Biotecnologa de plantas

Rafael Salgado Garciglia, Rodolfo Lpez Gmez, Mauro M. Martnez Pacheco y Abraham
Garca Chvez
Cuerpo Acadmico de Biotecnologa de Plantas
Resumen
El Cuerpo Acadmico de Biotecnologa de Plantas desarrolla diversas lneas de in-
vestigacin relacionadas con la biotecnologa vegetal moderna. El principal inters es
la propagacin, conservacin y mejoramiento gentico de plantas, el uso de las tcni-
cas de biologa molecular para la certificacin gentica, para esclarecer la filogenia y
sistemtica de plantas, para la identificacin de genes relacionados con la defensa de
las plantas a patgenos (marcadores moleculares) y en la genmica funcional de ma-
duracin de frutos, as como la bsqueda de metabolitos bioactivos. Actualmente se
realizan investigaciones relacionadas con la propagacin y conservacin in vitro de
especies de importancia agrcola, forestal, medicinal y en riesgo de extincin; el uso
de las tcnicas de biologa molecular para estudios filogenticos, certificacin de es-
pecies, mejoramiento gentico y el aislamiento e identificacin de genes relaciona-
dos con defensa y procesos fisiolgicos; la obtencin de extractos vegetales con
propiedades antimicrobianas e insecticidas, contra patgenos de plantas y humanos;
biotecnologa de aguacate, la investigacin central del grupo, con estudios de biolo-
ga molecular, resistencia a patgenos, micropropagacin y conservacin in vitro.
Abstract
The Academic Group of Plant Biotechnology develops diverse lines of investigation
related to the modern plant biotechnology. The main interest is the propagation, con-
servation and genetic improvement of plants, the use of the techniques of molecular
biology for the genetic certification, to clarify phylogeny and systematic of plants, for
the identification of genes related to the defense of the plants to pathogens (molecular
markers), in functional genomic on maturation of fruits, as well as the search of bioacti-
ve metabolites. Different research lines are related to the propagation and conserva-
tion in vitro of agricultural, forest, medicinal and in extinction-risk plants; the use of the
techniques of molecular biology for phylogenetic studies, certification of species, ge-
Ciencia Nicolaita No. 48 65 Octubre de 2007
netic improvement and the isolation and identification of genes related to defense and
physiological processes; the obtaining of plant extracts with antimicrobial and insecti-
cide properties, against plants and human pathogens; biotechnology of avocado, the
central research line of the group, with studies of molecular biology, resistance to pat-
hogens, micropropagation and in vitro conservation.
Introduccin
La biotecnologa vegetal ha tenido un mayor desarrollo en los ltimos aos y se pre-
senta como una alternativa de resolucin de un gran nmero de problemas relacionados con
el mejor aprovechamiento de las plantas por parte del hombre; constituyendo una herra-
mienta invaluable para incrementar tanto la cantidad como la calidad de los alimentos de ori-
gen vegetal, as como para obtener nuevos productos con diversas aplicaciones a partir de
las plantas (Pierik, 1990). Con el cultivo de tejidos vegetales se han hecho aportaciones su-
mamente valiosas al conocimiento cientfico y tecnolgico, y se ha convertido en una de las
tcnicas ms utilizadas de la biotecnologa vegetal, ya que permiten la regeneracin de
plantas, la conservacin, la coleccin in vitro de germoplasma y la aplicacin de tcnicas en
conjunto para el mejoramiento (Drew, 1997). Las herramientas de la biologa molecular,
como la de marcadores moleculares, la de construccin de bancos genmicos y la genmi-
ca funcional, son tcnicas modernas que apoyan al esclarecimiento filogentico de las es-
pecies, a la gentica de poblaciones, a la certificacin de plantas de valor comercial y para el
aislamiento e identificacin de genes expresados durantes las etapas de desarrollo y en la
defensa de las plantas o bien para la elucidacin de genomas (Flavell, 1995).
