ESTUDI O DE LA ACTI VIDAD ENZI MTI CA CELULOL TICA EN LA ETAPA

TERMFILA DE UNA FERMENTACI N EN ESTADO SLI DO REALI ZADA A

PARTI R DE RESIDUOS GENERADOS EN EL PROCESAMI ENTO I NDUSTRI AL DE
PAPA R-12





LINA MARCELA BOHRQUEZ GUTI RREZ
LAURA LUCI A LOSADA RI VERA






Proyecto de grado para optar al ttulo de Ingeniero de Produccin
Agroindustrial






Director
I NDIRA SOTELO
DOCTOR EN CI ENCI A Y TECNOLOGI A DE ALI MENTOS
UNIVERSI DAD PLITECNI CA DE VALENCI A





UNIVERSIDAD DE LA SABANA
FACULTAD DE I NGENI ERI A
PROGRAMA DE PRODUCCI N AGROI NDUSTRI AL
CHA
2004





2




























GRACI AS!

A Dios por ser nuestro compaero incondicional.

A la Facultad de Ingeniera de la Universidad de la Sabana.

A Indira Sotelo, directora del proyecto y Ana Lucia Moreno,
asesora del proyecto.

Y a todas las personas que de una u otra forma hicieron posible la
realizacin de este proyecto de grado.






3









































Dedicado a nuestras familias quienes con su apoyo incondicional
hicieron posible la culminacin no solo de este proyecto de grado,
sino tambin de esta etapa de nuestras vidas.





4







TABLA DE CONTENI DO

RESUMEN..................................................................................................................................................................14
ABSTRACT.................................................................................................................................................................15
INTRODUCCIN.....................................................................................................................................................16
GLOSARIO................................................................................................................................................................17
J USTIFICACIN......................................................................................................................................................18
OBJ ETIVOS...............................................................................................................................................................19
OBJETIVO GENERAL.........................................................................................................................................19
OBJETIVOS ESPECFICOS................................................................................................................................19
1. MARCO TERICO.............................................................................................................................................20
1.1. FERMENTACIN EN ESTADO SLIDO..................................................................................................20
1.1.1 Aspectos Generales y microbiolgicos de la fermentacin en estado slido (SSF)........................20
1.1.2 Sustratos en la Fermentacin en Estado Slido.................................................................................21
1.2. COMPOSTAJE ...............................................................................................................................................22
1.2.1. Definicin de compostaje.......................................................................................................................22
1.2.2. Propiedades del compostaje .................................................................................................................23
1.2.3. Materias primas del compostaje..........................................................................................................23
1.2.4. Factores que condicionan el proceso de compostaje ........................................................................24
1.2.5.Microorganismos involucrados en el proceso de compostaje............................................................25
1.2.6 El proceso de compostaje.......................................................................................................................29
1.2.7 Tcnicas de produccin de compostaje................................................................................................29
1.2.7.1 Compostaje en montn................................................................................................................................... 30
1.2.7.2. Compostaje en silos. ......................................................................................................................................... 30
1.2.7.3. Compostaje en superficie. ................................................................................................................................ 30
1.2.8. TIPOS DE COMPOSTAJE........................................................................................................................31
1.2.8.1 Materia Prima....................................................................................................................................................... 31
1.2.8.2 Segn la poca.................................................................................................................................................... 31
1.3. TRANSFORMACIONES BIOLGICAS CON RESIDUOS DE PAPA.....................................................32
1.4. ACTIVIDAD ENZIMATICA CELULOLTICA .........................................................................................32
1.4.1.Sustrato .....................................................................................................................................................32
1.4.2.Enzima Celulasa........................................................................................................................................33
1.4.3.Actividad Enzimtica Celuloltica............................................................................................................34
1.4.3.1. Estructura del Sustrato Celulsico................................................................................................................... 35
1.4.3.2.Propiedades y medio de accin de las celulasas ............................................................................................ 35
1.4.3.3.Interaccin Enzima Sustrato .......................................................................................................................... 37
1.4.3.4.Influencia del medio de reaccin...................................................................................................................... 37
1.4.4.Cintica de hidrlisis Enzimtica............................................................................................................38
2. MATERIALES Y METODOLODIA...................................................................................................................40
2.1 MATERIALES .................................................................................................................................................40
2.1.1 Residuos generados en el procesamiento industrial de Papa R-12..................................................40
2.1.2 Carboximetilcelulosa................................................................................................................................42
2.1.3 Enzima Comercial .....................................................................................................................................42

5






2.1.4. Reactivo Azul Coomassie. ......................................................................................................................43
2.2. METODOLOGA............................................................................................................................................45
2.2.1. Estandarizacin del sustrato..................................................................................................................45
2.2.1.1 Adecuacin del Sustrato..................................................................................................................................... 46
2.2.2 Mtodos Microbiolgicos .........................................................................................................................48
2.2.2.1 Obtencin de Cepa Madre ................................................................................................................................. 48
2.2.2.2 Separacin de Cepa Madre................................................................................................................................ 48
2.2.3 Mtodos Fisicoqumicos...........................................................................................................................49
2.2.3.1 Determinacin del pH......................................................................................................................................... 49
2.2.3.2.Determinacin de Humedad.............................................................................................................................. 50
2.2.3.3 Determinacin Carbono Orgnico Total.......................................................................................................... 50
2.2.3.4 Determinacin contenido de Nitrgeno......................................................................................................... 52
2.2.3.5 Determinacin del Contenido de Cenizas...................................................................................................... 53
2.2.3.6 Determinacin Contenido de Fibra ................................................................................................................... 54
2.2.3.Mtodos enzimticos ...............................................................................................................................55
2.2.3.1. Metodologa para realizar la curva patrn de la enzima celulasa................................................................ 56
2.2.3.2 Metodologa de medicin de la absorbancia para cada uno de los tratamientos ..................................... 57
2.2.3.3 Metodologa de la medida de absorbancia para el tratamiento con sonicacin......................................... 58
2.2.3.4 Metodologa Tratamiento Carboximetilcelulosa + Cepa ................................................................................ 59
2.2.3.5 Metodologa para determinar la constante de afinidad entre la enzima y el sustrato............................... 59
2.3 DISEO EXPERIMENTAL...........................................................................................................................60
2.3.1 Definicin de los tratamientos................................................................................................................60
2.3.1.1 Tratamiento 1...................................................................................................................................................... 60
2.3.1.2 Tratamiento 2...................................................................................................................................................... 60
2.3.1.3 Tratamiento 3..................................................................................................................................................... 61
2.3.1.4 Tratamiento 4...................................................................................................................................................... 61
2.3.2 Proceso de Compostaje Inducido ..........................................................................................................61
2.3.3 Diseo experimental de los tratamientos .............................................................................................63
3. RESULTADOS Y ANLISIS.............................................................................................................................66
3.1. ESTANDARIZACIN DEL SUSTRATO.....................................................................................................66
3.2. RESULTADOS MICROBIOLGICOS. OBTENCIN Y SEPARACIN DE LA CEPA MADRE. .....69
3.3. RESULTADOS FISICOQUMICOS.............................................................................................................70
3.3.1. pH..............................................................................................................................................................70
3.3.1.1. Resultados Determinacin de pH ................................................................................................................... 70
3.3.1.2. Anlisis de la Determinacin del pH................................................................................................................ 71
3.3.2. Humedad..................................................................................................................................................73
3.3.2.1. Resultados en la Determinacin de la Humedad.......................................................................................... 73
3.3.2.2. Anlisis en la Determinacin de la Humedad................................................................................................. 73
3.3.3. Carbono Orgnico Total .........................................................................................................................74
3.3.3.1. Resultados de la Determinacin de Carbono Orgnico Total ...................................................................... 74
3.3.3.2. Anlisis de la Determinacin de Carbono Orgnico Total ........................................................................... 75
3.3.4. Nitrgeno .................................................................................................................................................76
3.3.4.1. Resultados en la Determinacin del Nitrgeno.............................................................................................. 76
3.3.4.1. Anlisis en la Determinacin del Nitrgeno.................................................................................................... 77
3.3.5. Relacin C/N............................................................................................................................................78
3.3.5.1. Resultados de la Relacin C/N........................................................................................................................ 78
3.3.5.2. Anlisis de la Relacin C/N............................................................................................................................... 79
3.3.6. Cenizas .....................................................................................................................................................80
3.3.6.1. Resultados en la Determinacin de las cenizas............................................................................................ 80
3.3.6.2. Anlisis en la Determinacin de las cenizas.................................................................................................. 81
3.3.7. Fibra..........................................................................................................................................................81
3.3.7.1. Resultados en la Determinacin de la fibra .................................................................................................. 81
3.3.7.2. Anlisis en la Determinacin de fibra seca.................................................................................................... 82
3.4. RESULTADOS ACTIVIDAD ENZIMTICA .............................................................................................84

6






3.4.1 Curva Patrn.............................................................................................................................................84
3.4.1.1. Resultados en el proceso de obtencin de la curva de actividad enzimtica ........................................ 84
3.4.1.2. Anlisis en el proceso de obtencin de la curva de actividad enzimtica .............................................. 85
3.4.2. Medida de la actividad enzimtica en los tratamientos.....................................................................85
3.4.2.1. Resultados de la medida de la actividad enzimtica en los tratamientos................................................. 85
3.4.2.2. Anlisis de la medida de la actividad enzimtica en los tratamientos....................................................... 87
3.4.3. Medida de la absorbancia en el ensayo con sonicacin....................................................................88
3.4.3.1. Resultados de la medida de la absorbancia en el ensayo con sonicacin............................................... 88
3.4.3.2. Anlisis de la medida de la absorbancia en el ensayo con sonicacin..................................................... 88
3.4.4. Medida de la absorbancia en el complejo CMC + cepa.....................................................................89
3.4.4.1. Resultados de la medida de la absorbancia en el complejo CMC + cepa................................................. 89
3.4.4.2. Anlisis de la medida de la absorbancia en el tratamiento CMC + cepa .................................................. 90
3.4.5 Determinacin de la constante de afinidad..........................................................................................90
3.4.5.1 Resultados de la determinacin de la constante de afinidad. ..................................................................... 90
3.4.5.2. Anlisis de la determinacin de la constante de afinidad. ........................................................................... 92
3.4.6 Resultados y Anlisis del diseo experimental ....................................................................................92
CONCLUSIONES......................................................................................................................................................96
RECOMENDACIONES............................................................................................................................................97
BIBLIOGRAFA........................................................................................................................................................98
ANEXOS................................................................................................................................................................... 100

























