de subunidades 3
aisladas a los cromatforos carentes de subunidad [3,pero si evitaba larecuperacin de la
1l~7
actividad ATPasa (Avital y col., 1991). Aunque las subunidades a de cloroplastos eran
aportadas al ensayo en forma de dimeros a/J3, el efecto observado era especfico de la
subunidad a, puesto que cantidades similares de subunidad [3ailslada eran incapaces de
promover larecuperacinde laactividad ATPasa (Avni y col., 1991). En definitiva, Avni
y col. (1991) demostraron, por medio de un ensayo heterlogo de reconstitucin
actividad ATPasa de cromatforos de R.rubrum, como la subunidad a. en cantidades
catalticas, eracapaz de facilitar el correcto plegamiento y/o ensamblajede subunidades 3
aisladas en cromatforos carentes de dicha subunidad (Fig. 2.3), actividad sta
caracterstica de chaperones moleculares.
Deformaindependiente, Yuan y Douglas (1992), haciendo uso de cepas mutantes
de cerev isiae que presentaban deleciones en los genes codificantes parala subunidad a,
para la subunidad IB o paraambas simultneamente, pudieron observar como los mutantes
Q
3 -
E
E
o
3 -
1 >
04
ca
200
1 50
loo
50
FIGURA 2.3. Efecto de cantidades catalticas de dmero a13 de de complejos
F1-ATPasa de cloropastos sobre la capacidad reconstituyente de la
actividad ATPasa en cromataiforos de R.rubruns carentes de subunidad ji. El
ensayoheterlogo dereconstitucin se llev a cabo incubando cromatforos de R. rubrum
carentes de la subunidad 3 preparados mediante tratamiento con LiCI (4 j.tg de
bacerioclorofila) y las cantidades indicadas en abcisas de subunidades [3aisladas de
cloroplastos de espinaca, en presencia (crculos abiertos) o ausencia (crculos cerrados) de
0,4 ~gde dmeros <43 de cloroplastos deespinaca (tomadodc Avni y col., 1991).
o
0 5 10 15
CF1-13 aadida qig)
118
INTRODUCCIN
de deleccin de la subunidad a presentaban velocidades de crecimiento en fuentes
fermentables de carbonoconsiderablemente menores a las cepas salvajes y a las cepas
mutantes de delecin de la subunidad 3 . Por otro lado, laeficiencia en la importacina la
mitocondria de determinados precursores proteicos, determinada tanto in vitroen clulas
semi-intacta.s como in vivo medianteexperimentos de pulso y caza, eraconsiderablemente
menor en los mutantes de delecin de la subunidad a que en la cepas salvajes o en los
mutantes carentes de subunidad IB (Fig. 2.4). As mismo, los dobles mutantes (deleccin
de los genes codificantes para la subunidades a y 3) aunque presentaban unas
velocidades de crecimiento semejantes a las cepas de tipo salvaje, mostraban una
eficienciaen laimportacin de precursores a lamitocondriaintermedia entre las cepas de
FIGURA 2.4. Efecto diferencial de la deleccin de los genes codificantes
para las subunidades a y j3 del complejo FI-ATPasa sobre a eficiencia en
la importacin de distintos precursores mitocondriales. A. Eficiencia de la
imporrtacinde la subunidades a y 3 dcl complejo F-AlPasa y de las subuiniddes 4 y Sa
de lacitocromo oxidasaen mutantes de deleccinde las subunidadess a(columnas abiertas)
y 3 (columnascerradas). H. Comparacin de laeficienciade laimportacin ala mitocondria
de 3-FI -ATPasa en mutantes dedeleccin de las subunidades a(crculos cerrados) y de los
dobles mutantes.a-fl (cuadrados) frente a lacepa salvaje. El ensayo deimportacin se llev
a cabo incubando los distintos precursores mitocondriales marcados con [
35S]-metionina
obtenidos mediante transcripcin/traduccin in v iti-o en un sistema de lisado de reticulocitos
con clulas de levadura semi-intactas procedentes de mutantes dedeleccin arribaindicados.
La eficiencia de la importacin se detennin mediante la cuantificacin del grado de
resistencia aprotea.sas dc los distintos precursores.
119
tipo salvaje y los mutantes de deleccin de la subunidad a (Fig. 2.4), aunque
significativamente menor que la que presentaba un mutante (Mas7Op) de deleccin del
receptor de 70 kDa de la membrana externa mitocondrial (Fig. 2.4). La demostracin
concluyente de la funcin de chapern molecular de la subunidad a del complejo F-
ATPasa permite reinterpretar, al menos parcialmente, algunas evidencias experimentales
no justificadas hasta la fecha para esta protena y para su mensajero. Esta protena,
esencial para la actividad biolgica del complejo H~-ATP sintasa (Futai y col., 1989;
Williams y Coleman, 1982), sufre profundos cambios conformacionales en presencia de
ATP, segn indican los estudios de la resistencia a proteasas (Senda y col., 1983) y la
cuantificacin de determinados parmetros fsico-qumicos (Dunn, 1980) en la protena
purificada en presencia y ausencia de ATP. Esta propiedad parece depender de la union
de ATPa los sitios de unin de nucletidos de alta afinidad presentes en la subunidades
a. Esa propiedad constituye una semejanza notable con lafamilia de las chaperoninas y,
en general, con los chaperones moleculares. As mismo, otra peculiaridad aparentemente
sin explicacin, observadaparaesta protena lo constituye el que su mRNAse acumula y
no se encuentra uniformemente distribuido en el citosol de los oocitos de Xenopus
(Weeks y Melton, 1987). Estedistribucin en gradiente del mensajero de la subunidad a
contrasta con la de su producto de traduccin, cuya distribucin celular coincide,
evidentemente, con la de las mitocondrias. El mecanismo y significado biolgico de este
fenmeno se desconoce por completo.
Ahora bien, debemos resaltar que cuando nos propusimos, como parte de los
objetivos de esta Tesis, demostrar la posible ubicuidad de la subunidad alpha en otros
tipos celulares, con el fin de obtner nuevos datos sobre el papel biolgico de esta
protena, los resultados obtenidos demostraron de forma concluyenteque el polipptido
inmunoreactivo, inicialmente adscrito a la subunidad a del complejo F1-ATPasa,
corresponda a lacatalasade hfgado de rata. Noobstante, aunque el objetivo inicialmente
propuesto result negativoy no aport ninguna informacin adkional sobre las posibles
funciones biolgicas de la subunidad a, los resultados obtenidos nos han permitido
obtener evidencias de la presencia y naturaleza de lacatalasa de mitocondria de hgado de
rata, una protena descrita como marcadoraexclusiva del peroxisomaen este rgano (de
Duve y col., 1965). Estos resultados, por sus posibles implicaciones celulares y
funcionales, se describen en las secciones 5.1.6. y 5.1.7.
Otro aspecto de los mecanismos post-traduccionales implicados en la biognesis
mitocondrial, anterior al plegamientoy ensamblaje mediadopor chaperones moleculares y
120
INTRODUCCIN
del que lainformacinexistente en clulas de mamferos es prcticamentre inexistente, lo
constituye el procesamiento o maduracin de los precursores mitocondriales, entendido
ste comola eliminacinproteoltica intramitocondrial de lasecuenciaseal que dirige al
precursor hacia la mitocondria. La maduracin de los precursores mitocondriales
mediantela eliminacin protelitica de la secuenciaseal (etapa 6 enefig. 34) constituye
otrade las etapas claves de la biognesis mitocondrial que hemos abordado. Con este fin,
y ante la posibilidad de que este proceso constituya una etapa limitante en el proceso de
biognesis mitocondrial, nos propusimos desarrollar un sistema analtico de alta
sensibilidad que permitia la caracterizacin inequvoca de los distintos intermedios de
procesamiento de los precursores mitocondriales. Este sistema resultar de indudable
utilidad para detectar la posible acumulacin citoslica de precursores proteicos
mitocondriales, algo que puede ocurrir en situaciones de activa biognesis mitocondrial
y/o patologas mitocondriales asociadas a la maquinariade importacin. El desarrollo de
esta metodologa permitir, en un futuro muy prximo, el estudio de lavariacin con el
tiempo de lacantidad de precursor y forma madurade los polipptidos mitocondriales en
las distintas situaciones experimentales de biognesis mitocondrial que estudia nuestro
grupo y, eventualmente, la posible caracterizacin de determinadas patologas
mitocondriales ligadas a disfunciones en lamaquinaria de importacin y procesamiento de
los precursores proteicos enlneas celulares de pacientes con mitocondriopatas, aspecto
este ltimo que ser abordadoencolaboracin con el laboratorio del Dr. Zeviani (Miln).
Los resultados obtenidos en este apartado se describen y discuten conjuntamente en la
seccin 5.2.
En resumen, los resultados presentados en esta Memoria constituyen la primera
aproximacinexperimental de nuestro grupode investigacin al estudio de los factores y
mecanismos que, a nivel post-traducconal, influyen en el proceso de biognesis
mitocondrial de mamferos. En concreto, se aportan evidencias, por anlisis de
secuencias y en base a la inmunoreactividad frente a determinados antisueros de la
relacin evolutiva entrelas chaperoninas y lasubunidad a del complejo F1-ATPasa. Este
anlisis ha permitido, por un lado, caracterizar el dominio estructural responsable del
reconocimiento molecular de las chaperoninas y subunidades a por sus sustratos. Por
otro lado, ha permitido inferir aquellos aminocidos que posiblemente conforman el
centro de unin paranucletidos de adenina en la molcula de la chaperonina. As mismo,
se ha desarrollado un sistema experimental que permitir en el futuro la caracterizacin
inequvoca del proceso de maduracin de precursores proteicos mitcondriales, tanto en