Con el propsito de hacer uso de estas herramientas biotecnolgicas, se han pro-
puesto cuatro lneas de generacin y/o aplicacin del conocimiento (LGAC): 1) Propaga-
cin, conservacin y mejoramiento gentico de plantas; 2) Marcadores moleculares; 3)
Genmica funcional de maduracin de frutos; 4) Metabolitos vegetales biocidas. Principal-
mente se realizan proyectos de investigacin y desarrollo biotecnolgico orientados a la utili-
zacin, mejoramiento y conservacin de los recursos naturales renovables del pas, as
como a la formacin de recursos humanos especializados que puedan fortalecer los progra-
mas de investigacin de la propia Institucin o del pas.
En el Laboratorio de Biotecnologa Vegetal se desarrollan tres lneas en particular:
propagacin, conservacin y mejoramiento gentico in vitro; bsqueda de metabolitos ve-
getales con actividad biocida; y estudios de filogenia, certificacin molecular de especies co-
merciales, gentica de poblaciones e identificacin de genes de defensa.
En el laboratorio de Fisiologa Molecular de Plantas tambin se han establecido tres
lneas de investigacin: genmica funcional en procesos de desarrollo y maduracin de fru-
tos tropicales; mejoramiento gentico en frutales; produccin de protenas inmungenas en
plantas y genmica de aguacate.
Biotecnologa de Plantas
Octubre de 2007 66 Ciencia Nicolaita No. 48
En el laboratorio de Fisiologa Celular, las lneas son: Estudio de la va de sntesis de
folatos en aguacate y hongos; produccin de enzimas extracelular de origen fngico; y bs-
queda de principios activos biocidas en plantas medicinales.
CUADRO 1
Plantas micropropagadas y bajo conservacin in vitro.
Nombre comn Especie (Familia) Referencia
Limoncillo Euchile citrina (Orchidaceae) Becerril, 2003
Flor de corpus Laelia speciosa (Orchidaceae) Ortega, 2003
Aguacate Hass Persea americana Mill. Cv. Hass (Myrtaceae) Leal-Nares, 2003
Aguacate criollo
Persea americana Mill. Var. Drymifolia (Myrta-
ceae)
ngel-Palomares, 2003
Helechos arbreos Sphaeropteris sp. S. Myosuroides (Cyatheaceae) Aguilar-Coria, 2003
Geranios aromticos Pelargonium spp. (Geraniaceae) Crdenas, 2003
Phalaenopsis
Phalaenopsis amabilis Luchia Lady (Orchida-
ceae).
Malagn-Quintana, 2004
Flor de muertos Laelia autumnalis (Orchidaceae) Huapeo, 2004
Cempaschil Tagetes erecta (Asteraceae) Tovar-Almanza, 2004
Tilia Tilia mexicana (Tiliaceae) Atrin-Mendoza, 2005
Algodn silvestre Cochlospermum vitifolium (Cochlospermaceae) Mendoza-Jurez, 2005
Paulonia
Paulownia fortunei P. Imperiales (Schrophularia-
ceae)
Morales, 2005
Ahuehuete Taxodium mucronatum (Taxodiaceae) Sntiz-Mndez, 2005
Papayo Carica papaya L. Cv. Maradol Carreto et al. 2006
Oreja de burro Oncidium cavendishianum (Orchidaceae) Luviano, 2006.
Pitayo de mayo Stenocereus quevedonis (Cactaceae) Villalobos-Jarqun et al. 2007
Propagacin, conservacin y mejoramiento gentico de plantas
Dentro de las principales aplicaciones del cultivo de tejidos vegetales destacan la mi-
cropropagacin (propagacin clonal masiva), la conservacin de germoplasma y el mejora-
miento gentico (Dodds y Roberts, 1995).
Micropropagacin.- La micropropagacin se aplica a especies vegetales con el fin
de obtener su propagacin masiva en el menor perodo de tiempo posible. Se le conoce
Biotecnologa de Plantas
Ciencia Nicolaita No. 40 67 Abril de 2005
como una biotecnologa de respuesta rpida, puesto que se logran resultados en perodos
de 3 a 6 meses. Gran cantidad de plantas se propagan con xito por este mtodo, principal-
mente ornamentales, hortcolas, frutales, forestales y algunas en riesgo de extincin (Salga-
do-Garciglia et al. 1997).