7









CONTENI DO DE TABLAS REFERENCIADAS

- Tabla N 1. Principales Microorganismos identificados durante el proceso de
compostaje
- Tabla N 2. Caractersticas Morfolgicas de las Bacteria celulolticas
- Tabla N 3. Condiciones ptimas de iniciacin y finalizacin de un compostaje
- Tabla N 4. Identificacin de la Enzima
- Tabla N 5 Componentes de la Enzima
- Tabla N 6. Condiciones ptimas de la Enzima
- Tabla N 7. Caracterizacin fisicoqumica de los residuos a tratar. Congelagro S.A
- Tabla N 8. Caracterizacin del sustrato balanceado
- Tabla N 9. Preparacin curva de calibrado
- Tabla N 10. Tiempo y temperatura del proceso de compostaje
- Tabla N 11,12 y 13. Resumen del ensayo de cada uno de los tratamientos
- Tabla N 14. Das de medicin propiedades fisicoquimicas del tratamiento 4.
- Tabla N 15. Das de medicin propiedades fisicoquimicas de los tratamientos 1, 2 y
3
- Tabla N 16. Temperaturas y tiempos de los cuatro tratamientos.
- Tabla N 17. Tabla de resultados diseo experimental
- Tabla N 18. Promedios de los pH obtenidos en los triplicados y sus respectivas
desviaciones.
- Tabla N 19. Promedios de los triplicados y las respectivas desviaciones para la
determinacin de humedad.
- Tabla N 20. Promedios del contenido de carbono en base seca de los tres ensayos y
sus respectivas desviaciones.
- Tabla N 21. Promedios de los porcentajes de Nitrgeno (en base seca) y sus
respectivas desviaciones estndar
- Tabla N 22. Promedios de la relacin C/N (en base hmeda) y sus respectivas
desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los triplicados
- Tabla N 23. Promedios de los porcentajes de cenizas (en base seca) y sus
respectivas desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los triplicados

8






- Tabla N 24. Promedios de los porcentajes de fibra (en base seca) y sus respectivas
desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los triplicados.
- Tabla N 25. Absorbancias a las diferentes concentraciones de enzima.
- Tabla N 26. Promedios de las concentraciones enzimticas con las respectivas
desviaciones de los resultados obtenidos en los triplicados.
- Tabla N 27. Diferencia en % de actividad enzimtica entre tratamientos
- Tabla N 28. Cuadro comparativo con las respectivas desviaciones estndar entre la
medida de actividad enzimtica con sonicacin y sin sonicacin
- Tabla N 29. Promedios de las concentraciones enzimticas con las respectivas
desviaciones de los resultados obtenidos en los triplicados
- Tabla N 30. Lectura realizada durante 2 horas cada 5 minutos. (CMC +enzima
novo)





















9









CONTENI DO DE FIGURAS REFERENCIADAS

- Figura 1. Estrategias generales de la hidrlisis de la celulosa y su utilizacin por
bacterias aerbicas y anaerbicas.
- Figura 2. Estructura de la celulosa
- Figura 3. Mecanismo de hidrlisis de la celulosa
- Figura 4. Mecanismos de desplazamiento doble en la hidrlisis enzimtica del enlace
- Figura 5. Interaccin Enzima Sustrato
- Figura 6. Reaccin esquemtica para la prueba de coomassie en protena.
- Figura 7. Balance del sustrato para obtener una relacin C/N de 27
- Figura 8. Balance del sustrato para obtener una humedad del 55%.





















10









CONTENI DO DE GRFI CAS REFERENCIADAS

- Grfico N 1. Evolucin del pH con la temperatura para cada uno de los
tratamientos.
- Grfico N 2. Evolucin de la humedad frente a la temperatura en los tres
tratamientos
- Grfico N 3. Cantidad de carbono orgnico total (BS) para los tres tratamientos.
- Grfico N 4. Evolucin de la cantidad de N (BS) para los tres tratamientos.
- Grfico N 5. Evolucin de la relacin C/N de 30 a 70 C.
- Grfico N 6. Evolucin del contenido de cenizas (BS).
- Grfico N 7. Evolucin del contenido de fibra seca (BS) desde la mezcla inicial hasta
la finalizacin del compostaje (70C).
- Grfico N 8. Curva de absorbancia frente a la cantidad de enzima absorbida por el
sustrato
- Grfico 9. Evolucin de la enzima absorbida por el sustrato a travs de la
temperatura para cada uno de los tratamientos.
- Grfico N 10. Actividad enzimtica CMC + cepa comparada con los dems
tratamientos.
- Grfico N 11. Comportamiento de la enzima Celluclast frente al tiempo.















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CONTENIDO DE FOTOGRAFIAS REFERENCI ADAS


- Fotografa N1.Torta Filtro Prensa. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad de
Ingeniera. Universidad de la Sabana. 2004

- Fotografa N2. Residuos Filtro Parablico. Laboratorio de Operaciones Unitarias.
Facultad de Ingeniera. Universidad de la Sabana. 2004

- Fotografa N3. Cascarilla de Pelado. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad
de Ingeniera. Universidad de la Sabana. 2004

- Fotografa N4. Slivers. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad de Ingeniera.
Universidad de la Sabana. 2004

- Fotografa N5 y 6. Sustrato Balanceado

- Fotografa N7. Obtencin Cepa Madre




















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ANEXOS

DATOS PRIMARI OS DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES

ANEXO A
Tabla de resultados. Determinacin del pH para los tratamientos 1, 2 y 3
Tabla de resultados. Determinacin del pH para el blanco o patrn

ANEXO B
Grficas de los triplicados en la determinacin de pH para cada tratamiento

ANEXO C
Desecacin en estufa (Determinacin de Humedad)
ANEXO D
Grfico con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin de
humedad.

ANEXO E
Tabla de resultados. Determinacin de Carbono

ANEXO F
Grficas de los triplicados en la determinacin de carbono.

ANEXO G
Resultados Determinacin de Nitrgeno

ANEXO H
Grficos con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin del
porcentaje de Nitrgeno (BS).

ANEXO I
Tabla de Resultados. Relacin C/N

ANEXO J
Grficos con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin de la
relacin C/N.

13







ANEXO K
Las cantidades de ceniza que obtenidas para cada uno de los tratamientos.

ANEXO L
Grficos con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin de
cenizas.

ANEXO M
Tabla de Resultados. Porcentaje de fibra seca.

ANEXO N
Resultados de absorbancia (cantidad de enzima adherida al sustrato) obtenidos para
cada uno de los tratamientos.

ANEXO O
Actividad enzimtica por triplicado para cada uno de los tratamientos.

ANEXO P
Resultados de la medida de absorbancia obtenidos al utilizar el ultrasonido.

ANEXO Q
Grficas comparativas del procedimiento con sonicacin y sin sonicacin.

ANEXO R
Curva patrn reportada en el Espectofotmetro Cary Varian

ANEXO S
Lecturas de absorbancia para los tres tratamientos y el blanco en el Espectofotmetro
Cary Varian

ANEXO T
Ficha Tcnica Celluclast Novozymes











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RESUMEN

Se realiz un proceso de compostaje (SSF) inducido a partir de residuos generados en
el procesamiento industrial de papa R-12, durante 7 das. Este proceso de compostaje
se realiz con el fin de estudiar la actividad enzimtica celuloltica presente en la etapa
termfila, y tambin con el fin de observar lo que suceda con determinados parmetros
fisicoqumicos (Carbono orgnico total, Nitrgeno, Relacin C/N, Humedad, Cenizas,
pH y actividad enzimtica) a travs del tiempo. Inicialmente se realiz una adecuacin
del sustrato, debido a que se trabajo con 4 residuos provenientes de diferentes partes
del proceso industrial. La adecuacin se realiz para iniciar con las condiciones ptimas
de un compostaje (pH = 6.0, relacin C/N = 27 y humedad = 55 %). Se realizaron 4
tratamientos (tratamiento 1: residuo de papa + enzima novozymes; tratamiento 2:
residuo de papa + cepa madre; tratamiento 3: residuo de papa) incluyendo el
tratamiento patrn (CMC + enzima novozymes) con el cual se iban a comparar los otros
tres tratamientos. Los 4 tratamientos fueron sometidos a 30, 45, 55, y 70C durante 1,
1, 2 y 3 das respectivamente
A los tratamientos 1, 2 y 3 se les determinaron medidas de: Carbono orgnico total,
Nitrgeno, Relacin C/N, Humedad, Cenizas, pH y actividad enzimtica; en los das en
los cuales finalizaba cada temperatura programada; y al tratamiento patrn se le
hicieron medidas de pH y actividad enzimtica en los mismos das.

La variacin de los parmetros en los tratamientos permiti observar que tanto para
Carbono como para Nitrgeno se presentaba una disminucin debido al proceso de
mineralizacin, estos parmetros al disminuir permitieron llegar a una relacin C/N
entre el rango vlido para finalizacin de un compostaje. Para el pH se observ un
ascenso cuyo pico para los tres tratamientos se presenta en 55C, seguido de un
descenso para los tres en 70C. La humedad como es de esperarse disminuye a
medida que pasan los das pero se concluye que no es conveniente dejar el compostaje
hasta la temperatura de 70C, pues la humedad adecuada para la finalizacin del
mismo se obtiene en 55C. El porcentaje de ceniza desciende en los tres tratamientos
confirmando una vez ms el proceso de mineralizacin.

La fibra present un descenso en los tres tratamientos (74.75, 80.32, 69.24%),
mostrando de esta forma que la degradacin de celulosa se present en los
tratamientos. Por ltimo en el anlisis de la actividad enzimtica, se observa que el
tratamiento que ms se acerca al comportamiento de la enzima patrn, es decir el que
presenta mayor cantidad de enzima adsorbida sobre el sustrato, es el tratamiento 2.
Para observar de una manera ms puntual, la actividad de la cepa madre, se realiz un
ltimo tratamiento (CMC + cepa) y se someti a los mismos das y las mismas
temperaturas, dando como resultado que la cepa si posee actividad enzimtica.

15








ABSTRACT

During a period of seven days a compost process (SSF) was induced to the residue
generated by the industrial processing of R-12 potatoes. This compost process was
performed with the object of studying the cellulolytic enzymatic activity during the
thermophylus stage of the same; and also with the purpose of observing the changes
that took place in the determined physiochemical parameters (Total Organic Carbon,
Nitrogen, C/N relation, Humidity, Ashes, pH and Enzymatic Activity) during the time
of the project. Initially the substrate was adequated, due to the fact that the work was
performed on four residues proceeding from four different stages of the industrial
process. The adequation part was done to start the process under optimum compost
conditions (pH = 6.0, C/N relation = 27 and Humidity = 73 %). Four treatments were
performed (Treatment 1: potato residue + Novozyme enzyme; Treatment 2: potato
residue + "cepa madre"; Treatment 3: potato residue) including the pattern treatment
(CMC + Novozyme enzyme) with which the other three treatments were compared.
The four treatments were placed at 30, 45, 55 and 70C during 1, 1, 2 and 3 days
respectively.
Total Organic Carbon, Nitrogen, C/N relation, Humidity, Ashes, pH and Enzymatic
Activity were determined on treatments 1, 2 and 3 in the days in which each
programmed temperature ended; and on the pattern treatment pH and enzymatic
activity were measured during those same days.

The variation of parameters in these treatments allowed the observation that there was
a decrease in Carbon and Nitrogen, due to the process of mineralization; the decrease
of these parameters allowed to obtain a C/N relation within a valid range for the
finalization of a compost. An increase in pH was observed with the highest peak
showing, for the three treatments, at 55C, followed by a decrease in the three
treatments, at 70C. Humidity as it was to be expected, decreased as the days passed,
but it was concluded that it was not convenient to let the compost reach a temperature
of 70C, since the adequate humidity for the finalization of the process is obtained at
55C. The percent of ashes decreased in the three treatments, confirming once again
the process of mineralization. Fiber also decreased in the three treatments (74.75,
80.32, 69.24%) showing the degradation of cellulose that took place in the treatments.
Finally the analysis of enzymatic activity showed that, the treatment that most closely
resembles the behavior of the pattern enzyme, that is, the one that shows the largest
quantity of absorbed enzyme by the substrate, is the treatment 2. To observe more
closely the activity of the "cepa madre" a last treatment was performed (CMC + "cepa")
and was placed at the same temperatures and during the same number of days, and its
results showed that the "cepa" does posses enzymatic activity.