situaciones fisiolgicas como patolgicas. En otro contexto, hemos demostrado la
existenciade catalasaen lamitocondria, aunque estaprotena carecede actividad biolgica
121
en este orgnulo y hemos aportado quiz las primeras evidencias experimentales
encaminadas a dilucidar el significado biolgico de la presencia de esta protena en la
mitocondria.
122
3. OBJETIVOS
OBJETIVOS
3.OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO
De entre todo el conjunto de procesos moleculares que se suceden de forma
coordinada durante la biognesis mitocondrial, aquellos que ocurren de forma post-
traduccional son los que menor atencin han recibido en los ltimos aos, explcitamente
en el caso de clulas de mamferos. Esto es as, no por resultar en su conjunto menos
importantes para la funcionalidad mitocondrial, sino por la falta de un sistema
experimental adecuado para suestudio. Por este motivo, resultaba prioritario entre los
planteamientos iniciales del trabajo aqu presentado el estudio de dos procesos cuya
relevancia para la biognesis mitocondrial ha sido claramente puesto de manifiesto en
clulas cucariotas inferiores. En concreto, estbamos interesados en la caracterizacin
estructura] y funcional de cienos componentes moleculares de la maquinaria mitocondrial
responsable del plegamiento y ensamblaje de los precursores proteicos recin importados
y, por otro lado, en desarrollar un sistema analtico que permitiera el estudio del proceso
de maduracin de los precursores proteicos mitocondriales.
Lgicamente, los objetivos inicialmente planteados fueron abordados de forma
simultnea, lo que origin que, en ciertos casos, la obtencin de resultados negativos
hiciese necesaria la redefinicin de alguno de ellos. A continuacin se detallan los
objetivos generales del trabajo aqu presentado, incluyendo, en cada caso, los objetivos
parciales y una somera descripcin de los resultados obtenidos para facilitar su
comprension.
En primer lugar, se trat de identificar la existencia de homologas de secuencia
entre las chaperoninas y las subunidades u, mediante el anlisis comparativo de las
correspondientes secuencias proteicas. As mismo, se intent determinar la existenciade
homologas en la estructura secundaria entre ambas familias proteicas. Los resultados
obtenidos demostraron la existencia de un alto grado de homologa a ambos niveles, lo
que implica laexistencia de un origenevolutivo comn y ladefinicin de cieros modulos
proteicos involucrados en actividades/funciones comunes. La existencia de evidentes
homologas entre chaperoninas y las subunidades alpha de las ATPasas de tipoFimplica,
a su vez, la existencia de homologa entre chaperoninas y el resto de las subunidades
mayoritarias de las AlPasas de tipo V (A y B) y de tipoF (subunidad beta), ya que sc ha
propuesto que todas ellas derivan del mismo ancestro. En este sentido se procedi al
alineamiento parcial de las secuencias de todas estas familias protecias con un doble
objetivo; por un lado, determinar la posible relacinevolutivaentretodas ellas y por otro,
125
caracterizar los aminocidos responsables en las chaperoninas del conformar el dominio
de unin a nucletidos.
Con objeto de verificar experimentalemente la existenciade homologa estructural
entre chaperoninas y subunidades alpha, se procedi al desarrollo de anticuerpos contra
pptidos sintticos de la subunidad alpha de hgado de rata en la regin de mxima
homologa con las chaperoninas. Los resultados obtenidos demostraron la capacidad de
estos anticuerpos parareconocer protenas de estrs celular.
Con el fin de analizar la relacin estructura-funcin de los posibles mdulos
proteicos y aminocidos comunes entrechaperoninas y subunidades alpha, se intent el
clonaje molecular del cDNA de la subunidad alpha de hgado de rata. Los resultados
obtenidos fueron negativos.
Puesto que el alineamiento mltiple entre las secuencias de chaperoninas y
subunidades a nos permiti proponer regiones conservadas que podran resultar
esenciales para la actividad chaperonina de ambas familias proteicas, se trat de
identificar, mediante bsquedas en el banco de datos de secuencias proteicas, la posible
existencia de polipptidos no relacionados con chaperoninas y subunidades a que
contuvieran estas secuencias y pudieran aportar informacin sobre aspectos funcionales
comunes Tras la caracterizacin y reinterpretacin de uno de ellos, y puesto que el
abordaje del clonaje molecular haba resultado negativo, se procedi al anlisis de la
relacin estructura-funcin de estos mdulos proteicos de la subunidad alpha en la
actividad chaperonina. Para ello, se estudi el efecto de varios pptidos sintticos sobre
los procesos de plegamiento de protenas desnaturalizadas y sobre la solubilidad de
protenas nativas. Estos resultados nos han permitido definir la regin de la cadena
polipeptidica de las subunidades ay de las chaperoninas responsabledel reconocimiento
de sus sustratos enla actividad chaperonina de estas protenas.
Dada laaparente localizacinextramitocondrial (en los peroxisomas de hgado de
rata) de la subunidad a del complejoF1-ATPasa, nos propusimos identificar laexistencia
de esta protena en otras localizaciones celulares que pudieran aportar informacin sobre
la actividad biolgica de esta protena independientemente de su intervencin en la
fosforilacin oxidativa. Esta aproximacin nos permiti caracterizar la presencia de
material inmunoreactivo en la matriz de los eritrocitos de rata. Sin embargo, cuando se
estableci la naturaleza molecular del material inmunoreactivo (p57), comn a
126
OBJEII VOS
mitocondrias. peroxisomas y eritrocitos de rata, mediante tcnicas inmunolgicas, de
mapeo peptdico y microsecuenciacin, los resultados indicaron que dicha protena era
catalasa. Enconsecuencia, este resultado se reorient, por no estar descrita la presencia
de catalasa en la mitocondria, hacia la caracterizacin parcial de la misma en este
orgnulo.
Finalmente, se pretendi desarrollar un sistema experimental que permita
caracterizar el procesamiento de precursores mitocondriales. Con este objerto, seutiliz el
sistema de electroforesis bidimensional queilustra experimentalmente las modificaciones
en peso molecular y punto isoelctrico que se producen en dichos precursores tras la
eliminacin de la secuencia seal. Estesistema permitir lacaracterizacin inequvoca de
algunos precursores proteicos y permitir en el futuro el anlisis molecular de los
mecanismos y disfunciones de lamaquinariade importacinque pudieran ocurrir durante
la biognesis mitocondrial de mamferos.
127
4. MATERIALES Y METODOS
MATERIALES YMTODOS
4. MATERIALES Y METODOS.
4.1. MATERIALES
4.1.1. Animales de experimentacin, lneas celulares y cepas bacterianas.
4.1.1.1. Ratas.
Se emplearon ratas albinas de la raza Wistar de peso comprendido entre 250 y
300 gr. Los animales han sido criados en el animalario del Centro de Biologa Molecualar
en celdas estancas dotadas de ventilacin por cmara de aire de 15 renovaciones por
minuto y un ciclo luz-oscuridad de 12 horas con la fase de oscuridad entre las 20:00
horas y las 8:00 horas del da siguiente. La humedad ha oscilado entre el 45-50% y la
temperaturaentre22-24
0C. Los animales han sido alimentados con una dieta estndar de
laboratorio (23.5% protenas, 5% lpidos. 49.8% glcidos, 4% celulosa, 5.7 % sales
minerales, 12% agua y vitaminas) y han tenido en todo momentolibreacceso a la dieta y
agua de bebida.
4.1 .1 .2. Conejos.
Se han utilizado conejos hembras de la raza New Zealand.
4.1.1.3. Drosophia.
Se han empleado larvas de las especies Drosophila hydei y Drosoph ita
metanogaster. Todas ellas se encontraban en la mitad del tercer estadio del desarrollo. El
crecimiento de las larvas se llev a cabo en botellas que contenan 50 ml del medio
nutritivo compuesto por: 7.5% azucar moreno, 10% levadura, 1.1% agar, 5% harina y
0.5% cido propinico.
4.1.1.4. L neas celulares.
Se han empleado las lineas celulares establecidas NRK (Normal Rat Kidney
fibroblasts, ATCC-CRL 1570) y C9 (hgado de rata, ATCC-CRL 1439). El cultivo de
estas clulas sc efectu con DMEMsuplementado con un 10% de suero de ternera fetal,
glutamina 2 mM, amino cidos no esenciales (Ala, Asn, Asp, Glu, y Pro 400 gM, ),
penicilina 0.6% y estreptomicina 1%.
4.1.1.5. Cepas bacterianas.
135
MATERIALES Y MTODOS
Se han empleadoEscherichiacoli de las cepas bacrterianas XL1-Blue (Stratagene)
y DH5a (BRL). El cultivo de estas cepas en medio lquido se efectu en medio LB
(Bactotriptona 1% (p/v), extractode levadura 0.5% (p/v) y NaC 1% (p/v). El cultivo en
placa se efectu suplementando el medio LB con agar al 1.5% (p/v). En ambos casos se
incluy ampicilina a 50 ~.tg/ml parala seleccin de transformantes.
4.1.1.6. Vectores de donacin.
Se emplearon los vectores plasmdicos Bluescript (Stratagene) y pUCl8 y el
vector fgico Xgtl 1.
4.1.2. Productos.
Los reactivos comunes fueron de grado analftico y se emplearon sin previa
purificacin.
Los productos ATP, GTP, CTP, UTP, EDTA, EGTA, PPO, dimetil-POPOP,
Tris, Hepes, Tritn X-100, manitol, UIT, Azida sdica, 4-cloro-a-naftol, Pipes, SOS,
13-mercaptoetanol, sarcosil, la tripsina de pancreas bovino, la N-cloro sucinimida, los
adyuvantes completo e incompleto de Freund y los inhibidores de proteasas (excepto
