Lab Bioqumica

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MANUAL DE PRCTICAS
DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
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MANUAL
PRCTICAS DE
LABORATORIO DE
BIOQUMICA

HERMINSUL DE JESS CANO CALLE TELIA
CAROLINA MNDEZ SNCHEZ NNIFFER
CRUZ LAITN

CUELA DE QUMICA
CULTAD DE CIENCIAS
NIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

MANUAL DE PRCTICAS
DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
Cdigo: MFOQ-BQ.01
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MANUAL
PRCTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUMICA

HERMINSUL DE JESS CANO CALLE
STELIA CAROLINA MENDEZ SANCHEZ
JENNIFFER CRUZ LAITN

UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER
FACULTAD DE CIENCIAS
2013

MANUAL DE PRCTICAS
DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
Cdigo: MFOQ-BQ.01
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Contenido

Introduccin

Pg.
1. Espectroscopa y diluciones 6
2. Determinacin experimental del pH y soluciones amortiguadoras.
13
3. Soluciones amortiguadoras II 20
4. Anlisis estructural de protenas 26
5. Mtodo de cuantificacin de protenas: mtodo de Bradford, Biuret y Lowry. 31
6. Fraccionamiento de las protenas de la leche por pI y precipitacin salina. 40
7. Separacin de protenas sricas por electroforesis en acetato de celulosa 48
8. Purificacin y caracterizacin del ADN de la cebolla 58
9. Electroforesis de cidos nucleicos en gel de agarosa 64
10. Carbohidratos XX
11. Extraccin e identificacin cualitativa de Lpidos XX
12. Peroxidasa XX

13. Amilasa
salival

XX

14. XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XX
15. XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX XX

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Introduccin

Este curso intenta introducir al estudiante a algunos de los procedimientos experimentales ms ampliamente
usados en bioqumica. Incluye anlisis de macromolculas como carbohidratos, lpidos, protenas y cidos
nucleicos; purificacin y caracterizacin de protenas, ensayos de enzimas y cintica enzimtica, aislamiento y
manipulacin de ADN y otros. El estudiante tambin se familiarizara con algunos de los equipos ms
frecuentemente usados en las prcticas de bioqumica.

Pocos artculos en la literatura estn escritos por un solo autor; la mayora tienen al menos dos autores y algunos
hasta ms de diez. Es as, que las prcticas sern llevadas a cabo en grupos de dos o tres estudiantes. Usted
puede escoger compaeros, o puede preguntar para que lo asignen a un grupo.

Antes de cada periodo de laboratorio, el estudiante necesita gastar algn tiempo leyendo la prctica, esta
lectura proveer informacin y entendimiento sobre los procedimientos a ser desarrollados. Si esto no se hace,
usted desperdiciara mucho tiempo de clase, y perjudicara a los dems estudiantes y al profesor. Tambin
encontrara difcil responder las preguntas de la prctica que deben ser entregadas cada da.

ASPECTOS FILOSOFICOS: La investigacin cientfica involucra una exploracin de lo desconocido. En
algunos casos, una pregunta tiene una respuesta correcta, la cual es conocida por el profesor e impartida a
los estudiantes. En investigacin, por otro lado, la respuesta correcta es raramente conocida de antemano y
debe siempre ser deducida de los resultados experimentales. Los investigadores deben por lo tanto
acostumbrarse a algn nivel de incertidumbre sobre la respuesta correcta a una pregunta experimental,
y debe siempre permanecer abierto a la evidencia experimental que contradice una hiptesis que ha surgido
de experimentos previos. Su trabajo como cientfico ser considerar sus datos, y tratar de interpretarlos.
En este contexto, respuestas equivocadas son respuestas que son contradichas por sus datos o que no
producen una conclusin lgica de los datos que usted ha recolectado. As, usted debe ser muy cuidadoso
cuando reporte datos o resultados de lo que usted hizo u observo, especialmente si usted observa algo
inesperado. Fraude cientfico, en la cual personas intencionalmente reportan datos falsos, es considerado muy
en serio porque esto resulta en una creencia difcil de sobreponer ya que es un estamento que entra en conflicto
con la verdad. En algunas ocasiones vemos en la literatura retractaciones, en la cual un cientfico publica
un estamento de una informacin dada en un articulo previo como el resultado de un artefacto y no como
una reflexin de la respuesta correcta. Evitando as la pena de publicar una retractacin y ser visto como
una persona que no es cuidadosa en el desarrollo de experimentos y en la interpretacin de resultados.

Otro asunto crtico es la apropiada citacin de las fuentes de informacin que usted usa para escritos cientficos.
Se debe siempre referenciar apropiadamente los autores de artculos y libros que usted consulta. Si usted no lo
hace, estar reclamando crdito por trabajo desarrollado por otros.

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1. ESPECTROSCOPA Y DILUCIONES

Tipo de prctica: Duracin: Indicaciones de peligro:
Grupal (2 personas) 4 horas No presenta indicadores de peligro

1.1. Objetivos

Adquirir habilidades y competencias bsicas en el desempeo dentro de un laboratorio de bioqumica.
Determinacin cuantitativa de la concentracin de CuSO
4
en una muestra problema mediante
espectroscopa de absorcin molecular UV-VIS.
Comprender y aplicar los conceptos de molaridad, normalidad, porcentajes de peso a peso y dilucin.

1.2. Conceptos relacionados

Absorbancia, ley de Lambert-Beer, dilucin, espectrofotometra.

1.3. Fundamento terico

1.3.1. Espectroscopa

Un espectrofotmetro es un instrumento para medir la absorbancia de una solucin. La absorbancia es una
medida cuantitativa til y est relacionada con la concentracin a travs de la ley de Beer-Lambert, la cual
establece lo siguiente:

Donde A es la absorbancia de la muestra a una longitud de onda dada, es el coeficiente de extincin del
compuesto a esa longitud de onda y sus unidades son (Mcm)
-1
, c es la concentracin molar de la especie
que absorbe, y l es la longitud de paso de la celda que contiene la solucin donde se realiza la medicin y est
dada en cm. As, si el coeficiente de extincin es conocido, la absorbancia de la solucin puede ser usada
para calcular la concentracin de la especie en solucin (asumiendo que la nica especie que absorbe
es el compuesto de inters).

La explicacin anterior de por qu medimos la absorbancia no explica lo que significa la absorbancia en s. Otra
definicin ms precisa est dada por la expresin (2):

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( )

Donde I
0
es la cantidad de luz que entra a la muestra, e I es la cantidad de luz que sale de la muestra. La
absorbancia es por lo tanto una medida de la porcin de luz que llega al detector. De lo cual se deduce que
cuando la absorbancia vale 1, solo el 10% de la luz alcanza el detector, y cuando es 2, solo el 1% de la luz
alcanza el detector.

Figura 1. Arreglo interno tpico de una cubeta de en el espectrofotmetro.

Valores de absorbancia mayores de 2 no son confiables porque muy poca luz est alcanzando el detector para permitir
mediciones acertadas. Cuando se realizan las mediciones, si el valor de absorbancia es mayor de 2, se debe diluir la
muestra y realizar las mediciones nuevamente.

Un espectrofotmetro interpretar huellas presentes en las caras pticas de la cubeta, como tambin burbujas
de aire o presencia de slidos en la solucin, afectando los valores reales de la medicin. Antes de colocar la
cubeta se deben tener en cuenta estos aspectos.

Algunas cubetas estn diseadas para luz visible nicamente. Cuando el espectrofotmetro est en modo de
ultravioleta (340 nm o menos) asegrese que su cubeta no tiene gran absorbancia cuando solamente contiene
agua.

El trmino espectroscopia proviene de la palabra espectro que originalmente se refera a los mltiples
colores de luz que aparecan al analizar luz blanca a travs de un prisma. Implica por lo tanto, el uso de mltiples
longitudes de onda de luz.

Los espectrofotmetros tienen entonces la habilidad de medir absorbancia a valores especficos de longitud de
onda. El mtodo usado ms comnmente involucra un monocromador que permite descomponer la luz
incidente en sus componentes con diferentes longitudes de onda y de esta forma escoger una longitud de onda a
la cual una muestra dada absorbe con mayor intensidad. La habilidad para medir la absorbancia a diferentes
longitudes de onda es muy til porque el coeficiente de extincin vara al variar la longitud de onda. Adems, el

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espectro de absorbancia puede variar dependiendo de la composicin qumica del compuesto y el ambiente
(solvente) alrededor de este.

La figura 2 muestra el espectro de absorbancia de una protena. Esta tiene un valor muy alto de absorbancia de
alrededor de 280 nm, y muy bajo a mayores longitudes de onda. Para esta protena, los nicos cromforos que
absorben a esta longitud de onda son los anillos aromticos de los aminocidos tirosina y triptfano. Como estas
protenas absorben en el ultravioleta, son incoloras. Sin embargo, hay otras protenas que absorban en la regin
visible como lo son la Hemoglobina que posee un grupo (Hemo) que absorbe fuertemente en esta regin.

Figura 2. Espectro absorcin ultravioleta de una protena.

El coeficiente de extincin de una molcula a una longitud de onda dada puede ser calculado utilizando la ley de
Beer-Lambert para medidas de absorbancia de soluciones de concentracin conocida.

1.3.2. Diluciones

Muchas soluciones usadas en bioqumica son preparadas por dilucin de una solucin estndar. Para esto se
necesita considerar la concentracin final deseada y el volumen requerido del material diluido, esto se puede
hacer utilizando la ecuacin (3).

Donde C
1
en la concentracin inicial, V
1
es el volumen inicial, V
2
es el volumen del material diluido y C
2
en la
concentracin final del material diluido.

Consideremos un ejemplo. Se necesita preparar unas diluciones para una curva de calibracin. Se tiene una
solucin estndar de 1000 g/mL de un compuesto y se necesita preparar 200 L de una solucin 20 g/mL. El
clculo entonces es:

(

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V
1
=?
C
1
= 1000 g/mL
V
2
=200 L
C
2
= 20 g/mL

) (

)
Esto quiere decir que se toman 4 L de la solucin inicial, se le adiciona 196 L de disolvente para obtener la
solucin final de concentracin conocida.

Otro factor importante es la nomenclatura para las diluciones la cual se muestra como una relacin. Por
ejemplo: Una relacin 1:2 quiere decir que a un volumen inicial se le agrega otro volumen de solvente para
lograr el volumen final. Una relacin 1:5 quiere decir que a un volumen inicial se le agregan 4 volmenes de
solvente. Otras veces la nomenclatura est dada en valores de X, por ejemplo una solucin 10X. Si se quiere
preparar de esta una dilucin 1X se necesitara una relacin 1:10 para prepararla. De la misma forma se pueden
preparar otras diluciones para realizar una curva de calibracin. En este experimento, se aprender cmo
preparar diluciones, cmo usar el espectrofotmetro y cmo interpretar los datos.

1.4. Materiales

Pipetas
Puntas para pipetas
Papel parafinado

1.5. Equipos

Espectrofotmetro UV-Vis

1.6. Sustancias

Sulfato de cobre (CuSO
4
) 0,1 M
Solucin problema de CuSO
4

1.7. Procedimiento

1.7.1. Dilucin simple 1

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Colocar la longitud de onda a un valor de 700 nm y calibrar un blanco a cero con agua.
Preparar 3 mL de las siguientes diluciones de CuSO
4
usando agua destilada: 1:2, 1:5, 1:10, 1:50, y 1:100.
Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para cada dilucin.

1.7.2. Dilucin simple 2

Asumiendo que la solucin estndar de CuSO
4
es 5X, preparar las siguientes diluciones: 0,5X, 1X, 2X.

1.7.3. Diluciones en serie

Preparar las siguientes diluciones de CuSO
4
usando dilucin en serie: 1:5, 1:25, 1:125, y 1:625.

1.7.4. Aplicacin experimental

Leer y registrar la absorbancia a la longitud de onda dada para las soluciones o diluciones de
concentracin desconocida.

1.8. Disposicin de los residuos

Tabla. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.

Sustancia o Mezcla Recipiente rotulado
Todos sern descartados en el recipiente indicado Residuos acuosos

1.9. Consultar antes de la prctica

a) Una disolucin que contiene 4.48 ppm de KMnO
4
presenta una transmitancia de 0.309 en un cubeta de
1.00 cm a 520 nm. Calcular la absortividad molar del KMnO
4
.

b) El complejo FeSCN
+2
, cuya longitud de onda de mxima absorcin es 580 mn, tiene una absortividad molar
de 7.00 X 10
3
L cm
-1
mol
-1
. Calcular:

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1. La absorbancia a 580 nm de una disolucin del complejo 2.50 X 10
-5
M,si se mide en una cubeta de
1.00 cm
2. La absorbancia de una disolucin del complejo cuya concentracin es el doble de la del apartado
anterior.
3. La trasmitancia de las disoluciones descritas en los apartados 1 y 2.
4. La absorbancia de una solucin cuya transmitancia es la mitad de la descita en el apartado 1.
c) La constante de equilibrio del par cido/base conjugado:

Es 8.00 X 10
-5
. A partir de la siguiente informacin

Especie Mximo de absorcin,
nm
Absortividad Molar
430 nm 600nm
HIn
430 8.04X10
3
1.23X10
3

In-
600 0.775X10
3
6.96X10
3

1. Calcular la absorbancia a 430 nm y a 600 nm de las disoluciones de indicador con las siguientes
concentraciones: 3,00 x 10-4 M; 2,00 X 10-4; 1,00 X 10-4 M; 0,500 X 10-4 M y 0,250 X 10-4 M.
2. Representar grficamente la absorbancia como funcin de la concentracin de indicador.

Referencias bibliogrficas

1) UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA.
Bioqumica: aulas prticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega. Captulo 3
(2006).
3) Skoog D. A., West D. M. y Holler F.J., "Fundamentos de Qumica Analtica". Ed. Reverte.
Barcelona. 1997.

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2. DETERMINACIN EXPERIMENTAL DEL pH Y
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS


2.1. Objetivos
Determinar el pH de una solucin utilizando mtodos colorimtricos o
potenciomtricos.
Reconocer la capacidad tampn de aminocidos y protenas
Relacionar los conocimientos adquiridos del funcionamiento de las soluciones tampn
de importancia biolgica.
Concepto de cido-base, ionizacin del agua, definicin de pH y pKa, ecuacin de
Henderson-Hassenbalch, capacidad tampn, valores de pKa de aminocidos.

El pH de una solucin acuosa se define como el logaritmo negativo de la concentracin

+
molar de hidrogeniones (H
3
O
). La determinacin de pH es muy importante, ya que
influencia de manera directa en la carga de la molcula y en su actividad biolgica. El producto
inico del agua es la base de la escala del pH propuesta por Srensen (:k =[ H
+
10
-14
, pH = -log [ H
+
]).
] [ OH
-
] =

La escala de pH permite expresar la concentracin de iones hidronio (protn
hidratado) comprendida entre 1M y 1X10
-14
M, extremos que corresponden a pH 0 y 14, la
neutralidad es igual a pH 7.0.
La manera mas conveniente y exacta de determinar el pH es usando un electrodo de vidrio.
Este electrodo depende del intercambio de iones en las capas hidratadas formadas sobre
la superficie del electrodo de vidrio.

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Generalmente se utiliza vidrio compuesto de aproximadamente 22% de Na
2
O, 6% de
CaO y 72% de SiO
2
. Este vidrio muestra una especificidad hacia los iones hidrgeno hasta un
pH de cerca de 9; a valores mayores de pH, la membrana se vuelve sensible a iones
sodio y otros iones alcalinos. Esto se evita empleando membranas construidas con vidrio en
que el sodio se remplaza por litio. El electrodo de vidrio debe mantenerse en agua
destilada o en solucin de KCl saturada para evitar el crecimiento de microrganismos.
En el electrodo de vidrio est presente un electrodo de referencia interno de
plata/cloruro de plata (Ag/AgCl) rodeado por un electrolito de HCl 0.1M. Este electrodo de
referencia interno produce un potencial estacionario.

