UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARABA

CENTRO DE CINCIAS EXATAS E DA NATUREZA

DEPARTAMENTO DE QUMICA
INTRODUO AOS MTODOS INSTRUMENTAIS EXPERIMENTAIS





CROMATOGRAFIA LQUIDA
Aplicada Na Determinao De Hormnios






PROFESSOR: Dr. MRIO CSAR UGULINO DE ARAJO

ALUNOS :
CARLA BRITO FRANCO - 11011558
CCERO NEVES DA COSTA - 10611207
FABIO CORREIA SAMPAIO - 11011551
ROMILDO HENRIQUES DOS ANJOS JNIOR -11111747




Joo Pessoa PB
Julho de 2014



Sumrio

1 Introduo ............................................................................................................ 3
1.1 Contaminantes emergentes............................................................................... 3
1.2 Cromatografia....................................................................................................... 4

2 Objetivos................................................................................................................. 6
3 Materiais e mtodos.............................................................................................. 6
3.1 Materiais.............................................................................................................. 6
3.2 Procedimentos experimentais.............................................................................. 6

4 Resultados e Discusso........................................................................................... 7
4.1 Curvas analticas................................................................................................... 7
4.2 Cromatogramas.................................................................................................... 10

5 Concluses............................................................................................................... 12
Referencias bibliogrficas....................................................................................... 13







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1. Introduo

1.1 Contaminantes emergentes
O desenvolvimento da vida em nosso planeta est ligado utilizao dos
recursos hdricos, em especial a gua doce, porm este um recurso escasso. Segundo
Baird e Cann (2004), apenas 3% da gua disponvel no planeta considerada doce, com
o agravante de que deste total, trs quartos esto nas geleiras e calotas polares, tornando
os rios e lagos as principais fontes de gua disponveis, oferecendo apenas 0,1% do
suprimento total de gua doce.
Segundo Sperling (1996) a reserva hdrica disponvel para a humanidade agrega
diversos usos, como o abastecimento pblico, abastecimento industrial, irrigao,
dessedentao de animais, aquicultura, preservao da flora e fauna, recreao e lazer,
harmonia paisagstica, gerao de energia eltrica, navegao e diluio de despejos.
Dentro do papel que a gua exerce na sociedade a presena de contaminao de
origem qumica e agrotxica e seus efeitos ambientais devem ser monitorados para
evitar elevados nveis txicos, segundo Fernandes (2011) outros contaminantes, at
ento negligenciados, vm chamando a ateno da comunidade cientfica, sendo
denominados contaminantes emergentes (CE). Estes contaminantes so compostos
normalmente utilizados em atividades dirias, sendo metabolizados e excretados,
entrando em contato com os corpos hdricos, os CE so produtos novos, desta forma
no possuem regulamentao jurdica nem avaliaes sobre o efeito toxico junto ao
meio ambiente.
Fernandes (2011) menciona ainda que os CE podem mesmo em pequena
quantidade interferir no sitema endcrino humano e de outros animais, afetando a sade,
o crescimento e a reproduo dos mesmo, sendo conhecidos como interferentes
endcrinos (IE). Dentre este IE, podemos citar a estrona (E1), estradiol (E2), estriol
(E3) e o 17 -etinilestradiol (EE2), com as suas respectivas estruturas apresentadas na
Fig01.



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Fig01 Estrutura da estrona, estradiol, estriol e o 17 -etinilestradiol

Dentro do exposto a prtica de cromatografia foi realizada utilizando duas
amostras sintticas, contendo os hormnios E1, E2, E3 e o EE2.


1.2 Cromatografia
A tcnica analtica empregada na execuo da aula pratica na determinao dos
hormnios, foi a da cromatografia, sendo definida por Skoog (2010) como uma tcnica
na qual os componentes de uma mistura so separados com base nas diferenas de
velocidade nas quais so transportados atravs de uma fase fixa estacionria por uma
fase mvel liquida ou gasosa. A classificao geral desta tcnica baseada na natureza
da fase mvel, sendo caracterizada como liquida, gasosa e supercrtica,
Segundo Vogel (2002) a cromatografia liquida de alta eficincia mais verstil
do que a cromatografia com fase gasosa porque ela no esta limitada a amostras volteis
e termicamente estveis e tambm devido escolha de fases moveis e estacionaria mais
ampla. A cromatografia liquida apresenta caracterstica de alto poder de resoluo,
separao rpida, monitoramento continua do eluente, medidas quantitativas acuradas,
5

analise repetitivas e reprodutveis com a mesma coluna e automao do procedimento
analtico e do manuseio de dados.
Para a determinao dos hormnios presentes nas amostras sintticas de numero
1 e 8, foi aplicada a cromatografia liquida de alta eficincia (CLAE). Os principais
componentes presentes em um sistema de CLAE esta representada na Fig02.
Fig 02 Diagrama demonstrando os componentes tpicos de um sitema CLAE.