INTRODUCCIN

La fermentacin en estado slido (SSF) es una de las transformaciones biolgicas de
material orgnico que se est usando con mayor frecuencia. Consiste especficamente
en produccin de enzimas, utilizadas en la agricultura y se est desarrollando como una
posible alternativa para las fermentaciones convencionales.

Una de las SSF que s est usando con mayor frecuencia es el compostaje, un proceso
de descomposicin biolgica de los constituyentes orgnicos de los materiales de
desecho, que se lleva a cabo bajo condiciones controladas sobre sustratos slidos
orgnicos heterogneos, originando un producto que representa grandes beneficios
cuando es adicionado al suelo

segn Farias D.(1999).

La actividad celuloltica en la etapa termfila (45C a 70C) se considera como una
medida de la madurez y de la evolucin del proceso de transformacin bioqumica del
compostaje.

Este proyecto estudia la actividad enzimtica celuloltica presente en una transformacin
de residuos orgnicos tipo compostaje. El compostaje es realizado a partir de residuos
generados en el procesamiento industrial de papa R-12 (sustrato), y resultar afectado
por factores que influyen directa o indirectamente en el metabolismo microbiano; as los
parmetros ms importantes que se controlan son la temperatura, la humedad, el pH, el
contenido de cenizas y la relacin C/N.(Carbono/Nitrgeno).

El objetivo de esta experiencia es estudiar la actividad enzimtica celuloltica presente
en la etapa termfila de un experimento inducido simulando una fermentacin en
estado slido (compostaje) en donde se mantienen dos de las etapas (mesfila y
termfila,) de un proceso normal de compostaje, a temperaturas y tiempos previamente
definidos a travs de la recopilacin bibliogrfica, partiendo de que la experimentacin
se realiza a nivel de laboratorio. El proceso tiene una duracin de 7 das y se mantiene
por 30, 45, 55 y 70C, por 1, 1, 2, y3 das respectivamente.

Donde el monitoreo de la actividad enzimtica celuloltica se realiza para tres
tratamientos (tratamiento 1: sustrato +enzima comercial, tratamiento 2: sustrato +cepa
madre, tratamiento 3: sustrato solo, fermentacin endgena).
En el diseo experimental se defini un patrn representativo del complejo enzima -
sustrato (E-S) (tratamiento 4: enzima comercial + carboximetilcelulosa), determinado
por todas las experiencias encontradas en la literatura, con el fin de observar las
diferencias entre los tres tratamientos y determinar cuales presentan mayor actividad
celuloltica en comparacin con el blanco.



17






GLOSARI O

Celulasa: Son enzimas hidrolticas que participan en el rompimiento de los enlaces
glicosdicos-1,4 presentes en los polisacridos celulosa y hemicelulosa,
respectivamente. Las celulasas son producidas por una gran variedad de
microorganismos entre los que se encuentran hongos y bacterias.

Celulosa: Polisacrido que forma la estructura de las paredes celulares de todas las
plantas, a excepcin de algunos hongos. Las molculas de la celulosa son cadenas no
ramificadas que forman juntas una estructura rgida muy resistente a la tensin.

Cepa: Conjunto de individuos de una especie microbiana que presentan caractersticas
biolgicas comunes y definidas a nivel intraespecfico, estas caractersticas son
generalmente fisiolgicas.

Compostaje: Proceso biolgico aerbico, mediante el cual los microorganismos actan
sobre la materia rpidamente biodegradable, convirtindola en un acondicionador para
el suelo.

Enzima: Compuesto que cataliza las reacciones qumicas. Las enzimas son protenas
que actan con un determinado compuesto (sustrato) para producir un complejo, el
cual forma el producto de la reaccin.

Mineralizacin: Transformacin del nitrgeno orgnico en amonio (NH4 +) mediante la
accin de microorganismos.

Residuo: Material que es clasificado como inservible en cualquier tipo de trabajo u
operacin.

Sonicacin: Proceso mediante el cual, a una sustancia, por medio de vibraciones se le
genera un rompimiento celular.

Sustrato: Compuesto especfico sobre el cual acta la enzima, para producir el complejo
enzimtico que forma el producto de la reaccin.

Capacidad de Intercambio: Es la capacidad de este complejo de ceder nutrientes a las
plantas por intermedio de la captacin de partculas minerales que el vegetal
posteriormente va a absorber.
Fertilidad Actual: Nutrientes que estn a disposicin de la planta en el momento, estn
en determinado estado qumico que necesitan de un periodo de tiempo para poder ser
absorbidos, el vegetal lo toma a largo plazo.


18






J USTIFICACIN

La lnea de investigacin de Aprovechamiento de Residuos de la facultad de ingeniera
de la Universidad de la Sabana ha realizado proyectos que involucran este tema con el
fin de buscar mejores alternativas para la industria agroalimentaria, por esta razn la
facultad decidi realizar este proyecto que ser el inicio de una investigacin ms
detallada.

Residuo se define como aquel material que no representa una utilidad o un valor
econmico para la industria y la cantidad de residuos que esta genera depende de la
tecnologa del proceso productivo, calidad de las materias primas o productos
intermedios, propiedades fsicas y qumicas de las materias auxiliares empleadas,
combustibles utilizados y los envases y embalajes del proceso. (Pineda, 2003)

Una parte importante de los residuos que se generan en la industria agroalimentaria
esta constituida por la fraccin orgnica slida derivada del tratamiento previo de las
materias primas. En la actualidad esta fraccin de slidos orgnicos se emplea en parte
como alimentacin animal, una pequea proporcin se destina a otras aplicaciones
(combustible) y el resto de la materia no empleada constituye un residuo destinado al
vertedero
1
. El envo de esta materia orgnica a un vertedero supone una perdida de
recursos puesto que puede ser un subproducto aprovechable en otros procesos como lo
son la fabricacin de compostaje, biocombustibles, etc. El reciclaje de los residuos
orgnicos por cualquiera de las vas mencionadas se ve favorecido, entre otros, por el
hecho de que las empresas generadoras normalmente estn concentradas en
determinadas zonas geogrficas y podran aplicarse medidas conjuntas de
aprovechamiento de los residuos.

Una de las transformaciones de residuos slidos ms usadas en el momento es la
fermentacin en estado slido (SSF
2
), la cual se ha usado en los ltimos aos de forma
exitosa en la produccin de metabolitos secundarios. Estos productos estn asociados
con la fase estacionaria de crecimiento microbiano y son producidos a escala industrial
para su uso en agricultura y en el tratamiento de enfermedades. Una de las SSF que s
esta usando con mayor frecuencia es el compostaje, por esta razn en este proyecto se
ha decidido medir la actividad enzimtica celuloltica que se presenta al realizar una
fermentacin en estado slido a partir de residuos de papa procedentes de la planta de
Congelagro, R-12, para observar y entender la transformacin del residuo desde las
medidas de la actividad enzimtica y los principales cambios fisicoqumicos de la
fermentacin en estado slido del compostaje.




1
Espacio anexo a todos los sistemas de tratamiento de residuos, para depositar aquellas fracciones que no se pueden reciclar o
resultantes de los distintos procesos.
2
Solid Substrate Fermentation (Fermentacin en Estado Slido)

19








OBJ ETI VOS

OBJ ETIVO GENERAL
Determinar la actividad enzimtica desde el punto de vista celuloltico presente en una
fermentacin en estado slido realizada a partir de residuos de papa (R-12).

OBJ ETIVOS ESPECFI COS

Determinar las cantidades especficas de materia prima que constituyan un sustrato
y las condiciones adecuadas (pH, Carbono, Nitrgeno y humedad) en las cuales se
realiza la fermentacin en estado slido (compostaje).

Disear un experimento inducido de un sistema de compostaje a nivel de
laboratorio, para simular y controlar las condiciones de actividad enzimtica
celuloltica en la etapa termfila (45 C 70 C). Comparado con un diseo blanco o
patrn (Complejo Enzimtico: CMC
3
+ enzima patrn
4
).

Definir las metodologas de medicin cuantitativa de la actividad celuloltica.

Obtener en el espectofotmetro la curva patrn de calibracin de la enzima celulasa
para posteriormente realizar el clculo de la actividad celuloltica en los diferentes
complejos enzimticos a montar.

Determinar cuantitativamente la actividad celuloltica durante la etapa termfila en
cada uno de los tratamientos.

Medir las transformaciones bioqumicas que se presentan durante el proceso con los
siguientes parmetros: humedad, pH, relacin C/N y cenizas.












3
CMC carboximetilcelulosa: Sustrato polisacrido especfico para determinar la accin cuantitativa de la enzima celulasa.
4
Enzima Comercial Celluclast, suministrada por la empresa Novozymes

20
















CAPTULO I

1. MARCO TERICO

1.1. FERMENTACI N EN ESTADO SLI DO

La fermentacin en estado slido (SSF) es una de las transformaciones biolgicas de
material orgnico que se esta usando con mayor frecuencia, consiste en la produccin
de enzimas, las cuales son usadas en la agricultura y en el tratamiento de
enfermedades. La SSF ha mostrado que elabora productos ms estables, utiliza menor
cantidad de energa, en fermentadores ms pequeos que facilitan el proceso de
separacin de los productos. (Farias, 1999)

1.1.1 Aspectos Generales y microbiolgicos de la fermentacin en estado
slido (SSF)

La transformacin microbiana aerobia de materiales slidos o la fermentacin en estado
slido se puede definir en trminos de las siguientes propiedades:

Un sustrato poroso que puede ser biodegradable o no, pero con una gran superficie
de rea por unidad de volumen, en el rango de 10 a 10
6
m/cm, listo para que se
de un crecimiento microbiano en la interfase slido/gas.
Este sustrato debe absorber agua hasta completar su peso en seco, debe tener una
actividad de agua alta en la interfase slido/gas con el fin de buscar tasas altas en
las que se den procesos bioqumicos.
La mezcla de aire de oxgeno con otros gases y aerosoles debe fluir a una presin
baja.
La interfase slido/gas debe tener un buen hbitat para el rpido desarrollo de
mohos, levaduras o bacterias tanto en medios puros como mixtos.
Las propiedades mecnicas del sustrato deben soportar compresin o suave
agitacin, que son requeridas para que s de la fermentacin.

21






Requiere de pequeas partculas granuladas o fibrosas que no tiendan a romperse o
a pegarse entre ellas.
El sustrato no debe ser contaminado por inhibidores o actividad microbiana y debe
tener la capacidad de absorber o contener sustancias alimenticias como
carbohidratos (celulosa, almidn, azucares) y fuentes de nitrgeno (amonio, urea,
pptidos) y sales minerales.