Conservacin in vitro.- Con la utilizacin de cultivos in vitro se ha logrado la conser-
vacin de germoplasma vegetal, mediante sistemas de conservacin a travs del almace-
namiento en condiciones de crecimiento mnimo y la criopreservacin. Con esta
herramienta biotecnolgica es posible establecer cultivos in vitro de plantas completas, seg-
mentos de stas (yemas, pices, meristemos) y cultivos celulares, con los cuales se pueden
llevar a cabo programas de conservacin de germoplasma en perodos a corto, mediano y
largo plazo (Bajaj, 1991). El almacenamiento se realiza bajo condiciones de cultivo que inhi-
ban o disminuyan el crecimiento, con la utilizacin de medios de cultivo mnimos e incuba-
cin en intensidades bajas de luz y temperatura (20, 10, 0, -20, -80, -196C) (Villalobos,
1990). Esta tcnica se ha desarrollado slo para unas cuantas plantas, por lo que existe la
necesidad de realizar estudios de conservacin in vitro para todas aquellas que requieren
sistemas alternativos de conservacin (Villalobos y Engelmann, 1995).
Mejoramiento gentico.- Con la biotecnologa moderna, la manipulacin gentica
abarca desde el cultivo de protoplastos (clulas sin pared celular), clulas y tejidos in vitro
hasta la manipulacin directa del ADN, que incluyen diferentes tcnicas como el cultivo y fu-
sin de protoplastos, micropropagacin, seleccin in vitro frente a agentes biticos o abiti-
cos adversos e insercin de genes por transformacin gentica (Prez-Ponce, 1998). Con
estos mtodos se han conseguido plantas mejoradas con diferentes caractersticas como
resistencia a patgenos, a sequa, salinidad, aumento de valor nutrimental, mayor vida de
anaquel de flores o frutos, cambios de color de frutos y flores y produccin de metabolitos.
Una de las aplicaciones ms novedosas de la transformacin gentica es la de utilizar a las
plantas como biofbricas o biorreactores, al introducir genes deseados y regular la expre-
sin dentro de stos, para la produccin de frmacos, protenas teraputicas, pigmentos y
vacunas comestibles, etc. (Lindsey y Jones, 1989, Borojevic, 1990, Prez-Ponce, 1998).
En los ltimos cinco aos, en los diferentes laboratorios se han establecido cultivos in
vitro de especies de inters ornamental, forestal, medicinal, hortcola y de plantas en riesgo
de extincin (Cuadro 1). En la figura 1 se muestran cultivos in vitro de la orqudea Oncidium
cavendishianum Batem., de la cactcea Stenocereus quevedonis J.G. Ortega Bravo (pita-
yo de mayo) y de aguacate criollo mexicano (P. americana Mill. Var. drymifolia). Actualmente
se realizan investigaciones en colaboracin con el Parque Nacional Barranca del Cupatitzio
para la propagacin y conservacin in vitro de orqudeas, as como para el cultivo de la or-
qudea Laelia speciosa para su aprovechamiento como fuente de muclago para la elabora-
cin de figuras de pasta de caa de maz, con artesanos de la Casa de los Once Patios de
Ptzcuaro, Michoacn. Tambin se mantienen bajo conservacin in vitro 15 especies de or-
qudeas, cinco especies de helechos arbreos, cinco medicinales, tres cactceas y una fo-
restal, todas ellas en alguna categora de riesgo de extincin (Ochoa-Ambriz, 2005;
vila-Daz y Salgado-Garciglia, 2006; Valdez-Partida, 2007). En cuanto al mejoramiento ge-
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Octubre de 2007 68 Ciencia Nicolaita No. 48
ntico, se han establecido sistemas de transformacin gentica en aguacate, alfalfa, papa-
yo, pitayo y en la orqudea Phalaenopsis amabilis, con el objetivo de obtener plantas
transgnicas resistentes a fitopatgenos (Zavala-Corona, 2003; Surez-Rodrguez, 2006;
Herrera-Rodrguez, 2007; Malagn-Quintana et al., 2007). Particularmente en tabaco, se
han obtenido plantas transgnicas con el gen de la protena HSP65 de Mycobacterium le-
prae, logrando la expresin del gen (Fierro-Aguilar et al., 2006; Rodrguez-Narciso et al.,
2006).