No diagrama mostrado podemos verificar a presena de reservatrios, contendo
os solventes que representam a fase mvel da cromatografia liquida. Durante o processo
de eluio, caso seja aplicado apenas um solvente de composio constante, teremos
uma eluio isocrtica, caso acha a aplicao de uma mistura de solventes com
concentraes variando em funo do tempo, teremos uma eluio por gradiente, sendo
muito empregada por melhorar a eficincia da separao na amostra.
As colunas aplicadas na cromatografia apresentam um recheio com partculas na
faixa de 3 e 10 m, onde segundo Skoog (2010), o tipo mais comum de recheio para a
cromatografia lquida preparado a partir de partculas de slica, as quais so
sintetizadas aglomerando-se partculas de slica de tamanho submicromtrico sob
condies que levam formao de partculas maiores com dimetros altamente
uniformes.
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Os detectores mais amplamente empregados em cromatografia lquida so
baseados na absoro da radiao ultravioleta ou visvel. Os fotmetros e os
espectrofotmetros projetados especificamente para uso com colunas cromatogrficas
esto disponveis comercialmente. Os instrumentos modernos usam arranjos lineares de
fotodiodos que podem adquirir um espectro completo medida que o analito deixa a
coluna (SKOOG, 2010).

2. Objetivos
Determinar as concentraes dos hormnios E1, E2, E3 e EE2 presentes nas
amostras sintticas 01 e 08.
Propiciar uma aprendizagem aos alunos da disciplina de introduo aos mtodos
instrumentais experimentais, sobre a tcnica de cromatografia liquida.

3.Materiais e Mtodos
3.1 Materiais

Acetonitrila;
gua deionizada;
Soluo sinttica 01;
Soluo sinttica 08;
Cromatografo Dionex Ultimate 3000;


3.2 Procedimentos experimentais
* Os resultados referentes leitura dos padres para a construo da curva
analtica j haviam sido realizados, devido ao tempo excessivo necessrio para a sua
obteno, e os valores disponibilizados para a turma.
- o equipamento encontrava-se ligado e com a passagem da soluo de
acetonitrila;
- foram escolhidas as amostras sintticas de numero 01 e 08 para serem
analisadas;
7

- inicialmente foi inserida a amostra 01 no equipamento com o auxilio de uma
seringa, em volume de microlitros;
- o equipamento estava configurado para realizar a eluio seguindo as
especificaes:
- 15 % de acetonitrila durante os 03 minutos iniciais;
- realizar a eluio utilizando um gradiente de 15 50 % de acetonitrila
durante o intervalo de 3 a 8 minutos;
- trabalhar com 50% de acetonitrila no intervalo de 8 a 14 minutos.
- 100% de acetonitrila durante um intervalo de 14 a 16 minutos, com a
inteno de limpar o sistema para a prxima amostra.
- Durante o processo o equipamento demonstrava o sinal analtico obtido, com a
utilizao de um Arranjo de diodos (DAD);
- aps o perodo de limpeza da coluna, o processo foi repetido inserindo a
amostra 08;
- os resultados obtidos esto apresentados na tabela 02.

4 Resultados e Discusso

4.1 Curvas analticas
As curvas analticas destinadas aos compostos E1, E2, E3 e EE2 foram
construdas aplicando um total de 13 padres, com concentrao variando de 4 a 10
ppm. Os valores foram fornecidos ao grupo, de acordo com os dados demonstrados no
quadro 1.



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Quadro 01 resultado obtidos da leitura dos padres
Padro
Concentrao
(ppm)
E1 E2 E3 EE2
1 4 0,662 0,632 0,589 0,543
2 4,5 0,709 0,701 0,682 0,611
3 5 0,821 0,785 0,726 0,682
4 5,5 0,893 0,874 0,808 0,747
5 6 1,022 0,946 0,878 0,827
6 6,5 1,047 1,017 0,954 0,879
7 7 1,150 1,093 1,066 0,926
8 7,5 1,307 1,178 1,143 1,036
9 8 1,417 1,284 1,243 1,116
10 8,5 1,485 1,369 1,355 1,198
11 9 1,614 1,447 1,421 1,231
12 9,5 1,683 1,549 1,521 1,339
13 10 1,744 1,656 1,584 1,354


Partindo dos dados da tabela foram construdas as curvas analticas para cada
um dos compostos e representadas nos grficos (graf01, graf02, graf03 e graf04). Em
cada uma das curvas foi determinadas as suas equaes e seu respectivo R
2
, aplicando
o mtodo dos mnimos quadrados.