Los ejemplos tpicos de SSF son las fermentaciones tradicionales como:

Koji: En el Japn donde utilizan arroz cocido al vapor como sustrato slido y lo
inoculan con el moho Aspergillus oryzae.
Tempeh: En Indonesia o ragi en la India utilizaron vapor y residuos de semillas
como sustrato slido y una variedad de mohos no txicos como semillas
microbianas.
Blue cheese: En Francia que utiliza queso fresco perforado como sustrato y
selector de hongos, el Penicilium roqueforti se utiliza como inoculo.
Compostaje de fibras lignocelulosas, naturalmente contaminadas por una extensa
variedad de organismos incluyendo bacterias celulolticas, mohos y Streptomyces sp.

Adems nuevas aplicaciones de SSF han sido sugeridas para la produccin de
antibiticos, metabolitos secundarios o alimentos enriquecidos.

Actualmente SSF ha sido aplicado a escala industrial principalmente en el Japn. El
tradicional koji fabricado en pequeos recipientes de madera han sido cambiados
gradualmente a procesos ms sofisticados como cmaras de fermentacin, sensores
elctricos, cilindros rodantes, cmaras de acero inoxidable, microprocesadores y
sensores elctricos. La escala habitual en las fbricas es de 1 o 2 toneladas por bache,
pero si se cuenta con reactores la capacidad puede llegar a 20 toneladas.

En Francia una nueva firma cre recientemente un proceso para comercializar la
produccin de pectinasa a partir de pulpa de remolacha. El queso azul en Francia ha
comenzado a modernizarse mejorando el condicionamiento mecnico de los quesos,
produccin de esporas de mohos y control de las condiciones ambientales.

Las investigaciones ms recientes muestran que las naciones estn desarrollando la SSF
como una posible alternativa para las fermentaciones convencionales, que son los
procesos principales de las industrias farmacuticas y alimenticias en las naciones
industrializadas. (Raimbault M, 1998)

1.1.2 Sustratos en la Fermentacin en Estado Slido

Todos los sustratos slidos tienen un rasgo en comn: Su estructura macromolecular

22






bsica. En general los sustratos para la SSF son compuestos y productos heterogneos
que vienen de la agricultura o de residuos de la agroindustria. Esta estructura
macromolecular bsica (celulosa, almidn, pectina, lignocelulosa, fibras, etc.) confiere
las propiedades de un sustrato slido. La estructura macromolecular puede proporcionar
una matriz (bagazo de caa de azcar, fibras inertes, resinas) dentro de la cual el
carbono y la fuente de energa (azucares, lpidos, cidos orgnicos) son absorbidos.
Pero generalmente, la matriz macromolecular representa el sustrato y proporciona
tambin el carbono y la fuente de energa.


1.2. COMPOSTAJ E

La SSF es un proceso en baches que utiliza materiales heterogneos naturales,
conteniendo polmeros complejos como la lignina, lignocelulosa y pectina. El
compostaje. Una de las SSF ms usadas en los ltimos 10 aos es el compostaje, en el
cual la materia orgnica es descompuesta, con la ayuda del aire y los microorganismos,
en dixido de carbono y agua mientras se libera energa.

1.2.1. Definicin de compostaje

El compostaje es un proceso biolgico aerbico, mediante el cual los microorganismos
actan sobre la materia rpidamente biodegradable (restos de cosecha, excrementos de
animales y residuos urbanos), permitiendo obtener un abono excelente para la
agricultura.

El compostaje se puede definir como el resultado de un proceso de humificacin
5
de la
materia orgnica bajo condiciones controladas y en ausencia de suelo, es un nutriente
para el suelo que mejora la estructura y ayuda a reducir la erosin y ayuda a la
absorcin de agua y nutrientes por parte de las plantas.
La produccin de humus es el resultado final del compostaje. El humus
6
es la vida del
suelo y debe estar presente en l para ser frtil. Un total de slo un 1 o 2% es
necesario para diferenciar un suelo frtil y otro que no lo es. Los microorganismos del
suelo usan el humus como sustrato y la mayora de los nutrientes de los minerales del
suelo permanecern no asimilables por las plantas en los suelos pobres o carentes de
humus segn Emison (2000).
El compostaje consta de cuatro etapas, primero aparecen bacterias y hongos mesfilos
(etapa mesoflica). Cuando la temperatura llega alrededor de los 40C, aparecen las
bacterias y hongos termfilos (etapa termoflica). Viene la etapa de enfriamiento, donde
la temperatura es menor de 60 C y finalmente se llega a la etapa de maduracin donde
el sustrato se vuelve a encontrar a temperatura ambiente.


5
Humificacin: Proceso fisicoqumico que genera humus como producto final.
6
Humus: Fraccin Orgnica coloidal del suelo, de alta estabilidad frente a cambios en las condiciones ambientales y de manejo.

23








1.2.2. Propiedades del compostaje

Diferentes referencias han definido las siguientes propiedades que tiene el compostaje:

Mejora las propiedades fsicas del suelo. La materia orgnica favorece la estabilidad
de la estructura de los agregados del suelo agrcola, reduce la densidad aparente,
aumenta la porosidad y permeabilidad, y aumenta su capacidad de retencin de
agua en el suelo.

Mejora las propiedades qumicas como la capacidad de intercambio, la fertilidad
actual. Aumenta el contenido en macronutrientes y micronutrientes (N, P2O5, K2O,
CaO, S, Fe2O3, MgO, Al, Na, Mn) (Madrid C, 2001) y es fuente y almacn de
nutrientes, (fsforo soluble, Nitrgeno amoniacal, Boro, sodio, etc.) (Cedeo, 2001)
para los cultivos.

Mejora la actividad biolgica del suelo porque proporciona un saludable entorno
biolgico por el alimento que proporciona a gusanos e insectos del suelo, segn
Emison (2000). Acta como soporte y alimento de los microorganismos ya que viven
a expensas del humus y contribuyen a su mineralizacin.


1.2.3. Materias primas del compostaje

Para la elaboracin del compostaje se puede emplear cualquier materia orgnica, con la
condicin de que no se encuentre contaminada como por ejemplo partes enfermas de
plantas, plantas atacadas por plagas, hierbas con races fuertes o semillas maduras,
plantas tratadas con herbicidas o pesticidas, etc. Segn Emison (2000).
Generalmente estas materias primas proceden de:

Productos de origen agrcola.
Paja de cereales
Rastrojos de maz y de cualquier planta herbcea
Restos de plantas hortcolas (coles, lechugas,...)
Cultivos industriales
Cosechas de baja calidad: paja vieja o humedecida, ensilados deteriorados...
Cscaras de frutos secos y del arroz
Frutas deterioradas o retiradas del mercado
Desechos de almacenes horto-frutcolas
Subproductos de industrias agro-alimentarias

24






Restos de cosechas de invernaderos y cultivos hortcolas
Corteza de pino, chopo, etc.
Ramas de poda

Productos de origen industrial.
Subproductos de extractos vegetales de la industria farmacutica
Subproductos de la destilacin de vegetales para la fabricacin de licores
Cscara y residuo del cacao
Residuos de caf
Subproductos de la industria del vino, de la cerveza, del aceite
Lodo de depuradoras biolgicas de industrias agro-alimentarias
Filtros deteriorados de industrias alimentarias
Lodos de depuradora de industrias variadas, papeleras, etc.
Subproductos de aserraderos

Productos de origen urbano.
Restos de poda y de limpieza de jardines
Lodos de depuradoras urbanas
Lodos de albaales
Residuos slidos urbanos
Residuos de mercados de frutas y verduras

Productos de origen animal.
Estircol
Gallinaza
Pelo animal, piel, lanas, plumas, etc.
Residuos de mataderos.

1.2.4. Factores que condicionan el proceso de compostaje
El proceso de compostaje se basa en la actividad de microorganismos que viven en
el entorno (fermentacin Endgena), ya que son los responsables de la
descomposicin de la materia orgnica. Para que estos microorganismos puedan
vivir y desarrollar la actividad descomponedora se necesitan unas condiciones
ptimas de temperatura, humedad y oxigenacin.
Son muchos y muy complejos los factores que intervienen en el proceso biolgico del
compostaje, estando a su vez influenciados por las condiciones ambientales, tipo de
residuo a tratar y el tipo de tcnica de compostaje empleada. Los factores ms
importantes son:
Temperatura. Se consideran ptimas las temperaturas del intervalo 30-70 C
para conseguir la eliminacin de patgenos y parsitos. A temperaturas muy
altas, microorganismos como hongos y bacterias mueren y otros no actan al

25






estar esporulados.
Humedad. En el proceso de compostaje es importante que la humedad alcance
unos niveles ptimos del 40-60 % (Bh). Si el contenido en humedad es mayor, el
agua ocupar todos los poros y por lo tanto el proceso se volvera anaerbico, es
decir se producira una putrefaccin de la materia orgnica. Si la humedad es
excesivamente baja se disminuye la actividad de los microorganismos y el
proceso es ms lento. El contenido de humedad depende de las materias primas
empleadas: Materiales fibrosos o residuos forestales gruesos la humedad mxima
permisible es del 75-85 % mientras que para material vegetal fresco, sta oscila
entre 50-60%.
pH. Influye en el proceso debido a su accin sobre microorganismos. En general
los hongos toleran un margen de pH entre 5-8, mientras que las bacterias tienen
menor capacidad de tolerancia ( pH = 6 7.5). Presenta una tendencia a la
alcalinidad que obedece al tipo de iones aportados por el residuo a compostar.
Finalmente se produce un descenso provocado por el proceso de nitrificacin en el
cual parte del amonio liberado durante el proceso de amonificacin sufre una
conversin a nitrato liberando iones hidrogeno H
+
.
Oxgeno. El compostaje es un proceso aerbico, por lo que la presencia de
oxgeno es esencial. La concentracin de oxgeno depender del tipo de material,
textura, humedad, frecuencia de volteo y de la presencia o ausencia de aireacin
forzada.
Relacin C/N equilibrada. El carbono y el nitrgeno son los dos constituyentes
bsicos de la materia orgnica. Por ello para obtener buenos resultados en el
proceso de compostaje es importante que exista una relacin equilibrada entre
ambos elementos. Tericamente una relacin C/N de 25-35 es la adecuada, pero
esta variar en funcin de las materias primas que conforman el compost. Si la
relacin C/N es muy elevada, disminuye la actividad biolgica. Una relacin C/N
muy baja no afecta al proceso de compostaje, perdiendo el exceso de nitrgeno
en forma de amoniaco. Es importante realizar una mezcla adecuada de los
distintos residuos con diferentes relaciones C/N para obtener un compost
equilibrado. Los materiales orgnicos ricos en carbono y pobres en nitrgeno son
la paja, el heno seco, las hojas, las ramas, la turba y el serrn. Los pobres en
carbono y ricos en nitrgeno son los vegetales jvenes, las deyecciones animales
y los residuos de matadero (Emison, 2000).
1.2.5.Microorganismos involucrados en el proceso de compostaje

El compostaje es un proceso aerbico de descomposicin de la materia orgnica, llevado
a cabo por una amplia gama de poblaciones de bacterias, hongos y actinomicetes.

Entre la variedad de microorganismos aerbios mesfilos y termfilos, se pueden

26






diferenciar los siguientes durante el proceso de compostaje:

Microorganismos presentes ya en el material a compostar; constituido
principalmente por bacterias entricas.
Microorganismos que se desarrollan durante el proceso de compostaje;
principalmente formado por bacterias, hongos y actinomicetos.
Endotoxinas, producidas por bacterias gram negativo.