El electrodo de vidrio acta como una batera cuyo voltaje depende la actividad del H
+
de la
solucin en que est sumergida. En el pHmetro, el electrodo de vidrio y el electrodo de
referencia de calomel, estn diseados para que a pH 7 d un potencial cero. Antes de
medirse el pH de una solucin desconocida el pHmetro se estandariza con soluciones
amortiguadoras de pH conocidos.
El voltaje depende de la temperatura, por lo que los potencimetros tienen un control de
ajuste para la temperatura de la solucin. Los electrodos de vidrio son frgiles y caros, por lo
tanto deben manejarse con cuidado. Si se mide el pH de soluciones de protenas, se puede
formar una capa delgada en el electrodo la cual puede removerse sumergiendo en HCl
0.1N, y despus limpiando con detergente diluido y enjuagando con agua.

Por otro lado, las soluciones amortiguadoras (buffers o soluciones tampn), son
aquellas capaces de mantener el pH dentro de un rango de variacin mnima. Estn
formadas generalmente por un cido dbil y su base conjugada cuando se trabaja a pHs por
debajo de
7. En el caso de pHs alcalinos se usa una base dbil con su cido conjugado respectivo. La
eficiencia de una solucin reguladora est regida por dos factores: (a) La concentracin total
del regulador (suma de las concentraciones del cido dbil y de la sal). Cuanto ms
concentrado sea un regulador, ms tolerante ser a la adicin de cidos o bases fuerte. (b)
Por la relacin existente entre la base conjugada y el cido. Cuando esta relacin es igual a 1,
la solucin reguladora tiene su mxima eficiencia.

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Este valor se alcanza cuando el pH del regulador es igual al pKa de cido. La
E=ecuacin de Henderson y Hasselbalch, es muy til para la preparacin de las soluciones
amortiguadoras. (pH = pKa + log [sal]/ [cido]). El pH mas adecuado para que una
solucin amortiguadora funcione eficientemente, es cuando se encuentra en un rango de
pH igual a su pKa 1.

2.4. Materiales

8 tubos de ensayo
Pipetas (5-10 mL)
Varillas de agitacin
3 vasos de precipitados (50 o 100
mL)

2.5. Equipos
PHmtro

2.6. Sustancias
Soluciones tampn de pH 3,5,7,9 y
10
Indicador universal
cido brico
Fosfato de sodio monobsico
(NaH
2
PO
4
)

NaOH 0.1 M
cido ortofosfrico
HCl O.1 M
cido actico glacial
Fosfato de sodio dibsico
(Na
2
HPO
4
.7H
2
O)

2.7. Procedimiento
1. Determinacin del pH mediante el mtodo potenciomtrico.

1) Preparacin de soluciones en un rango de pH de 3-10:
Pesar 0.5 g de cido brico y disolver en un 100mL de agua destilada, adicionar 560 L de
cido ortofosfrico y 480 L de cido actico glacial, completar hasta 200 mL de agua
destilada. El pH de la solucin da alrededor de 1.9.

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A partir de esta solucin, a 25 mL de la solucin anterior adicionar NaOH 0.2 M, con ayuda
de una bureta, para obtener diferentes pHs. Realizar los clculos tericos del volumen de
NaOH para obtener soluciones a pH 3,5, 7,9 y 10. Comparar estos datos con los obtenidos
experimentalmente.

2) Preparacin de una solucin tampn de fosfato 0.1M a pH 7.0

A) Pesar 2.78 g de fosfato de sodio monobsico (NaH
2
PO
4
) y disolver en agua en un baln
volumtrico de 100 mL, para obtener una solucin de 0.2M.
B) Pesar 5.365 g de fosfato de sodio dibsico (Na
2
HPO
4
.7H
2
O) o 7.17g
(Na
2
HPO
4
.12H
2
O) y disolver en agua en un baln volumtrico de 100 mL, para
obtener una solucin de 0.2M.

Mezclar 9,75 mL de la solucin A con 15,25 mL de la solucin B y diluir hasta 50 mL para
obtener una solucin tampn de fosfato 0.1M a pH=7.0.
La tabla 1 contiene los volmenes de las soluciones A y B necesarios para obtener
soluciones tampn de fosfato a diferentes pHs. Determinar el pH terico y experimental.
Tabla 1. Relacin entre los volmenes de las soluciones A y B para obtener diferentes
pHs.

A (mL) B(mL) pH A(mL) B(mL) pH
23.5 1.5 16 9
23 2 15 10
22,5 2,5 14 11
22 3 13 12
21.5 3.5 12 13
21 4 11 14
20.5 4.5 10 15
20 5 9 14

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19 6 7 18
18 7 5 20
17 8 3 22

2. Determinacin del pH mediante el mtodo colorimtrico.

1) Preparacin de las soluciones con papel universal:

Pesar 0.05g de naranja de metilo, 0,15g de rojo de metilo, 0.30g de azul de bromotimol,
0.35g de fenolftalena y el 66% de alcohol etlico a un litro.

Escala estndar

Preparar una batera de 8 tubos de ensayo y colocar en cada tubo de ensayo 1mL de las
soluciones preparadas en un rango de pH de 3-10. Adicionar 5 gotas de indicador universal
y 9 mL de agua destilada.

Experimentacin
Experimento 1: Determinacin del pH.

Tubo 1: 5 gotas de indicador+10 mL de agua
Tubo 2: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solucin tampn pH 7.0 + 9 mL de agua.
Tubo 3: 5 gotas de indicador+10 mL de agua
Tubo 4: 5 gotas de indicador+ 1 mL de solucin tampn pH 7.0 + 9 mL de agua.
Determinar el pH de cada solucin y anotar los resultados en una tabla

Experimento II: Capacidad amortiguadora

Tubo 1: Adicionar una gota de NaOH 0.1M + 9 mL de agua destilada
Tubo 2: 9 mL de solucin amortiguadora a pH= 7.0+ una gota de NaOH 0.1M

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*Observar, determinar el pH y anotar en una tabla.

Soplar por 15 segundo el tubo 1 y por un minuto el tubo 2. Observar el cambio de color,
determinar el pH (pHmetro) y anotar en una tabla.

Tubo 3: 9 mL de agua destilada+ 2 gotas de HCl 0.1M +
Tubo 4: 9 mL de solucin amortiguadora a pH= 7.0+ 2 gotas de HCl 0.1M
Observar, determinar el pH y anotar en una tabla.
Continuar adicionando gota a gota HCl 0.1M al tubo 4 hasta obtener el mismo color del tubo
3. Determinar el nmero de gotas. Qu pueden concluir?.


Tabla 2. Disposicin final de los residuos generados en la prctica.

Todos sern descartados en el recipiente indicado Residuos acuosos


1) Colocar en orden decreciente de acidez las siguientes soluciones: CH
3
COOH 1M,
agua, NaOH 1M y HCl 1M.
2) Calcular la [H
+
] y [OH
-
] que estn presentes en una solucin de HCl 1 mM.
3) Calcular la concentracin de protones, en mol/L, de una solucin de cido actico 1M,
sabiendo que la K
a
del cido actico a 25C es de 1.86*10
-5
.

4) Calcular el punto isoelctrico de la Glicina sabiendo sus valores de pK
a1
=2.4 y
pK
a2
=9.7.
5) Calcular el valor del pH de una solucin de a) 1mM de H
2
SO
4
, b) 1mM de NaOH,
asumiendo que en ambos los solutos estn completamente ionizados. Cul sera el

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valor del pH de la solucin resultante de la mezcla de 25 mL de H
2
SO
4
con 20 mL de
solucin de NaOH?


1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical Biochemistry.
Fifth edition. Cambridge University Press.
2. UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA.
3. Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega.
Captulo 3 (2006).
4. Observaciones Oveimar

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3. DISEO DE SOLUCIONES AMORTIGUADORAS II


Grupal (2 personas) 4 horas

3.1. Objetivos
Explorar las caractersticas de los sistemas amortiguadores y la forma como
mantienen valores constantes de pH.
Determinar la K
a
para un cido dbil o K
b
para una base dbil.
Preparar una solucin amortiguadora de un pH determinado.
Predecir la magnitud del cambio de pH cuando se adiciona acido o base a una
solucin amortiguadora.

Soluciones tampn, equivalentes cido-base, equilibrio inico, producto inico del agua,
contante de disociacin del agua, capacidad amortiguadora.

Las soluciones amortiguadoras son crticas en los procesos biolgicos y en general los
seres vivos utilizan diferentes tipos de soluciones amortiguadoras para controlar el pH a la
cual se llevan a cabo las reacciones.

Una solucin amortiguadora es una sustancia que mantiene constante el pH despus de la
adicin de pequeas cantidades de cido o base. Un sistema de este tipo, consiste de un
cido o base dbil y su respectiva sal, por ejemplo el cido carbnico y el bicarbonato de
sodio son un sistema amortiguador.

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El pH de una mezcla amortiguadora se puede conocer mediante la ecuacin de
Henderson-Hasselbalch:

A partir de esta frmula se pueden deducir fcilmente las propiedades de los
amortiguadores:

1.- El pH de una disolucin amortiguadora depende de la naturaleza del cido dbil que lo
integra (de su pKa), de modo que para cantidades equimoleculares de sal y de cido, el pH
es justamente el pKa de este cido. Dicho de otra forma, se puede definir el pKa de un
cido dbil como el pH del sistema amortiguador que se obtiene cuando [sal] = [cido]
(Figura de la derecha).

2.- El pH del sistema amortiguador depende de la proporcin relativa entre la sal y el
cido, pero no de las concentraciones absolutas de estos componentes. De aqu se
deduce que aadiendo agua al sistema, las concentraciones de sal y cido disminuyen
paralelamente, pero su cociente permanece constante, y el pH no cambia. Sin embargo, si
la dilucin llega a ser muy grande, el equilibrio de disociacin del cido se desplazara hacia
la derecha, aumentando la [sal] y disminuyendo [cido], con lo cual el cociente aumenta y
el pH tambin, de forma que se ira acercando gradualmente a la neutralidad (pH 7).

3.- Cuando se aaden cidos o bases fuertes a la disolucin amortiguadora, el equilibrio se
desplaza en el sentido de eliminar el cido aadido (hacia la izquierda) o de neutralizar la
base aadida (hacia la derecha). Este desplazamiento afecta a las proporciones relativas de
sal y cido en el equilibrio. Como el pH vara con el logaritmo de este cociente, la
modificacin del pH resulta exigua hasta que uno de los componentes est prximo a
agotarse
3

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Como ejemplo de lo anterior, la adicin de 10 mL de una solucin 0,10 m de NaOH a 1 L
de agua destilada incrementa el pH de en 4 unidades (de 7 a 11). Para una solucin que
contiene 0,20 mol/L de cido etanoco (CH
3
COOH) y etanoato de sodio (CH
3
COONa)
su pH es de 4,76.

Cuando se le agregan cantidades moderadas de un cido o una base a esta ltima solucin,
el pH experimenta pocos cambios; as tendremos que la adicin de 10 mL de una solucin
de NaOH 0,10 M en un litro de la solucin de cido etanoco (CH
3
COOH) y etanoato de
sodio (CH
3
COONa), incrementa el pH en 0,01 unidades, es decir el nuevo pH de la
solucin es 4,77.

Por lo que tendremos que una solucin amortiguadora es capaz de resistir cambios en el
pH en comparacin al agua pura, o en comparacin con un cido al cual se le agrega cierta
cantidad de base, o lo contrario, una base a la cual se le agrega cierta cantidad de cido.

Por ejemplo la solucin amortiguadora preparada entre cido etanoco (CH
3
COOH) y
etanoato de sodio (CH
3
COONa):

El cido etanoico y su anin CH COO
-
reacciona con los iones H
+
u OH
-
que puedan ser
agregados a la solucin. Cuando un cido se aade a esta solucin, el ion etanoato
reacciona formando cido etanoco, el cual no se disocia completamente en agua
(electrolito dbil) de acuerdo a la siguiente reaccin:

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De esta forma el pH de la solucin no cambia.

Cuando una base se aade a esta solucin, el cido etanoico reacciona con los iones OH
-
,
de acuerdo a la siguiente reaccin:

Debido a que el ion etanoato no es una base lo suficientemente fuerte para aceptar iones
H
+
del agua, el pH de la solucin no presenta cambios significativos.

Una solucin amortiguadora no puede actuar de forma eficiente si se adiciona cido o
base es adicionado al sistema. La cantidad de cido o base que se puede agregar a una
solucin amortiguadora antes de cambiar de forma significativa su pH de denomina
capacidad de amortiguacin o capacidad buffer.

Ejemplos de soluciones amortiguadoras importantes corresponden al sistema cido
carbnico anin bicarbonato, responsable de mantener el pH de la sangre dentro del
intervalo pequeo de variaciones, indispensable en los humanos.

3.4. Materiales
Esptula
Erlenmeyer de 250 mL
pH metro

Pipeta de 10 mL
Vaso de preciptado de 250 mL

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3.5. Sustancias
Cloruro de sodio (NaCl) 0,1 M
Hidrogenosulfato de sodio
(NaHSO
4
) 0,1 M
Acetato de sodio (CH
3
COONa)
0,1 M
cido actico (CH
3
COOH) 0,1 M

Carbonato de sodio (Na
2
CO
3
) 0,1 M
Hidrogenocarbonato de sodio
(NaHCO
3
) 0,1 M
Hidrxido de sodio (NaOH) 0,1 M
cido clorhdrico (HCl) 0,1 M

3.6. Procedimiento
Escribir las ecuaciones netas para soluciones de NaCl, NaHSO
4
, CH
3
COONa,
CH
3
COOH, Na
2
CO
3
, y NaHCO
3
0,1 M, y calcular los valores de pH de forma
terica.
Usar un pH metro para medir los valores de pH de las soluciones anteriores.
Preparar soluciones amortiguadoras 0,1 M de: CH
3
COOH, CH
3
COONa, Na
2
CO
3
y NaHCO
3.
Realizar los clculos tericos de pH y compararlos con los resultados
experimentales obtenidos.
Tomar 25 mL de la solucin cida y mezclarla con 25 mL de la sal. Medir el pH de
la solucin amortiguadora. Escribir las reacciones respectivas y realizar los clculos.
Dividir la solucin anterior en 2 volmenes iguales. Adicionar 1 mL de NaOH 0,1
M a una mitad y HCl 0,1 M a la otra mitad. Registre el pH de estas soluciones
despus de la adicin.
Poner 25 mL de agua destilada en dos erlenmeyers y medirles el pH. Adicionar 1
mL de NaOH 0,1 M a uno y HCl 0,1 M al otro. Registrar el pH de estas soluciones
despus de la adicin.
Preparar una solucin amortiguadora mezclando 1 mL de la solucin cida y 10 mL
de la base conjugada. Medir el pH. Calcular con estos datos el pK
a
y el K
a
del cido.
Preparar una solucin amortiguadora mezclando 10 mL del cido y 1 mL de
solucin de la base conjugada. Medir el pH y calcular con estos datos el pK
a
y el K
a
.
Comparar resultados con el punto anterior.

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Todos sern descartados en el recipiente indicado
Residuos acuosos

(Buffer)

1. Porque el pH del potencimetro se ajusta primero a pH 7 y no a 4 o 10?
2. Porque el electrodo se tiene que mantener en una solucin de KCl
saturado? En caso de no contar en el laboratorio con KCl, Que otros
compuestos pueden usarse?
3. Si quisieras preparar un buffer de fosfatos de potasio pH 11, Qu sales
seleccionaras?
4. El buffer de acetato de sodio que preparaste est a un pH que se puede
considerar adecuado para servir como solucin reguladora? .Explica tu
respuesta.
5. En la preparacin del acetato de sodio, cual es el cido y cual la base
conjugada.