Graf01 curva analtica para o composto estrona

y = 0.1908x - 0.1387
R = 0.9938
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
1.800
2.000
0 2 4 6 8 10 12
E1
E1
Linear (E1)
9


Graf02 curva analtica para o composto estradiol


Graf03 curva analtica para o composto estriol






y = 0.1687x - 0.0632
R = 0.9975
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
1.800
0 2 4 6 8 10 12
E2
E2
Linear (E2)
y = 0.1703x - 0.1178
R = 0.996
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
1.800
0 2 4 6 8 10 12
E3
E3
Linear (E3)
10


Graf04 curva analtica para o composto 17 -etinilestradiol


4.2 Cromatogramas
A passagem das amostras pelo cromatografo gerou uma resposta analtica na
forma de grfico, definida de cromatograma, representada nos graf05 (amostra 01) e
graf06 (amostra 08).
Graf05 cromatograma da amostra sinttica 01

y = 0.1406x - 0.0231
R = 0.9955
0.000
0.200
0.400
0.600
0.800
1.000
1.200
1.400
1.600
0 2 4 6 8 10 12
EE2
EE2
Linear (EE2)
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Graf06 cromatograma da amostra sinttica 08


A presena de diversos picos representados no cromatograma possibilita a
identificao dos componentes presentes na amostra, onde o pico obtido reflete a
deteco do analito pelo detector do equipamento. Desta forma a rea dos picos em
funo do tempo, pode ser aplicada na identificao e quantificao dos componentes
presentes na amostra analisada.
Para a determinao da quantidade dos analitos presente nas amostras foi
necessrio correlacionar o valor da rea do pico presente no cromatograma com os
obtidos na curva analtica, desta forma foram obtidas pelo equipamento os valores
apresentados na tabela02.

Tabela02 resultados da rea dos picos obtidos na cromatografia
E1 E2 E3 EE2
Amostra 1 rea 0,8744 0,832 0,6327 0,7235
Amostra 8 rea 1,0642 1,1684 1,1671 1,2858

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A obteno quantitativa dos analitos esta relacionada com a aplicao das
equaes da reta presentes nas curvas analticas (graf01, graf02, graf03 e graf04),
considerando os valores de y como os da rea do pico referente a cada analito, obtendo
assim o valor de x como a concentrao procurada (tabela03).

Tabela02 resultados da rea dos picos obtidos na cromatografia

Observando os resultados apresentados na tabela02, verificamos que as
concentraes encontradas dos analitos presentes nas amostra 01 e 08 apresentaram
valores prximos ao esperado (valor real), com exceo dos valores para o analito E3,
tanto na amostra 01 como para a 08.
Avaliando os cromatogramas presentes nos graf05 e graf06, podemos identificar
os picos reverentes aos analitos em estudo, e observar que para o analito E3 o pico
presente no cromatograma apresenta uma sobreposio, e que interfere
diretamente no valor da sua rea, acarretando uma variao no clculo da sua
concentrao aplicando a curva analtica.

5 Concluses
Com os dados expostos conclui-se que a cromatografia lquida pode ser
aplicada na quantificao dos contaminantes emergentes, relacionado aos interferentes
endcrinos.
Devemos destacar que dentro das configuraes aplicadas na anlise das
amostras sintticas, a determinao do analito E3 apresentou uma sobreposio no
sinal presente no cromatograma, o que corrobora com a divergncia encontrada em
relao ao seu valor real, indicando que a anlise nas configuraes escolhidas no
E1
Valor
Real
E2
Valor
Real
E3
Valor
Real
EE2
Valor
Real
Amostra 1 ppm 5,3097 5,300 5,3064 5,300 4,043 5,300 5,3101 5,300
Amostra 8 ppm 6,3034 6,300 7,3005 7,300 7,5449 8,300 9,3094 9,300
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pode ser aplicada na quantificao do E3 (estriol), mas pode ser aplicada na
determinao dos demais analitos (E1, E2 e EE2).



Referencias Bibliogrficas

BAIRD, C.; CANN, M.; Qumica ambiental. 4.ed. Porto Alegre. Bookman, 2004.
. SKOOG, D. A.; WEST, D. M.; HOLLER, F. J.; CROUCH, S. R. Fundamentos de
Qumica Analtica, Traduo da 8 Edio norte-americana. Ed. Cencage Learning.
2010.

SPERLING, M. S. Introduo qualidade das guas e ao tratamento de esgotos.
Belo Horizonte. UFMG. 2.ed. 1996.
VOGEL, Anlise Qumica Quantitativa. Rio de Janeiro. LTC Livros Tcnicos e
Cientficos, 6 ed. 2002

FERNANDES, A. N. E. et. al. Remoo Dos Hormnios 17b-Estradiol E 17a-
Etinilestradiol De Solues Aquosas Empregando Turfa Decomposta Como Material
Adsorvente. Qumica Nova , v.34, n.9. p.1526-1533, 2011.