Los distintos estudios ambientales realizados muestran que las concentraciones de
hongos halladas en distintas partes del proceso varan entre 10
5
y 10
7
UFC (unidades
formadoras de colonias) por m
3
; las concentraciones de bacterias gram negativo que se
han determinado en la mayora de estudios superan las 10
4
UFC/m
3
; en cuanto a
actinomicetos termfilos, se han determinado concentraciones entre 10
5
y 10
8
UFC/m
3
.
Las concentraciones de endotoxinas en aire se hallan en la mayora de estudios
alrededor de 30-40 ng/m
3
aunque en algn caso se han superado los 3000 ng/m
3
.
(Solans X, 1999).

Estas diferencias obtenidas en las concentraciones ambientales de los distintos
microorganismos en los diferentes estudios realizados pueden ser debidas a diferencias
en el tipo de compostaje (ver numeral 5.2.8), pero no hay que descartar que se deban a
variaciones en la estrategia de muestreo y en el mtodo analtico empleado.

En la tabla N1 se muestran los principales microorganismos identificados en muestras
ambientales obtenidas durante el proceso de compostaje de residuos.

Bacterias Hongos Actinomicetos
Acinetobacter Acremonium Actinomyces
Enterobacter Alternaria Nocardia
Escherichia coli Aspergillus flavus Thermoactinomyces
Klebsiella Aspergillus fumigatus Thermomonospora
Pseudomonas Cladosporium
Salmonella Fusarium
Serra tia Geotrichum
Shigella Mucor
Staphyloccus Penicillium
Streptococcus Rhizopus
Yersinia Stachybotrys
Tabla N 1. Principales microorganismos identificados durante el proceso de compostaje. Solans X. 1999

Los microorganismos han adaptado diferentes mtodos para hidrolizar de manera
efectiva la celulosa, lo cual ocurre de forma natural en partculas insolubles o alojadas

27






dentro de polmeros de lignina y hemicelulosa. Los hongos celulticos filamentosos (y
las bacterias actinomicetas) tienen la habilidad de penetrar las sustancias celulosas a
travs sus extensiones, presentando frecuentemente sus sistemas de celulasa en
cavidades confinadas dentro de las partculas celulsicas.

Las bacterias anaerbicas no tienen la habilidad para penetrar efectivamente el material
celulsico y posiblemente tuvieron que encontrar mecanismos alternos para degradar la
celulosa y obtener el acceso a productos de hidrlisis de celulosa en presencia de otros
microorganismos y con limitada disponibilidad de ATP para la sntesis de celulosa.

Los sistemas de celulosa no complejos se tratan primeramente, resaltando los sistemas
de celulasa de los hongos aerbicos filamentosos Tricoderma reesei y Humicola insolens
al igual que los actinomicetes aerbicos de los gneros Cellulomonas y Thermofibida.

Fisiologa de los microorganismos celulolticos.
- Preferencia del sustrato. El amplio rango de diversidad catablica entre los
microorganismos es una de las caractersticas ms notables del mundo microbiano.
- El rango de esta diversidad vara ampliamente dentro de especies individuales, desde
altamente especializadas que pueden utilizar solo uno o unos pocos sustratos como
fuente de energa hasta otras especies altamente verstiles que pueden utilizar ms
de 100 compuestos entre los otros el Carbono.
- Los microbios celulolticos se ubican cerca de la terminacin especializada del
sustrato. Son generalmente degradadores de carbohidrato que no pueden utilizar
protenas ni lpidos (ni sus componentes) como fuente de energa para el
crecimiento.
















Figura 1. Estrategias generales de la hidrlisis de la celulosa y su utilizacin por bacterias aerbicas
(arriba) y anaerbicas (abajo). Lee R. Lynd (2002)

28






La celulosa, los productos de degradacin y las caractersticas celulares no se muestran
a escala. Algunas caractersticas de la estrategia alterna son utilizadas por una o ms
especies. Por ejemplo la celulasa de la Clostridium Stercorarium aerbica es del tipo no
complejo, y miembros de las Cellulomonas
7
, utilizan un tipo de estrategia aerbica para
hidrolizar la celulosa, pero realizan un catabolismo mezclado cido fermento de los
productos hidrolticos


Relacin con l
oxigeno
Gnero Especie
representativa
Reaccin
Gram
Morfologa Temperatura de
Crecimiento
Movimiento
Acidothermus A. cellulolyticus + Bastn Termfila
Bacillus B. pumilis + Bastn Mesfila Flagelar
Caklibacillus C. cellovorans + Bastn Termfila
Cellulomonas C. flavigena, C.
uda
+ Bastn Termfila Flagelar
Cellvibrio C.fulvus, C.
Gilvus
- Bastn Curvo Mesfila Flagelar
Cytophaga C.hutchinsonii - Bastn Mesfila Deslizamiento
Erwinia C.carotovora - Bastn Mesfila No Movimiento
Micronomospora M. chalcae + Bastn
Filamentoso
Mesfila Flagelar
Pseudomonas P. fluorescens
var. cellulosa
- Bastn Mesfila Deslizamiento
Sporocytophaga S. Myxococcoides - Bastn Mesfila
Rhodothermus R. marinus Bastn Termfila No Movimiento
Streptomyces S. reticuli + Bastn
Filamentoso
Mesfila No Movimiento
Aerbico
Thermobifida T. fusca + Bastn
Filamentoso
Termfila
Acetivibrio D. cellulolyticus - Bastn Curvo Mesfila No Movimiento
Anaerocellum D. thermophilum + Bastn Termfila Flagelar
Butyrivibrio B. fibrisolvens + Bastn Curvo Mesfila Flagelar
Caldicellulosirupt
or
C.
saccharolyticum
- Bastn Termfila Flagelar
Clostridium C. thermocellum,
C. cellulolyticum
+ Bastn Termfila,
Mesfila
Flagelar
Eucbacterium E. cellulosolvens + Bastn Mesfila No Movimiento
Fervidobacterium F. islandicum - Bastn Termfila Flagelar
Fibrobacter F. succinogenes - Bastn Mesfila No Movimiento
Halocella H. cellulolytica - Bastn Mesfila Flagelar
Ruminococcus R. albus, R.
flavefaciens
+ Coco Mesfila No Movimiento
Spirochaeta S. Thermophila + Espiral Termfila
Anaerobio
Thermotoga T. neapolitana - Bastn Termfila
Tabla N2. Caractersticas Morfolgicas de las Bacteria celulolticas. (Gonzlez G. 1999)


7
Cellulomonas: Componente de la celulosa, bsico para su degradacin, varan desde 600 K Da hasta 16 M Da y pueden contener
mnimo 13 diferentes protenas catalticas.

29







1.2.6 El proceso de compostaje
El proceso de compostaje se divide en cuatro perodos, atendiendo a la evolucin de
la temperatura:
Mesoflico. El sustrato est a temperatura ambiente y los microorganismos mesfilos
se multiplican rpidamente. Como consecuencia de la actividad metablica la
temperatura se eleva y se producen cidos orgnicos que hacen descender el pH.
Termoflico. Cuando se alcanza una temperatura de 40 C, los microorganismos
termfilos actan transformando el nitrgeno en amonaco y el pH del medio se hace
alcalino. A los 60 C estos hongos termfilos desaparecen y aparecen las bacterias
esporgenas y actinomicetos. Estos microorganismos son los encargados de
descomponer las ceras, protenas y hemicelulosas.
De enfriamiento. Cuando la temperatura es menor de 60 C, reaparecen los hongos
termfilos que reinvaden el compostaje y descomponen la celulosa. Al bajar de 40
C los mesfilos tambin reinician su actividad y el pH del medio desciende
ligeramente.
De maduracin. Es un periodo que requiere 3 meses aproximadamente segn
Leconte M. (2001) a temperatura ambiente, durante los cuales se producen
reacciones secundarias de condensacin y polimerizacin del humus.
Las Condiciones ptimas de iniciacin y finalizacin de un compostaje son:
Caracterstica Fisicoqumica Inicio Fin
Relacin C/N (%) 25 30 10 15
Contenido de Humedad (%) 50 70 40 50
pH 4.0 - 6.0 4.5 5.5
Tabla N 2. Condiciones ptimas de iniciacin y finalizacin de un compostaje. (Ferrer J, 1997, Emison,
2000)


1.2.7 Tcnicas de produccin de compostaje

A continuacin se nombrarn las principales tcnicas de produccin de compostaje
encontrados en la bibliografa:


30






1.2.7.1 Compostaje en montn
Es la tcnica ms conocida y se basa en la construccin de una pila formado por las
diferentes materias primas que deben estar bien mezcladas y homogeneizadas, por
lo que se recomienda una trituracin previa de los restos de cosecha leosos, ya que
la rapidez de formacin del compost es inversamente proporcional al tamao de los
materiales. Cuando los restos son demasiado grandes se corre el peligro de una
aireacin y desecacin excesiva del montn lo que perjudica el proceso de
compostaje.

Es importante que la relacin C/N est equilibrada, ya que una relacin elevada
retrasa la velocidad de humificacin y un exceso de N ocasiona fermentaciones no
deseables. La mezcla debe ser rica en celulosa, lignina (restos de poda, pajas y hojas
muertas) y en azcares (hierba verde, restos de hortalizas y orujos de frutas). Se
mezcla de manera tan homognea como sea posible materiales pobres y ricos en
nitrgeno, y materiales secos y hmedos. El montn debe tener el suficiente
volumen para conseguir un adecuado equilibrio entre humedad y aireacin. El volteo
de la pila es la forma ms rpida y econmica de garantizar la presencia de oxgeno
en el proceso de compostaje, adems de homogeneizar la mezcla e intentar que
todas las zonas de la pila tengan una temperatura uniforme. La humedad debe
mantenerse entre el 40 y 60%. Si el montn est muy apelmazado, tiene demasiada
agua o la mezcla no es la adecuada se pueden producir fermentaciones indeseables
que dan lugar a sustancias txicas para las plantas. En general, un compostaje bien
elaborado tiene un olor caracterstico.(Emison, 2000).
1.2.7.2. Compostaje en silos.
Se emplea en la fabricacin de compost poco voluminosos. Los materiales se
introducen en un silo vertical de unos 2 o 3 metros de altura, redondo o cuadrado,
cuyos lados estn calados para permitir la aireacin. El silo se carga por la parte
superior y el compost ya elaborado de descarga por una abertura que existe debajo
del silo. Si la cantidad de material es pequea, el silo puede funcionar de forma
continua: se retira el compost maduro a la vez que se recarga el silo por la parte
superior. (Emison, 2000)
1.2.7.3. Compostaje en superficie.
Consiste en esparcir sobre el terreno una delgada capa de material orgnico
finamente dividido, dejndolo descomponerse y penetrar poco a poco en el suelo.
Este material sufre una descomposicin aerobia y asegura la cobertura y proteccin
del suelo, sin embargo las prdidas de N son mayores, pero son compensadas por la
fijacin de nitrgeno atmosfrico.(Emison, 2000).


