Pr ctic N 3: Reccio n en

Cden de l Polimers
(PCR)

BIOLOGA MOLECULAR


APELLIDOS:
BENITES MONTEZA

NOMBRES:
JONNATHAN CARLOS

DOCENTE:
PhD. Luis Rodrguez Delfn.

UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
Escuela Profesional de Biologa

Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR)

I. INTRODUCCIN

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en
ingls (Polymerase Chain Reaction), es una tcnica de biologa molecular
desarrollada en 1986 por Kary Mullis, cuyo objetivo es obtener un gran nmero de
copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora
basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica
sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin
resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad virus o bacterias
causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer
investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la
amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el
consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al
realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas
en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases de
desnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda
protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de
microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la
mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son:
Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus
litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas
de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de
errores (Pfu, Vent).
Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en
laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de
aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la
filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de
trastornos hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas
forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades
infecciosas.


II. OBJETIVOS

Comprender la importancia del protocolo de la PCR.
Realizar la amplificacin de un fragmento de ADN del virus TBC.

III. FUNDAMENTO TERICO

Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de las ADN polimerasas para
replicar hebras de ADN, para lo cual emplea ciclos de altas y bajas temperaturas
alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada
fase de replicacin y, a continuacin, dejar que vuelvan a unirse las polimerasas
para que vuelvan a duplicarlas. Los reactivos para realizar esta tcnica son: Los 4
desoxirribonuclesidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), delimitan la zona de ADN a
amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la
secuencia que se desea replicar. Iones divalentes. Actan como cofactores de la
polimerasa Iones monovalentes. Una solucin tampn (buffer) que mantiene el pH
adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa. ADN polimerasa o
mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la
ms comn es la Taq polimerasa). ADN molde, que contiene la regin de ADN
que se va a amplificar. Termocilador, aparato que mantiene las temperaturas
durante cada uno de los ciclos.
Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamado
termociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar
la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Muchos termocicladores
modernos hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los
tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR
tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica,
permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los
termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar
la condensacin sobre los tubos de reaccin.
Con esta metodologa se pueden producir en el laboratorio mltiples copias de un
fragmento de ADN especfico, incluso en presencia de millones de otras
molculas de ADN. Como su nombre indica, se basa en la actividad de la enzima

ADN polimerasa que es capaz de fabricar una cadena de ADN complementaria a
otra ya existente. Sus nicos requerimientos son que existan nucletidos en el
medio que son la materia base para fabricar el ADN (los nucletidos de adenina,
timina, citosina y guanina), y una pequea cadena de ADN que pueda unirse a la
molcula que queremos copiar para que sirva como cebadora (el cebador, en
ingls "primer").

PROCESO METODOLOGICO
Cada ciclo de PCR consta de tres fases:
1. Desnaturalizacin: En esta el ADN blanco de doble cadena se somete a una
temperatura de 90 a 95 C durante 30 segundos; permitiendo la separacin de
las dos cadenas.
2. Hibridacin: En esta la temperatura de la mezcla se disminuye hasta alcanzar la
temperatura adecuada para favorecer el apareamiento de los primers con la
secuencia blanco, lo cual generalmente ocurre entre 45 a 55 C (dependiendo de
la temperatura de Fusin o Tm de los primers) durante 20 a 30 segundos
3. Elongacin o extensin: En este la temperatura de la mezcla se eleva hasta 72
C para que la Taq polimerasa (DNA polimerasa) comience el proceso de
extensin en direccin 5 a 3 agregando los nucletidos correspondientes,
obtenindose la hebra complementaria de DNA o AMPLICN.
Estas tres fases tienen lugar en el mismo tubo y constituyen un ciclo completo de
PCR, que se realiza en menos de dos minutos. Tericamente, el ciclo de PCR se
puede repetir sin lmite, pero la polimerasa, los nucletidos y los cebadores suelen
renovarse al cabo de unos 30 ciclos. Estos 30 ciclos, que duran menos de tres
horas, bastan para producir ms de mil millones de copias de ADN.
En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reaccin, de manera
que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un solo fragmento.







IV. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS

Materiales
Guantes
estriles.
Pipetas
automticas.
Puntas estriles.
Tubos de PCR
estriles.
Gradilla para
tubos de PCR.



Equipos
Termociclador.
Micropipetas.
Cmaras de
bioseguridad.
Congeladores.