PMSF) fueron suministrados por Sigma Chemical Co. (Estados Unidos).
Los cloruros sdico, potsico, magnsico, clcico, amnico, de cesio y de litio;
los hidrxidos sdico y potsico, la sacarosa, el glicerol, los fosfatos potsicos, el
acetato amnico, magnsico y sdico, el nitrato de plata, el cloruro de cobre, el
permanaganato potsico, el citrato sdico; el vanadato sdico; el sulfato magnsico; el
etanol; la glicina; el acido trifluoroactico, la 8-hidroxiquinoleina; el formaldehido; la
formamida y el TCA fueronadquiridos a Merck (Darmstad, Alemania).
El citocromo c, el PMSF, la proteasa VS, los marcadores de peso molecular de
DNA(X-HindII y X-HindllI-EcoRl), laDNA polimerasa1, la ONasal y la RNasafueron
adquiridos a la marcaBoehringer (Mannheim, Alemania).
La acrilamida, la bis-acrilamida y m-cresol fueron adquiridos a Fluka A. G.
Chemicals.
Los anfolitos y la protena A-Sepharosafueron suminstrados por Pharmacia-LKB
(Bromma, Suecia).
El cido actico, el isopropanol, el fenol, el cloroformo, el alcohol isoamlico, el
butanol y el metanol fueron suministrados por Panreac (Barcelona, Espaa). El acetnitrilo
y el metanol de gradoHPLC fueron adquiridos a Scharlau.
El azul de Coomasie, los marcadores de peso molecular y el Affi-Gel Hzfueron
suministrados por Bio-Rad (Richmond, Estados Unidos).
136
MATERIALES Y MTODOS
La eche Molico empleada fue de Nestie (Barcelona, Espaa).
Los productos radiactivos [cx-
32P]-CTPy [358]-Metioninafueron adquiridos en
Radiochemical Center (Amersham, ReinoUnido).
El lisado de reticulocitos y los marcadores de peso molecular de DNA fueron
suminstrados por Promega(
La albminasrica bovina(fraccin V) empleadafue de la firmaArmour (Armour
Pharmaceutical Company, Illinois, Estados Unidos).
Lahemocianina de Megatura crenukita, lasulfo-N-hidroxi succinimida y el EDC
fue suministrado por Pierce.
Los pptidos sintticos fueron adquiridos a BIO-synthesis (Denton. Estados
Unidos).
Las membranas de PVDF empleadas para la transferencia de protenas fueron
suministradas por Millipore (Bedford, Estados Unidos).
El Nycodenzfue adquirido a Nyeomed (Oslo, Noruega).
La bactotriptona. el extracto de levadura y el agar fueronde DIFCO y la agarosa
de Hispanagar (Burgos, Espaa).
El agua oxigenada fue adqurida a Foret (Barcelona, Espaa).
4.2. METODOS
4.2.1. Fraccionamiento subcelular del hgado de rata.
4.2.1.1. Preparacin de honwgenados.
Los animales fueron anestesiados y a continuacin se les perfundi el hgado a
travs de la vena porta con medio de aislamiento (medio A) de composicin: sacarosa
0.25 M, Tris-HCI 10mM, pH 7.4 y EGTA 1 mM con las siguientes concentraciones de
inhibidores de proteasas: benzamidina 100 mM, leupeptina 10 gg/ml. pepstatina 5
mg/m, cloruro de benzetonio 100 mM y PMSF 10 mM. A continuacin, el hgado se
extrajo, se pes, se troce finamente y se homogeneiz con medio A (relacin 1:4 p/v)
con un homogeneizador manual vidrio-vidrio tipo Dounce realizndose 5 pases con el
mbolo A y 4 pases con el mbolo B. Posteriormente, se centrifug a SOOxg (2.500 rpm
en rotor Sorval SS-34) durante 10 minutos. El sedimento, compuesto por ncleos y
clulas no rotas, se desech.
137
MATERIALES YMTODOS
4.2.1.2. Aislamiento de mitocondrias.
4.2.1.2.1. Mediante centrifugacin diferencial
.
Las mitocondrias de hgado de rata se aislaron segn el mtodo descrito por
Schneider (1948> , con algunas modificaciones introducidas en nuestro laboratorio
(Valcarce y col. 1988).
4.2.1.2.2. Mediante pradiente de sacarosa
.
Las mitocondrias se obtuvieron a partir de 3 ml del homogeneizado preparado
segn el apartado 2.2.1.1 mediante centrifugacin isopenica en gradientes de densidad
de sacarosa del 24 al 54% (p/p) (volumen = 35m1) a l4SOOOxg (rotor Beckmann VTI5O,
42.000 rpm) durante 70 minutos a 4
0C. Los gradientes se fraccionaron desde el fondo
del tubo enfracciones de 2 ml. La localizacin de las mitocondrias se efectu mediante
determinacin de la actividad citocromo c oxidasa en una alicuota de cada fraccin
previamente sometida a 3 ciclos de congelacin/descongelacin. Lafraccin con mayor
actividad especficacitocromo c oxidasa (d~ 1.18 g/cm3) se diluy con medio A hasta
que la concentracin de sacarosa fue de 0.25 M y se centrifug a 8000xg (8.500 rpm en
rotor Sorval 55-34) durante 10 mm a 4 0C, obtenindose un sedimento de mitocondrias
que fue resuspendido en el mnimo volumen de medio A. La densidad de los orgnulos
fue determinada tericamente a partir de los lmites de densidad superior e inferior del
gradiente, o biende formaemprica medianteanlisis por refractometrade ladensidad de
las fracciones de un gradienteen blanco procesadoen paralelo.
4.2.1.2.3. Mediante 2radiente de Nycodenz
.
Las mitocondrias se obtuvieron a partir de 2 ml dc homogeneizado preparado segn el
apartado 2.1.1. Para ello, sobre 15 ml de una solucin isotnica de Nycodenz al
27.6%(p/v) preparada en Tris-HCl 5mM, KCl 3 mM y EDTA 0.3 mM (densidad 1.15
mg/m, indice de refraccin a 22 0C de 1,3784) sedepositaron 2 ml de homogeneizado de
hgado. Los tubos se centrifugaron a 96000xg (24.000 rpm en rotor Sorval SW-27)
durante 6 h a 4 0C. Los gradientes se fraccionaron desde el fondo del tubo y el pellet
resultante se resuspendi en 100 g de medio de dilucin de Nycodenz. Se determin la
actividad citocromo coxidasa y laconcentracin de protena en cadafraccin. Lafraccin
con mayor actividad especficacitocromo c oxidasa se diluy 10 veces con medio Ay se
138
MATERIALES Y MTODOS
centrifug a 8000xg (8.500 rpm en rotor Sorval SS-34) durante 10 mm a 4
0C. El pellet
obtenido se resuspendi en el mnimo volumen de medio A.
4.2.1.3. Aislamiento de peroxisonms
4.2.1.3.1. Mediante gradiente de sacarosa
.
Se procedi de forma anloga alo descritoenel apanado 2.1.2.2. Posteriormente
se determin la actividad catalasay laconcentracin de protena en una alicuota de cada
fraccin previamente congelada y descongelada 3 veces. Las fracciones que contenanla
mxima actividad especfica catalasa fueron diluidas con Tris-HCl pH 7.5 hasta una
concentracin final de sacarosa de 0.25 M. Los peroxisomas fueron recuperados a partir
de esas fracciones mediante ultracentrifugacin a 105.OOOxg (40.000 rpm en rotor
Beckmann 75 Ti) durante 30 minutos a40C o bien mediante precipitacin del total de
protenas de lafraccin con TCA al 10%.
4.2.1.3.2. Mediante gradiente de Nvcodenz
.
La preparacin de peroxisomas seefectu de forma semejante a lo descrito en el apartado
4.2.1.2.3 para mitocondrias. Para ello, se determin la actividad catalasa en cada
fraccin. De forma totalmente reproducible, el pico de actividad especfica catalasa se
localizabaen el pellet compactoque fue resuspendidoen 100 g de medio de dilucin de
Nycodenz.
4.2.1.4. Fraccionamiento submitocondrial.
El subfraccionamiento de las niitocondrias se efectu bsicamente segn el
mtodo descrito por Colbeuy col. (1971).
4.2.1.4.1. Preparacin de solubilizado mitocondrial
.
Las mitocondrias obtenidas por los mtodos descritos en el apartado 4.2.1.2
fueron solubilizadas conTriton X-100 mediante resuspensindel pellet de mitocondrias
en 1 mIde tampn fosfato 20 mMpH 7.5. NaC 0,15M y Triton X-100 1% por cada 0.5
g de tejido heptico de partida. A continuacin, el solubilizado fue sometido a 3 ciclos de
congelacin (con nitrgeno liquido)/descongelacin (en bao de agua a 37 0C), incubado
durante 30 minutos a 370C y finalmenmte centrifugado a 104.OOOxg (40.000 rpm en
139
MATERIALES Y MTODOS
rotor Beckmann 75 Ti) durante 1 h a 4
0C. El sobrenadante constitua el solubilizado
mitocondrial.
4.2.1.4.2. Obtencin de mitoplastos
.
Las mitocondrias preparadas mediante centrifugacin diferencial (apanado
4.2.1.2.1) o mediante centrifugacin en gradiente de sacarosa (apartado 4.2.1.2.2)
fueron sometidas acheque osmtico mediante resuspensin del pellet en 3 ml de fosfato
potsico 20 mM pH 7.4 y BSA 0.02% por cada gramo de tejido heptico de partida y
posteriormente incubadas durante 20 mm a O 0C con agitacin intermitente. Los
mitoplastos resultantes fueron sedimentados mediantecentrifugacin a 13.OOOxg (10.500
rpm en rotor sorvail 55-34) durante 10 minutos a 40C.
4.2.1.4.3. Obtencin de veskulas de membrana interna mitocondrial
.
Los mitoplastos fueron sometidos achoque osmtico mediante incubacin en 1.5
ml de fosfato potsico20 mM pH 7.4 porcadamg de protena durante 15 minutos a 00C.
A continuacin, los mitoplastos fueron vesicularizados con un politron durante 30
segundos a fuerza 3 y centrifugados a 25.OOOxg (15.000 rpm en rotor Sorval SS-34)
durante 10 minutos a 4C. El pellet de vesculas de MIM fue lavado 2 veces mediante
resuspensin en fosfato potsico 20 mM pH 7.4 y sedimentacin a 25.OOOxg (15.000
rpmen rotor Sorval 55-34).
4.2.1.4.4. Purificacinparcial del complejo Fl-ATPasa
.
Se realiz esencialmente segn el protocolo propuesto por Beechy y col., (1975)
con las modificaciones introducidas por Tyler y Webb (1979). Las vesculas de MIM
fueron recogidas mediante ultracentrifugacin a 80.OOOxg (35.000 rpm en rotor 75Ti) y
el pellet se resuspendi en medio E, que contena sacarosa 0.25M, Tris-SO4 10 mM y
EDTA 5 mM hastauna concentracin de protena de 10 mg/ml. Se aadi ATPhasta una
concentracin de 100 gM y se incub durante 5 minutos a temperatura ambiente. A la
suspensin de MIM se le aadieron lentamente 0.5 vol de cloroformo con agitacin
constante e inmediatamente fue centrifugada a 1.SOOxg (3.500 en rotor Sorvail SS-34)