Biotecnologa de Plantas
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Figura 1. Cultivos in vitro de algunas especies micropropagadas: A, plntula de Phalaenopsis amabilis Luchia Lady (Orchida-
ceae); B, brotes de Stenocereus quevedonis J.G. Ortega Bravo (pitayo de mayo); C, plntula de Taxodium mucronatum Ten.
(ahuehuete).
Marcadores moleculares en plantas
Dentro de las tcnicas de biologa molecular ms usadas para caracterizar y evaluar
la diversidad gentica existente en los bancos de germoplasma de plantas, se encuentra la
amplificacin aleatoria de ADN polimrfico (RAPD), marcadores basados en la hibridacin
del ADN en plantas con los polimorfismos en la longitud de fragmentos de restriccin de
ADN (RFLP), amplificacin selectiva de fragmentos de restriccin (AFLPs), microsatlites
(SSR) y marcadores moleculares estrechamente relacionados con genes de resistencia a
enfermedades, conocidos como RGAPs (Resistance Gene Analog Polymorphism), con los
cuales se ha logrado identificar genes de resistencia a enfermedades ocasionadas por hon-
gos (Collins et al., 2001; Chen, 2002). Otra de las aplicaciones del uso de marcadores mole-
culares es la certificacin gentica que permite, adems, esclarecer la filogenia y
sistemtica del grupo de plantas de inters comercial y de aquellas que presentan dificulta-
des en la clasificacin taxonmica tradicional.
Con estas tcnicas, se han realizado estudios con la finalidad de detectar la variabili-
dad gentica en helechos arborescentes, un grupo de plantas con problemas de ubicacin
taxonmica, para esclarecer su filogenia. El estudio se ha hecho con el uso de los genes ri-
bosomales y sus regiones espaciadoras asociadas, ITS1-5.8s-ITS2 (Regin ITS), detectan-
do fragmentos de ADN polimrficos que permitieron establecer relaciones de parentesco
entre las diferentes especies de los helechos, ubicando a los taxones Cyathea mexicana y
Sphaeropteris myosuroides como cercanos genticamente dentro de la familia Cyathea-
ceae (Valdez-Partida, 2007). Secuencias de ITS obtenidas de los helechos arborescentes
se han reportado en el Centro Nacional para la Informacin Biotecnolgica (NCBI):
EU090937, Alsophila firma; EU090939, Cyathea myosuroides; EU090940, Dicksonia sello-
wiana y EU090941, Lophosoria quadripinnata. Para la certificacin de plantas de inters co-
mercial, se estudian con la misma tcnica, genotipos de aguacate criollo mexicano y plantas
medicinales de la regin.
Genmica funcional de maduracin de frutos
El desarrollo y la maduracin del fruto son procesos nicos en las plantas y represen-
tan un componente importante en la dieta humana y animal (Giovannoni, 2004). En las plan-
tas superiores, los procesos biolgicos tales como la maduracin del fruto y la senescencia
estn regulados por una compleja expresin diferencial de genes. Para entender estos pro-
cesos es indispensable identificar, clonar y caracterizar los genes involucrados. El entendi-
miento de cmo los genes coordinan el crecimiento y desarrollo de los organismos vivos es
de gran importancia en muchas reas de la ciencia y la tecnologa. En la ltima dcada, los
proyectos de secuenciacin e identificacin de genes de organismos en general, han gene-
rado miles de secuencias gnicas. Es as como la informacin gentica ha revolucionado a
la gentica generando una nueva rea en las ciencia biolgicas llamada genmica (Koncz,
2003). El conocimiento bsico de cmo funciona un organismo provee una informacin in-
valuable para el desarrollo biotecnolgico. Como complemento al conocimiento de los geno-
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mas de plantas han surgido los proyectos de ESTs (Expressed Sequence Tags) los cuales
consisten bsicamente en secuenciar un gran nmero de cADNs obtenidos de bancos de
cADNs generados de diferentes estructuras y estadios de desarrollo de plantas. Esta tcni-
ca explota los avances recientes en la tecnologa de secuenciacin automatizada y de ma-
nejo del ADN. Los anlisis comparativos de las bases de datos de los ESTs facilitan tambin
la deteccin de secuencias conservadas entre diferentes organismos, lo que permite cono-
cer secuencias esenciales para los seres vivos (Olmedo et al., 2005).