Reactivos
H
2
O destilada.
Buffer (tampn).
dNTPs.
Cebadores
(Primers, IS
6110).
MgCl
2
(ion
divalente).
Taq polimerasa.
ADN molde
(muestra de
Mycobacterium
tuberculosis).

V. PROCEDIMIENTO

1. Rotular cada uno de los tubos de Eppendorf (4 de 0.6 ml para los ADN moldes
y 1 de 2 ml para mix) con sus respectivos cdigos, segn las muestras
obtenidas de ADN de Mycobacterium tuberculosis.















2. Preparar el mix:
2.1. Se toma una micropipeta con punta y se colocan 128 L de H
2
O destilada
en el tubo de Eppendorf de 2 mL.

2.2. (Se debe cambiar la punta de la micropipeta para cada reactivo).







2.3. Luego colocar 50 L de Buffer en el mismo tubo de Eppendorf, lo mismo
con los siguientes reactivos y sus respectivas cantidades:
MgCl
2
16 L
dNTPs 20 L
Cebador (IS 6110) 10 L
Taq polimerasa 1 L







3. En los otros 4 tubos de Eppendorf rotulados colocar 3 L de ADN molde
respectivamente.









4. A cada uno agregarle 45 L del mix preparado.




































5. Llevar los tubos de Eppendorf al termociclador por 1 hora de tiempo.















VI. RESULTADOS

Despus de 3 ciclos de PCR con una hebra de ADN, se obtuvieron:
2 copias del gen de inters (target).
6 copias de ADN de longitud variable.
En aproximadamente 3 horas, despus de 30 ciclos de PCR con una hebra de
ADN, se obtuvieron 1 073 741 764 copias del gen de inters.

VII. CONCLUSIONES
La tcnica PCR es de gran utilidad en una variedad de campos, incluidas la
biologa molecular, la biotecnologa, la gentica, la epidemiologa, las ciencias
forestales, las ciencias forenses, la microbiologa, el diagnstico de
enfermedades infecciosas, diagnstico de virus, parsitos, bacterias de difcil
cultivo. Es significativo que se aplique en dichas tcnicas ya que ofrece un
diagnstico confiable y rpido.
En cada ciclo de PCR se duplica todo el ADN presente en la reaccin, de
manera que en unas pocas horas se obtienen millones de copias de un solo
fragmento.
VIII. CUESTIONARIO
1. Qu sucede con el exceso o dficit de los reactantes, sobre todo MgCl
2
?
MgCl
2
: Es benfico optimizar la concentracin del in magnesio, ya que
afecta: el alineamiento de los primers, la temperatura de disociacin de las
cadenas, tanto del templado como del producto de PCR, la especificidad
del producto, la formacin de dmeros de primer y la actividad y fidelidad
de la enzima. La Taq polimerasa requiere magnesio libre en la unin con el
templado, los primers y los dNTPs. Concentraciones elevadas de MgCl
2

pueden dar lugar a la formacin de productos inespecficos de
amplificacin y baja fidelidad de copia. Bajas concentraciones de MgCl
2

reducen el rendimiento del producto deseado.
ADN molde: La calidad as como la cantidad de ADN molde afecta a la
sensibilidad y la eficiencia de la reaccin de amplificacin. Generalmente el
empleo de altas concentraciones de ADN favorece el aumento de
productos inespecficos de la reaccin. La reaccin de PCR puede ser
inhibida por varios componentes; por ejemplo, detergentes inicos, fenol,
dyes, etc. Si el ADN molde contiene trazas de inhibidores, reduzca su

presencia diluyendo el ADN molde o utilizando menor cantidad de ADN
molde. Pudiera ser necesario re-purificar el ADN molde mediante
precipitacin con etanol seguido de varios lavados.
dNTPs: La concentracin de dNTPs puede disminuirse (ej. cuando
existen amplificaciones inespecficas) o aumentarse (cuando se amplifican
fragmentos de gran tamao), incluso se pueden desequilibrar en favor de
algn dNTP en concreto (ej. experimentos in vitro de mutaciones). Si se
aumenta la concentracin de dNTPs en una reaccin de amplificacin, se
deber aumentar a su vez la concentracin de MgCl
2
, pues los dNTPs se
comportan como potentes agentes quelantes del catin Mg
2+
.
2. Composicin y usos del aceite mineral
Se utiliza esta denominacin para aceites obtenidos por refinacin del petrleo
y cuyo uso es el de lubricantes. Se usan ampliamente en la industria
metalmecnica y automotriz. Estos aceites se destacan por su viscosidad, su
capacidad de lubricacin frente a la temperatura y su capacidad de disipar el
calor, como es el caso de los aceites.
Tambin conocido como aceite de parafina, nujol o vaselina lquida, el aceite
mineral est compuesto de hidrocarburos y es similar en composicin qumica
a la jalea de petrleo. Se puede utilizar en la casa para remover productos
cosmticos o para que la alacena en tu cocina luzca brillante y nueva. Se usa
como coadyuvante para formular otros plaguicidas.
En el protocolo de la PCR, para aquellos termocicladores que no tengan una
heated lid (tapa trmica), se aade aceite mineral para prevenir la
evaporacin.
3. En qu se fundamenta la PCR?
Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas
para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas
temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas
entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de
ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente.