31






1.2.8. TI POS DE COMPOSTAJ E
El compostaje se clasifica de acuerdo al origen de sus materias primas y a la poca
en la que se aporta a la tierra y el cultivo as se distinguen los siguientes tipos.
1.2.8.1 Materia Prima
De maleza. El material empleado es vegetacin de sotobosque, arbustos, etc.,
excepto conferas, zarzas, cardos y ortigas. El material obtenido se utiliza
generalmente como cobertura sobre la superficie del suelo (acolchado o
mulching).
De maleza y broza. Similar al anterior, pero al que se le aade broza (restos de
vegetacin muertos, evitando restos de especies resinosas). Es un compost de
cobertura.
De material vegetal con estircol. Procede de restos de vegetales, malezas, plantas
aromticas y estircol de quidos o de pequeos rumiantes. Este tipo de compost se
incorpora al suelo en barbecho, dejndolo madurar sobre el suelo durante varios
das antes de incorporarlo mediante una labor.
De material de origen industrial. Procede de subproductos de extractos vegetales de
la industria farmacutica, la destilacin de vegetales para la fabricacin de licores,
de la cscara y residuo de diferentes productos de origen agrcola como la papa y
otros tubrculos, residuos de caf, subproductos de la industria del vino, de la
cerveza y del aceite, lodo de depuradoras biolgicas de industrias agro-alimentarias,
filtros deteriorados de industrias alimentarias, lodos de depuradora de industrias
variadas, papeleras, etc, subproductos de aserraderos
Compostaje tipo Quick- Return. Est compuesto por restos vegetales, a los que se
les ha aadido rocas en polvo, cuernos en polvo, algas calcreas, activador Quick
Return, paja y tierra.
Compostaje activado con levadura de cerveza. Es una mezcla de restos vegetales,
levadura fresca de cerveza, tierra, agua tibia y azcar.
1.2.8.2 Segn la poca
Compostaje maduro. Es aquel que est muy descompuesto y puede utilizarse
para cualquier tipo de cultivo pero para cantidades iguales tiene un valor
fertilizante menos elevado que el compostaje joven. Se emplea en aquellos
cultivos que no soportan materia orgnica fresca o poco descompuesta y como
cobertura en los semilleros.
Compostaje joven. Est poco descompuesto y se emplea en el abonado de
plantas que soportan bien este tipo de compostaje (papa, maz, tomate, pepino o

32






calabaza).
La elaboracin de compostaje est indicada en los casos en que la
transformacin de restos de cosechas en el mismo lugar es complicada, debido a
que:
Existe una cantidad muy elevada de restos de la cosecha anterior, que
dificultan la implantacin del cultivo siguiente.
Se trata muchas veces de residuos muy celulsicos, con una relacin C/N
alta, lo que se traduce en un bloqueo provisional del nitrgeno del suelo.
Se trata de suelos con escasa actividad biolgica y en los que el proceso
de humificacin va a resultar lento.


1.3. TRANSFORMACI ONES BIOLGI CAS CON RESI DUOS DE PAPA

Los residuos de papa se estn utilizando como ensilaje en Colombia. Se han realizado
numerosos ensayos, teniendo xito el ensilaje producido a partir de una mezcla de
diversas materias primas con residuos de papa.
Una de las formas de utilizar los tubrculos afectados por esta y otras plagas, es la
elaboracin de ensilaje, a partir de una mezcla en capas sucesivas de papa de desecho,
con pasto, tamos o torta de palmiste y la adicin de melaza o azcar morena, que se
descomponen en un medio anaerbico, sin daarse. (FEDEPAPA, 2001)
El objetivo fundamental del ensilaje es preservar por largo tiempo, en lo posible, todos o
la mayor parte de los nutrientes originales de los materiales frescos, especialmente los
energticos y los proticos, mediante la conservacin, basada en un mtodo de
fermentacin en ausencia de oxgeno.

1.4. ACTIVIDAD ENZI MATI CA CELULOL TICA

Para describir el estudio de la actividad enzimtica celuloltica es preciso conocer los
siguientes tems:

1.4.1.Sustrato

Celulosa: La celulosa es un polisacrido estructural en las plantas ya que forma parte de
los tejidos de sostn. La pared de una clula vegetal joven contiene aproximadamente
un 40% de celulosa; la madera un 50 %, mientras que el ejemplo ms puro de celulosa

33






es el algodn con un porcentaje mayor al 90%.


A pesar de que est formada por glucosas, el hombre no puede utilizar a la celulosa
como fuente de energa, ya que no cuenta con la enzima necesaria para romper los
enlaces -1,4-glucosdicos, sin embargo, es importante incluirla en la dieta humana
(fibra diettica) porque al mezclarse con las heces, facilita la digestin y defecacin.
En el intestino de los rumiantes y otros herbvoros, existen microorganismos que atacan
al enlace -1,4-glucosdico y al hidrolizarse la molcula de celulosa quedan disponibles
las glucosas como fuente de energa.

La celulosa constituye la materia prima del papel y de los tejidos de fibras naturales.
Tambin se utiliza en la fabricacin de explosivos, celuloide, seda artificial, barnices.


Estructura de la Celulosa: La estructura de la celulosa se forma por la unin de
molculas de -glucosa a travs de enlaces -1,4-glucosdico, lo que hace que sea
insoluble en agua. Larga cadena polimrica de peso molecular variable, con frmula
emprica (C
6
H
10
0
5
)
n
, con un valor mnimo de n= 200.(es.wikipedia.org).

Estructura de la celulosa















Figura 2. Estructura de la celulosa. (es.wikipedia.org)
1.4.2.Enzima Celulasa

Las celulasas son enzimas hidrolticas que participan en el rompimiento de los enlaces
glicosdicos-1,4 presentes en los polisacridos celulosa y hemicelulosa,
respectivamente. El inters por las celulasas empez alrededor de los aos 50 debido a
su enorme potencial para convertir la lignocelulosa en glucosa y azcares solubles. Cabe

34






sealar que la lignocelulosa es la fuente de energa renovable ms abundante de la
tierra. Est formada por tres componentes principales que son: celulosa, hemicelulosa y
lignina, y su contenido es bajo en cenizas, protenas, grasas y ceras.
Las celulasas son producidas por una gran variedad de microorganismos entre los que
se encuentran hongos y bacterias. La mayora de los microorganismos celulolticos son
capaces de producir celulasas. La produccin microbiana de estas enzimas est sujeta a
diferentes mecanismos de regulacin. A partir de los estudios realizados tanto en
hongos como bacterias se ha propuesto un modelo general de regulacin controlado por
dos mecanismos principalmente. Por un lado, la induccin que se lleva a cabo por sus
sustratos naturales celulosa para las celulasas y por otro la represin por fuentes de
carbono de bajo peso molecular como glucosa y celobiosa.

El trmino celulasas involucra un complejo de, por lo menos, tres actividades diferentes,
las que a su vez existen en una multiplicidad de formas para llevar a cabo la hidrlisis
total de la celulosa. De esta manera las endo--1,4-glucanasas rompen al azar los
enlaces internos de la molcula en las regiones amorfas, producen un rpido
decremento en la longitud de la cadena y un lento incremento de los grupos reductores
libres. Las exo--1,4-glucanasas remueven unidades de glucosa o celobiosa a partir del
extremo libre no reductor de la cadena de celulosa, dando como resultado un
incremento rpido en los azcares o grupos reductores y poco cambio en el tamao del
polmero. Finalmente la -glucosidasa hidroliza la celobiosa producida por las actividades
anteriores, dando como producto final la glucosa.(Ponce, Prez, 2002).

1.4.3.Actividad Enzimtica Celuloltica

La elevada especificidad de las reacciones enzimticas es sensible a los cambios
estructurales de los sustratos celulsicos. La investigaciones realizadas en este campo
(Focher B. 1991, Beltrame P. 1982, Bhatawdekar S. 1992, Puri V. 1984) demuestran que
la temperatura, tipo de enzima, mohos y propiedades fisicoquimicas (pH, humedad,
C/N, cenizas, fibra,..), de diversos sustratos celulsicos, influyen en el desarrollo del
proceso de degradacin enzimtica.

La actividad cataltica de la enzima depende tanto de su capacidad de adsorcin sobre el
sustrato, como de la formacin del complejo activo enzima sustrato. Este ltimo
aspecto estar controlado por aquellos factores que afectan la accesibilidad del sustrato
(Lee S. 1982, Ooshima H. 1983) (temperatura, tiempo de exposicin,..), las
caractersticas de la protena enzimtica (Klyosov A. 1986, Rabinovich M. 1983), a las
concentraciones relativas de enzima y sustrato.

Para el desarrollo y estudio de la actividad enzimtica de sustratos celulsicos se deben
considerar cuatro factores relevantes: la estructura y propiedades fisicoquimicas del
sustrato celulsico, las propiedades y modo de accin de la enzima celulasa, el modo de

35






interaccin entre las molculas de enzima y celulosa y las condiciones del medio del
sistema reaccionante. Los aspectos particulares de cada uno de ellos se desarrollan a
continuacin.
1.4.3.1. Estructura del Sustrato Celulsico

Los residuos de papa estn constituidos bsicamente por regiones mas o menos
ordenadas y regiones aformas. Modificaciones en la naturaleza de estos residuos
producen cambios en la reactividad, propiedades de adsorcin, y accesibilidad de la
enzima (Wald S. 1984, Eigner W. 1985). Por lo tanto la actividad enzimtica se estudiar
por medio de los factores que afectan directamente al sustrato como lo son las
temperaturas de exposicin y el tipo de tratamiento.

1.4.3.2.Propiedades y medio de accin de las celulasas

Las celulasas son protenas derivadas de los procesos naturales de fermentacin,
capaces de degradar la celulosa. En realidad una enzima de celulasa es una mezcla de
diversos componentes enzimticos, formndose lo que se denomina un complejo
enzimtico, que acta de forma sinrgica en la degradacin de la celulosa (Enari T.
1987). Este complejo enzimtico esta formado por dos tipos de enzima: Endogluconasas
(EGs) o endocelulasas, (-1,4-D-glucan 4-glucanohidrolasa), Celobiohidrolasas (CBHs) o
exocelulasas (1,4-D-glucancelobiohidrolasa) y -glucosidasa (BGs) o celobiasa (-D-
glucosidoglucohidrolasa).
Mediante un mecanismo de hidrlisis cataltica, (Walker L. 1991, Goyal A. 1991) todos
los componentes de las celulasas producen la ruptura del enlace -1,4-glicosidico del
polmero celulsico, aunque cada uno de ellos acta de forma especifica. Las
investigaciones actuales proponen el mecanismo de reaccin (Van Ee. 1990) que se
muestra en la siguiente figura:












Figura 3. Mecanismo de Hidrlisis de la Celulosa. Gonzlez G (1999)

36






La primera etapa consiste en la degradacin hidroltica de las regiones amorfas por
medio de las endoglucanasas (EGs), que ataca el enlace -1,4-glicosdico de las regiones
amorfas del polmero de celulosa, produciendo mltiples cadenas de polmeros de
diversas magnitudes. En la etapa siguiente actan las celobiohidrolasas (CBs) o
exoglucanasas, cuya accin se limita al extremo, no reductor de la cadena, presentando
una elevada actividad frente a la celulosa amorfa y dando como producto celobiosa
(dmero -1,4-glucosa). Esta enzima presenta gran afinidad por la celulosa, por lo que
tambin degrada lentamente las cadenas terminales no reductoras de las regiones
cristalinas accesibles del polmero, produciendo celobiosa. Finalmente las - glucosidasas
hidrolizan las cadenas de celobiosa y celooligosacridos solubles produciendo glucosa.
Este proceso no solo completa la degradacin de celulosa, sino que elimina la
acumulacin de celobiosa que actuara como inhibidor de las celobiohidrolasas en la
segunda etapa del mecanismo de hidrlisis. Investigaciones han constatado segn
Gonzlez G. (1999) que la hidrlisis enzimtica se produce por medio de un mecanismo
de catlisis cida que se ha esquematizado en la figura 4. Este proceso consiste en la
hidrlisis del enlace -1,4-glicosdico. El mecanismo envuelve la donacin de un protn
al enlace, por medio del grupo carboxlico del cido glutmico residual, produciendo la
rotura del enlace y la estabilizacin del carbocatin intermedio formado por medio de un
grupo nucleoflico por medio de una molcula de agua, obtenindose los productos
finales de hidrlisis. En funcin de carbocatin intermedio formado, la configuracin del
tomo de carbono en el producto puede ser retenida o invertida. El proceso
normalmente se interpreta como un mecanismo cataltico de simple o doble
desplazamiento, dependiendo de si la configuracin es invertida o retenida,
respectivamente. El producto intermedio es hidrolizado por una molcula de agua. El
resultado de esta segunda sustitucin nuclefila genera un producto de la misma
estereoquimica que el sustrato. En el mecanismo de inversin, la protonacin del
oxgeno glicosdico (activado por la base) es acompaando de una ataque simultaneo de
la molcula de agua. Se produce un mecanismo de desplazamiento simple que produce
la inversin estereoquimica en el producto.












Figura 4. Mecanismos de desplazamiento doble en la hidrlisis enzimtica del enlace -1,4-glicosdico: a)
retencin de configuracin, b) inversin de configuracin. Gonzlez G. (1999).

37






1.4.3.3. Interaccin Enzima Sustrato

Como la celulosa es un sustrato insoluble, sus caractersticas cinticas difieren
sustancialmente de las usuales reacciones homogneas catalizadas por enzimas. En este
caso la hidrlisis enzimtica se produce en medio heterogneo y envuelve las siguientes
etapas (figura 4):a) transferencia de las molculas de enzima (E) de la solucin acuosa
a la superficie de sustrato de celulosa (S), b) formacin del complejo enzima - sustrato
(ES), previa adsorcin de las molculas de enzima sobre la celulosa, c) transferencia de
las molculas de agua hacia los centros activos del complejo (ES), d) reaccin en la
superficie del sustrato y transferencia de los productos solubles (P), glucosa y celobiosa,
desde la superficie de la celulosa hasta el bao acuoso, e) descomposicin de las
cadenas de celobiosa en glucosa por medio de -glucosidasas.





















Figura 5. Interaccin Enzima Sustrato. Gonzlez G. (1999).
1.4.3.4.Influencia del medio de reaccin

La especificidad de la catlisis hace que para el caso de la celulasa utilizada para el
tratamiento enzimtico, las condiciones optimas de pH y temperatura sea de 5-6 y 45-
70C, respectivamente, variando en funcin del tipo de enzima comercial utilizado. Por
lo tanto, la efectividad y reproductibilidad del tratamiento depender enormemente del
control de estas dos variables. Por este motivo es recomendable el uso de soluciones
tampn, que modifican la fuerza inica del medio, produciendo diferentes efectos sobre
la hidrlisis.

38






1.4.4.Cintica de hidrlisis Enzimtica

Como la celulosa es un sustrato insoluble, sus caractersticas cinticas difieren
sustancialmente de las usuales reacciones homogneas catalizadas por enzimas. La
hidrlisis de un sustrato insoluble de celulosa requiere la adsorcin previa de la enzima
sobre el mismo. El proceso de adsorcin previa de la enzima sobre el mismo. El proceso
de adsorcin/desorcin puede ser descrito segn:



Donde: E, representa la concentracin de enzima, S la del sustrato, (ES)ad, la
concentracin de enzima adsorbido sobre el sustrato, y k1, k2, son las constantes para la
adsorcin y desorcin, respectivamente. Esta etapa de adsorcin ha sido modelada, por
numerosos autores, por medio de la isoterma Langmuir o por modificaciones de esta
(Lee Y. 1982, Steiner W. 1988, Stuart J. 1985). Si se considera la relacin k1/k2 igual a
la constante de adsorcin k12, el modelo de Langmuir puede escribirse:






Donde: Ead, representa la concentracin de enzima adsorbido en el equilibrio, Esat, la
cantidad de enzima adsorbido a saturacin y Ef, la concentracin de enzima libre en
disolucin en el equilibrio.

La ecuacin de Michaelis Menten asume que la formacin del complejo enzima -
sustrato (ES) es un requisito previo para la reaccin enzimtica:






Donde: ka y ka, representan las constantes directa y reversible del complejo activado,
respectivamente, kb, la velocidad de reaccin y P el producto de reaccin.

Si la relacin enzima/sustrato es pequea y las concentraciones de sustrato estn
comprendidas entre los limites de saturacin, la velocidad de reaccin inicial (v) puede
expresarse:

Donde: Vm, representa la velocidad mxima de reaccin (a saturacin de enzima) y km,

39






la constante media de saturacin (Km =( ka + kb)/ ka)







La aplicacin de la ecuacin clsica de Michaelis- Menten permite calcular los
parmetros de velocidad mxima de hidrlisis a saturacin (Vmx) y la constante media
de saturacin (km), que proporcionan informacin til sobre el mecanismo de hidrlisis.
Sin embargo tal y como propone Bailey J. (1989), si se tiene en cuenta que la reaccin
se produce en un slido hidratado, en el que es prcticamente imposible cambiar la
concentracin de los lugares especficos del sustrato, parece ms conveniente
establecer la velocidad de hidrlisis funcin de la concentracin de enzima que en
funcin de la concentracin de sustrato, tal y como lo expresa la ecuacin de Michaelis
Menten. Adems, teniendo en cuenta que el efecto sinrgico del complejo enzimtico
desaparece a altas concentraciones de enzima (Woodward J. 1988), como las utilizadas
normalmente en el mbito industrial, parece apropiado expresar la velocidad de
reaccin en funcin de la concentracin de enzima.

De forma anloga a la ecuacin propuesta por Michaelis - Menten se puede calcular
una velocidad mxima de hidrlisis a saturacin (Vemx) y una constante media de
saturacin (ke), segn la siguiente ecuacin:






Donde:
vo = Velocidad inicial de Hidrlisis
Vemx = Velocidad mxima de hidrlisis a saturacin
Ke = Constante media de saturacin
[Eo]= Concentracin inicial de enzima

La modelizacin de cintica de hidrlisis, incluyendo la etapa de adsorcin de la enzima,
ha ocupado un gran numero de trabajos entre los que podemos destacar los de:
Converse y colaboradores (1988), Lee y Fan (1983), Holtzaple y colaboradores (1983), y
Nideztky y Steiner (1993). Todos estos modelos asumen que la velocidad inicial de
hidrlisis es proporcional a la concentracin del complejo enzima sustrato formado.



40













CAPI TULO I I

2. MATERI ALES Y METODOLODIA

En este captulo se describen los materiales y mtodos utilizados en este proyecto para
cumplir los objetivos.

2.1 MATERI ALES
2.1.1 Residuos generados en el procesamiento industrial de Papa R-12

Estos residuos constituyen el sustrato para tres de los tratamientos que se explicarn
mas adelante.
Residuos de papa (Solanum tuberosum L.) variedad R-12 provenientes de la empresa
Congelagro, ubicada en Bogot en la Tr 64 42C - 70 S. Estos residuos se obtienen de
cuatro etapas diferentes del proceso; a los cuales se les ha nombrado de acuerdo al
orden de salida en la planta procesadora:
Torta de filtro prensa (T)
Fotografa N1.Torta Filtro Prensa. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad de Ingeniera.
Universidad de la Sabana. 2004

41







Residuos del filtro parablico (R)
Fotografa N2. Residuos Filtro Parablico. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad de Ingeniera.
Universidad de la Sabana. 2004

Cascarilla de pelado (C)
Fotografa N3. Cascarilla de Pelado. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad de Ingeniera.
Universidad de la Sabana. 2004





42








Slivers (S)

Fotografa N4. Slivers. Laboratorio de Operaciones Unitarias. Facultad de Ingeniera. Universidad de la
Sabana. 2004

2.1.2 Carboximetilcelulosa

Para el desarrollo de este proyecto la carboximetilcelulosa se utiliza como sustrato
blanco o patrn. Es un sustrato polisacrido especfico para determinar la accin
cuantitativa de la enzima celulasa. Polmero resultante de la reaccin del monocloro
acetato sdico con una disolucin alcalina de celulosa, caracterizado por la presencia de
grupos OCH2COONa unidos a las cadenas de la celulosa. Es un polvo blanco, soluble
en agua e insoluble en alcohol, acetona, ter y benceno.

2.1.3 Enzima Comercial

La enzima utilizada corresponde a un preparado comercial de celulasa suministrada por
Novozymes A/S, con la denominacin comercial Celluclast 1.5L (Alcohol/2002-21774-
01.pdf). Celluclast 1.5L es un producto liquido de celulasa producido por fermentacin
sumergida de una cepa seleccionada del hongo Trichoderma reesei. La enzima fue
utilizada en su forma comercial, es decir, sin purificacin previa. Las especificaciones
comerciales del producto enzimtico son las siguientes:




43








IDENTIFICACION
Nombre Comercial Celluclast 1.5L
Descripcin Preparacin Enzimtica Liquida
Aspecto Liquido Marrn
Sociedad Responsable Novozymes A/S
Tabla N4. Identificacin Enzima, Gonzlez G. (1999) Ficha Tcnica Celluclast


Informacin sobre los componentes:

COMPONENTES
Naturaleza Qumica Protena Enzimtica
Denominacin Celulasa
Componentes Peligrosos Protena Enzimtica (10-40%)
Clasificacin Xn (nocivo), R-42
Limite de Exposicin No establecido
Tabla N5. Componentes Enzima, Gonzlez G. (1999) Ficha Tcnica Celluclast

Condiciones ptimas de Trabajo:

CONDICIONES PTIMAS
Rango de pH 4.5- 6.0
Temperatura 45 60 C
Tabla N5. Condiciones Optimas Enzima, Gonzlez G. (1999) Ficha Tcnica Celluclast

2.1.4. Reactivo Azul Coomassie.

Prueba de Coomassie basados en la tincin de protenas

El uso del tinte de Coomassie G - 250 en un reactivo colorimtrico para la deteccin y
cuantificacin de la protena total, fue descrito originalmente por el Doctor Marion
Bradford en 1976, posteriormente se utiliz la prueba de protena de Coomassie
(producto N 23200) y la prueba de protena de Coomassie Plus (producto N 23236),
los cuales son modificaciones del primero. Y la ltima prueba utilizada es la de placas
de Coomassie para protena seca.

Qumica de la prueba de Coomassie en protena

En el ambiente cido del reactivo, la protena (enzima) se liga al tinte de Coomassie.