1. Wilson, K., and Walker, J. 2000. Principles and Techniques of practical
Biochemistry. Fifth edition. Cambridge University Press.
2. Robert, JF., and White B.J. 1990. Biochemical techniques theory and practice.
1st edition. Waveland Press, Inc. USA.
3. Douglas A. Skoog and Donald M. West.1971. Principles of Instrumental
Analysis. Holt, Rinehart and Winston, Inc.
4. Rodney F. Boyer.1986. Modern Experimental Biochemistry. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc.

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4. ANLISIS ESTRUCTURAL DE PROTEINAS

Grupal (2 personas) 3 horas Ninguna

4.1. Objetivos
Obtener la estructura primaria de protenas de bases de datos
Analizar la estructura secundaria y terciaria de protenas obtenidas en bases de datos.
Usar visualizadores de protenas.

Pptidos, estructura secundaria, protenas, -hlice y hoja .

Los pptidos (del griego , pepts, digerido) son un tipo de molculas formadas por
la unin de varios aminocidos mediante enlaces peptdicos.

Figura 1. Reaccin de formacin del enlace peptdico.
El enlace peptdico es un enlace covalente entre el grupo amino (NH2) de un aminocido y
el grupo carboxilo (COOH) de otro aminocido. Los pptidos y las protenas estn
formados por la unin de aminocidos mediante enlaces peptdicos. El enlace peptdico

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implica la prdida de una molcula de agua y la formacin de un enlace covalente CO-NH. Es,
en realidad, un enlace amida sustituido. Podemos seguir aadiendo aminocidos al pptido,
pero siempre en el extremo -COOH terminal.
Los pptidos, al igual que las protenas, estn presentes en la naturaleza y son responsables
por un gran nmero de funciones, muchas de las cuales todava no se conocen.
La unin de un bajo nmero de aminocidos da lugar a un pptido, y si el nmero es alto, a
una protena, aunque los lmites entre ambos no estn definidos. Orientativamente:
Oligopptido: de 2 a 9 aminocidos.
Polipptido: entre 10 y 100 aminocidos.
Protena: ms de 100 aminocidos.
Las protenas con una sola cadena polipeptdica se denominan protenas monomricas,
mientras que las compuestas de ms de una cadena polipeptdica se conocen como protenas
multimricas.
La estructura secundaria de las protenas es el plegamiento regular local entre residuos
aminoacdicos cercanos de la cadena polipeptdica. Se adopta gracias a la formacin de
enlaces de hidrgeno entre los grupos carbonilo (-CO-) y amino (-NH-) de los carbonos
involucrados en las uniones peptdicas de aminocidos cercanos en la cadena. Estos tambin
se los encuentra en forma de espiral aplana.

Hlice alfa: En esta estructura la cadena polipeptdica se desarrolla en espiral sobre s misma
debido a los giros producidos en torno al carbono beta de cada aminocido. Esta estructura
se mantiene gracias a los enlaces de hidrgeno intracatenarios formados entre el grupo el
grupo -C=O del aminocido "n" y el -NH del "n+4" (cuatro aminocidos ms adelante en la
cadena). Un ejemplo particular es la Hlice de colgeno: una variedad particular de la
estructura secundaria, caracterstica del colgeno, protena presente en tendones y tejido
conectivo.Existen otros tipos de hlices: Hlice 310 (puentes de hidrgeno entre los
aminocidos "n" y "n+3") y hlice (puentes de hidrgeno entre los aminocidos "n" y
"n+5"), pero son mucho menos usuales.

Hoja plegada beta o -plegada: Cuando la cadena principal se estira al mximo que
permiten sus enlaces covalentes se adopta una configuracin espacial denominada cadena

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beta. Algunas regiones de protenas adoptan una estructura en zigzag y se asocian entre s
estableciendo uniones mediante enlaces de hidrgeno intercatenarios. Todos los enlaces
peptdicos participan en estos enlaces cruzados, confiriendo as gran estabilidad a la
estructura. La forma en beta es una conformacin simple formada por dos o ms cadenas
polipeptdicas paralelas (que corren en el mismo sentido) o antiparalelas (que corren en
direcciones opuestas) y se adosan estrechamente por medio de puentes de hidrgeno y
diversos arreglos entre los radicales libres de los aminocidos. Esta conformacin tiene una
estructura laminar y plegada, a la manera de un acorden.

Giros beta-: Secuencias de la cadena polipeptdica con estructura alfa o beta, a menudo
estn conectadas entre s por medio de los llamados giros beta. Son secuencias cortas, con
una conformacin caracterstica que impone un brusco giro de 180 grados a la cadena
principal de un polipptido.

(C)

Figura 2. Principales estructuras secundarias de las protenas: (A) -plegada, Tachiplesina I;
(B) -hlice, Magainina 2, (C) Giros beta-. [4-6]

4.4. Materiales

Secuencias de protenas obtenidas
de bases de datos.

4.5. Equipos
Computador con conexin a internet.

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4.6. Sustancias
No sern usadas sustancias en este
laboratorio por tratarse de una
prctica de bioinformtica.

4.7. Procedimiento
Existen muchas bases de datos en donde se pueden encontrar las secuencias en aminocidos
y cidos nucleicos de protenas.
Para esta prctica usted har uso de estas bases de datos y escoger 4 secuencias problema
(de 4 proteinas diferentes) a las cuales les deber realizar los anlisis descritos desde el tem b
al f.
a. Ingrese a la pgina de protein data bank http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
En esta pgina puede buscar protenas por palabras claves. Escoja 4 protenas
diferentes.
b. Descargue la secuencia de la protena en formato FASTA y en formato PDB.
c. Reporte el nmero de residuos de aminocidos, punto isoelctrico, el nmero de
hojas y de -hlices.
d. Descargue un visualizador de protenas, en internet se encuentran varios para esta
prctica se recomienda uno de los ms sencillos
http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm, siga las instrucciones e instale el
programa.
e. En el visualizador RasMol abra cada una de las protenas descargadas en el tem a (en
formato PDB), resalte las estructuras secundarias y juegue con el visualizador.

4.8 Responda las siguientes preguntas:
a. Qu informacin adicional es reportara en la pgina de la protein data bank?
b. De dnde sale la informacin reportada en la pgina?

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1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M. Principles of Biochemistry, Worth
Publishers, 2 edicin, 1997.
2. D.Voet, JG Voet, CW Pratt. Fundamentos de Bioqumica. Editorial
Mdica Panamericana. 2 Ed.Bioqumica, Madrid, 2007.
3. Eric Martz. University of Massachusetts, Amherst MA USA. July 12,
2008. http://www.umass.edu/microbio/rasmol/index2.htm.
4. Lamberty M, Caille A, Landon C, Tassin-Moindrot S, Hetru C, Bulet P, Vovelle F.
Solution structures of the antifungal heliomicin and a selected variant with both
antibacterial and antifungal activities. Biochem 2001; 40(40):1199512003.
5. Haney F, Hunter H, Matsuzaki K, Vogel H. Solution NMR studies of amphibian
antimicrobial peptides: Linking structure to function?. Biochim Biophys Acta 2009;
1788(8):1639-55.
6. Koradi R, Billeter M, Wuthrich K. MOLMOL: a program for display and analysis of
macromolecular structures. J Mol Graph 1996;14(1):2932.

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5 MTODOS DE CUANTIFICACIN DE PROTENAS: Mtodo de
Bradford, Biuret y Lowry.


5.1. Objetivos
Comparar los mtodos de cuantificacin de protenas.
Determinar el rendimiento y pureza de una protena: Casena.
Apreciar el uso de las tcnicas espectrofotomtricas para la cuantificacin de material
biolgico.

Ley de Lambert-Beer, reactivo de Biuret, reactivo de Bradford, curva de calibracin, casena,
reactivo de Lowry.


Para el estudio de la estructura de una protena, de la actividad de una enzima o el contenido
protenico de un alimento, es necesario conocer cuantitativamente la concentracin de las
protenas.
Existen diferentes mtodos para la cuantificacin de protenas. Muchos de estos mtodos se
basan en: a) la propiedad intrnseca de las protenas para absorber luz en el UV, b) para la
formacin de derivados qumicos, o c) la capacidad que tienen las protenas de formar
complejos.
Entre los mtodos que se basan en la formacin de complejos colorimtricos entre las
protenas y reactivos especficos se encuentran:

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Tabla 1. Principales mtodos para la cuantificacin de protenas y sus rangos de
sensibilidad.

Mtodo Rango de
sensibilida
d (g)
Ventajas Aplicaciones
Bradford 1-15 Limite bajo de
deteccin
Compatible con
agentes
reductores
Rapidez
Resultados rpidos

Muestras que
contienen agentes
reductores
Lowry 25-100 a
500nm

2-30 a 660 nm

1-2 a 750 nm
Color estable

Preciso
Mayormente usado

til para cuantificar
protenas de
membrana
Biuret 1000-10000 Muy especfico
para protenas.
Muestra pocas
interferencias
Es barato
Determinacin de
protenas en cereal.

Mtodo de Bradford

Est basado en el cambio de color del colorante azul brillante de Coomassie en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante
con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de

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Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.
Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-
465nm).

Figura1. Estructura del azul de Coomassie.

Mtodo de Lowry

Es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las protenas. A la muestra
se aade un reactivo que forma un complejo coloreado con las protenas, siendo la
intensidad de color proporcional a la concentracin de protenas, segn la ley de
Lambert-Beer
Este mtodo consta de dos etapas:

1) Los iones Cu2+, en medio alcalino, se unen a las protenas formando complejos
con los tomos de nitrgeno de los enlaces peptdicos. Estos complejos Cu2+-
protena tienen un color azul claro. Adems, provocan el desdoblamiento de la
estructura tridimensional de la protena, exponindose los residuos fenlicos de
tirosina que van a participar en la segunda etapa de la reaccin. El Cu2+ se mantiene
en solucin alcalina en forma de su complejo con tartrato.

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2) La reduccin, tambin en medio bsico, del reactivo de Folin-Ciocalteau, por los
grupos fenlicos de los residuos de tirosina, presentes en la mayora de las protenas,
actuando el cobre como catalizador. El principal constituyente del reactivo de Folin-
Ciocalteau es el cido fosfomolibdotngstico, de color amarillo, que al ser reducido
por los grupos fenlicos da lugar a un complejo de color azul intenso.

Mtodo de Biuret

La reaccin de Biuret es una reaccin coloreada (violeta) debida a la formacin de un
complejo de Cu en un medio alcalino en compuestos que poseen ms de un enlace peptdico,
como las protenas:

Figura 2. Reaccin de Biuret.

La curva de patrn es un mtodo de qumica analtica empleado para medir la concentracin
de una sustancia en una muestra por comparacin con una serie de elementos de
concentracin conocida. Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal entre un
carcter medible (por ejemplo la absorbancia en los enfoques de espectrofotometra) y la
variable a determinar (la concentracin). Para ello, se efectan diluciones de unas muestras
de contenido conocido y se produce su lectura y el consiguiente establecimiento de una
funcin matemtica que relacione ambas; despus, se lee el mismo carcter en la muestra
problema y, mediante la sustitucin de la variable independiente de esa funcin, se obtiene la

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concentracin de esta. Se dice pues que la respuesta de la muestra puede cuantificarse y,
empleando la curva patrn, se puede interpolar el dato de la muestra problema hasta
encontrar la concentracin.

5.4. Materiales

15 Tubos de ensayo.
Micropipetas de 20-100 l y de
100-1000 l
Gradillas para tubos
Agitador Vortex

5.5. Equipos
Espectrofotmetro.

5.6. Sustancias
Reactivo de Bradford

Suero albumina srica bovina (BSA)
(10 mg/mL)
Agua destilada

Reactivo de Biuret
Reactivo de Lowry
NaCl al 1% (P/P)
NaOH 1N

5.7. Procedimiento
Mtodo de Biuret, Bradford y Lowry

Pesar 0.1 g de casena y colocarla en un vaso de precipitado de 100 mL. Aadir 30
mL de solucin de NaCl al 1%, agregar gota a gota una disolucin concentrada de
NaOH 1N hasta completar la disolucin de la protena.
Pasar la disolucin anterior a un matraz aforado de 50 mL y aforar. Esta es la
disolucin problema y de estas se tomarn alcuotas.
Para la preparacin de la muestra problema de leche; tomar 0.05 mL de leche y
realizar una dilucin de 1:10 (Vol. Final: 1 mL). Si la concentracin de protena no se

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encuentra dentro del rango de absorbancia preparar diluciones de 1:20, 1:100 y
1:1000 de la solucin inicial.
A continuacin, separar los tubos de ensayo en dos grupos, los seis primeros se
utilizaron para obtener la curva patrn y los otros seis para analizar la muestra
problema, el tubo 1 contendr el blanco, del tubo 2 al 6 adicionar los siguientes
volmenes: 0.1ml, 0.2ml, 0.4ml, 0.8ml y 1.0ml de solucin de albumina srica bovina
(BSA), respectivamente.
En seguida, los tubos 7 a 12 se tratar con la muestra problema y los reactivos de
Biuret, Lowry y Bradford con la misma cantidad (3 mL), como se muestra en la tabla
1, se homogeniza la solucin por medio de un agitador tipo vortex. (Solamente al tubo
1 se le agregaron 3 ml de reactivo de Biuret, Lowry y Bradford, segn corresponda y
3 ml de NaCl).
Posteriormente, llevar los tubos a 100 C durante 10 minutos hasta la formacin del
complejo. Dejar reposar las soluciones hasta alcanzar la temperatura ambiente.
(Realizar un ensayo con y sin calentamiento)
Finalmente, realizar la cuantificacin de la solucin por medio de un
espectrofotmetro a 540 nm para el reactivo de Biuret, 595 nm para el reactivo de
Bradford y 600 nm para el reactivo de Lowry, entre cada medicin lavar las celdas; al
tener todas las mediciones realizar la curva de calibracin.

Tabla 1. Metodologa para la cuantificacin de protenas.

Tubo
No.
Solucin * Absorbancia
Protena
(mg)
1 3 ml NaCl al 0.9%, Blanco
2 0.1 ml BSA y 2.9 ml NaCl
6 1 ml BSA y 2 ml NaCl
7 0.25 ml casena y 2.75 ml NaCl
8 0.5 ml casena y 2.5 ml NaCl
9 0.25 ml sabrenadante y 2.75 ml NaCl
10 0.5 ml sobrenadantey 2.5 ml NaCl
11 0.25 ml leche diluida y 2.75 ml NaCl
12 0.5 ml leche diluida y 2.5 ml NaCl

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*A todas las soluciones se agregaron 3 ml del reactivo de Biuret, 3mlde reactivos de
Bradford y 3 mL de reactivo de Lowry.

Registrar los resultados en la tabla 2.

Tabla 2: Concentracin de protena en las muestras problema.

Tubo No. Protena (mg) Factor de disolucin Protena (mg/ mL)
7
8
9
10
11
12


1.8.1 Defina con sus propias palabras que es una curva patrn.
1.8.2 Explique por qu en el mtodo de Biuret la absorbancia de una protena se lee a una
longitud de 540 nm.
1.8.3 Cul mtodo es el ms sensible?, y el menos sensible?. Por qu?.
1.8.4 Decide qu mtodo de determinacin de protenas elegiras para la cuantificacin de
protenas en: suero, orina, durante una purificacin enzimtica, en un extracto bacteriano
concentrado, en preparaciones de membranas plasmticas solubilizadas con SDS, en
preparaciones de membranas mitocondriales solubilizadas con Tritn X-100. Justifique su
respuesta.


1. Lehninger A, Nelson DL, Cox M (1997). Principles of Biochemistry, Worth
Publishers, 2 edicin.
2 D. Voet, JG Voet, CW Pratt. Fundamentos de Bioqumica. Editorial
Mdica Panamericana. 2 Ed.Bioqumica, Madrid, 2007.