4. Usos del pcr
Huella digital gentica
Es una tcnica forense que permite identificar a una persona comparando su DNA con
el de una muestra obtenida, por ejemplo, de la escena de un crimen. Como la muestra
puede ser muy escasa, la PCR permite aumentar la cantidad de DNA amplificando
ciertos segmentos polimrficos (variables en la poblacin), para luego separarlos
mediante electroforesis, lo que se conoce como DNA fingerprint o huella digital.





Test de Paternidad
Amplificando por PCR fragmentos polimrficos de DNA de la madre, del nio y de l o
los presuntos padres, y separndolo mediante electroforesis, se puede visualizar una
serie de segmentos que tiene el nio, que debe compartir con la madre y padre
biolgicos.
Deteccin de Enfermedades Hereditarias
Cada gen en estudio puede ser amplificado fcilmente por PCR, con los partidores
adecuados, y luego ser secuenciado, para as determinar si un individuo porta alguna
mutacin que explica la presencia de una enfermedad o su aparicin en el futuro, la
que puede ser heredada a sus hijos.
Comparacin de la expresin gnica
Al introducir una modificacin en la PCR clsica se puede estimar la cantidad de
mRNA de un gen determinado en ciertas condiciones experimentales. Al extraer el
RNA total de una clula y con el uso de la transcriptasa inversa, se puede producir un
DNA complementario (cDNA) de todos los mRNA o de alguno en particular. Con este
cDNA se puede hacer una PCR para amplificarlo y facilitar su cuantificacin. Esto se
conoce como RT-PCR y permite estimar cuanto se expresa uno o varios genes en una
clula en una condicin de cultivo determinada.



Clonamiento de Genes
La PCR es habitualmente usada para amplificar un determinado gen o un mRNA
(representado por un cDNA), que puede introducirse en un vector y luego en un
organismo, que al duplicarse tambin duplicar el gen que nos interesa. As podemos
tener una cantidad suficiente de un gen o cDNA, por ejemplo, para secuenciarlo o
producir a gran escala la protena que este gen codifica.
Anlisis de DNA antiguo
Con la PCR se puede analizar DNA que tiene miles de aos de antigedad, lo que ha
permitido estudiar muestras obtenidas desde momias y de restos de animales extintos,
como algunos ejemplos.
Genotipificacion de polimorfismos
Mediante el uso de la PCR se puede determinar el genotipo de un individuo para un
polimorfismo dado, como un microsatlite o un SNP (single nucleotide polymorphism).
En este ltimo caso necesitamos dos partidores para un mismo extremo del segmento,
los cuales varan en slo una base en el extremo 3', lo que generar una amplificacin
alelo-especfica, de acuerdo al alelo del SNP que tenga el individuo en estudio. Estos
polimorfismos son muy tiles para estudios poblacionales y para relacionar un gen o
una regin cromosmica con una enfermedad, ya sea mediante estudios de
asociacin o ligamiento.
5. Que es el efecto plateau
-Meseta (Plateau) alcanzada ms tarde: 30 ciclos en vez de 20 ciclos cuando se
comienza la reaccin con 1 g DNA. En la meseta la reaccin se hace lineal al final de
los ciclos debido, en parte (inicialmente), a que en los ltimos ciclos la enzima no es
capaz de terminar de extender todos los complejos DNA/cebadores ya presentes, en
un simple ciclo (por eso normalmente el ltimo ciclo de extensin se le da al menos 15
min.). Otros efectos tambin contribuyen a la formacin de la meseta y son discutidos
aparte.
6. Para qu sirve la fase de conservacin es necesaria?
Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para
conservar la reaccin a corto plazo.
La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en
pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador.


Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean
tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo
a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz
empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa,
para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms
rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3
El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de
peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y
que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

7. Balisas moleculares
Las balizas moleculares (u oligobalizas) son sondas especficas con forma de horquilla
que contienen en su extremo 5' un fluorocromo y en el 3' una molcula que inhibe la
fluorescencia (quencher). La adopcin de la estructura en horquilla es posible debido a
que presentan de 5 a 7 pares de bases complementarias en sus extremos. Entre estos
extremos hay una secuencia especfica y complementaria a la diana que se quiere
detectar. Cuando la secuencia diana no est presente, las balizas moleculares se
encuentran en forma de horquilla, con sus extremos prximos impidiendo la emisin
de la seal. En presencia de la diana, las balizas hibridan con esta y adoptan una
disposicin estirada, que aleja al quencher del fluorocromo permitiendo la
fluorescencia de la molcula.1 2
El fluorocromo causa la fluorescencia y la otra mitad acta como interruptor de
apagado de este fenmeno, mediante la aceptacin de energa resonante transferida y
posterior liberacin en forma de calor. En concreto, se pueden usar como quenchers el
cido fluoroforo 5-(2aminoetil) aminonaptaleno-1- sulfnico (EDANS) y el apagador
cido 4-(4-dimetilaminofenilazo) benzoico (DABCYL).3
8. Sondas de transferencia de energa de resonancia fluorescente
La transferencia de energa por resonancia de fluorescencia (FRET), tambin llamada
transferencia lineal de energa (en ingls, fluorescence resonance energy transfer) es
una interaccin que ocurre solo a muy corta distancia entre dos estados de excitacin
electrnica de dos molculas fluorescentes en la que la longitud de onda de emisin
de una de ellas coincide con la de excitacin de la otra.











La FRET es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre los
dos fluorocromos por lo que solo puede producirse cuando estn muy prximos.
En el ejemplo de la figura, la Blue fluorescent protein (donador) se excitara con un
fotn ultravioleta y emitira en el rango del azul, mientras que la green fluorescent
proten (aceptor) se excitara con los fotones azules emitidos por la BFP y emitira
fotones verdes. Por si solos los fotones ultravioletas seran incapaces de conseguir la
emisin de fotones verdes de la GFP por lo que la emisin de estos solo podra
realizarse si ha habido FRET.
La FRET es una tcnica importante para investigar una gran variedad de fenmenos
biolgicos que implican la proximidad entre dos molculas.
Condiciones necesarias para el FRET
1. Las molculas de aceptor y donante deben estar muy prximas (10-100 ).
2. El espectro de absorcin del aceptador debe sobreponer el espectro de emisin de
fluorescencia del donante.(ver figura).
3. Si extinguimos la fluorescencia del fluorocromo aceptador (fotobleaching) aumenta
la intensidad de la emisin del fluorocromo donador. Lo que hacemos es destruir la
FRET excitando fuertemente con el laser adecuado (488 nm para GFP) con lo que el
aceptador ya es incapaz de absorber fotones, al excitar al fluorocromo donador (BFP
con 350 nm) la intensidad de emisin de este ltimo AUMENTA respecto a cuando se
produca FRET porque los fotones que emite ya no son absorbidos por el aceptador.



IX. BIBLIOGRAFA

Geral Karp. BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR. 5a edicin.
Cornide, M.T.. DIVERSIDAD GENTICA Y MARCADORES MOLECULARES.
CNIC, La Habana, 2000.
Ross, Michael H Palina, Wojciech. HISTOLOGA: TEXTO Y ATLAS
COLOR CON BIOLOGA CELULAR Y MOLECULAR. 5ta. Edicin. Editorial
Mdica Panamericana.
X. LINKOGRAFA
http://www.biotools.eu/esp/pdf/Boletines%20de%20Producto/Enzimas/Enzimas
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pdf
http://www.uco.es/dptos/bioquimica-biol-
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http://es.slideshare.net/CarlosBenitesMonteza/savedfiles?s_title=aplicaciones-
pcr&user_login=paulinacamposgomez
http://biologiamolecularinteractiva.files.wordpress.com/2013/01/prc3a1ctica-no-
6-pcr.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Aceite#Aceites_minerales
http://www.ehowenespanol.com/usos-precauciones-aceite-mineral-
info_333166/
http://www.bioted.es/bioted%20protocolos/PCR%20gen%2018S%20rRNA.pdf
http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa