PRCTICA No.

7
AISLAMIENTO Y PROPIEDADES QUMICAS DE LA
HEMOGLOBINA


Juan Figueroa (201214522), Katherinne Sagastume (201214622), Lesly Suchini (201219900),
Geordy Gonzlez (201214409).
Departamento de Bioqumica, Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacia, Universidad San
Carlos de Guatemala, Carrera Qumica Biolgica


MUCHA NO ENCUENTRO PORQUE LA METAHEMOGLOGINA LIBERO OXIGENO
CUANDO
ESTA CONCENTRADA :/ VOY A DEJAR ESO PENDIENTE Y SI UDS ENCUENTRAN ALGO
DELEN


INTRODUCCIN
La hemoglobina (Hb) es una protena conjugada formada por una globina y un grupo
prosttico denominado hemo. Es un pigmento rojo que contiene hierro en estado ferroso y
al que le corresponde la funcin fisiolgica del transporte de oxgeno (......). Cuando la Hb
se expone a la accin de varios compuestos sobrevienen cambios en su constitucin que
resultan reversibles o irreversibles, resultando en ocasiones en la formacin de derivados
txicos. La identificacin de los derivados es esencial en pruebas de laboratorio, por lo que
se pretende determinar los causantes principales de la formacin de sus estados relativos
normales como la deoxihemoglobina, tanto como de estados txicos correspondientes a la
nitrosilhemoglobina y metahemoglobina, por medio de adicin de reactivos qumicos,
lecturas espectrofotomtricas y elaboracin de una grfica de la cintica de formacin de la
ltima mencionada. Todo para identificar en adelante las caractersticas propias de cada
una, su formacin y actividad, as como que el investigador pueda establecer su
diferenciacin en exmenes posteriores.


Metodologia
La oxihemoglobina es cuando en la sexta posicion de enlace de coordinacin de la
hemoglobina es ocupado por un oxgeno, se encuentra en estado R (Lehninger, 2005). A la
oxihemoglobina concentrada y purificada se le agreg agua destilada para diluirla.
Deoxihemoglobina es la forma sin oxgeno de la hemoglobina y se encuentra en estado T
(Voet, 2004). En la deoxihemoglobina se le agreg el reactivo de Stokes amoniacal para
remover el oxgeno de la oxihemoglobina. Metahemoglobina es cuando la hemoglobina su ion
ferroso es cambiado a ferrico y por lo tanto no puede reaccionar con el oxigeno ni con el
dixido de carbono (Voet, 2004). Para la metahemoglobina se le aadi ferricianuro de potasio.
Nitrosilhemoglobina es la unin del NO2 al grupo de hierro en su forma oxidada (Devlin,
2004). En la Nitrosilhemoglobina se le agreg cido ascrbico con buffer de acetatos, el cido
ascrbico funcion com antioxidante y el buffer para evitar la desnaturalizacin de la
hemoglobina por el cido, luego se le aadi el nitrito de sodio para que se uniera al in frrico
y forma Nitrosilhemoglobina. Y finalmente en la Metahemoglobina concentrada se le aadi
bastante ferricianuro de potasio para que toda la hemoglobina reaccionara y pasar totalmente a
su derivado (metahemoglobina).
Para el espectro de absorcin de los derivados de la hemoglobina, en la oxihemoglobina se le
aadi agua destilada para diluir la muestra y as evitar que la absorbancia fuera mayor a 1 y
cumpliera con la ley de Beer-Lambert utilizando agua destilada como blanco ya que se diluy
con esta. En la Deoxihemoglobina se prepar como anteriormente dicho y se utiliz como
blanco reactivo de Stokes amoniacal ya que con este fue preparada. Y en la Metahemoglobina
se prepar como anteriormente citada y se uso un blanco de ferricianuro de potasio ya que con
este se oxido la oxihemoglobina a metahemoglobina. Tanto en la oxihemoglobina,
deoxihemoglobina y metahemoglobina se midi la absorbancia desde 450 a 650 nm en ciertos
intervalos para observar cual era el pico mximo de absorcion de cada una de ellas.


Resultados
Tabla 1. Examen cualitativo de la hemoglobina y sus derivados
Derivado Color Otros
Oxihemoglobina Roja ------------
Deoxihemoglobina Marron ------------
Metahemoglobina Marron claro ------------
Nitrosilhemoglobina Corinto ------------
Metahemoglobina concentrada Amarillo Liberacin de Oxgeno (burbujas)
* Ninguno de los derivados present formacin de precipitado o variaciones en su viscosidad y turbidez.
Fuente: Datos experimentales obtenidos del Laboratorio de Bioqumica, Edificio T-12; USAC.


Grafica 1. Tiempo (seg) Vs. Absorbancia de la cintica de formacin de la Metahemoglobina

* Las mediciones fueron realizadas todas a una longitud de onda de 560 nm.
Fuente: Datos experimentales obtenidos del Laboratorio de Bioqumica, Edificio T-12; USAC.


Grafica 2. Espectro de absorcin de la Oxihemoglobina.

Fuente: Datos experimentales obtenidos del Laboratorio de Bioqumica, Edificio T-12; USAC.
*No hay un pico mximo de absorbancia vlida.







Grafica 3. Espectros de absorcin de la Metahemoglobina y Deoxihemoglobina

Fuente: Datos experimentales obtenidos del Laboratorio de Bioqumica, Edificio T-12; USAC.
* Los picos mximos de absorbancia no corresponden a los valores por encima de 1.


DISCUSIN DE RESULTADOS
La forma reducida de la hemoglobina es la nica capaz de unirse al oxgeno, y se
denomina una vez enlazada con el mismo oxihemoglobina, la cual es de un color rojo
bastante vivo (Mathews, 1996). Una vez con esta forma de la protena disponible se dispuso
a la transformacin de sus otros derivados, los cuales se listan en la tabla 1. El segundo
derivado, la desoxihemoglobina, en su transformacin emplea un reactivo que contiene
cido tartrico y sulfato ferroso, los que con hidrxido de amonio forman un complejo entre
el hierro (Fe2+) y el anin del cido (Tartrato) en medio bsico, el que propici el cambio
de coloracin de rojo a marrn del derivado caracterstico de la sangre desoxigenada,
puesto que el hierro del complejo se oxida ms fcilmente que el que est presente en la
oxihemoglobina provocando el secuestro del O2 sin generar propiamente una reaccin
qumica sobre la protena. Es tambin importante aclarar que al no efectuar ningn cambio
que alterase la estructura o propiedades de la protena no se debe agitar el tubo puesto que
disolvera oxgeno y generara de nuevo la formacin de oxihemoglobina alterando la
apreciacin de los resultados (Powers, 1989).
El tercer y quinto derivado, la metahemoglobina, se lleva la hemoglobina reducida a
una forma en la que no puede realizar el transporte del oxgeno por impedir su liberacin al
modificar su grupo prosttico. La reaccin cambia el estado de oxidacin del hierro desde
Fe2+ a Fe3+ de mayor afinidad por el oxgeno (enlazado en forma de agua), a lo que debe
el cambio de coloracin a marrn claro caracterstico (Mathews, 1996). Por otro lado el
derivado concentrado con ferricianuro confiri a la solucin su propia coloracin amarilla y
consecuentemente provoc la liberacin de oxgeno indicando la completa transicin al
derivado buscado, que no enlaza O2 propiamente dicho.
El ltimo derivado, la nitrosilhemoglobina, necesit de cido ascrbico para
contrarrestar el poder oxidante del nitrito (al no contar con las protenas presentes en los
eritrocitos al haber realizado su separacin), pues este ltimo forma como producto final
metahemoglobina, pasando por el compuesto de inters. Segn (Ash-Berlan, Wise &
Wrigth, 2004), La formacin espontnea de metahemoglobina en la sangre se reduce
normalmente a travs de la donacin de electrones de los sistemas enzimticos de
proteccin como, por ejemplo, la metahemoglobinareductasa NADH o, en menor medida,
el cido ascrbico al ser un antioxidante. Al detener el proceso en el paso correcto, se
mantuvo el enlace con monoxido de nitrogeno, confirmado por la coloracin roja oscura
caracterstica.