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3 Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal
Biochem. 72: 248-254.
4 Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., and Randall, R. J. (1951) Protein
measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265-275).
5 Gornall A, Bardawill CJ, David MM (1949). Determination of serum proteins by
means of the biuret reaction. J Biol Chem. 177: 751766.

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6. FRACCIONAMIENTO DE LAS PROTENAS DE LA LECHE
POR pI Y PRECIPITACIN SALINA.

Grupal (2 personas) 4 horas No se presenta riesgos.

6.1. Objetivos
Analizar el efecto del pH sobre la solubilidad de protenas hidrosolubles en solucin
acuosa.
Separar protenas de una solucin acuosa de protenas hidrosolubles utilizando
precipitacin salina.
Cuantificar la concentracin de protenas en diferentes fracciones de leche entera
bovina.

Protena Casena, contenido proteico de la leche, hidrlisis enzimtica, desnaturalizacin de
protenas.

La casena (del latn caseus, "queso") es una fosfoprotena (un tipo de heteroprotena)
presente en la leche y en algunos de sus derivados (productos fermentados como el yogur o
el queso). En la leche, se encuentra en la fase soluble asociada al calcio (fosfato de calcio) en
un complejo que se ha denominado caseingeno. La tabla 1 recoge el contenido de esta
protena en la leche de distintas especies de mamferos.

Tabla 1. Contenido proteico y casenico de la leche de algunas especies
animales.
Componente

especie

humana bovina ovina caprina
protenas (% del total lcteo) 1,3-1,5 3,2-3,5 5,4-6,0 3,1-4,0
casenas (% del total proteico) 44,9 82,5 84,8 81,3

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Caractersticas de las casenas
Las casenas es un conjunto heterogneo de aminocidos por lo que es difcil fijar una
definicin. Sin embargo, todas las protenas englobadas en lo que se denomina casena tienen
una caracterstica comn: precipitan cuando se acidifica la leche a pH 4,6. Por ello, a la
casena tambin se le suele denominar protena insoluble de la leche. Por otra parte, y aunque
las protenas que se denominan casenas son especficas de cada especie, se clasifican en los
siguientes grandes grupos de acuerdo con su movilidad electrofortica: s1-casena, s2-
casena, -casena y -casena (vase la Figura 1). Esta ltima es de especial inters en la
industria quesera, ya que su hidrlisis enzimtica por el cuajo (la enzima quimosina) genera
una nueva protena, denominada para--casena. Cuando esta ltima reacciona con el calcio
genera paracaseinato de calcio. Durante el proceso de maduracin del queso, y a partir de la
para--casena, se forman unos macropptidos denominados -casenas, responsables de las
caractersticas reolgicas y organolpticas de los quesos.

Figura 1. Patrn de electroforesis que se obtienen con las protenas lcteas. Carril 1:
Marcador de peso molecular. Carril 2: Protenas procedentes de las especies humanas. Carril 3:
Protenas procedentes de la especie bovina. (Tomada de Farrell, et al.)

Qumica y fsica de las casenas
A diferencia de muchas otras protenas, incluso del queso, las casenas no precipita por accin
del calor. Por el contrario, precipita por la accin de una enzima proteasa presente en el
estmago de los mamferos llamada renina y forma un precipitado denominado paracasena.

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Si la precipitacin se realiza por la accin de cidos, se le llama casena cida. En la
elaboracin de los quesos tienen lugar ambos tipos de precipitaciones.
Cuando se emplea la enzima tripsina, la casena se hidroliza a una molcula fosfatada llamado
pepto.
Las caractersticas de las casenas de la leche de vaca se resumen en la tabla 2. La secuencia
aminoacdica de la casena contiene un nmero inusual de residuos del aminocido prolina:
entre 10 en la -s2-casena y 35 en la -casena. Como resultado, las casenas son
relativamente hidrofbicas (poco soluble en agua) y carecen de estructura secundaria o
terciaria bien definidas. En la leche se encuentra como suspensin de partculas que asemeja a
las micelas de surfactantes (pequeas esferas hidroflicas en el exterior e hidrfobicas en el
interior). Estas micelas de casena se estabilizan por iones de calcio e interacciones
hidrofbicas.
Otro dato interesante, utilizado para separar las casenas del resto de las protenas lcteas
mediante su precipitacin, es que su punto isoelctrico (pI) promedio es de 4,6. A este pH,
las casenas se encuentran en su punto de menor solubilidad debido a la reduccin de las
repulsiones intermoleculares, por lo que precipitan. Ahora bien, el pI es diferente para cada
una de las fracciones casenicas, ya que vara entre el 4,44-4.97 para la -s1-casena y el 5,3-
5,8 en la variante gentica B de la -casena.

Tabla 2. Algunas de las caractersticas fisicoqumicas de las casenas
bovinas.
Caracterstica
Casena
s1
s2

Concentracin en leche (g/L) 12-15 3-4 9-11 2-4
Variantes genticas B y C A A
1
y A
2
A y B
Masa molecular 23.545 - 23.615 25.226 23.983 - 24.023 19.006 - 19.037
Punto isoelctrico (pI) 4,44 - 4,76 ... 4,83 - 5,07 5,45 - 5,77
Restos de aminocidos (n) 199 207 209 169

Por otra parte, cuando la protena no ha sufrido ningn cambio en su interaccin con el
disolvente, se dice que presenta una estructura nativa (Figura 2). Se llama desnaturalizacin

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de las protenas a la prdida de las estructuras de orden superior (secundaria, terciaria y
cuaternaria), quedando la cadena polipeptdica reducida a un polmero estadstico sin ninguna
estructura tridimensional fija.

Estado nativo

Estado desnaturalizado

Figura 2. Estados de una protena.

Los agentes que provocan la desnaturalizacin de una protena se llaman agentes
desnaturalizantes. Se distinguen agentes fsicos (calor) y qumicos (detergentes,
disolventes orgnicos, pH, fuerza inica). Como en algunos casos el fenmeno de la
desnaturalizacin es reversible, es posible precipitar protenas de manera selectiva mediante
cambios en:

la polaridad del disolvente
la fuerza inica
el pH
la temperatura

Cualquier factor que modifique la interaccin de la protena con el disolvente disminuir su
estabilidad en disolucin y provocar la precipitacin. As, la desaparicin total o parcial de la
envoltura acuosa, la neutralizacin de las cargas elctricas de tipo repulsivo o la ruptura de los
puentes de hidrgeno facilitarn la agregacin intermolecular y provocar la precipitacin. La
precipitacin suele ser consecuencia del fenmeno llamado desnaturalizacin.

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La precipitacin salina de las protenas es una tcnica en donde se logra la precipitacin de
una fraccin de protenas mediante el aumento de la fuerza inica del medio. Grandes
cantidades de una sal agregada a una solucin de protenas, disminuye la interaccin protena-
H
2
O porque quita la capa de solvatacin, predominando la interaccin protena-protena y
generando la precipitacin de las mismas. La concentracin salina a la que se produce la
precipitacin no es igual para todas las protenas, lo que permite usar sta propiedad para la
separacin y purificacin de protenas particulares a partir de mezclas complejas.
Comnmente se usa sulfato de amonio (NH4)
2
SO
4
para tal fin, a causa de su gran solubilidad
(760 g de sulfato de amonio/1000 mL de agua a una temperatura de 20C) y porque el in
sulfato divalente permite alcanzar altas fuerzas inicas. La adicin gradual de sta sal permite
el fraccionamiento de una mezcla de protenas, las cuales son precipitadas pero no
desnaturalizadas.

6.4. Materiales

4 tubos de centrfuga
4 tubos de ensayo
1 micropipeta de 100-1000 L
Vasos de precipitado
Papel de filtro
Embudo Bchner
Erlenmeyer con desprendimiento
lateral
Bomba de vaco

6.5. Equipos
pHmtro
Centrfuga
Espectrofotmetro

6.6. Sustancias
Reactivo de Biuret.
100 mL Solucin de Sulfato de
amonio saturada.
100 mL de leche de cantina.

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6.7 Procedimiento

6.7.1 Determinacin de las protenas totales en la leche.

a) En un tubo de ensayo tome 1,5 mL de agua destilada y adicione 1,5 mL del reactivo
segn corresponda. Mezcle bien y calibre el espectrofotmetro.
b) En otro tubo de ensayo adicione 1,5 mL de leche y 1,5 mL del reactivo (Biuret, Lowry
y Bradford), mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de
calibracin que obtuvo en la prctica anterior. Si la absorbancia es mayor a los valores
de la curva, haga diluciones hasta que tenga un valor de absorbancia en el rango de la
curva de calibracin. Para realizar las diluciones use la frmula V
1
C
1
=V
2
C
2
. Anote los
datos de las diluciones para que los tenga en cuenta para calcular la concentracin de
las protenas totales de la leche.

6.7.2 Fraccionamiento de las protenas de la leche.

a) Precipitacin de casena por punto isoelctrico

Tome 20 mL de leche en un vaso de precipitado y mida el pH.
Agregue lentamente pequeas alcuotas de HCl, agite (con agitacin
magntica), hasta obtener un pH de 4,7. Registre las observaciones del efecto
del pH sobre las propiedades de la leche (suspensin de protenas en agua).
Pese el papel de filtro y filtre al vaco usando un embudo Bchner (al vaco).
Determine el peso de las casenas (despus de la filtracin). Tenga en cuenta
este peso para determinar la concentracin de casenas totales en la leche (%).
Mida el volumen del sobrenadante y tngalo en cuenta para determinar el
porcentaje de las protenas de la leche que son solubles a pH 4.7.

b) Determinacin de la concentracin de protenas solubles (presentes en el sobrenadante)

Tome 1,5 mL del sobrenadante y 1,5 mL del reactivo (Biuret, Lowry y

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Bradford), mezcle bien y mida la absorbancia. Tenga en cuenta la curva de
calibracin que se obtuvo en la prctica anterior. Si la absorbancia es mayor a
los valores de la curva, haga diluciones hasta que tenga un valor de
absorbancia en el rango de la curva de calibracin y tenga en cuenta estos
datos para calcular la concentracin de protenas solubles totales en la leche
(mg/mL).

c) Precipitacin salina de las protenas solubles (presentes en el sobrenadante).

Tome 1,5 mL de la solucin de sulfato de amonio saturada y mzclela con 1,5 mL
del sobrenadante (protenas solubles).
Centrifugue y observe si se forma un pellet. Pese el pellet y mida el volumen del
sobrenadante.


Residuos acuosos

(Buffer)

a. Qu es desnaturalizacin de una protena?
b. Consulte las aplicaciones alimenticias e industriales de la casena.
c. Consulte el pI para las protenas Lactoferrina, albmina srica bovina, -
Lactoalbmina y -Lactoalbmina de la leche. Explique por qu estas protenas no
precipitan a pH 4.7.
d. Qu tipo de protenas son las protenas de la leche, soluble a pH de 4.7?
e. Qu otros mtodos, diferentes a la precipitacin salina, se pude usar para la
precipitacin de protenas?.

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1. Jenness J. 1980. Composition and characteristics of goat milk: Review 1968-1979.
Journal of Dairy Science 63(10): 1605-1630.
2. Lonnerdal B and Forsum E. 1985. Casein content of human milk. American Journal of
Clinical Nutrition 41(1): 113-120.
3. Ribadeau-Dumas B and Grappin R. 1989. Milk protein analysis. Le Lait 69(5): 357-
416.
4. Park YW, Jurez M, Ramos M y Haenlein GFW. 2007. Physico-chemical characteristics
of goat and sheep milk. Small Ruminant Research 68(1-2): 88113.
5. Willamson MB. 1944. The amino acid composition of human milk proteins. Journal of
Biological Chemistry 156(1): 47 - 52.
6. Farrell HM, Jimenez-Flores R, Bleck GT, Brown EM, Butler JE, Creamer LK, Hicks
CL, Hollar CM, Ng-Kwai-Hang KF y Swaisgood HE. 2004. Nomenclature of the
Proteins of Cows MilkSixth Revision. Journal of Dairy Science '87'(6): 1641-
1674.

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7. SEPARACIN DE PROTENAS SRICAS POR
ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA


7.1. Objetivos
Conocer los principios de la tcnica de electroforesis.
Separacin de las protenas en acetato de celulosa.

Protenas, enzimas, electroforesis, acetato de celulosa, movilidad electrofortica, protenas
sricas.

La electroforesis consiste en la migracin de solutos inicos a travs de un medio por efecto
de un campo elctrico. El soluto, como es el caso de esta prctica, puede ser una
macromolcula como, por ejemplo, una protena.
En presencia de un campo elctrico, E, una partcula cargada con carga q en un medio
determinado alcanzar una velocidad estacionaria, v, que depende del balance entre la fuerza
que origina el campo elctrico, Eq, y el rozamiento viscoso, f v, donde f es el coeficiente de
rozamiento, es decir, en condiciones de migracin estacionaria Eq= fv. Se define la
movilidad electrofortica U como la velocidad por unidad de campo elctrico:

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La aparicin en la ecuacin anterior del coeficiente de rozamiento, f, que se relaciona, entre
otros factores, con el tamao y forma de la partcula, sugiere en principio que un
experimento de electroforesis con macromolculas podra proporcionar informacin sobre
su estructura. Sin embargo, esto no ha sido posible debido a la carencia de una formulacin
exacta del proceso de electroforesis por, entre otras razones, el desconocimiento del valor
del campo elctrico en las cercanas de la macromolcula o, incluso, el valor de la carga de la
misma macromolcula. A pesar de estas dificultades tericas, la electroforesis es una tcnica
analtica muy utilizada, debido a su capacidad para la separacin de sustancias,
fundamentalmente macromolculas biolgicas.

Tipos de electroforesis

Electroforesis de frente mvil o libre
Las sustancias a separar se introducen en un tubo en forma de U, disueltas en un tampn de
pH y fuerza inica adecuados. Se colocan dos electrodos en sendos brazos del dispositivo,
entre los que se crea un campo elctrico, provocando que las molculas de protena cargadas
emigren hacia los electrodos de polaridad opuesta. Las diferentes protenas se desplazan a
velocidades diferentes de acuerdo con sus cargas y coeficientes de friccin respectivos,
formndose nubes (o frentes) que se desplazan en la disolucin tampn.

Este desplazamiento puede seguirse con diversos sistemas opticos que ponen de manifiesto
las sustancias segn se van separando. Para impedir la mezcla por conveccin de las protenas
que emigran se necesita un sofisticado aparato y a su vez se precisa el empleo de muestras
muy grandes. Esta es la razn por la que la electroforesis de frente mvil ha sido sustituida
por la electroforesis de zona.

Electroforesis de zona
En esta tcnica, la muestra est obligada a desplazarse sobre un soporte
slido de papel, celulosa o gel. La pequea cantidad necesaria de muestra permite que las
molculas migren en discretas zonas o bandas. La electroforesis zonal de biomolculas

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cargadas, generalmente se lleva a cabo en una disolucin estabilizada con un medio que sirve
de soporte.

Electroforesis en papel
La muestra se aplica sobre una tira de papel de filtro humedecido con una disolucin tampn,
bien en el centro o en cualquiera de los extremos del papel, dependiendo de las sustancias a
separar y del pH del tampn. Los extremos de la tira se sumergen en dos recipientes
separados que contienen la disolucin tampn y en los que se hallan colocados los electrodos.
Se conectan los electrodos a una fuente de tensin continua y se aplica una diferencia de
potencial durante el tiempo adecuado. Al aplicar una corriente directa, las molculas cargadas
de la mezcla emigran hacia los electrodos de polaridad opuesta formando bandas en el papel.
La velocidad de emigracin de una molcula, depende preferentemente de su carga.
Completada la electroforesis, se desconecta la fuente de tensin y se secan las tiras sobre una
superficie, limpia, seca y lisa (cristal, azulejo, etc...).
El revelado se realiza empleando los mismos mtodos que los utilizados en cromatografa
sobre papel, mediante la accin de los colorantes adecuados.
La electroforesis y la cromatografa en papel tienen ciertas similitudes. Sin embargo, mientras
que la electroforesis separa las molculas fundamentalmente en funcin de su carga, la
cromatografa lo hace en base a una amplia gama de caractersticas (ejemplos, solubilidad en
la cromatografa de reparto, polaridad en la de adsorcin, carga en la de intercambio inico,
etc.).
La electroforesis en papel se emplea principalmente en la separacin de sustancias de bajo
peso molecular como aminocidos y pptidos. La difusin que se produce puede disminuirse
aumentando la diferencia de potencial entre los electrodos con lo que se reduce el tiempo de
desarrollo. Este tipo de electroforesis se denomina de alto voltaje. El revelador para
localizar las sustancias seria la Ninhidrina en el caso de pptidos y aminocidos.
Las electroforesis en papel tambin pueden hacerse en tiras de acetato de celulosa, que son
qumicamente ms homogneas y tienen la ventaja de ser transparentes, con lo que las
sustancias a separar, una vez tenidas o reveladas, pueden cuantificarse por densitometra. Es
muy til en los laboratorios clnicos por su fcil manipulacin y su rpido desarrollo.

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La principal aplicacin es la separacin de protenas del suero, conocindose el resultado
como proteinograma. Las fracciones proteicas del suero que se separan mediante este tipo
de electroforesis son la albumina y las globulinas 1, 2, y .
El acetato de celulosa se utiliza tambin para separar lipoprotenas. El resultado obtenido se
denomina lipidograma. Las fracciones lipoprotecas son denominadas , pre- y . El tampn
ms usado es el veronal, a pH 8,6. La separacin se realiza de forma anloga a la de protenas
y se produce en unos 30 minutos. Las lipoprotenas, una vez separadas, se localizan tindolas
con colorantes que se unen a la fraccin lipdica, como Negro Sudan o Ciba 7B Fat Red.
Electroforesis anlogas a las de protenas y lipoprotenas, utilizando como soporte el acetato
de celulosa, se han aplicado tambin para la separacin de isoenzimas de la lactato
deshidrogenasa y la creatin-quinasa.

Electroforesis en gel
Un gel es un estado intermedio entre el slido y el lquido. Este tipo de electroforesis se halla
entre los mtodos ms resolutivos y convenientes empleados en la separacin de
macromolculas. Los geles de uso ms generalizado son: poliacrilamida y agarosa. Estos
poseen poros de diferentes dimensiones moleculares que delimitan la velocidad de traslado y
molculas trasladadas durante el proceso electrofortico. De esta forma, la separacin no se
produce solo por las diferentes cargas de las molculas, sino tambin por las diferencias de
tamao. Los geles estn formados por un reticulado de polmeros (constituyendo una red
enmaraada) y el lquido intersticial en el que se encuentra inmerso esta red.

Existe una gran variedad de tipos de electroforesis en gel, que se pueden agrupar en dos
categoras:
Electroforesis en gel en una dimensin (continuo o discontinuo)
o PAGE-nativa
o SDS-PAGE
o Isoelectroenfoque

Electroforesis en gel en dos dimensiones (bidimensional)

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Segn las aplicaciones u objetivos que se pretendan conseguir en una prctica o experimento,
se utilizara un tipo u otro de electroforesis en gel. Los geles discontinuos mejoran la
resolucin de la electroforesis pues se consigue agudizar las bandas en gran medida por el uso
de esta tcnica conocida como electroforesis a pH discontinuo que precisa de dos geles y dos
tampones diferentes.
La PAGE-nativa se utiliza para separar protenas en condiciones no desnaturalizantes, por
tanto, en funcin de la carga intrnseca de las mismas. La SDS-PAGE es muy til para calcular
el peso molecular de una protena concreta ya que separa las protenas segn su tamao. El
isoelectroenfoque es un tipo de PAGE en una dimensin que se basa en la separacin de
molculas de acuerdo a sus diferentes puntos isoelctricos.
La electroforesis en gel en dos dimensiones combina el isoelectroenfoque (primera
dimensin) con la SDS-PAGE (segunda dimensin). Es una tcnica muy resolutiva, y el mejor
mtodo analtico para separar protenas que existe hoy en da.

Electroforesis capilar
Aunque la electroforesis en gel en sus diversas formas resulta un mtodo comn y efectivo
para la separacin de molculas, el proceso de separacin puede durar varias horas, siendo
difcil de cuantificar y automatizar.
La tcnica aqu presentada se lleva a cabo en el interior de tubos capilares (1-10 m de
dimetro). Estos capilares disipan el calor rpidamente permitiendo la aplicacin de campos
elctricos elevados, reduciendo as los tiempos de separacin.

7.4. Materiales

Pipetas de 15 ml.
Micropipeta de 251000 L.
Puntas desechables
Vasos de precipitado.
Tiras de papel especial (Whatman
1, 3, etc.) de filtro o de acetato
de celulosa.

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7.5. Equipos

Sistema de electroforesis.
Fotodensitmetro
Agitador orbital.

7.6. Sustancias
Agua destilada
Soluciones amortiguadoras: Tris
glicina 50 mol/L, pH 8.3 (ver anexo).
Solucin patrn de albumina 2
mg/mL
Suero o plasma sanguneo.
Marcador de corrida: Azul de
Bromofenol 3 mg/mL
Colorantes.
Decolorantes

Preparacin de los reactivos:
Tampn Tris glicina 50 mol/L, pH 8.3: Pesar tres gramos de Tris (Tris(hidroxiamino)-
aminometano) y 14.413 g de glicina y completar en un baln volumtrico de 1000 mL.
Solucin de colorante: Azul de Coomassie R-250 al 0.25% en Metanol: cido actico: agua
50%:10%:39.75%.
Solucin de decolorante: Mezclar 50 mL de metanol con 10 mL de agua destilada y adicionar
40 mL de cido actico al 5%.
Solucin patrn de Albumina 2 mg/mL.

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7.7 Procedimiento
Colocar una solucin tampn en una cubeta, teniendo cuidado de igualar los
volmenes de los dos compartimentos del electrodo.
Las tiras de acetato de celulosa deben ser sumergidas en la solucin tampn durante
al menos 10 minutos y como mximo 24 horas. Con la ayuda de unas pinzas, eliminar
las tiras de acetato de celulosa de la solucin tampn.
Perforar una esquina de la tira de acetato de celulosa para indicar la polaridad.
En la parte opaca de la tira de celulosa, marcar un origen o una lnea de aplicacin de
las muestras con lpiz rojo, asegurndose de que el lado perforado esta hacia abajo y
hacia la derecha. Marque el origen cerca de 4 cm de la extremidad que se sumergir
en el compartimiento catdico.
Colocar las tiras bien estiradas rectas en el apoyo, de tal manera que cada extremidad
toque la solucin tampn. Observar que cada lado perforado deber permanecer en
el polo negativo (ctodo). Como se realizar una corrida en tampn alcalino, las
protenas debern estar cargadas negativamente y por tanto migrarn hacia el polo
positivo (nodo). Por conveniencia, el polo negativo es de color negro y el positivo de
color rojo.
Adicionar a cada muestra 2 L de marcador de corrida (azul de bromofenol).
Cerrar la cmara de electroforesis y conectar a una fuente de 200 V, dejando correr
la electroforesis por 45 a 60 minutos. La corriente aplicada deber ser de 1 a 1,5
mA/tira.
Despus de la corrida, desconectar la cmara de la fuente de poder.
Remover las tiras y realizar la coloracin con Azul de Coomassie.
Sumergir las tiras en la solucin colorante por 15 minutos, agitando lentamente en el
agitar orbital.
Lavar las tiras 3 veces con una solucin de actico al 5%.
Sumergir las tiras en la solucin decolorante, para remover el exceso de colorante. Se
deja slo el que ha sido fijado por las protenas.
Cuantificar por densitometra.

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La cuantificacin de las bandas de protena de suero o plasma puede ser realizada por
densitometra desde que la tira de acetato de celulosa sea debidamente transparente
como sigue:
Sumergir una tira por 30 segundos en metanol para completa deshidratacin. En
seguida, colocar la tira en una mezcla Glicerol: metanol: cido actico1:85:14 por un
minuto. Depositar la tira sobre una placa de vidrio. Secar en una estufa a 55C, para
ser usada en el densmetro.

Muestra

Campo elctrico (V)

1. Aplicacin de la muestra.
1. Electroforesis.
2. Deteccin por tincin:
Azul de Coomassie

Fig.1. Perfil electrofortico de la Albmina.[tomado de]



Residuos de soluciones

acuosas (Buffer)

a Para qu polo migra cada fraccin proteca de suero o plasma?. Explique.
b Qu factores afectan la separacin electrofortica de protenas?.

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c Qu diferencia espera obtener en el perfil electrofortico de protenas de plasma y
de suero?.


2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega.
Captulo 3 (2006).
3) Skoog D. A., West D. M. y Holler F.J., "Fundamentos de Qumica Analtica". Ed.
Reverte. Barcelona. 1997

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8. PURIFICACIN Y CARACTERIZACIN DEL ADN DE LA
CEBOLLA


8.1. Objetivos
Purificar el DNA de clulas vegetales.
Observar la estructura fibrilar del ADN.

cido desoxirribonucleico, cidos nucleicos, propiedades fsicas de cidos nucleicos.


El cido desoxirribonucleico (ADN), frecuentemente abreviado como ADN, es un cido nucleico que
contiene instrucciones genticas usadas en el desarrollo y funcionamiento de todos los organismos
vivos conocidos y algunos virus, y es responsable de su transmisin hereditaria. El papel principal de la
molcula de ADN es el almacenamiento a largo plazo de informacin. Muchas veces, el ADN es
comparado con un plano o una receta, o un cdigo, ya que contiene las instrucciones necesarias para
construir otros componentes de las clulas, como las protenas y las molculas de ARN. Los
segmentos de ADN que llevan esta informacin gentica son llamados genes, pero las otras secuencias
de ADN tienen propsitos estructurales o toman parte en la regulacin del uso de esta informacin
gentica.

Desde el punto de vista qumico, el ADN es un polmero de nucletidos, es decir, un polinucletido.
Un polmero es un compuesto formado por muchas unidades simples conectadas entre s, como si
fuera un largo tren formado por vagones. En el ADN, cada vagn es un nucletido, y cada nucletido,
a su vez, est formado por un azcar (la desoxirribosa), una base nitrogenada (que puede ser
adeninaA, timinaT, citosinaC o guaninaG) y un grupo fosfato que acta como enganche de
cada vagn con el siguiente. Lo que distingue a un vagn (nucletido) de otro es, entonces, la base
nitrogenada, y por ello la secuencia del ADN se especifica nombrando slo la secuencia de sus bases.

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La disposicin secuencial de estas cuatro bases a lo largo de la cadena (el ordenamiento de los cuatro
tipos de vagones a lo largo de todo el tren) es la que codifica la informacin gentica: por ejemplo, una
secuencia de ADN puede ser ATGCTAGATCGC. En los organismos vivos, el ADN se presenta como
una doble cadena de nucletidos, en la que las dos hebras estn unidas entre s por unas conexiones
denominadas puentes de hidrgeno.

Componentes

Estructura de soporte: La estructura de soporte de una hebra de ADN est formada por unidades
alternas de grupos fosfato y azcar. El azcar en el ADN es una pentosa, concretamente, la
desoxirribosa.

cido fosfrico:
Su frmula qumica es H
3
PO
4
. Cada nucletido puede contener uno (monofosfato: AMP), dos
(difosfato: ADP) o tres (trifosfato: ATP) grupos de cido fosfrico, aunque como monmeros
constituyentes de los cidos nucleicos slo aparecen en forma de nuclesidos monofosfato.

Desoxirribosa
Es un monosacrido de 5 tomos de carbono (una pentosa) derivado de la ribosa, que forma parte de
la estructura de nucletidos del ADN. Su frmula es C
5
H
10
O
4
. Una de las principales diferencias entre
el ADN y el ARN es el azcar, pues en el ARN la 2-desoxirribosa del ADN es reemplazada por una
pentosa alternativa, la ribosa.25 Las molculas de azcar se unen entre s a travs de grupos fosfato,
que forman enlaces fosfodister entre los tomos de carbono tercero (3, tres prima) y quinto (5,
cinco prima) de dos anillos adyacentes de azcar. La formacin de enlaces asimtricos implica que
cada hebra de ADN tiene una direccin. En una doble hlice, la direccin de los nucletidos en una
hebra (3 5) es opuesta a la direccin en la otra hebra (5 3). Esta organizacin de las hebras de
ADN se denomina antiparalela; son cadenas paralelas, pero con direcciones opuestas. De la misma
manera, los extremos asimtricos de las hebras de ADN se denominan extremo 5 (cinco prima) y
extremo 3 (tres prima), respectivamente.

Bases nitrogenadas:
Las cuatro bases nitrogenadas mayoritarias que se encuentran en el ADN son la adenina (A), la
citosina (C), la guanina (G) y la timina (T). Cada una de estas cuatro bases est unida al armazn de
azcar-fosfato a travs del azcar para formar el nucletido completo (base-azcar-fosfato). Las bases
son compuestos heterocclicos y aromticos con dos o ms tomos de nitrgeno, y, dentro de las

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bases mayoritarias, se clasifican en dos grupos: las bases pricas o purinas (adenina y guanina),
derivadas de la purina y formadas por dos anillos unidos entre s, y las bases pirimidnicas o bases
pirimdicas o pirimidinas (citosina y timina), derivadas de la pirimidina y con un solo anillo.En los cidos
nucleicos existe una quinta base pirimidnica, denominada uracilo (U), que normalmente ocupa el lugar
de la timina en el ARN y difiere de sta en que carece de un grupo metilo en su anillo. El uracilo no se
encuentra habitualmente en el ADN, slo aparece raramente como un producto residual de la
degradacin de la citosina por procesos de desaminacin oxidativa.

Figura 1. Estructura qumica del DNA.

8.4. Materiales

Una cebolla grande (fresca).
Vaso de precipitado
Tubos de ensayo.
Varilla de vidrio.
8.5. Sustancias
Agua desionizada
EDTA
Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0.1%.
Micropipetas automticas
Puntas desechables
Algodn

Difenilalanina
Etanol al 95%

cido sulfrico concentrado
(H
2
SO
4
)

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Preparacin de los reactivos:

Soluciones Stock y buffer

1. Solucin de lisis

Mezclar 0.1% de SDS con una solucin 25mM de EDTA, pH=8.

2. Reactivo de difenilamina

Disolver 1g de Difenilamina en 100 mL de cido actico glacial y adicionar 2,75 mL de cido sulfrico
concentrado (H
2
SO
4
).

8.6 Procedimiento

1. Descascarar una cebolla de tamao medio.
2 Rajar la cebolla, pesar 50 g y adicionar 100 mL de solucin de lisis.
3. Mezclar a temperatura ambiente por 10 a 20 minutos.
4. Filtrar la suspensin en un embudo que contenga algodn, recogiendo el filtrado en una
probeta. Anotar el volumen.
5. Transferir 4 mL del filtrado y colocar en un tubo de ensayo. Adicionar 8 mL de etanol al 95%
(se debe adicionar gota a gota) procurando no mezclar ambas soluciones. Observar la
formacin de un precipitado blanco. Con la ayuda de una varilla de vidrio enrollar el
precipitado.
6. Transferir el material de vidrio a otro tubo de ensayo y adicionar 0.5 mL de agua. A esta
solucin adicionar 1.5 mL de reactivo de difenilamina.
7. En otro tubo de ensayo adicionar 0.5 mL de agua y 1.5 mL de difenilamina. Colocar los dos
tubos a bao de Mara fuerte por 10 minutos. Comparar los resultados obtenidos.
8. El volumen restante del filtrado debe ser transferido a un vaso de precipitado y adicionar dos
volmenes de etanol al 95%. El precipitado obtenido se transfiere a un tubo de ensayo.
9. Disolver el precipitado en 5 mL de agua con ayuda de la varilla de vidrio. Dividir esta solucin
en dos tubos para observar las diferencias de viscosidad en las diferentes condiciones.

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10. Pipetear la solucin de uno de los tubos con una pipeta graduada de 0.2 mL y cronometrar el
tiempo de flujo de salida (dejar caer libremente el lquido por gravedad) de la solucin hasta
extraer 0.15 mL.
11. El otro tubo debe ser calentado en bao de Mara por 10 minutos. Despus del perodo de
calentamiento, proceder como en el tem 10, anotando el tiempo de flujo.
12. Enfriar esta solucin en hielo por 15 minutos y repetir el procedimiento 10.
13. Interpretar los resultados.



Todos sern descartados en el recipiente indicado Residuos acuosos (Buffer)


a Cul es la funcin de los dos componentes de la solucin de lisis ?. Explique.
b A qu se debe la diferencia de viscosidades del DNA observada en los experimentos?.


1) UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARAN; DEPARTAMENTO DE BIOQUMICA. Bioqumica:
aulas prticas. 6. ed. Curitiba: Ed. Da UFPR, 2001. 178 p.
2) Nelson, D.L., Cox, M. M. Lehninger Principios de Bioqumica. Ediciones Omega. Captulo 3
(2006).
3) Lewin, B. Genes VI. Oxford: Oxford University Press, 1997. Pg: 1260.

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9. ELECTROFORESIS DE CIDOS NUCLICOS EN GEL DE AGAROSA


9.1. Objetivos
Observar el perfil de migracin de diferentes formas de DNA en electroforesis de gel
de agarosa.
Familiarizarse con mtodos de separacin de cidos nucleicos mediante electroforesis
en geles de agarosa

cidos nucleicos, electroforesis, gel de agarosa, marcadores de peso molecular, plsmidos.

El trmino electroforesis se usa para describir la migracin de una partcula cargada bajo la influencia
de un campo elctrico. Muchas molculas importantes biolgicamente (aminocidos, pptidos,
protenas, nucletidos, cidos nucleicos) poseen grupos ionizables y existen en solucin como
especies cargadas, bien como cationes, o bien como aniones. Estas especies cargadas se van a separar
en funcin de su carga cuando se aplica un voltaje a travs de los electrodos. Existen muchos tipos de
electroforesis, que se engloban en dos categoras fundamentales:

Electroforesis de frente mvil.
-Electroforesis de zona.

Actualmente, slo se utiliza la electroforesis de zona, en la cual la muestra se desplaza sobre un
soporte slido, como papel de filtro, celulosa o gel (agarosa, acrilamida) y los componentes de la
muestra migran en forma de pequeas bandas, tambin llamadas zonas.

La electroforesis en gel es una tcnica muy utilizada para separar molculas o fragmentos de
molculas de cidos nucleicos. Los materiales ms comunes para separar molculas de cidos

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nucleicos son polmeros como la poliacrilamida o la agarosa. Estos geles se colocan en la cubeta de
electroforesis, sumergidos en un tampn de pH alrededor de 8. De esta forma, las molculas de DNA
o RNA sometidas a electroforesis se desplazarn al polo positivo ya que a pH superiores a 5 poseen
carga negativa. Los geles se comportan como un tamiz molecular y permiten separar molculas
cargadas en funcin de su tamao y forma. As, molculas de DNA de diferente tamao, van a emigrar
de forma distinta en un gel de electroforesis. La distancia recorrida por cada fragmento de DNA va a
ser inversamente proporcional al logaritmo de su peso molecular. Es importante la utilizacin de
marcadores de tamao conocido porque nos permitirn calcular los pesos moleculares de las
muestras de DNA problema.

En el caso de los geles de agarosa, se le aade bromuro de etidio, sustancia que se intercala entre las
bases del DNA y es fluorescente cuando se ilumina con luz ultravioleta. Tras la electroforesis, se
visualiza el gel con una lmpara de luz UV, y se vern las bandas correspondientes a las muestras de
DNA aplicado y los marcadores de peso molecular.

El DNA problema que se va a analizar mediante electroforesis en gel de agarosa en esta prctica es
DNA plasmdico. Los plsmidos son molculas de DNA extracromosmico, circular y de pequeo
tamao (entre dos y varios cientos de kilobases) que se encuentran en muchas especies bacterianas.
Se caracterizan porque se replican de manera independiente del DNA cromosmico bacteriano,
tienen su propio origen de replicacin, y no son necesarios para la viabilidad general de la clula, pero
pueden contener genes que contribuyan a la supervivencia en condiciones especiales, como los que
confieren resistencia a antibiticos. Una determinada clula bacteriana puede no tener ningn
plsmido o puede albergar un nmero variable de los mismos. Algunas clases de plsmidos poseen la
propiedad conocida como replicacin relajada, esto es, estn presentes en forma de muchas
copias por clula, lo que facilita enormemente su aislamiento y purificacin.

Se han desarrollado un gran nmero de mtodos para la purificacin de DNA plasmdico de bacterias
y todos ellos implican invariablemente tres pasos:
a) Crecimiento de la estirpe bacteriana portadora en medio de cultivo
b) Recogida y lisis de las bacterias
c) Purificacin del DNA plasmdico

El mtodo utilizado para la obtencin de plsmido en esta prctica se denomina lisis alcalina y se basa
en la desnaturalizacin selectiva del DNA cromosmico mediante alcalinizacin con NaOH y adicin

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de SDS (detergente), en condiciones en las que el DNA plasmdico permanece prximo a su
estructura nativa, debido principalmente a su pequeo tamao y su naturaleza circular y
superenrollada.

Al neutralizar el medio y aadir una alta concentracin de sal (acetato potsico), se produce la
precipitacin de gran parte de las protenas debido al tratamiento con SDS y a la alta concentracin de
sales. Tambin precipita el DNA cromosmico, probablemente porque se producen reasociaciones al
azar entre las diferentes regiones de este DNA y as se forman agregados insolubles. Por el contrario,
no precipita el DNA plasmdico, que queda en el sobrenadante. Este DNA puede ser analizado y
visualizado mediante electroforesis en gel de agarosa. En cada una de las calles del gel donde se cargue
el DNA plasmdico, veremos tres bandas de distinto tamao que correspondern a las tres formas
principales con las que migra el mismo en funcin de su grado de enrollamiento. Son las formas
circular, enrollada y superenrollada que migran con menor a mayor velocidad, respectivamente, en
una electroforesis.

9.4. Materiales

Matraces pequeos.
Pipetas de vidrio de 5 mL.
Tubos eppendorf de 1,5 mL.
9.5. Equipos

Centrifuga eppendorf de sobremesa.
Microondas o placa calefactora.
Equipo de electroforesis (cmara de
electroforesis, soporte, peine, fuente de
alimentacin).

9.6. Sustancias
Agua desionizada
Acrilamida 30%
Bisacrilamida 0.8%
Tris-HCl, 1.5 M, pH=8.8
Micropipetas automticas
Puntas desechables

Glicina
Glicerol
2-Mercaptoetanol
Tetrametiletilendiamina (TEMED)

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Dodecilsulfato de sodio (SDS) al 10 y 20%.
Persulfato de amonio 10%
Solucin Colorante.
Solucin Decolorante.
Marcador de peso molecular:
Pageruler Unstead Protein

PREPARACIN DE LOS REACTIVOS
Soluciones Stock y buffer

14. Acrilamida/Bis (30% T, 2.67% C)

Pesar 14.6 g de Acrilamida (29.2 g/100 mL) y 0.4 g de Bis-acrilamida (0.8 g/100 mL) y aforar en un
baln de 50 mL con agua desionizada. Filtrar y almacenar a 4 C en la oscuridad (30 das como
mximo).

15. SDS al 20 y 10% P/V.

Disolver 10 g de SDS y aforar en un baln de 100 mL con agua desionizada.
Disolver 20 g de SDS y aforar en un baln de 100 mL con agua desionizada.

16. Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8

Disolver 27.23 g de Tris base y adicionar 80 mL de agua desionizada. Ajustar el pH a 8.8 con
una solucin de HCl 6N. Adicionar agua hasta 150 mL de agua desionizada y almacenar a 4
C.

17. Tris-HCl 0.5 M, pH 6.8

Disolver 6 g de Tris base y adicionar 60 mL de agua desionizada. Ajustar el pH a 8.8 con una
solucin de HCl 6N. Adicionar agua hasta 100 mL de agua desionizada y almacenar a 4 C.

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9.7 Procedimiento

18. Realizar el montaje de electroforesis como se muestra en la figura.

Figura 1. Equipo de electroforesis. Tomado de http://www.bio-rad.com/

19. Preparar 5.01 mL del gel siguiendo el orden y las cantidades descritas en la tabla:

Tabla 1. Componentes y volmenes para el gel de separacin.

GEL DE SEPARACIN
Agua destilada 1.70
Acrilamida/Bis-acrilamida 2.00
Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8 1.25
SDS al 20% 0.025
Persulfato de amonio 10% 0.025
TEMED 0.010

20. Vierta el gel entre los vidrios y cubra con una capa de isopropanol al 60%, con el propsito de
hacer ms efectiva la polimerizacin.
21. Una vez polimerizado el gel de corrido lave con agua para retirar el isopropanol y porciones
de acrilamida sin polimerizar.
22. Seque con papel de filtro y agregue 3.165 mL de gel de concentracin de acuerdo a la tabla 2:

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Tabla 2. Componentes y volmenes para el gel de concentracin.

GEL DE CONCENTRACIN
Agua destilada 1.86
Acrilamida/Bis-acrilamida 0.45
Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8 0.75
SDS al 10% 0.030
Persulfato de amonio 10% 0.060
TEMED 0.010

23. Una vez terminada la polimerizacin saque el peine, limpie los pozos con papel de filtro.
24. Introduzca el montaje en la cmara de electroforesis y cubra con buffer de corrido. La
composicin de buffer de corrido se describe a continuacin en la tabla 3:

Tabla 3. Composicin y concentracin del buffer de separacin.

BUFFER DE CORRIDO
Tris base 0.3%
Glicina 1.44%
SDS 0.1%

25. Prepare las muestras mezclando 10L del extracto de protenas de inters con 10L de
buffer de carga, la composicin y el buffer de carga se muestra en la tabla 4.

Tabla 4. Composicin y concentracin del buffer de carga para muestras.

BUFFER DE CARGA PARA MUESTRAS
Tris-HCl 0.5 M 25%
Glicerol 20%
SDS al 10% 40%
2-Mercaptoetanol 10%
Azul de bromofenol 5%

26. Siembre en los pozos las muestras junto a 4 L de marcador de peso molecular
27. Aplique voltaje entre 80-110 V de acuerdo al frente de corrido.

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28. Terminado el corrido transfiea el gel a la solucin colorante de azul de Coomassie R250, deje
colorear 30 minutos. La composicin de la solucin colorante.
29. Para observar las bandas, deje el gel en solucin decolorante hasta que el gel decolore y se
observen las bandas.
30. Posteriormente, escanear el gel y comparar las bandas con el carril 1 que corresponde al
marcador de peso molecular.



Todos sern descartados en el recipiente indicado Residuos acuosos (Buffer)
El residuo slido del gel se debe envolver en papel aluminio y se
debe desechar en el recipiente de residuos slidos.

Residuos slidos

a. Responda las siguientes preguntas:

a Cul es el fundamento de la tcnica de electroforesis ?. Explique.
b Cul es la naturaleza bioqumica de la estructura de la agarosa?.
c Indique las posibles aplicaciones de la tcnica de electroforesis
d Diferencie la utilizacin de Bromuro de etidio y de azul de bromofenol durante el proceso de
coloracin de DNA.


Captulo 3 (2006).
3) Miller, MB. DNA technology in schools: a straightforward approach. Biotechnology
education, v. 4, 1993. Pgs:15-21.

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10. CARBOHIDRATOS



10.1. Objetivos
Diferenciar las sustancias que contienen carbohidratos simples por medio de
reacciones qumicas.
Demostrar que el almidn es un polisacrido compuesto por muchas molculas de
azcares sencillos (glucosa).
Identificar la presencia de azcares reductores mediante la reaccin de Fehling.

Carbohidrato, azcares reductores, almidn.

Los carbohidratos son los compuestos orgnicos ms abundantes de la biosfera. La mayora
pueden ser representados con la frmula general C
n
(H
2
O)
n
, por lo que se les conoce cono
hidratos de carbono. Gran parte de sus funciones biolgicas dependen de su estructura
qumica tan particular y verstil. Ellos son componentes fundamentales de muchos alimentos
y su degradacin durante el proceso de digestin genera la energa necesaria para las
funciones vitales del organismo. Cuando se encuentran combinados con otras biomolculas,
dan origen a molculas ms complejas cuyas funciones pueden ser estructurales o de soporte
celular y tisular, de comunicacin entre clulas, de reconocimiento o de sealizacin.
Qumicamente se definen como polihidroxialdehdos o polihidroxiacetonas cclicas o
sustancias que luego de hidrolizarse dan origen a los mismos. Un carbohidrato que no puede
ser hidrolizado en uno ms simple es llamado monosacrido. Los monosacridos ms
comunes son la glucosa, la fructosa, la galactosa y la manosa. Un carbohidrato que puede ser
hidrolizado en dos molculas de monosacridos es llamado disacrido. Los ms importantes

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son la lactosa (presente en la leche), la sacarosa (presente en el azcar comn) y la maltosa.
Por su parte, aquellos carbohidratos que pueden ser hidrolizados en varias molculas de
monosacridos son llamados polisacridos. Los ms comunes son el almidn y la celulosa,
ste ltimo es componente estructural de las plantas. La determinacin de glucosa es de
importancia mdica ya que niveles sanguneos alterados pueden ser signo de una enfermedad
metablica comn conocida como diabetes mellitus.

Algunos azcares tienen la propiedad de oxidarse en presencia de agentes oxidantes suaves
como el ion Fe
3+
o Cu
2+
. Esta caracterstica radica en la presencia de un grupo carbonilo
libre, el cual es oxidado y genera un grupo carboxilo. Por lo tanto, aquellos azcares con un
grupo carbonilo libre son llamados azcares reductores y aquellos en los que el grupo
carbonilo se encuentra combinado en unin glicosdica se conocen como azcares no
reductores. Existen varias reacciones qumicas que permiten determinar si se est en
presencia de un azcar reductor o no. Algunas de ellas son, la prueba de Benedict, la prueba
cualitativa de la glucosa oxidasa, la prueba de yodo para almidn e hidrlisis del almidn.

(i) Prueba de Benedict
Esta prueba se basa precisamente en la reaccin o no de un azcar con el ion Cu
2+
. El
reactivo de Benedict contiene soluciones de carbonato de sodio, sulfato de cobre, y citrato
de sodio. El Na
2
CO
3
confiere a la solucin un pH alcalino necesario para que la reaccin
pueda llevarse a cabo. El citrato de sodio mantiene al ion Cu
2+
en solucin ya tiene la
propiedad de formar complejos coloreados poco ionizados con algunos de los metales
pesados. Con el cobre produce un complejo de color azul. Si se le agrega al reactivo una
solucin de azcar reductor y se calienta hasta llevar la mezcla a ebullicin, el azcar en
solucin alcalina a elevadas temperaturas se convertir en D-gluconato y su ene-diol,
rompindose luego en dos fragmentos altamente reductores, los cuales con sus electrones
expuestos, reaccionarn con el Cu
2+
. Se obtiene entonces un azcar oxidado y dos iones
Cu
+
. Posteriormente el Cu
+
producido reacciona con los iones OH
-
presentes en la solucin
para formar el hidrxido de cobre.

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Esquema 1. Reaccin de la prueba de Benedict.