Con estas tcnicas, se han generados bancos de ESTs de plntulas de papayo (Cari-
ca papaya L. Cv. Maradol) y de frutos de aguacate criollo mexicano (Persea americana Mill.
Var. drymifolia), con la finalidad de obtener las secuencias de los genes que participan en el
desarrollo de la planta y durante el desarrollo de frutos, respectivamente (Torres-Crdenas,
2006).
Biotecnologa de Plantas
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Figura 2. Efecto inhibitorio del extracto etanlico de la planta Artemisia ludoviciana Nutt. (Estafiate) sobre el crecimiento del
oomiceto Phytophthora capsici: A, tratamiento control (50 mL etanol absoluto); B, tratamiento control positivo (100 mg/L de
mefenoxam, antioomiceto comercial); C, 50 mL extracto etanlico (ensayo por difusin en placa); D, 50 mL extracto etanlico
(ensayo de disco impregnado).
CUADRO 2
Plantas con actividad biocida y sus respectivos metabolitos activos.
Especie (Nombre
comn, Familia)
Actividad: Organismos blanco
Metabolito(s)
activo(s)
Referencia
Melia azaderacht (Pa-
raso, Meliaceae)
Insecticida:
Culex stigmastosoma
Azadiractina
Snchez-Daz et al.
2003
Pelargonium spp (Ge-
ranios aromticos, Ge-
raniaceae)
Insecticida:
Culex stigmastosoma
Limoneno
Geraniol
Barrera-Ponce et al.
2003
Heliopsis longipes
(Chilcuague, Astera-
ceae)
Fungicida:
Candida albicans
Mucor circinelloides
Sporotrix schenckii
Afinina
Decatrienato de bornilo
Morales-Lpez, 2003
Lippia berlandieri (Or-
gano, Labiatae)
Bactericida:
Escherichia coli
Salmonella sp.
Shigella flexneri
Staphylococcus aureus
Timol
Carvacrol
Serrato et al. 2005
Satureja macrostema
(Nurite, Labiatae)
Fungicida:
Fusarium oxysporum
Phytophthora capsici
Pulegona
Garca-Chvez et al.
2006
Tagetes lucida (Santa
Mara, Asteraceae)
Bactericida:
Vibrio cholera
Escherichia coli
Proteus mirabilis
Fungicida:
Trichophyton mentagrophytes
Rhizoctonia solani
Cumarina
Umbeliferona
Escopoletina
Escoparona
Cspedes et al. 2006
Artemisia ludoviciana
(Estafiate, Asteraceae)
Fungicida:
Candida albicans
Collethotrichum gloesporiodes
Phytophthora spp
Borneol
Verbenol
Terpineol
Damin-Badillo, 2007
Ageratum corymbosum
(Servilletilla, Astera-
ceae)
Fungicida:
Sporotrix schenckii
b-Pineno
b-Mirceno
2-Careno
Eugenol
lvarez-Rodrguez et
al. 2007
Metabolitos con actividad biocida
Sin lugar a dudas, las plantas son una fuente importante de productos qumicos, co-
nocidos como metabolitos secundarios. Al respecto, la biotecnologa ofrece como una alter-
nativa el empleo de compuestos de origen vegetal, como agentes potenciales en el combate
Biotecnologa de Plantas
Octubre de 2007 72 Ciencia Nicolaita No. 48
y control de enfermedades que afectan los cultivos de valor agronmico (Covin y Salga-
do-Garciglia, 1999). Con este fin, se han realizado investigaciones para la bsqueda de me-
tabolitos con accin biocida; a la fecha se han estudiado ms de 20 especies vegetales,
principalmente de la familia Asteraceae, y algunas de stas presentan actividad insecticida,
bactericida o fungicida, de las cuales se han identificado los compuestos activos (Cuadro 2).