Al cambiar el estado redox de la hemoglobina tambin cambian algunas de sus
caractersticas fsicoqumicas, como las longitudes de onda a las que absorbe ms, aunque
todas lo hacen en un rango prximo de 450 a 650 nm por su color rojo o rosado. Por ende,
cada derivado presenta un espectro de absorcin como se puede verificar de las Grficas 2
y 3., aunque solo en la Grfica 2. se aprecia un pico de absorbancia mxima que cumpla
con los parmetros aceptables de las mediciones, ya que las absorbancias no deben ser
mayor de 1, pues no se cumplira la Ley de BEER. El espectro de la oxihemoglobina es
caracterstico de 2 picos alrededor de 540 y 580 nm, el de la metahemoglobina presenta los
mismos picos que la anterior con una ancho mucho mayor y un pico adicional en 630 nm,
mientras que el la desoxihemoglobina es la nica con una sola medicin amplia cuya
elevacin inicia en 500, con un mximo en 560, despus de la que desciende
paulatinamente sin presentar ninguna otra seal en el aparato (Miale, 1985). Las
variaciones en los resultados pudieron deberse a diluciones insuficientes de las muestras al
no verificar la absorbancia de 0.5 de la solucin madre de oxihemoglobina empleada.
Aunque la tendencia de los espectros experimentales refleja cierta similitud con los
espectros reales en cada uno de los casos.
En la cintica de formacin de la metahemoglobina que se observa en la grfica
1,en donde se le agreg NaNO2 a la oxihemoglobina en un tiempo 0, este mostr una
absorbancia de 0.520, ya que ambos an no haban reaccionado. Posteriormente se midi a
un tiempo de 30 seg donde se observa un incremento de la absorbancia esto debido a que ya
estaba ocurriendo la reaccin, luego existe una disminucin porque el NaNO2 empieza a
desaparecer y hay formacin de metahemoglobina y por ltimo se observa un valor
constante en el cual ya no hay presencia de NaNO2 con una completa produccin de
metahemoglobina.






RECOMENDACIONES
Puesto que la sexta posicion de la metahemoglobina puede ser ocupada adems por otros
aniones, el agregado de KCN podra unir cianuro al hierro oxidado y formar cantidades de
cianometahemoglobina , y proporcionar lecturas positivas a 546 nm, para la presencia de
este derivado en sangre.


REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
Ash-Bernal, R., Wise, R & Wright, S. (2004). Acquired methemoglobinemia: a
retrospective series of 138 cases at 2 teaching hospitals. Medicine (Baltimore) 83
(5): pp. 265273.
Mathews, C. K. (1996). Protein function and evolution. California: Benjamin
Cummings Publishing
Miale, J. (1985). Hematologa: medicina de laboratorio. Barcelona: Revert
Powers, L. W. (1989). Diagnostic hematology: Clinical and technical principles. St.
Louis: C. V Mosby
Lehninger, D. (2005). Fundamento de bioquimica. (4ed). Mexico: Pearson Educacion
Voet, S. (2004). Bioquimica. (3ed). Chile: Universidad Sistmica.
Devlin, P. (2004). Principios de la Bioquimica. (2ed). Barcelona: Panamericana


ANEXOS
Figura 1. Bandas de absorcin de la regin visible de los espectros de absorcin de los
derivados de la hemoglobina.
* Las oxihemoglobinas presentan diferentes concentraciones, donde la 1 es la ms diluida, y la 3 la ms
concentrada.
Fuente: Miale, J. (1985). Hematologa: medicina de laboratorio. Barcelona: Revert