durante 10 mm a 250C, recogindose la fase acuosa superior, que fue centrifugada a
80.O00xg (35.000 rpm en rotor 75Ti) durante 45 minutos 220C para eliminar restos
insolubles. El sobrenadante fue distribuido en alicuotas, liofilizado y conservadoa -20 0C
hasta suutilizacin.
140
MATERIALES Y MTODOS
4.2.1.5. Preparacin defraccin citoslica
El homogeneizado de hgadode rata preparado segn lo descrito en el apartado
2.1.1 fue centrifugado a 8.500xg (8.000 rpm en un rotor Sorval SS-34) durante 10 mm
a 4
0C. El sobrenadante fue de nuevo centrifugado a 105.O00xg (40.000 rpm en un rotor
Beckmann 75Ti) durante 1 hora a 4 0C. El sobrenadante, que constitua la fraccin
citoslica, contenadel orden de 15 mg/ml de protena.
4.2.2 Preparacin de matriz de eritrocitos de rata.
La fraccin de matriz de eritrocitos de ratase obtuvo segn el mtodo descritopor
Hanahan y col. (1974), con ciertas modificaciones introducidas en nuestro laboratorio.
Sangre heparinizada de rataadulta, obtenia mediante puncinde la venaprota del animal
anestesiado fue centrifugada a l.OOOxg (3.000 rpm en rotor Sorval 55-34). El
sedimento se resuspendi en 20 ml de una solucin isotnica de Tris (310 imOsm =
0.172 M pH 7.6) y se centrifug de nuevo en las mismas condiciones. Este
procedimiento se repiti 2 veces ms. El precipitado de clulas lavadas, constituido
fundamentalmente por eritrocitos se resuspendi en una solucin hipotnica de Tris (20
imOsm = OmM pH 7.6) en una proporcin 1:1 (y/y) y se incub durante 1 hora a 00C
con agitacin intermintente. Posteriormente, las muestras fueron centrifugadas a
20.OOOxg (13.000 rpm en rotor Sorval 55-34) durante40 minutos a 4 0C, obtenindose
un precipitado compuesto por la fraccin de membrana y un sobrenadante que contenia
las protenas de la matriz del eritrocito, que fue conservada a -200C. Durante los
primeros ciclos de congelacin/descongelacin se observ de forma constante la
formacin de agregados proteicos insolubles que fueron separados de la preparacin
mediante ultracentrifugacin a 105.OOOxg (40.000 rpm en rotor Beckmann75Ti) durante
1 hora a 4 0C. Laadicin a lapreparacin de matriz de NaC hasta una concentracin final
de 0.15 M prevena parcialmenteeste efecto. Laconcentracin de protena se determin
conel reactivo de Bradford.
4.2.3 Tratamiento de choque trmico de larvas de Drosophila.
Para el tratamiento de choquetrmico de las larvas de Drosophila, grupos de 20
larvas fueron transferidas a una cmara a 37 0C durante 60 minutos. Durante esteperiodo
de tiempo se tomaron muestras a 15, 30, 45 y 60 minutos de iniciado el tratamiento. A
141
MATERIALES YMTODoS
los 60 minutos, los grupos restantes fueron trasladados de nuevo a la cmara de 25
0C y
setomaron muestras a 90 y 120 minutos desde el inicio del tratamiento. Inmediatamente
despus de tomar cada muestra las larvas fueron congeladas en nitrgeno lquido y
convertidas en polvo con la ayuda de un mortero. Al polvo de cadamuestra se le aadi
un medio que contena fosfato potsico 20 mM pH 7, NaC 0.9% y Triton X-100 al 1%
en proporcin 1:5 (plv ). La suspensin as obtenida se someti a 3 ciclos de
congelacin/descongelacin y se centrifug a 15.000 x g (12.000 rpm en microfuga)
durante 10 minutos, recogindose el sobrenadante para su posterior anlisis. La
concentracin de protena enla muestra se determin por el mtodo de Bradford.
4.2.4 Determinacin de actividades enzimticas.
4.2.4.1. Activ idad citocromo c oxidasa.
Se emple el mtodo descrito por Warton y Tzagaloff (1967), basado en la
disminucin de densidad ptica a 550 nm durante laoxidacin del citocromo c reducido.
La reaccin se dispara mediante la adicin de 25 nmol de citocromoc reducido en un
volumen final de cubeta de 1 ml. El coeficiente de extincin molar del citocromo c
reducidoa 550 nm es de 2 x io~ M.cmt
4.2.4.2. Activ idad catalasa.
La determinacin de laactividad catalasaseefectu segn el mtodo descrito por
Chance y Herbert (1950), basado en la determinacin espectrofotomtrica de la
desaparcin de H
202 midiendo a 240 nm. La reaccin se inici mediante la adicin de
100 timol de H202 a lacubeta (volumenfinal lml). El coeficiente de extincin molar del
perxido de hidrgeno a 240 nm es de 0.00394 Mlcm
1. Alternativamente, en las
muestras procedentes de gradientes de Nycodenz, la actividad catalasa se determin
mediante el mtodo volumtrico descrito por Feinstein (1949), puestoque el Nycodenz
tambinabsorbe a 240 nm. Dicho mtodo sebasa en latitulacin volumtrica redox con
permanganato potsicodel H
202 remanente.
142
MATERIALES YMTODOS
4.2.5 Fraccionamiento electrofortico de protenas.
4.2.5.1. Electroforesis nionodimensional en geles de SDS-poliacriiamido.
Los fraccionamientos de protenas se realizaron bsicamente segn el protcolo
descrito por Laemmli (1970). El porcentaje de acrilamida empleadoen cada casose indica
en los correspondientes pies de figura. La calibracin de los geles sc efectu mediante
electroforesis en paralelo de un conjunto de protenas de peso molecu]ar conocido.
4.2.5.2. Electroforesis bidimensional
4.2.5.2.1. Isoelectroenfopue/electroforesis en ~el de noliacrilamidalSDS <IEF/SDS-ET1 w115 563 m487 563 lSBT
PAGEL
El protocolo usado fue el inicialmente descrito por OFarrell (1975) con algunas
modificaciones (Bravo y col.). La separacin en la primera dimensin mediante
isoelectroenfoque fue efectuada en geles cilndricos del 4 % (p/p) de poliacrilamida de
230x2,3 mm o 150x2,3 mm con un 2% de anfolitos (16% pH 5-7, 4% pH 3.5-10). El
isoelectroenfoque se llev a cabo a 1200 V durante 20 h. Una vez finalizado ste, los
geles se equilibraron en 5 ml de tampn de composicin Tris-HCI 006M pH 6.8, SDS
2%, DIT 0.1 M y glicerol 10% durante 10 minutos y se guardaron a -30
0C hasta su
utilizacin. El gradiente de pHde os geles de laprimera dimensin oscilaba entre 4.4 y
7,5. Para la segunda dimensin, los geles del isoelectroenfoque fueron descongelados y
cargados en un gel de poliacrilamida del 15% de 25x25 cmy recubiertos de agarosa al
15% (p/v) disuelta en tampn de equilbrio con un 0.02% de azul de bromofenol. La
electroforesis sellev acabo durante todalanoche a temperaturaambiente.
4.2.5.2.2. Non-equilibrium pH sradient electrovhoresis/electroforesis en 2e1 de
poliacrilamida/SDS (NEPHGE/SDS-PAGE
)
La separacin en la primera dimensin para separar protenas bsicas se llev a
cabo siguiendo el mtodo descrito por OFarrel (1977). Los geles empleados fuerondel
4% de poliacrilamida y de 150x2.3 mm. Laelectroforesis se efectu a 400V durante 4-5
horas. El fraccionamiento en la segunda dimensin se efectu de forma anloga a lo
descrito en el apanado anterior.
143
MATERIALES Y MTODOS
4.2.5.2.3. Visualizacinde las protenas fraccionadas
.
4.2.5.2.3.1. Tincin con azul de Coomassie.
Los geles mono- o bidimensionales se fijaron en acido actico 10% (y/y) e
isopropanol 25% (y/y) durante 30 minutos y se tieron con una solucin al 7% (p/v) de
Coomasie Briuiant Blue R-250 en metanol 50% (y/y) y actico 7% (y/y). La eliminacin
del colorante no unidoa protenas se efectu mediante difusin lenta de ste en actico
10% (y/y) y metanol 25% (y/y).
4.2.5.2.3.2. Tincin con plata
Se sigui el protocol descrito por Ansorge y col. (1985). La tincin con nitrato de plata
se efectuaba directamentedespus de la electrofoirsis o bien a partir del gel previamente
teido conCoomasie, en cuyo caso, el gel teido se incubaba durante un mnimo de 4
horas en metanol al 50% (y/y).
4.2.5.2.3.3. Fluorografa
La deteccin de protenas marcadas con emisores 3 de bajaenerga (
35S) se efectu
mediante fluorografa segn el protocolo descrito por Laskey y col. (1975). El gel seco
se expuso a una pelcula de rayos XAGFA a -700C con una pantalla intensificadora
Cronex Dupont.
4.2.5.2.3.4. Autoradiografia
Las protenas marcadas con sevisualizaron mediante exposicin directadel gel teido
y seco a una pelculade rayos X a -70 0C o a temperatura ambiente.
4.2.6 Generacin de anticuerpos
4.2.6.1. Anticuerpos contra lospptidos sintticos ant-DRJ y ant-DR2.
Los pptidos sintticos DR-1 (NI-12-VGLKAPGIIPRI-COOH) y DR-2 (NH2-
YLHSRLLERAAKM-COOH) fueron sintetizados por Biosynthesis Inc. (Denton, USA).
La pureza y composicin de ambos pptidos fueron verificados por el propio proveedor
144
MATERIALES Y MTODOS
mediante HPLCen fase reversa y anlisis cuantitativo de composicin de aminocidos,
respectivamente. Para la generacin de anticuerpos contra ambos pptidos se emple la
hemocianina de Megathura crenulata (KLH) como carrier inmungeno. La conjugacin
de los pptidos al carrier seefectu a travs de los grupos amino libres empleando sulfo
N-hidroxisuccinimida (Sulfo-NHS) como agente de cross-linking y l-etil-3 (3-
dimetilamino propilcarbodiimida) (EDC) como catalizador del proceso. Los pptidos
fueron disueltos en agua a una concentracin de 2 mg/ml y se le aadi EDC hasta 50
mM y sulfo-NHS hasta 2 mM. Se incub la mezcla durante 5 minutos a temperatura
ambiente, ajustando el pH a 7 con NaOH y posteriormente se aadi un volumen de
solucin de KLH en PBS. de formaque la relacin de pesos entre KLHy pptido fuera
del orden de 0.22 g pptido por cadag de KLH. Lareaccin se dej proceder durante 2
horas a temperatura ambiente y se detuvo mediante adicin de acetato sdico pH 4.3
hasta una concentracin final de 100 mM. El rendimientode la reaccin de conjugacin