Recientemente se ha determinado el efecto del aceite esencial de estafiate (Artemisia ludo-
viciana Nutt.) sobre cinco especies de Phytophthora (P. cactorum, P. capsici, P. cinnamomi,
P. infestans y P. mirabilis), encontrandoun100%deinhibicinsobreel crecimientodel mice-
lio en ensayos in vitro. Los metabolitos responsables de dicho efecto son borneol, verbenol y
terpineol, los cuales actan en mezcla y no por s solos (Damin-Badillo, 2007). En la figura
2, se muestra el efecto de este extracto sobre el crecimiento de P. capsici a los 8 das de cul-
tivo, al inocular segmento de micelio de 0.2 cm
2
en el medio de papa-dextrosa-agar a 25C.
El crecimiento de P. capsici no fue afectado por la adicin de etanol absoluto, alcanzando su
mximo crecimiento a los 8 das del cultivo (Figura 2A). Un 100%de inhibicin fue observa-
do en los dos tipos de ensayos probados con el extracto etanlico de A. ludoviciana (Figuras
2C y 2D), efecto similar al ejercido por el antioomiceto comercial (Figura 2B).
Biotecnologa del aguacate
El aguacate (Persea americana Mill.) es en la actualidad uno de los cultivos ms im-
portantes en Mxico, no slo por la gran cantidad de toneladas producidas que lo ubica
como el productor ms importante a nivel mundial, sino tambin porque es un cultivo que ge-
nera miles de empleos directos e indirectos, y permite una alta entrada de divisas por la ex-
portacin de su fruto (Salazar y Lazcano, 2001). Apesar de su importancia econmica, poco
se sabe de su gentica y es significativo que la mayora de los problemas de produccin ms
importantes tienen una base gentica. Aunque el aguacate es un rbol de gran talla, su ge-
noma es pequeo, aproximadamente 907 Mpb (millones de pares de bases), slo seis ve-
ces mayor comparado con el genoma de la planta modelo Arabidopsis thaliana y 2.5 veces
el de papayo (Carica papaya L.) (Cui et al., 2007). Dentro de la problemtica ms importante
de este frutal, estn la falta de protocolos ptimos para su propagacin clonal, lo cual est re-
lacionado con la baja eficiencia para obtener plantas transgnicas, las cuales pudieran pre-
sentar resistencia a patgenos, principalmente a hongos y al oomiceto Phytophthora
cinnamomi, una necesidad urgente y necesaria. Asimismo, se desconoce la fisiologa del
fruto de aguacate, lo cual origina un mal manejo de poscosecha, causando considerables
prdidas econmicas (Snchez-Prez, 2001).
La biotecnologa de aguacate es la parte central de las investigaciones del Cuerpo
Acadmico Biotecnologa de Plantas, en la cual confluyen las diferentes LGACque se desa-
rrollan, con la participacin de todos los investigadores que lo integran.
Biotecnologa de Plantas
Ciencia Nicolaita No. 48 73 Octubre de 2007
Perspectivas
Actualmente se est generando el banco de germoplasma in vitro de genotipos de
aguacate criollo mexicano (P. americana Var. drymifolia), la seleccin y caracterizacin qu-
mica y molecular de genotipos resistentes a P. cinnamomi, para finalmente realizar pruebas
de resistencia al patgeno, en invernadero y campo. Tambin se ha iniciado el estudio de la
va de sntesis de folatos en aguacate y hongos, con fines de analizar sus propiedades en la
salud humana, ya que su carencia ocasiona anemia, otros trastornos hematolgicos y defi-
ciencias a nivel de sntesis y reparacin de ADN. Bajo este nombre se agrupan un gran n-
mero de compuestos similares al cido flico, como son los folatos, la folacina y el
pteroilmonoglutamato (Surez de Ronderos, 2003). Mediante el uso de marcadores mole-
culares (ITSs) se estn desarrollando trabajos para determinar diversidad gentica y paren-
tesco entre materiales de aguacate criollo mexicano. Asimismo, se est realizando una
colaboracin con el LANGEBIO (Laboratorio Nacional de Genmica para la Biodiversidad)
para participar en el desarrollo del proyecto del genoma de aguacate el cual consistir en
realizar la secuenciacin del genoma completo de esta importante planta.
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