La aparicin de un precipitado amarillo, anaranjado, o rojo ladrillo evidencia la presencia de
un azcar reductor.

(ii) Prueba cualitativa de la glucosa oxidasa
Este mtodo es utilizado hoy en da para la determinacin y cuantificacin de glucosa en
sangre y orina; vino a reemplazar a otros como la prueba de Benedict, debido a su mayor
especificidad y sensibilidad. La prueba se basa el uso de una enzima llamada glucosa oxidasa
que reconoce especficamente a una de las formas anomricas de la D-glucosa, la forma beta
glucopiranosa. Esta enzima, en presencia de glucosa, oxgeno y un amortiguador de pH,
genera gluconolactona y perxido de hidrgeno.

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Esquema 2. Reaccin de la prueba de la glucosa oxidasa. a) Oxidacin del carbono
anomrico de glucosa y otros azcares es la base de la reaccin de Fehling. b) Concentracin
de glucosa en sangre determinada por la medida de la concentracin de H
2
O
2
producido en la
reaccin catalizada por Glucosa oxidasa.

El perxido de hidrgeno es a su vez sustrato de otra enzima, la peroxidasa, la cual en
presencia de fenol y una amina aromtica (en nuestro caso, la amino-4-antipirina) genera un
compuesto de color rosado y agua. Por lo tanto, cuando el reactivo vira de incoloro a rosado,
se demuestra la presencia de glucosa en la muestra.

(iii) Prueba de yodo para almidn
El polisacrido almidn est constituido de dos polmeros, amilosa y amilopeptina. La amilosa
est constituida de largas cadenas lineales de glucosa unidas en enlace glicosdico alfa 1,4
(figura 1). Estas cadenas no poseen un tamao determinado sino que pueden variar desde
unos miles de unidades de glucosa hasta un milln. Por otro lado, la amilopeptina posee, al
igual que la amilosa, cadenas lineales de glucosa unidas en enlace alfa 1,4 pero adems, posee
una gran cantidad de ramificaciones, las cuales se presentan cada 24 a 30 residuos de glucosa
y en enlace glicosdico alfa 1,6.

El almidn es la molcula de reserva energtica en las plantas por excelencia. Debido a que
muchos organismos superiores poseen las enzimas necesarias para su degradacin, este
polmero puede ser convertido durante el proceso de digestin en diferentes intermediarios
metablicos que generan energa. El glucgeno a su vez es la contraparte del almidn en el
reino animal, con la diferencia de que esta molcula posee una mayor cantidad de
ramificaciones que el almidn y es ms compacta. La conformacin de los enlaces alfa 1,4
presentes en estas molculas causa que estos polmeros asuman una estructura helicoidal
muy estrecha. La prueba del almidn es una prueba muy sencilla pero que todava se utiliza
para determinar la presencia de almidn en algunos alimentos. La prueba se basa en una
reaccin fsica y no qumica, en la cual el almidn reacciona con el yodo para formar un
complejo de color azul intenso. Bajo las mismas condiciones, el glucgeno da una coloracin
caf.

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Figura 1. Estructura qumica del almidn.

(iv) Hidrlisis del almidn
Esta prueba tiene como objetivo demostrar que efectivamente los polisacridos como el
almidn estn compuestos de monosacridos unidos por enlaces glicosdicos. Como se
mencion anteriormente, el almidn est constituido de un solo monosacrido, la glucosa.
Las propiedades del almidn son diferentes a las de la glucosa como se evidenciar mediante
la hidrlisis del almidn para generar glucosa. Todos los polisacridos son hidrolizados en sus
constituyentes monosacridos, por la accin de cidos diluidos. Esta es una reaccin gradual
que puede observarse durante el tiempo de la sesin de laboratorio. Es por tanto
recomendable que usted inicie el proceso de hidrlisis al comenzar la sesin de laboratorio y
luego proceda con el resto de las pruebas. La hidrlisis del almidn se puede evidenciar con
dos pruebas:
a) Desaparicin del color azul caracterstico de la prueba del yodo.
b) Aparicin de glucosa, un azcar reductor. La aparicin de glucosa se evidenciar
mediante la prueba de Benedict.

10.4. Materiales
1 Tubo de ensayo grandes (10 mL)
10 Tubos de ensayo medianos
2 Gradillas

1 baln aforado de 1 L
Micropipeta de 0.5-5 mL.
Esptula

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7 Baln aforado de 1000 mL 1 placa de aglutinacin

10.5. Sustancias
Agua destilada

10.5.1. Prueba de Benedict
Reactivo de Benedict: 100 g de
Carbonato de sodio (Na
2
CO
3
)
anhdro, 173 g de Citrato de sodio,
17,3 g de Sulfato de cobre
pentahidratado (CuSO
4
.5H
2
O)

Soluciones de carbohidratos 0,1
mol/L
Solucin de almidn al 1%

10.5.2. Prueba cualitativa de la glucosa oxidasa
Solucin de glucosa/oxidasa: contiene
glucosa oxidasa, peroxidasa,
amortiguador y amino-4-antipirina.
Soluciones de carbohidratos 0,1
mol/L, usados en la prueba anterior
Solucin de almidn al 1%, usado en
la prueba anterior.

10.5.3. Prueba de yodo para almidn
Solucin de almidn al 1%, usado en
las pruebas anteriores.

Solucin de yodo: 1 g de yodo,
solucin de KI al 2%

10.5.4. Hidrlisis del almidn
cido clorhdrico (HCl) concentrado
Solucin de hidrxido de sodio
(NaOH) 0,4 mol/L

Solucin de yodo, usado en la prueba
anterior.
Reactivo de Benedict

10.6. Procedimiento

10.6.1. Prueba de Benedict
Pesar 100 g de Na
2
CO
3
anhidro y disolver en 200 mL de agua destilada hervida.
Pesar 173 g citrato de sodio (NaH
2
(C
3
H
5
O (COO)
3)
y disolverlo en 200 mL de agua
destilada hervida.
Pesar 17,3 g de CuSO
4
.5H
2
O y disolverlo en 300 mL de agua destilada hervida.

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Mezclar las tres soluciones cuando estn fras. Aforar a 1 L con agua destilada hervida.
Preparar una solucin 0.1 mol/L de cada uno de los siguientes carbohidratos glucosa,
galactosa, lactosa, xilosa, fructosa, sacarosa y una solucin al 1% de Almidn (La
disolucin del almidn se realiza en agua caliente).
Rotular las soluciones.
Adicionar 2,5 mL de reactivo de Benedict en un tubo de ensayo mediano (los tubos de
ensayo grandes se usan en la prueba de hidrlisis del almidn).
Repetir el paso anterior en 6 tubos ms. Luego, a cada tubo, aadir 6 gotas de un las
soluciones de carbohidratos.
Colocar los tubos en un bao de agua hirviendo por 5 minutos. Observar cualquier
cambio de color durante el calentamiento.
Tomar los tubos y ponerlos en una gradilla y despus de un corto tiempo observar si
se ha formado un precipitado, el cual puede ser rojo, anaranjado o verdoso.
Observar si los resultados concuerdan con lo esperado tericamente sobre
carbohidratos reductores y en el informe dar explicacin de ello.

10.6.2. Prueba cualitativa de la glucosa oxidasa
Poner 3 gotas de solucin de glucosa oxidasa/peroxidasa en siete depresiones de la
placa de ensayos.
Aadir una gota de glucosa a una depresin, una gota de fructosa a otra, etc. Observe
las depresiones inmediatamente y anote los resultados. Vuelva a observar las
depresiones y revise si existe algn cambio. Si se observa algn cambio luego de
incubar por ms tiempo las diferentes reacciones, en el informe se debe explicar a qu
se debe este cambio y qu implicaciones podra tener este resultado.

10.6.3. Prueba de yodo para almidn
En tres tubos medianos distribuir los reactivos como se indica en la tabla 1.
Agitar muy bien los tubos y notar la diferencia de color que se atribuye a la formacin
de un complejo entre el almidn y el yodo. Anotar el resultado.

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Colocar los tres tubos en un bao de agua caliente (70 C) con cuidado, por 10
minutos y observar cualquier cambio de color. Anotar el resultado.
Enfriar los tubos y observar nuevamente. Anotar el resultado.

Tabla 1. Preparacin de mezclas para la prueba de yodo.

Tubo
No.
Sustancia
Agua (mL) Almidn al 1% (gotas) Solucin de yodo (gotas)
1 5 5 1
2 5 1 1
3 5 0 1

10.6.4. Hidrlisis del almidn

Poner 10 mL de una solucin de almidn al 1% en un tubo de ensayo grande.
Aadir 1 mL de HCl concentrado al tubo. Agitar bien y luego colocar el tubo en un
bao de agua hirviendo con cuidado de no quemarse.
Mientras el almidn se est hidrolizando (tarda de 1:30 h a 2 h aproximadamente),
efecte la prueba de coloracin del yodo. Para ello, aada en otro tubo 5 mL de agua,
una gota de la solucin de yodo y 0,5 mL de la solucin de almidn que tiene
hidrolizando en el bao mara a ebullicin. Anote el resultado de la prueba del yodo.
Despus de que la hidrlisis del almidn se haya llevado a cabo por 15 minutos, saque
0,5 mL del almidn que se est hidrolizando en el bao mara y repita la prueba del
yodo cada 15 minutos. Contine la hidrlisis hasta obtener una prueba de yodo
negativa.
Posteriormente y para confirmar la presencia de glucosa, efecte la prueba de
Benedict. Para ello, aada en un tubo 0.5 mL del almidn hidrolizado, 1 mL de NaOH
0,4 mol/L (para neutralizar el cido) y 2,5 mL de reactivo de Benedict. Incubar por 8
minutos en agua hirviendo. Anotar y analizar los resultados. Utilice sus resultados del
punto 1 (Prueba de Benedict) y del punto 2 (Prueba de yodo para almidn) para
interpretar sus resultados.

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Solucin acuosa-

colorantes


a) Qu otro reactivo se puede usar para anlisis de azcares reductores?
b) Por qu es necesario el citrato de sodio en el reactivo de Benedict?
c) Qu coloracin es una prueba positiva para la glucosa oxidasa?
d) Por qu la prueba de la glucosa oxidasa es especfica para la determinacin de glucosa?
e) Qu tipo de enlaces es capaz de romper el HCl? Por qu?

Captulo 3 (2006).
3) Miller, MB. DNA technology in schools: a straightforward approach. Biotechnology
education, v. 4, 1993. Pgs:15-21.

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11. EXTRACCIN E IDENTIFICACIN CUALITATIVA DE
LPIDOS

Grupal (2 personas) 4 horas No tiene indicaciones de peligro

11.1. Objetivos
Extraer y caracterizar la lecitina y el colesterol de yema de huevo.
Determinar cualitativamente la presencia de colina, fosfatos y glicerol en un
hidrolizado de lecitina.

Lpidos, Lectinas, colina, fosfatos y glicerol.


Se llama lpidos a un conjunto de molculas orgnicas, la mayora biomolculas, compuestas
principalmente por carbono e hidrgeno y en menor medida oxgeno, aunque tambin
pueden contener fsforo, azufre y nitrgeno. Tienen como caracterstica principal ser
insolubles en agua y solubles en disolventes orgnicos como el benceno.

Los lpidos forman un grupo de sustancias de estructura qumica muy heterognea, siendo la
clasificacin ms aceptada la siguiente:

Lpidos saponificables: Los lpidos saponificables son los lpidos que contienen
cidos grasos en su molcula y producen reacciones qumicas de saponificacin. A su
vez los lpidos saponificables se dividen en:

Lpidos simples: Son aquellos lpidos que slo contienen carbono, hidrgeno y oxgeno. Estos
lpidos simples se subdividen a su vez en: Acilglicridos o grasas (cuando los acilglicridos son

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slidos se les llama grasas y cuando son lquidos a temperatura ambiente se llaman aceites) y
Cridos o ceras.

Lpidos complejos: Son los lpidos que adems de contener en su molcula carbono, hidrgeno
y oxgeno, tambin contienen otros elementos como nitrgeno, fsforo, azufre u otra
biomolcula como un glcido. A los lpidos complejos tambin se les llama lpidos de
membrana pues son las principales molculas que forman las membranas celulares:
Fosfolpidos y Glicolpidos.

Lpidos insaponificables: Son los lpidos que no poseen cidos grasos en su
estructura y no producen reacciones de saponificacin. Entre los lpidos
insaponificables encontramos a: Terpenos, Esteroides y Prostaglandinas. En el
esquema 1 se muestra la clasificacin general de los lpidos.

Esquema 1. Clasificacin general de los lpidos.

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Principalmente cumplen las siguientes tres funciones:

Funcin de reserva energtica: Los lpidos son la principal fuente de energa de los
animales ya que un gramo de grasa produce 9,4 kilocaloras en las reacciones
metablicas de oxidacin, mientras que las protenas y los glcidos slo producen 4,1
kilocaloras por gramo.
Funcin estructural: Los lpidos forman las bicapas lipdicas de las membranas
celulares. Adems recubren y proporcionan consistencia a los rganos y protegen
mecnicamente estructuras o son aislantes trmicos como el tejido adiposo.
Funcin catalizadora, hormonal o de mensajeros qumicos: Los lpidos facilitan
determinadas reacciones qumicas y los esteroides cumplen funciones hormonales.

El colesterol es una grasa presente en todas las clulas del organismo. Se presenta en altas
concentraciones en la mdula espinal, pncreas y cerebro pero se sintetiza principalmente en
el hgado y en el intestino delgado. Aproximadamente el 50% de las necesidades de
colesterol son sintetizadas en el hgado mientras que el resto se obtiene de los alimentos de
origen animal presentes en la dieta.

Esquema 2. Molcula de colesterol.

En la molcula de colesterol se puede distinguir una cabeza polar constituida por el grupo
hidroxilo y una cola o porcin apolar formada por los distintos ciclos y los sustituyentes
alifticos. As, el colesterol es una molcula hidrofbica que al igual que otros lpidos es
bastante soluble en disolventes apolares como el cloroformo, acetona y ter. Considerando

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lo anterior, cualquier mtodo de extraccin de lpidos requiere utilizar mezclas de solventes
orgnicos que permitan solubilizar todos los lpidos y precipiten protenas e hidratos de
carbono para su mejor separacin.

Los organismos mamferos obtienen colesterol a travs de dos vas:

Va exgena o absorcin de colesterol contenido en los alimentos. El colesterol se
encuentra exclusivamente en alimentos de origen animal, mayoritariamente en la yema de
huevo, hgado, lcteos, cerebro (sesos) y msculo esqueltico (carnes rojas).
Va endgena o sntesis de colesterol en las clulas animales a partir de su
precursor, el acetato, en su forma activada acetil-coenzima A.