se determin mediante fraccionamiento de lamezclade reaccinmediante cromatografa
de gel-filtracin en Sephadex G-50, empleando PBS como fase mvil (volumen de
columna = 10 m), monitorizando la densidad ptica del eluato a 214 o 280 nm. La
aparicin de un nico pico a ambas longitudes de onda paraambos ppetidos indic una
conjugacin proxima al 100%. La fracciones de mxima absorbancia en el UV fueron
liofilizadas y empleadas para la inumunizacin.
El protocolo empleado para la inmunizacin fue anlogo para ambos pptidos.
Las mezclas inumungenas empleadas fueron una emulsin de 500 ~wdel conjugado
pptido-KLHresuspendidos en 250 il de PBS con 2 volmenes de adyuvante completo
de Freund (parala primera inoculacin) o 1 volumen del adyuvante incompleto de Freund
(para las sucesivas inoculaciones). La emulsin se form mediante sonicacin (5 pulsos
de 15 segundos a 18 micrones de amplitud a intervalos de 15 segundos). La
inmunizacin se efectu en conejos New Zealand medianteinoculacin del antgeno por
via intradrmica (10 inculos repartidos por toda la superficie dorsal) en la primera
inmunizacin, y por via subcutanea par el resto de las inmunizaciones. Se efectuaron un
total de 8 inoculaciones con 500 gg de conjugado y 15 das antes del sacrificio del
animal, seefectu unaltima inoculacincon 2 mg de conjugado.
El titulo de los sueros fue determinado de forma peridica cada 15 das. Para ello,
cantidades crecientes de los pptidos se aplicaron sobre una membrana de nitrocelulosa
empleando un aparatode filtracin Dot Blot (Bio-Rad, Richmond, Estados Unidos) y se
incubaron con distintas diluciones del antisuero. Lainmunoreactividad en cadapunto de
145
MATERIALES Y MTODOS
4.2.6.2. Anticuerpos contra la protena de 57 kDa de matriz de eritrocito
inmunoprecipitaa por el anticuerpo anti FI-A TPasa.
Los productos resultantes de la inmunoprecipitacin de matriz de eritrocitocon el
anticuerpo anti FI-ATPasa consisten en una banda mayoritaria de aproximadamente 57
kDa (Fig. 4.2). Con el fin de generar anticuerpos contra esta protena, los productos dc
inumunoprecipitacin se fraccionaron m ediante SOS-PAGE en geles del 7.5%. La
protena de inters fue visualizada mediante tincin con Coomasie Blue R-250 y
emp]eada directamente comoagente inmungeno segn el protocolo descrito por Harlow
y Lane (1988). Para ello, por cada dosis de antgeno, se recortaron 10 o 12 bandas,
correspondientes cada una de ellas a una reaccin de inmunoprecipitacin directaa partir
de 1 mg de protena de matriz de eritrocito y con 50 g del antisuero anbFl-ATPasa. Las
bandas fueron liofilizadas y pulverizadas posteriormentecon la ayudade un mortero. Las
bandas pulverizadas se hidrataron con aguadurante 3 horas con agitacin constante y se
homogeneizaron con ayudade un homogeneizador manual vidrio-vidrio tipo Dounce. A
la mezcla se le aadieron 2 volmenes de adyuvante completo (primera inoculacin) o
adyuvante incompleto (sucesivas inoculaciones) y se sonic a 18 micrones de amplitud
con pulsos de 15 segundos hasta la formacin de una emulsin estable. La inmunizacin
se realiz segnse ha descrito anterioremente. El titulo del antisuero se monitoriz cada
15 das, llegando ste a sunivel mximo a los 2 meses de comenzar lainmunizacin. El
ttulo del suero fue determinado medianteWestemblot de distintas cantidades de protena
de matriz de eritrocito y de mitocondria de hgado de rata (Fig. 4.3) fraccionadas
mediante SDS-PAGE, transferidas a membranas de PVDF e incubadas con distintas
diluciones del antisuero.
4.2.6.3. Anticuerpos purificados por afinidad.
Se emple el mtodo desritopor Snyder y col., (1987), que permitela obtencin
de una fraccin de IgGs especficapara una determinada protena a partir de un antisuero
obtenido contra una mezcla de protenas. Para ello, la protena cuyos anticuerpos
deseamos enriquecer especficamente es fraccionada mediante geles preparativos de
poliacrilamida-SDS, transferida a PVDF e incubada con el anticuerpo poliespecfico
durante una noche a temperatura ambiente. Lalocalizacin inequvoca de la protena de
inters en la membrana se efectu recortando un carril longitudinal en la membrana e
incubandoste posteriormente con un segundo anticuerpoconjugado con peroxidasa y
visualizacin de las bandas inmunoreactivas. Laregin del membrana de PVDFque
147
MATERIALES Y MTODOS
contena la protena fue lavada con TBS-Molico y acontinuacin incubada en GIy-HCI 5
mM pH2.3 durante 90 segundos a temperatura ambiente, con el fin de eluirla fraccin
de IgGs. ELeluido fue neutralizado inmediatamente con tampn fosfato lM pH9 y 10%
BSA.
4.2.7 Anlisis inmunolgico de protenas.
4.2.7.1. Western blot
4.2.7.1.1. Transferencia
Tras el fraccionamiento de las protenas en geles mono o bidimensionales, stas
fueron transferidas a membranas de PVDF (0.45 ~.tmde poro) en un equipo de
transferencia semi seco Pharmacia-LKB empleando una intensidad de corriente de 1
mA/cm
2 de superficie del gel. Las transferencias seefectuaron alternativamente en Gly 39
mM, Tris 48 mM, metanol 20% (y/y) y SDS 0.0375% durante 2 horas o bien en CAPS
10 mM pH 11, metanol 10% (V/V) durante 45 minutos, segn se indica en los
correspondiente pies de figura.
4.2.7.1.2. Inmunodeteccin
Las membranas fueron bloqueadas con BSA al 3% en TBS durante 1 hora a
temperatura ambientecon agitacin constante. La incubacin con el anticuerpo scefectu
durante toda lanoche a temperatura ambiente y con agitacin. El anticuerpo y ladilucin
empleados en cada caso se indican en los correspondientes pies de figura. A
continuacin, las membranas fueron lavadas con TBS-Molico (leche desnatada en polvo
al 1% (p/v) en TBS) durante 30 minutos con 3 cambios de medio de lavado.
Posteriormente, las membranas se incubaron con una dilucin 1:1500 de una anticuerpo
de cabra contra la Fc de las IgOs de conejo conjugado a peroxidasaen TBS-Molico. Las
protenas inmunoreactivas se visualizaron medianteincubacin de las membranas en Tris-
HCI 80 mM pH 7, 4-cloro a-naftol 0.06% (plv ) y H
202 0.6 mg/ml. La reaccin de
revelado se detuvo sustituyedoel medio anterior por aguadestilada.
150
MATERIALES Y MTODOS
4.2.7.2. Inmunoprecipitacion.
4.2.7.2.1. Inmunonrecipitacin directa
Se efectu esencialmente segn el mtodo recientemente descrito por nuestro
grupo (Izquierdo y col., 1990). Las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo en fosfato
20 mM, NaC 0.9% y Triton X-100 1% conteniendo solubilizado mitocondrial o matriz
de eritocitoen cantidades variables segn se indica en los correspondientes pies de figura
y entre50 y 100 p.l del antisuero anti FL-ATPasao sueropreinmune. La reaccin se dej
proceder durante 1 hora a 37 oc con agitacin suave y 3 horas o todala noche a 4 C. Los
complejos antgeno-anticuerpo fueron recogidos mediante centrifugacin a 15.000 x g
(12.000 rpm en microfuga) y lavados con los siguientes medios: fosfato 20 mMpH 7.5,
NaC 0.9% y Triton X-100 0.5 % (2 veces) y fosfato 20 mM pH 7.5 y Triton X-100
0.5% (1 vez). Los complejos inmunes fueronresuspendidos en Tris-HCl 0.0625 M pH
6.8, SDS 2%, 3-mercaptoetanol 5%, glicerol 10% y azul de bromofenol 0.02% mediante
agitacin vigorosa, posteriormente calentados a 95
0C durante 5 minutos y fraccionados
en geles de poliacrilamida-SDS. Una inmunoprecipitacin representativa a partir matriz
de eritrocitos de rata se muestra en la figura 4.2. Para el anlisis de los productos de
inmunoprecipitacin medianteelectroforesis bidimensional, el precipitado resultante se
liofiliz y se resuspendi directamente en el tampn de laprimera dimensin (urea, NP-
40, etc).
4.2.7.2.2. Inmunoprecipitacin con oroteina A-sepharosa
.
Se sigui bsicamente el protocolo descrito por Izquierdo y col. (1990). Para
ello, las preparaciones de protenas mitocondriales, de matriz de eritrocito o de
peroxisoma (segn se especificaen los correspondientes pies de figura) fueron diluidas
hasta un volumen final de 1 ml con una concentracin final de fosfato 20 mM pH 7.5,
Nac 0.9% y triton X-l00 1%. Se aadi a continuacin el antisuero correspondiente y
se incub durante 30 minutos a 37 0c y 1 hora a 4 0C con agitacin. A continuacin se
aadieron 20 s de una suspensin de protena A-sepharosa al 50% (y/y) en PBS y se
incubo a 4 0c durante 1 hora ms. Los complejos antgeno-anticuerpo-protena A-
sepharosa se sedimentaron mediantecentrifugacin en microfuga durante 10 segundos y
fueron lavados sucesivamente con 1 ml de los siguientes medios Tris-Hcl 10 mM pH 8,
Nac 0.3 M y Triton X-100 2% (1 vez), Tris-HG 10 mM pH 8, Nacl 0.5M y Triton X-
100 0.1%(1 vez) y Tris-Hcl 10 mM pH 8 y Triton X-100 0.05% (1 vez). Tras estos
lavados, se aadieron 50 s de tampn de ruptura y secalent a 95 0C durante 5 minutos.
151
MATERIALES Y MTODOS
Los productos resultantes se analizaron mediante electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS.
4.2.7.3. Croinatografla de inmunoafinidad
La purificacin de la fraccin de IgG de los sucros anti-DRl y anti-DR2 sellev a
cabo empleando el Econo-Pac Serum IgO Purification Kit (Bio-Rad, Richmond,
Estados Unidos) siguiendo las instrucciones del proveedor. Para la conjugacin de las
IgO a un soporte slido, empleamos el Affi-Gel Hz Immunoaffinity Kit (Bio-Rad,
Richmond, Estados Unidos), que permite el acoplamiento covalente de la molcula de
IgO a travs de su regin Fc a un soporte slio de Affi-Gel. Este mtodo est basadoen
la generacin de restos aldehido reactivos en la molcula de IgG a consecuencia de la
oxidacin con periodato de los restos glicosilados presentes en laFc de estas molculas.
Los intermedios as formados pueden reaccionar con un soporte slido derivatizadocon
restos de hidrazida. La conjugacin de las IgGs de los sueros anti-DRl y anti-DR2 a
Affi-Gel Hzse realiz siguiendo las instrucciones del proveedor. Los conjugados matriz
slida-IgG fueron empaquetados en columnas dc cromatografa de 1 ml de volumen,
sobre las que se aplicaron 400 mg de protena de hgado de rata. A continuacin, las
columnas se lavaron con 25 volmenes de PES con NaC 0,15 M y con 25 volmenes de
NaC 0,01 M, hastaestabilizacin de la densidad optica a 280 nm del eluato. Laelucin
de las protenas retenidas se efectu aplicando a la columna MgCl
2 2,6M hasta que la
densidad ptica del eluato a 280 nra volvi a su valor basal. Las fracciones que contenan
el picode densiodad ptica fuerondializadas conjuntamente frente a H20 y liofilizadas.
4.2.8 Anlisis peptdico de protenas y mcrosecuencacin
4.2.8.1. Digestiones con proteasa VS
La proteolisis parcial con la proteasa VS de S.aureus se efectu segn el
protocolo descrito por Cleveland (1978) para la digestin de protenas previamente
fraccionadas mediante SDS-PAGE. La proteasaVS rompe especficamente los enlaces
peptdicos situados al extremo carboxilo de residuos cidos. Para ello, la banda que
contena al protena a analizar serecort del gel tenido con azul de Coomasse y seco y se
rehidrat mediante 3 Lavados de 20 minutos con cada uno de los siguientes medios: Tris-
HCI lM pH 8.8, metanol (1:1, y/y) y Tris-HCl 1M pH 8.8, metanol (4.1, y/y),
alternando uno y otro. Acontinuacin, seaadieron 40 iii de tampn de rupturaespecial
(Tris-HCI 0.125 M pH 8.8. SDS 0.1%, EDTA 1 mM, glicerol 10% y azul de
152
MATERIALES Y MTODOS
bromofenol 0.02%), se trocearon los fragmentos de gel y secalentaron a 95 oc durante 5
minutos. Posteriormente, los fragmentos de gel se cargaron en un gel de poliacrilamida
del 15%, y en cada pocillo se aadieron las cantidades correspondientes de proteasa VS
(segn se indica en los correspondientes pies de figura), diluida en tampn de ruptura
especial. Acontinuacinse arrancla electroforesis a 15 mA por gel hasta que el frente
se encontr en la mitad del gel concentrador, momento en el que se detuvo la
electroforesis durante un tiempo determinado (30-60 minutos), dejando as que se
produjera lareaccin proteoltica. Terminadala reaccin, la electroforesis se arranc de
nuevo y se dejo transcurrir hasta su trmino. Los fragmentos peptdicos se visualizaron
mediante tincin del gel con plata segn fue descrito en el apartado 2.4.3.2. Tanto los
tiempos de digestin como la cantidad de proteasa V8 empleada en cada caso se
especifican en la seccin de resultados en el correspondiente pie de figura.La cantidad
ptima de proteasa VS fue determinada mediante digestin decatalasa de hgado de rata
con cantidades crecientes de esta proteasa. hasta observar digestin del sustrato sin
aparicin de las bandas correspondientes alaproteasa (Fig. 4.4A)
4.2.8.2. Digestin con tripsina.
La digestin con tripsina se efectu a partir de la protena obtenida de geles de
poliacrilamida teidos con azul de Coomasssie y secos. Para ello, se recort el trozo de
gel que contena la protena de nuestro inters y se rehidrat y equilibr mediante
incubacin de ste con NH
4HCO3 20 mM pH 8/metanol (1:1 y/y) con varios cambios,
hastaque el pH de los lavados fue de aproximadamente 8.4. A continuacin, las bandas
se lavaron varias veces conNH4HCO3 20 mM pH 8.4 paraeliminarel exceso de metanol
y se inici la reaccin aadiendo tripsina disuelta en NH4HCO3 20 mM pH 8.4. El
tiempode raccin as como lacantidad de tripsina empleada en cada caso se especifican
en los correspondientes pies de figura. Unavez finalizada la digestin, la muestra se
congel en N2 liquido y se liofiliz. El anlisis de los fragmentos peptdicos
correspondientes se efectu mediante SDS-PAGE y tincin con AgNO3 o mediante
HPLC en fase reversa.
4.2.8.3. Digestin con N-cioro succinimida
Se sigui el mtodos descrito por Lischwe y Ochs (1982) para la digestin de
protenas previamente fraccionadas mediante SDS-PAGE. Este agente, enpresencia de
elevadas concentraciones de urea, rompeexclusivamente los enlaces peptdicos situados
en posicin carboxilo de triptfanos. Las bandas correspondientes a la protena de
153
MATERIALES YMTODOS
FIGURA 4.4. Determinacin de las condiciones ptimas para la digestin de
protenas previamente fraccionadas mediante SDS-PAGE, empleando
proteasa VS (Cleveland y col., 1977> y N-cloro succinintida (Lischwe y
Ows, 1982).
Como sustrato de las digestiones proteoliticas, se emplearon cm ambos casos 5 jig de
catalasa de eritrocitode rata, previamentepurificadamediante centrifugacin en gradientes de
densidad de glicerol (15-50%) (ver Materiales y Mtodos) y SDS-PAGE. La banda
correspondiente a catalasa fue localizada en los geles mediante Uncin con azul de
Coomassie. En ambos casos, los fragmentos peptdicos resultantes fueron analizados
mediante SOS-PAGE en geles del 15% y Uncin conplata(Ansorgey ccl., 1985).
A. Digestin de catalasacon 5 (carril 1), 10 (carril 2), 50 (canil 3) y 100 ng (canil 4)oen
ausencia de proteasaVS. La digestin con 100 ng de proteasaen ausenciade sustrato (carril
6> penni descartar la posible existencia de fragmentos peptdicos procedentes de la
proteasa. B. Digestin de catalasa con 1,5 (carril 1), 15 (carril 2> , 75 (carril 3) y 150 mM
(carril 4) oen ausencia (canil 5) de N-cloro succinimida.
nuestro inters se recortaron del gel teido y seco y se hidrataron mediante 3 lavados de
30 minutos con H
20. A continuacin se equilibraron las bandas con una mezcla de
urea:actico:H20 (1:1:1, p/v/v) durante 40 minutos a temperatura ambiente con un
cambio de medio. A continuacin, se aadieron 5 ml del mismo medio conteniendo N-
cloro succinimida en la concentracin especificada en cada caso y se dej proceder la
154
MATERIALES Y MTODOS
reaccin durante 30 minutos. Finalmente, las bandas se lavaron con agua durante 30
minutos y se equilibraron con tampn de ruptura durante 5 minutos a 95 C. Los
productos resultantes se analizaron mediante SDS-PAGE en geles del 15% y tincin con
plata. Las condiciones ptimas para la proteolisis con este agente fueron determinadas
mediante digestin de catalasa de eritrocitos de rata con distintas concetraciones de N-
cloro succinimida y observacin del perfil de los fragmentos peptdicos resultantes
mediante SDS-PAGE y tincin con plata (Fig. 4.4B)
4.2.8.4. Digestion con bromuro de cianogeno.
Las digestiones con CNBr se efectuaron a partir de polipptidos previamente
fraccionados mediante SDS-PAGE. Este agente rompe exclusivamente los enlaces
peptdicos situados en posicin carboxilo con respecto a los residuos de metionina. La
banda que contena la protena que desebamos digerir se recort del gel tenido con azul
de Coomassie y seco y sehidrat en 100 s de cido frmico al 70%. Acontinuacin, se
aadi CNBr (concentracin final aproximada de IM) y se incub durante 24h. a
temperatura ambienteen la oscuridad. Una vezfinalizada la digestin, se aadieron a la
mezcla900 s de aguadestilada y seliofiliz. Al residuo seco resultante se le aadi 1 ml
de agua y se volvi a liofilizar. El residuo seco resultante de lasegunda liofilizacin fue
directamente resuspendido en tampn de carga de electroforesis. Los fragmentos
peptdcos resultantes se visualizaronmediante SDS-PAGE y uncin con plata.
4.2.8.4. Analsis de mezclas pepffdicas mediante HPL C enfase rev erso.
Para el anlisis de pptidos mediante HPLC en fase reversa se emple un HPLC
Beckmann System GoId con una columna de fase reversaCiS, acoplado a un detector
monocromtico Beckmann y a un colector de fracciones Pharmacia. El funcionamiento
correcto del sistema secomprob mediante anlisis de los patrones Sigma de HPLC en
las mismas condiciones de elucin que las descritas posteriormentepara la muestra. La
muestra a analizar fue liofilizaday resuspendida en 50 s de agua milliQ (millipore) con
IFA al 0.1%. A continuacinse centrifug durante 15 minutos en una microfuga para
eliminar los restos insolubles que pudieran daar a la columna. La muestra seinyect y
se efectu en primer lugar una elucinisocrtica con agua-TFA0.1% conteniendoun 1.4
% de acetonitrilo-IFA 0.085% a 0.5 ml/mm hasta estabilizacin de la lnea base. A
continuacinse efectu una elucinen gradiente con agua-TFA 0.1% (A) y acetonitrilo-
TFA 0.085% (8> conel siguiente perfil: de 1.4% a 30% de E en60 minutos, de 30% a
60% de Ben 30 minutos, de 60% a 78% de Ben 15 minutos y de 78% a 1.4% de Ben 5
155
MATERIALES Y MTODOS
minutos. Se mantuvo un flujo de 0.5 ml/ruin durante todo el gradiente. Los pptidos
fueron detectados mediantedeterminacinde ladensidad ptica a214 nm enun rango de
0.1 AUFS.
4.2.8.5. Microsecuenciacin de fragmentos peptdicos.
La preparacin de las muestras para microsecuenciacin se efectu mediante
inmunoprecipitacin, fraccionamiento de los productos de inmunoprecipitacin en SDS-
PAGE, transferencia a PVDF con tampn CAPS 10 mM pH 11, metanol 10% (y/y)
durante 30 minutos a 1 mA/cm
2 de superficie de gel y tincin de lamembranacon negro
amido para visualizar la protena. El fragmento de membrana fue recortado y enviado al
Dr. Vandeckerckbove (Rijksuniversitat Gante, Blgica). La membrana fue incubada con
500 g de PVP 0.2% (p/v) en metanol para bloquear uniones inespecficas y
posteriormente lavada 4 veces con 500 sI de H20 y 2 veces con 500 1de Tris-HCI 0.1
M pH 8. A continuacin, la membrana se incub con tripsina (Boehringer, grado de
secuenciacin) en ese mismo tampn con una concentracin final de 0.01 mg/ml y se
incub durante 4 horas a 37 0C. El sobrenadante de la digestin fue transferido a otro
tuboy los pptidos retenidos en lamembrana se eluyeron con 100 1de cido frmico al
80%. El sobrenadante y los eluatos, conteniendo los pptidos trpticos resultantes, se
fraccionaron mediante HPLC en fase reversa con una columna Cl 8 de 25 cm de
longitud. La columna fue equilibrada en un 95% de agua-TFA 0.1% (A) y un 5% de
acetonitrilo-TFA 0.1% (B). Los pptidos se eluyeron mediante un gradiente de 90
minutos en el que se pasaba de un 5% inicial a un 80% final de B. Los pptidos fueron
detectados en un espectrofotmetro acoplado al HPLC a 214 nm y una sensibilidad de
0.2 AUFS. Las fracciones que contenanpicos aislados de absorbancia a 214 nm fueron
aplicadas directamente aun secuenciadoren fase lquidaApplied Biosystcms.
4.2.9. Estudio del grado del grado de glicosilacin de polipptidos
inmunoprecipitados.
Los complejos antgeno-ntcuerpo obtenidos en el sediemto tras la
inmunoprecipitacin directa fueron resuspendidos en 50 s de un tampn de
composicin: fosfato sdico 0,lM pH 6,1; Triton X-100 1%, acetato clcico 0,1M,
leupeptina 10 sg/ml y PMSF 0,1 mM. A continuacin se aadi 1 unidad de
neuraminidasa de Arthrobacter urefaciens y seincub durantre 1 hora a 37 0C. Unavez
finalizada lareaccin, las muestras fueron congeladas con N
2 liquido y liofilizadas. El
residuo seco se resuspendi directamente en el tampn de carga de isoelectroenfoque.
156
MATERIALES YMTODOS
Los productos resultantes del tratamiento se visualizaron mediante electroforesis
bidimensional y tincin con plata.
4.2.1 0. Estudios de plegamiento proteico iii v itro.
Se sigui bsicamente el protocolo descrito por Viitanen y col., (1992). Las
protenas de la fraccin ciroslica de hgado de rata (apartado 2.1.5) a una concentracin
de 123 sM fueron incubadas a temperatura ambientedurante 30 minutos en un tampn de
composicin Tris-lIC) 80 mM pH 7.4, Dfl 4.2 mM, Tween 20 0.008% en presencia o
ausencia de urea 8M. A continuacin, las muestras fueron diluidas 100 veces en un
tampn de composicin Tris-HCl 45 mM pH 7.7, DU 3.6 mM, MgCl2 7.3 mM, KCI
7.3 mM y Tween 20 0.008% e incubadas durante otros 30 minutos a temperatura
ambiente. Las concentraciones finales de protena y ureaen la muestra fueron por tanto
de 1.23 .tM y 80 mM , respectivamente. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a
l5.OOOxg (12.000 rpm en microfuga) durante 10 minutos a temperatura ambiente. El
precipitado fue directamente resuspendido en tampn de carga de electroforesis y al
sobrenadante se le aadieron 0.1 volmenes de TCA 100% y tRNA de levadura hasta
concentracin final de 0.25 mg/ml. Tras incubacin en hielo durante 1 h, los
sobrenadantes fueron centrifugados a 15.OOOxg (12.000 rpm en microfuga) durante 10
minutos a 4
0C. El precipitadofue resuspendido en tampn de carga de electroforesis y
neutralizado con Tris base 2M. La muestras correspondientes a los sobrenadantes y a los
precipitados fueron fraccionadas mediante SDS-PAGE al 10% y las protenas
visualizadas mediantetincin con Coomassie.
4.2.11. Anlisis en electroforesis bidimensional del procesamiento de
precursores mitocondriales.
Las mitocondrias de hgado de rata fueron aisladas mediante centrifugacin
diferencial (apartado 4.2.1.2.1). El pellet resultante fue resuspendido en 1 mIde Tris 10
mM pH 7.4 y sometido a 3 ciclos de congelacin/descongelacin. La protena fue
cuantificada mediante el mtodo de Bradford y el usado mitocondrial fue dividido en
alicuotas y liofilizado..
Por otro lado, RNA poliadenilado de hgado de rata (apartado 2.14.1) fue
traducido in vitrocon 200 si de lisado de reticulocitos tratados con RNAsa en presencia
de 0.4 mCi de [35Slmetionina durante 1 hora a 30 0C. Los productos de traduccin
resultantes fueron incubados concantidades crecientes de extracto mitocondrial heptico
157
MATERIALES Y MTODOS
durante 1 hora a 30
0C. Las muestras fueron liofilizadas y conservadas a -200C hasta su
procesamientomediante IEF/SDS-PAGEo NEPHGE/SDS-PAGE.
4.2.12. Tcnicas de microscopia.
4.2.12.1. Microscopia de inmunofluorescencia indirecta.
Clulas NRK (Normal Rat Kidney) fueroncrecidas hasta semiconfluencia sobre
cubres circulares en DMEM completo suplementado son un 10% de suero de ternera
fetal. Las clulas se fijaron con metanol absoluto a -20 0C. Los cubres se incubaron a
continuacincon unas pocas gotas de antisueroa distintas diluciones o suero preinmune
segn seespecifica enlos correspondientes pies de figura durante 30 minutos a 37 0C. A
continuacin, se lavaron2 veces conPBS y se incubarondurante 20 minutos a 37 0C con
un anticuerpo contra la fraccin Fc de las inmunoglobulinas de conejo conjugado a
fluoresceina (TAGO Immunochemcals). Por ltimo, los cubres se lavaron conPBS y se
montaron sobre portaobjetos con Gelvatol~. El microscopio de fluorescencia utilizado
fue un Zeiss Axiovert 35.
4.2.12.2. Microscopia electrnica.
Las muestras de hgado de rata seprocesaron segn se ha descrito recientemente
(Cuezvay col. 1990). Las muestras se fijaron con glutaraldehido al 1% en PES y cido
tnico al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. Se deshidrataron con etanol y se
embebieron enLowicryl K4M. El paso inicial de deshidratacin se realiz a 4 0C, para a
continuacin, someterlas a etanol al 50%. y por ltimo, mantenerlas a -20 0C. Las resinas
sepolimerizaron por irradiacin con luzultravioleta durante 48 horas a -20 0C y de 24 a
48 horas a temperatura ambiente. Secciones de muestra seadherieron a una rejilla, que se
embebi en una gotade ovoalbmina 1% en PBS durante 15 minutos a 25 0C. Despus la
rejilla se transfiri a una gotadel antisuero correspondiente o suero preinmune segun se
indica en el pie de figura correspondiente y se incub durante 12-16 horas a 4 0C.
Posteriormente, el exceso de anticuerpo se elimin lavando con PES. Las rejillas se
trataron con ovoalbmina al 1% y protena Aconjugadacon oroen PBS durante 1 hora a
25 0C. A continuacin, se lav con agua, se sec y se ti con acetato de uranilo
saturado, volviendo a lavarlas con agua. Por ltimo, las rejillas con las corespondientes
muestras seexaminaron con un microscopioelectrnico JEOL 100B.
158
MATERIALES YMTODOS
4.2.13. Purificacin de cidos nucleicos.
4.2.13.1. Aislamiento de RNA de hgado de rata y RNA pol A~
El RNA total de hgado de rata se aisl siguiendo el protocolo descrito por
Garca-Ruiz y col. (1978). La purificacin de la fraccin poliA~ del RNA se realiz
mediante cromatografa de afinidad en columnas de oligo (dT) celulosa (Boehringer-
Manhelin, Alemania) segn el mtodo decsrito por Aviv y Leder (1972).
4.2.13.2. Aislamiento de DNA plasmidico.
Lapreparacin de DNA plasmdico tanto aescala preparativa (a partir de 250 ml
de cultivo saturado) como a escala anlitica (minipreps de 5 ml de cultivo saturado) se
efectu por el mtodo de la lisis alcalina (Birnboimy Doly, 1979).
4.2.13.3. Aislamiento de dna del fago ~XgtJJ
Se realiz segn el protocolo descritopor Maniatis y col. (1989).
4.2.14. Electroforesis de cidos nucleicos.
4.2.14.1. Electroforesis de RNA
El RNA total o la fraccin de poli A~ se fraccion en geles de agarosa del 1%
conteniendo formaldehido (Thomas, 1980). Posteriormente, se tieron los geles con
bromuro de etidiopara comprobar lamigracin electroforticade los RNAs ribosmicos
(28S-4.100 b y 18S-1.800 b), as como para confirmar que en todos los casos se
fraccion lamisma cantidad de RNAtotal.
4.2.14.2. Electroforesis de DNA.
La electroforesis de DNA se realiz en geles de agarosa (entre 0.7% y 1%) de
longitud variableen tampn TAE (Tris-acetato 40 mM. EDTA2mM). La calibracin de
los geles seefectu medianteelectroforesis en paralelode una mezcla de fragmentos de
DNA de longitud conocida, resultantes de la digestin del DNA del fago 2~ con las
endonucleasas HindIl (23.6, 9.6, 6.6, 4.3, 2.3, 2. 0.6 y 0.14 kbp) o EcoR y Hindil
(21.2; 5.1. 4.9, 4,2. 3.5, 2, 1.9, 1.5, 1.33, 0.9. 0.8, 0.5 y 0.1 kbp)
159
MATERIAL ES Y MTODOS
4.2.15. Manejo de genotecas de cDNA de hgadode rata.
4.2.15.1. Sntesis de una genoteca de cDNA de hgado de rata.
La sntesisde cONA a partir de RNApoli A~ de hgado de ratade E horas de vida
sellev a cabo siguiendo el mtodo de Gubler y Hoffmann (1983), basadoen la sntesis
de laprimera cadenacon transcriptasa reversa de XMV con oligo(dT) como primer y de
la segunda cadena con RNasa H (Boehringer-Manheini, Alemania) y DNA pol 1 de
E.coli. Los cDNAs as obtenidos fueron ligados al plsmido pUCiS previamente
linealizadocon BamHl, tratadocon fosfatasa alcalina y con el fragmento Klenowde la
DNApolimerasa 1 para conseguir extremos romos. Los plsmidos recombinantes as
obtenidos fueron usados paratransformarbacterias competentes de lacepa DH5 (eficacia
transformacin 6 x 106 col/sg de DNA). El screening de esta genoteca se efectu
segnel mtodo descrito por Grunstein y Hogness (1975) para latransferenciadel DNA
de las colonias transformantes a filtros de nitrocelulosa de 0.45 ~imde poro y posterior