Un huevo posee una alta densidad de colesterol: aproximadamente 213 gramos por unidad,
que se encuentran en la yema. Segn antiguas recomendaciones para la poblacin sana en
general, slo deberan consumirse tres huevos a la semana como mximo. Pero ahora se sabe
que el colesterol dietario, por ejemplo el contenido en los huevos, no afecta en gran medida
al colesterol sanguneo en personas sanas, dado que no es el principal responsable de ese
aumento.
Ms aun, el huevo posee la ventaja de tener mayor porcentaje de cidos grasos poli y
monoinsaturados y, por ende, ms grasas insaturadas que saturadas. Estas ltimas constituyen
uno de los factores principales del aumento del colesterol en sangre, pero los huevos las
poseen en escasa cantidad. Especficamente, un huevo contiene 1,5 gramos de grasas
saturadas y de 2,5 a 3 gramos de grasas insaturadas. Pero adems, las grasas monoinsaturadas
contribuyen a elevar los lpidos de alta densidad (HDL) , tambin llamado "colesterol bueno".
El colesterol es el principal esterol del organismo humano y precursor de todos los dems
esteroides corporales. Se encuentra formando parte de membranas celulares, lipoprotenas,
cidos biliares y hormonas esteroideas.
El colesterol puede extraerse de muestras biolgicas con cloroformo, etanol caliente, ter
dietlico, acetona, y otros solventes orgnicos. Es comn la prctica de usar una mezcla de
solventes orgnicos en su extraccin. Cuando est inmerso en agua el colesterol se hincha y

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forma una emulsin. Al contrario de otros lpidos el colesterol no est sujeto a la
precipitacin por agentes alcalinos.
Entre los fosfoglicridos ms comunes, tenemos a los tres derivados del cido fosfatdico, a
saber: Fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina y fosfatidilserina. A los fosfatidilcolina se les
conoce con el nombre genrico de lectinas. Existen varias lectinas dependiendo de los dos
cidos grasos que contengan esterificados en carbono alfa y beta del glicerol.
Las lectinas son molculas polares que existen en formas de sales internas o zwiteriones, ya
que contienen la carga negativa del cido fosfrico, y la carga positiva del grupo trimetilamino
de la colina. El pH isoelctrico de una lectina pura es generalmente de 6.7, lo cual concuerda
con su estructura anftera.
Las lecitinas puras son sustancias blancas de aspecto grasoso, que cuando se exponen a la luz
y el aire toman una coloracin caf, debido a la autooxidacin y descomposicin. Son solubles
en los solventes ordinarios de las grasas, excepto en acetona. Esta propiedad se emplea para
su aislamiento. Son higroscpicas y se mezclan bien con el agua formando soluciones
coloidales nebulosas.
La identificacin de la lecitina puede hacerse por saponificacin, para separar los cidos grasos
y su hidrlisis para separar la colina.

11.4. Materiales
Yema de huevo cocida
Mortero
Manta de calentamiento
Vaso de precipitado de 100 mL
Balanza
Embudo

Erlenmeyer
Varilla de vidrio.
Pipetas
Probeta de 25 mL
1 Tubo de ensayo
Papel de filtro

11.5. Sustancias
Mezcla etanol:ter 2:1
Mezcla Cloroformo:etanol 2:1
cido sulfrico concentrado
cido molbdico
cido ascrbico 1 mg/mL recin
preparado.
Anhdrido actico

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11.6. Procedimiento
Pesar media yema de huevo cocido.
Adicionar 20 mL de una mezcla de etanol:ter 2:1. Macere en un mortero, deje en
reposo 10 minutos con agitacin ocasional.
Filtrar la solucin. El filtrado recogerlo en un vaso de precipitado de 100 mL y el
residuo guardarlo para una segunda extraccin.
Evapore el filtrado en bao de Mara usando una manta de calentamiento. Pesar los
lpidos totales.
Posteriormente, disolver los lpidos totales en 5 mL de ter, adicionar a esta solucin
15 mL de acetona. El precipitado obtenido es el contenido de lecitina en la yema.
Aglomere el precipitado de Lecitina. Decante y filtre de nuevo.
Pese el precipitado de Lecitina y el sobrenadante (Triglicridos + colesterol),
evaporar, pesar y guardar para el anlisis de colesterol.

11.6.1 Identificacin de colesterol

Reactivo de Liberman Burchard
Tome 2 mL del sobrenadante del paso 1 en un tubo de ensayo y aada 10 gotas de
anhdrido actico y 2 gotas de cido sulfrico concentrado, la aparicin de una
coloracin verde es indicadora de la presencia de colesterol.

Reaccin de Salkowski
Mida 1 mL del sobrenadanante del paso 1 en un tubo de ensayo, incline el tubo y
deslice por su pared interna un volumen igual de cido sulfrico concentrado,
cuidando que los lquidos no se mezclen. Observe la formacin de un anillo coloreado
en la interfase.

Despus de pesado el precipitado de lecitina, disulvalo nuevamente con 10 mL de una
mezcla de etanol-ter 2:1 y realice las siguientes pruebas:

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Identificacin de fostatos
Tome 1 mL del filtrado y adicione 1 mL de cido molbdico, agite, deje 3 minutos en
reposo. Adicione 1 mL de solucin de cido ascrbico observe la formacin de un color
azul.

Deteccin de colina
Tome 1 mL de filtrado y caliente suavemente en un mechero o en un bao de agua
hirviendo. La trimetilamina liberada se caracteriza por un olor a pescado.

Identificacin de glicerol
Tome 2 mL de filtrado + 2 mL de agua de bromo. Calentar en vitrina para expulsar el
exceso de bromo. Tomar 0,4 mL de esta solucin + 0,1 mL de solucin de naftol al 5% en
etanol, agitar. Adicionar 40 gotas de cido sulfrico. Calentar 2 minutos en bao mara,
enfriar. Observar la aparicin de coloracin verde.



Solucin acuosa-

colorantes

a) Es saponificable el colesterol?. Argumente su respuesta.
b) Cules deben ser los valores promedio de colesterol total, triglicridos y
lipoprotenas (VLDL, LDL, HDL)?. Son los mismos para todas las edades?
c) Cules son las funciones del colesterol en los humanos?
d) De cules compuestos es el colesterol un precursor?
e) En qu rgano y a partir de que compuesto se sintetiza el colesterol en los
humanos?

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4) Bohinski, R.C. Bioqumica. 1991. Editorial Addison-wesley. Ed. Iberoamericana.
Captulo 3 (2006).
6) Stryer, L. Bioqumica. 1.995. Editorial Revert, Barcelona

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12. DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA
PEROXIDASA EXTRADA DE HOJAS DE PLANTA (PALMA
AFRICANA) Y SU INHIBICIN POR EFECTO DE LA TEMPERATURA



12.1. Objetivos
Extraer en solucin la enzima peroxidasa y cuantificar su actividad a diferentes
diluciones.
Determinar el efecto de la temperatura en la actividad enzimtica de la peroxidasa.

Enzimas, peroxidasa, actividad enzimtica.

En Bioqumica, se llaman enzimas las sustancias de naturaleza proteica que catalizan
reacciones qumicas, siempre que sea termodinmicamente posible (si bien no pueden hacer
que el proceso sea ms termodinmicamente favorable). En estas reacciones, las molculas
sobre las que acta la enzima en el comienzo del proceso son llamadas sustratos, y estas los
convierten en diferentes molculas, los productos.
Las propiedades de las enzimas se derivan de su estructura proteica, siendo la principal
propiedad su capacidad cataltica. La especificidad y estabilidad de las enzimas estn tambin
determinadas por su condicin de protenas. As tenemos:

Estabilidad
La capacidad cataltica de una enzima depende de la manutencin de su estructura nativa.
Dicha configuracin es la resultante de muchas fuerzas de interaccin. Los cambios

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ambientales pueden debilitar estas interacciones alterando la estructura tridimensional nativa
ocasionando la prdida total o parcial de su funcionalidad biolgica
La desnaturalizacin se entiende como cualquier proceso que altere la estructura
tridimensional nativa de una enzima que conlleva a la prdida de la actividad. Dependiendo
de la magnitud del agente desnaturalizante, puede verse afectada su estructura cuaternaria (si
existe), terciaria o secundaria. La prdida de la estructura cuaternaria es frecuentemente
reversible, pudindose recobrar la actividad cataltica, por el contrario la prdida de la
estructura terciaria es frecuentemente irreversible y lleva asociada una prdida total o parcial
de la actividad; la alteracin de la estructura secundaria es irreversible, provocando un efecto
de coagulacin y la inactivacin total de la enzima.

Las enzimas son catalizadores muy sensibles a la temperatura. Un aumento del nivel trmico
se traduce en un aumento de la energa vibracional que puede provocar la ruptura de
puentes de hidrgeno y la destruccin de interacciones apolares.
La fuerza inica del medio afecta la estabilidad de la enzima producindose, a bajos valores de
fuerza inica, una disminucin de las interacciones enzima-solvente y un incremento de las
interacciones inicas en el interior de la cadena que pueden desestabilizar su estructura.
El pH tambin afecta fuertemente la estabilidad de la enzima. La carga de los residuos
aminoacdicos de la protena depende de la concentracin de protones en el medio. Valores
de pH bajo o sobre el punto isoelctrico provocan la acumulacin de cargas ya sean positivas
o negativas que pueden ocasionar la desestabilizacin de la estructura de la enzima debido a
las fuerzas de repulsin.

Actividad
La capacidad cataltica o actividad es la propiedad esencial de una enzima. Desde un punto de
vista termodinmico la enzima, como catalizador, acta disminuyendo la magnitud de la
energa de activacin que requiere una reaccin de transformacin de sustrato o producto.
Desde un punto de vista cintico la accin de la enzima se traduce en un incremento en la
velocidad de transformacin de sustrato a producto.

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La capacidad cataltica de la molcula enzimtica reside en el centro activo que comprende un
nmero reducido de residuos aminoacdicos, prximos en la estructura tridimensional aunque
lejanos en la estructura primaria. El centro activo es una estructura compleja cuya
configuracin permite ubicar la molcula de sustrato en la posicin correcta para que los
grupos funcionales de la enzima efecten su transformacin qumica

Existen diversos mtodos para medir la velocidad de una reaccin enzimtica. La
espectrofotometra permite detectar cambios en la absorbancia de luz por parte del sustrato
o del producto (segn la concentracin de estos) y la radiometra implica incorporacin o
liberacin de radiactividad para medir la cantidad de producto obtenido por tiempo. Los
ensayos espectrofotomtricos son los ms utilizados, ya que permiten medir la velocidad de
la reaccin de forma continua. Por el contrario, los ensayos radiomtricos requieren retirar
las muestras para medirlas, por lo que son ensayos discontinuos. Sin embargo, estos ensayos
son extremadamente sensibles y permiten detectar niveles muy bajos de actividad enzimtica
Como todos los catalizadores, las enzimas funcionan disminuyendo la energa de activacin
(G) de una reaccin, de forma que se acelera sustancialmente la tasa de reaccin. Las
enzimas no alteran el balance energtico de las reacciones en que intervienen, ni modifican,
por lo tanto, el equilibrio de la reaccin, pero consiguen acelerar el proceso incluso millones
de veces. Una reaccin que se produce bajo el control de una enzima, o de un catalizador en
general, alcanza el equilibrio mucho ms deprisa que la correspondiente reaccin no
catalizada.
Al igual que ocurre con otros catalizadores, las enzimas no son consumidas por las reacciones
que catalizan, ni alteran su equilibrio qumico. Sin embargo, las enzimas difieren de otros
catalizadores por ser ms especficas.
Las peroxidasas son glicoprotenas globulares con un peso molecular aproximado de 42000
Da, en las cuales la porcin proteica corresponde aproximadamente 34000 Da, el resto del
peso molecular del grupo est constituido por el grupo prosttico (grupo hemo), dos iones
calcio y algunos glicanos superficiales enlazados. Por lo general son molculas ms pequeas
que las oxidasas.

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La peroxidasa es una enzima que cataliza la oxidacin de un amplio nmero de sustratos
orgnicos e inorgnicos, utilizando el poder oxidante del perxido de hidrgeno (el cual es el
sustrato). Es utilizada ampliamente en bioqumica clnica. As, los ensayos para la
determinacin y cuantificacin de metabolitos como glucosa, cido rico, colesterol o
triglicridos en fluidos biolgicos usan peroxidasa como enzima acoplada. Tambin se utiliza
en inmunoensayos para la deteccin de virus tan conocidos como el virus de la
inmunodeficiencia humana (VIH) causante del SIDA o el herpesvirus. La peroxidasa tambin
se utiliza como biocatalizador para la generacin de productos de inters biotecnolgico e
industrial como resinas fenlicas, adhesivos, antioxidantes, antiestticos y protectores de
radiacin magntica, colorantes alimentarios y componentes bioactivos de detergentes. En
este experimento, para analizar la actividad de la enzima se utilizara la solucin extrada de la
planta y reaccionara con soluciones de H
2
O
2
. La enzima descompondr el perxido
produciendo O
2
libre que reaccionara con un compuesto (Guayacol) que al oxidarse forma
una solucin coloreada (Tetraguayacol) y de esta forma poder ser detectado a una longitud
de onda en el rango visible.
Para determinar la actividad de la peroxidasa se debe tener en cuenta que el coeficiente de
extincin molar a 470 nm del tetraguayacol es 5200 M
-1
cm
-1
. Utilice la siguiente ecuacin:
Act= (m(3.1)(60)(1x10
3
))/ 5200 donde
m = pendiente de la grfica para cada experimento de dilucin de peroxidasa
3.1 = volumen total en ml de la solucin en la celda del espectrofotmetro
60 = factor de la pendiente de segundos a minutos
1x10
-3
= factor de mmol a mol para el valor de M del coeficiente de
extincin.
12.4. Materiales
Mortero
Pipeta de 10 mL
Micropipeta de 0.5-10 L
5 tubos de ensayo
Tubos eppendorf
XXXXXXXXXXXXX

12.5. Sustancias
Solucin extractora: Buffer fosfato 60
mM, NaCl 0,1 M, pH 7,0
Buffer fosfato 10 mM pH 6,0

Perxido de hidrgeno al 30%.
Guayacol

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12.6 Equipos
Centrifuga

12.7. Procedimiento

12.7.1. Solucin de peroxidasa
Picar 2 g de hoja de palma africana y homogenizar con 20 mL de la solucin extractora
en licuadora durante 2-3 minutos.
Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego centrifugar a 5000 rpm
durante 15 minutos. Usar el sobrenadante como solucin de peroxidasa.

12.7.2. Solucin de sustratos
Disolver 10 L de perxido de hidrogeno al 30% y 40 L de guayacol en 20 mL de
buffer fosfato pH 6.0.

12.7.3. Actividad enzimtica
Preparar en 5 tubos de ensayo 100 L de la solucin de peroxidasa cada una de las
siguientes diluciones: 1:2, 1:5, 1:10, 1:25, 1:50.
Llevar con una pipeta 3 mL de la solucin de sustrato a la celda del
espectrofotmetro, colocar la longitud de onda a 470 nm y calibrar la absorbancia a
cero con esta solucin.
Para realizar las lecturas de absorbancia adicione primero 100 L de la solucin de
peroxidasa (5 experimentos, 1 para cada dilucin) a la celda, inmediatamente adicione
3 mL de solucin de sustrato y registre el valor de la absorbancia cada 15 segundos
por un periodo entre 3-5 minutos.
Dibuje una grfica para los 5 experimentos de absorbancia vs tiempo.
Determine la actividad de la peroxidasa.
Determinar la concentracin de protena utilizando el mtodo de Biuret (con
estndares de Albumina de suero Bovino (BSA).

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Utilizar los valores de concentracin de protena para mirar el comportamiento y
elucidar un valor aproximado para la actividad especfica de la enzima.

12.7.4. Efecto de la temperatura en la actividad de la enzima
Seleccionar una de las diluciones de la enzima del experimento anterior.
Adicionar 1 mL de esta dilucin a un tubo de eppendorf, taparlo y calentarlo en un
bao a 95 C.
Sacar 0,1 mL de esta solucin a los 0, 5, 10, 15, 30 minutos de incubacin y enfriarlos
inmediatamente en un vaso con hielo.
Realizar el experimento que se hizo anteriormente con esta dilucin para determinar
la actividad de la misma forma que lo anterior para cada valor de tiempo.
De los datos obtenidos comparar los valores de actividad para la enzima sin calentar y
al calentar la dilucin a cada tiempo.



Todos sern descartados en el recipiente indicado Solucin acuosa


a) Cmo vara la accin enzimtica sobre la naturaleza fsica de la muestra (comparar
resultados, hgado y papa macerados Vs las mismas muestras sin homogeneizar).
b) Cul es la funcin de un catalilizador sobre la velocidad de reaccin?
c) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
d) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
e) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
f) XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

MANUAL DE PRCTICAS
DE LABORATORIO DE
BIOQUMICA
Cdigo: MFOQ-BQ.01
Versin: 00
Pgina 91 de 91


Lab Bioqumica

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