hibridacinde stos con un oligonucletido marcado radiactivamente correspondiente a la
secuencia del cDNA de las subundades a o 3 del complejo F1-ATPasa (Garboczi y col.,
1988; Lee y col., 1990). El porcentaje de clones recombinantes fue muy bajo y nulo el
nmero de clones positivos enel screening, por lo que esta genoteca se deshech.
4.2.15.2. Screeningde una genoteca de expresin de cDNA de hgado de rata.
Para este fin, se emplearon 2 genotecas de cDNA de hgado de rata en el vector
Xgtl 1, una de ellas cedida por el Dr. Gonzlez Castao (Facultad de Medicina,
Universidad Autnoma de Madrid) y laotra, adquirida aClontech (Palo Alto, California,
Estados Unidos). En ambos casos nos basamos en la capacidad del vector lambda gtl 1
para expresar el inserto de cDNA exgeno durante el ciclo ltico de infeccin, lo que
permitela deteccin de clones positivos mediante el uso de anticuerpos especficos parala
protena codificadapor el gen de nuestro inters. Bsicamante, los procedimientos que se
han empleado para el inmunoscreening han sido: infeccin de clulas de Esclierichia
cali de lacepa Y1090 con ?~.gt1 1, plaqueo, transferenciade los productos de expresinde
las placas de lisis a los filtros de nitrocelulosae incubacin sucesiva de stos con un
anticuerpo policlonal capaz de reconocer a las subunidades a y [3 del complejo
mitocondrial Fl-ATPasa y su posterior deteccin con un anticuerpo anti IgG de conejo
conjugado con peroxidasa. El screning de ambas genotecas tambin se efectu
mediante hibridacin de los filtros con un oligonucletido de 25-mer de polaridad
160
MATERIALES Y MTODOS
positiva complementario a una regin 5del mesajero de la subunidad a del complejo FI-
ATPasa de mitocondria de hgado de rata (Lee y col. 1990), con el que no se obtuvo
resultado positivo.
Tras la identificacin de clones positivos por inmunoscreening y lapurificacin
de stos hasta homogeneidad, se procedi al aislamiento del DNA del fago XgtI 1 y
liberacin del inserto de cDNA para su posterior subclonaje en el vector plasmdico
Bluescript (Stratagene). La seleccin de transformantes se realiz por resistencia al
antibiticoamplicilina y los recombinantes fueron identificados por la coloracin blanca
de la colonia en un medio con el cromgeno X-Gal (5-bromo-4-cloro-3-indolic-3-D-
galactopiranosido) y el inductor del operon lac IPTG (Isopropil [3-D-galactopiranosido).
Todas las manipulaciones bsicas del DNA (digestiones con endonucleasas de
restriccin, defosforilaciones, ligaciones, etc.) se realizaron segn los protocolos
recomendados por el proveedor de los enzimas o segn Maniatis y col. (1989). La
cuantifiacin del DNA se realiz por comparacin de la intensidad de fluorescencia con
patrones de concentracin concida, despus de electroforesis en geles de agarosa del 1%
teidos con bromuro de etidio.
4.2.16. Anlisis de mensajeros.
4.2.16.1. Northern blot.
Los RNAs fraccionados mediante electroforesis desnaturalizante (apartado
2.13.1) se transfirieron a una membrana de GeneScreen (Dupont-NEN Research
Products. Masachusetts, Estados Unidos) empleando un equipo de transferencia
mediante vacio (LKB 2016 VacuGene Vaccum Blotting System) durante 2 horas a 10
mmHg de presin.
4.2.16.2 Marcaje de sondas de DNA.
Para el marcaje radiactivo de las sondas, aproximadamente 250 ng de DNAse
marcaroncon50 sCi de [a-
32P1-dCTPsegn el protocolo de nick-translation descrito
por Rigby y col., (1977). La separacin de los nucletidos no incorporados se realiz
mediante una columna de centrifugacinde Sephadex G-50, segn el protocolo descrito
por Maniatis y col. (1989).
161
MATERIALES Y MTODOS
4.2.16.3. Hibridacin.
Despus de fijar el RNA a lamembrana durante 2 horas a 80
0C, se prehibrid con
20 ml de una mezcla de composicin: formamida desionizada 50% (y/y). DNA de
esperma de salmn desnaturalizado 0.1 mg/m, Pipes 20 mM pH 6,4, NaC 0.8M,
EDTA 2 mM y SDS 0.5%, durante 90 minutos a 42 0C. La hibridacin se efectu en 10
ml de la misma mezcla a la que se aadieron 100 s de sonda marcada e incubacin
durante 1 hora a 60 0C y 48 horas a 42 0C. Tras la hibridacin, selav la membrana 1 vez
durante 10 minutos con 100 ml de 2xSSC atemperatura ambiente y 30 minutos con 100
ml de 0.lxSSC y SDS 0.1% a una temperatura deS 0C por debajo del punto de fusin
terico del hbrido oligonucletido-mRNA (Tm= 4 x (GC)+2 x (A+Tfl. La membrana
as lavada se expuso a una pelcula radiogrfica AGFA (X-ray FilmRP-2) a -70 0C
durante distintos tiempos con dos pantallas amplificadores de tungstato (Dupont Cronex
Lghting Plus XL)
4.2.17. Secuenciacin de DNA.
Las secuenciacin de los insertos contenidos en los plsmidos pAJ y pAJ2 se
realiz utilizando el mtodo de terminacin de cadena por incorporacin de
dideoxinucletidos trifosfato desarrollado por Sanger (1977), realizado directamente
sobre DNA de doble cadena previa desnaturalizacin de ste en medio alcalino.
La separacin de los productos de secuenciacin se realiz en geles
desnaturalizantes de acrilamida-bisacrilamida 6% (20:1) y urea 7M. El tampn de
electroforesis empleado fue TBE (Tris-borato 89 mM, EDTA 8 mM).
4.2.18. Anlisis asistido por ordenador de secuencias de protenas y cidos
nucleicos.
4.2.18.1. Anlisis de estructura de protenas.
4.2.18.1.1. Estructura onmana. Alineamientos
.
Todas las secuencias analizadas fueronextraidas del banco de datos de la NBRF
(National Basic Research Foundation) o de Swissprot. Las comparaciones de 2
secuencias seefectuaron mediante los algoritmos de Needeman y Wunsch (1970) y de
Smith y Waterman (1981), implementados respectivamente en los programas GAP y
162
MATERIALES Y MTODOS
BESTFIT del paquete de software del Genetics Computer Group de la Universidad de
Wisconsin (UWGCGSP) (Deveraux y col., 1984). El alineamiento de mltiples
secuencias proteicas pertenecientes a una misma familia (chaperoninas, subunidades a y
j3 de las F-ATPasas y subunidades A y B de las V-AlPasas) se realiz con los
programas MULTALIN y PILEUP, esteultimobasado en el algortimo de Sneath y Sokal
(1973) y tambin perteneciente al UWGCGSP. Cuando se compararon protenas de
distintas familias con bajasimilitud global de secuencia, los alineamientos se efectuaron
medianteinspeccin visual.
La identificacin de motivos conservados en un grupo de secuencias, as como de
duplicacionesdentro de una misma secuencia seefectu con el programaMOTIF.
El alineamiento mltiple de secuencias entrevarias familias proteicas permiti la
identificacin de regiones altamenteconservadas entre todas las familias. Estas regiones
fueron usadas como consensos paraefectuar bsquedas en el banco de datos con el fmde
identificarsecuencias relacionadas. Para ello, se emple el algortimode Wilbury Lipman
(1983), implementado en el programaWORDSEARCH del UWGCGSP. La existencia
en dichas regiones consenso de posiciones con residuos absolutamente conservados y
amino cidos variables fue simulado utilizando la opcin /MASK del programa
WORDESARCHdurante la bsquedt
El clculo del procentaje de similitud e identidad de secuencia en una detenninada
familiade protenas seefectu mediante comparacinde todas las protenas de esa familia
de 2 en 2 con el programa BESTFIT (Smith y Waterman, 1981) y posterior clculo de la
media aritmtica y error estandar de lamedia con todos los valores obtenidos.
4.2.18.1.2. Estructura secundaria
.
Para la prediccin de estructura secundaria de protenas, se emplearon lo 2
algoritmos ms eficaces descritos hasta la fecha. Estos son los de Gamier-Osguthorpe-
Robson (1978) y de Chou-Fasman (1978), implementados en el programa
PEPTIDESTRUCTURE del UWGCGSP. Con el fin de obtener la conformacin ms
probable para cadaresiduo, se analizaron conjuntamente las predicciones paracada uno
de las protenas estudiadas. De esta forma, disponiendo del alineamiento de estructura
primaria, es posible asignar un estado conformacional a cadaposicin aminoacdica en la
familia, promediandoel estadoconformacional predicho paracadauna de las secuencias
individuales en esa posicin. De la misma forma, cuando los 2 algortimos anteriormente
163
MATERIALES Y MTODOS
mencionados proporcionaban resultados contradictorios, se asumi como estado
conformacional ms probable el proporcionalmente ms abundante en esa posicin para
cadafamilia de protenas.
La identificacin de a-hlices anfiflicas dentro de cada secuencia se efectu
medianterepresentacin helicoidal de las caractersticas fsico-qumicas que definen alos
aminocidos proteinognicos (hidrofobicidad, carga elctricanetay polaridad)
4.2.18.2. Anlisis de secuencia de cidos nucleicos.
La identificacinde los clones obtenidos durante el screening de la genotecade
cDNA de hgado de rata fue efectuadomediante comparacin de la secuencia obtenida
contodas las secuencias de DNA incluidas en el banco de datos del GenEMBL, usando
el programa FASTA (Person y Lipmann, 1988) del UWGCGSP.
164
ABRIR CAPTULO 5

D 1015601

Загружено:

Сведения о документе

Оригинальное название

Авторское право

Доступные форматы

Поделиться этим документом

Поделиться или встроить документ

Параметры публикации

Этот документ был вам полезен?

Это неприемлемый материал?

Авторское право:

Доступные форматы

D 1015601

Загружено:

Авторское право:

Доступные форматы

UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID

Вам также может понравиться