44






Esto da como resultado un cambio espectral de rojo/caf del tinte (absorbancia mxima
de 465 nm) hasta la forma azulosa del tinte (absorbancia mxima de 610 nm) (figura
4). La diferencia entre las dos formas del colorante es mayor a 595 nm, de tal manera
que esta la longitud de onda ptima para medir el color azul en el completo de protena
seca de Coomassie. Si se desea el color azul puede ser medido entre 575 nm y 615 nm.
A los dos extremos (575 nm y 615 nm) hay una prdida del 10 % de la cantidad de
color medida (absorbancia) comparado con el dato que se obtiene cuando se mide a
595 nm.







Figura 6. La reaccin esquemtica para la prueba de Coomassie en protena (la prueba de protena de
Coomassie, la prueba de protena de Coomassie Plus y la prueba de placas de Coomassie para protena
seca)

El desarrollo del color en estas pruebas a sido asociado con la presencia de ciertos
aminocidos bsicos (arginina, licina y histidina) existentes en la protena
(estructuralmente de la enzima a estudiar). Las fuerzas de Van der Waals y las
interacciones hidrofbicas tambin participan en el enlace de la protena. El nmero de
cromforos Coomassie que se ligan a cada molcula de protena es aproximadamente
proporcional al nmero de cargas positivas encontradas en la protena. Los aminocidos
libres, los pptidos y las protenas de bajo peso molecular no producen color con los
reactivos del tinte Coomassie. En general, la masa de un pptido o de una protena

45






debe contener mnimo 3000 daltons para ser sometida a la prueba con este reactivo. En
algunas aplicaciones esto puede ser una ventaja. La prueba de protena de Coomassie
ha sido utilizada para medir "protenas de alto peso molecular" durante la fermentacin
en la industria de la cerveza

Ventajas de la prueba de Coomassie en protenas

Las pruebas de enlace de Coomassie son las ms rpidas y las ms fciles de realizar.
La prueba se realiza a temperatura ambiente y no se requiere equipo especializado.
Bien sea para la prueba de protena de Coomassie o la prueba de protena de
Coomassie Plus, la muestra se agrega al tubo que contiene el reactivo y el color azul
resultante se mide a 595 nm despus de un breve periodo de incubacin a temperatura
ambiente. Para la prueba de placas de Coomassie para protena seca, la muestra se
adiciona directamente al deposito que contiene el reactivo seco. Despus de mezclar
vigorosamente se lee la placa inmediatamente a 595 nm.

Caractersticas Generales de la prueba de Coomassie en protenas

Los ensayos de Coomassie para protena comparten varias caractersticas. La prueba de
protena de Coomassie produce una curva estndar no lineal. La prueba de placas de
Coomassie para protena seca tambin produce una curva estndar no lineal, pero bajo
un rango bajo de trabajo. La prueba de protena de Coomassie Plus es la nica que
tiene la ventaja de producir una curva lineal estndar en un rango total de trabajo.
Cuando se utiliza suero de albmina bovino (BSA) como el estndar, la prueba de
protena de Coomassie Plus es lineal de 125 g/ml a 1000 g/ml.

2.2. METODOLOG A

En este apartado se describen los mtodos que se desarrollaran en el proyecto.

2.2.1. Estandarizacin del sustrato

Como se especific en la revisin bibliogrfica, para iniciar el proceso de compostaje se
parte de unas condiciones ptimas (%Humedad, C/N, pH) de inicio. Por esta razn se
tom como referencia la caracterizacin fisicoqumica de los cuatro residuos
procedentes de la planta, reportada por Congelagro S.A (ver Tabla N7), con el fin de
realizar un balance de materia, para obtener una relacin C/N de 27 y una humedad del
55%.


Caracterizacin de los cuatro residuos de la planta. Los datos reportados se encuentran
en base hmeda y se presentan con las respectivas desviaciones obtenidas al realizar
los triplicados por cada determinacin.


46











Caracterizacin Fisicoqumica de los residuos a tratar
Congelagro. S.A
Residuo Humedad
(%)
Cenizas
(%)
Nitrgeno
(%)
COT
(%)
pH
Cascarilla de papa 88.04
S = 0.28
1.07
S = 0.03
0.39
S = 0.01
3.58
S = 0.013
4.13
S = 0.04
Slivers Desecho 78.74
S = 1
0.47
S = 0.01
0.24
S = 0.01
9.31
S = 0.21
6.0
S = 0.05
Torta Filtro
prensa
53.81
S = 0.06
2.32
S = 0.01
0.66
S = 0.01
18.87
S = 0.19
3.78
S = 0.03
Residuo Filtro
parablico
88.54
S = 0.14
0.53
S = 0.03
0.25
S = 0.01
4.93
S = 0.22
5.97
S = 0.02
Tabla N7.Datos Fisicoqumicos Residuos Congelagro S.A

2.2.1.1 Adecuacin del Sustrato

A partir de los datos obtenidos en el balance de materia se realiza la mezcla y
preparacin del sustrato inicial (residuo de papa balanceado), que consiste en triturar
los residuos cuyos pedazos eran muy grandes (slivers y residuos) en la picadora Black
and Decker, debido a que una mezcla de partculas finas y largas como el sustrato inicial
tienen elevada relacin rea/volumen y si no se empacan tienen espacios huecos, lo que
afectara la aireacin y el proceso de compostaje.
Los residuos se pesan y se mezclan con los dems, obteniendo como resultado una
mezcla homognea, muy hmeda y de un olor caracterstico, no ftido.
A este sustrato inicial se le determina la humedad, con el fin de conocer las condiciones
iniciales del sustrato,(H=73.01%). Fue necesario disminuirla y por esta razn el
sustrato se someti a un prensado que consisti en tomar el residuo y envolverlo en una
tela absorbente, a la cual se le realiz la mayor presin posible manualmente, con el fin
de que el agua retirada pasara por la tela y el residuo se fuera secando. Terminado el
prensado, se determin la humedad (H=68.59%).
Se mide el pH con el fin determinar si este se encuentra dentro del rango de las
condiciones iniciales (5-8) con las cuales se podra iniciar el proceso de compostaje, este
es de 5.
Se caracteriza nuevamente este sustrato para determinar la relacin C/N, la humedad y
pH (ver numeral 2.2.3).




47











Los datos obtenidos fueron:

Caracterizacin del sustrato balanceado
Parmetro Fisicoqumico Mezcla inicial para el compostaje
% COT (Carbono orgnico total) (BH) 15.95
% Nitrgeno (BH) 0.57
Relacin C/N (%) 27.92
Humedad (%) 68.59
pH 5
Tabla N 8. Caracterizacin del sustrato balanceado. 1 rplica por prueba.

Se obtienen 4 Kg de sustrato, los cuales se reparten en bolsas de polietileno de alta
densidad, cada una con 300g, las cuales se congelan con el fin de que las condiciones
iniciales del sustrato (C/N, Humedad y pH) no presenten variacin alguna y se cuente
con la cantidad suficiente de residuo para realizar el total de los ensayos.

Fotografa N5 y 6. Sustrato Balanceado


48






2.2.2 Mtodos Microbiolgicos
A continuacin se describen las dos metodologas microbiolgicas utilizadas para la
preparacin de uno de los tratamientos. (sustrato +cepa madre)


2.2.2.1 Obtencin de Cepa Madre

Se realiza una siembra a partir del sustrato, con el fin de crear un medio de crecimiento
para los microorganismos que pudieran crecer y de esta forma identificarlos
morfolgicamente.
Esto se realiza mediante la metodologa de diluciones seriadas que consiste en pesar
10g del sustrato e introducirlos en una bolsa, agregarle 100ml de agua de peptona
esterilizada, e introducirla en el equipo Stomacher, (modelo 400) donde la muestra es
homogeneizada, por dos paletas que actan sobre la bolsa mezclando la muestra, sin
tener un contacto directo con ella.
En cmara de flujo laminar, con pipetas de 10 ml estriles se realizaron diluciones de
10
-1
y 10
-2
, en tubos de ensayo para realizar la siembra en agar PDA con un asa de
siembra estril, donde se mantienen en estufa a 35C durante 5 das.

2.2.2.2 Separacin de Cepa Madre

Se realiza una nueva siembra realizada a partir de la cepa madre que creci en el agar
PDA con el fin de separar el hongo y replicarlo en un medio ms selectivo donde pueda
presentar mayor crecimiento, es decir un medio de cultivo para aislamiento (Vilches P,
2000).

Medio mnimo czapeck:
NaNO3
KH2PO4
KCL
MgSO47H2O
FeSO47H2O
Agua Destilada

Para fuente de nutrientes, se utiliz aserrn molido que tuvo un tratamiento previo que
consisti en sumergir 5g en una solucin de HCL al 5% durante 24 horas para
posteriormente unirlo con el medio czapeck. Una vez el medio estuvo listo se tom un
asa de siembra estril y se introdujo en el agar que contena el hongo en las partes
donde presentaba mayor crecimiento, tomando una pequea cantidad para sembrarla
inmediatamente en el medio czapeck con aserrn, que se mantuvo en estufa a 35C
durante 5 das.

49







A los cinco das, la cepa madre se obtiene haciendo un lavado con agua de peptona al
medio czapeck que contiene la cepa, y seguido de esto a esa agua que resulta del
lavado se le hace un filtrado con un filtro a vaco esterilizado.
Lo que queda en el papel - filtro, es la cepa madre que posteriormente ser pesada y
aadida a uno de los tratamientos.


2.2.3 Mtodos Fisicoqumicos

En el siguiente apartado se describirn las metodologas utilizadas para las
determinaciones fisicoquimicas.

2.2.3.1 Determinacin del pH

Mtodo Oficial: Norma AOAC 10.030
Las principales ventajas del mtodo potenciomtrico son su aplicabilidad a soluciones
turbias, florecentes o opacas o coloreadas o cuando sean inaplicables o no se puedan
obtener indicadores visuales adecuados.
El electrodo de vidrio, en realidad un electrodo de membrana, esta compuesto de un
bulbo de paredes delgadas de vidrio responsivo al pH sellado a un vstago, no
responsivo al pH de vidrio de alta resistencia de esta manera, la respuesta al pH se
confina totalmente al rea de la membrana de vidrio, especialmente eliminando
cualquier variacin causada por la profundidad de inmersin.
Ambas superficies de la membrana de vidrio son responsivas del pH, los cambios en el
potencial de electrodo de la superficie externa de la membrana, se miden por medio de
un electrodo de referencia externo.
8


Materiales y Equipos
Potencimetro Metrohm modelo 691
Balanza Analtica Mettler con aproximacin 0.1g
Licuadora
Vaso precipitado de 200ml
Probeta de 100 ml
Agua Destilada
Equipo de Filtracin a vaco

Procedimiento
Pesar 2g de muestra en la Balanza analtica


8
Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. American Public Health Association, American Water Works
Association, Water Pollution Control Federation. 19ed., New York, 1995.


50






Realizar un licuado con 100ml de agua destilada hervida fra
Pasar a un vaso precipitado y realizar la filtracin a vaco con el fin de separar las
partculas slidas y dejar la muestra liquida
Realizar la medicin del pH en el potencimetro

Esta determinacin se realiz en todos los ensayos para todos los tratamientos (1, 2 y
3) a todas las temperaturas. El tratamiento 4 por tratarse de una muestra liquida se
realiz la lectura directamente en el potencimetro sin ningn procedimiento previo.

2.2.3.2.Determinacin de Humedad

Mtodo Oficial: Norma AOAC 925.10
Mtodo por desecacin en estufa: Implica la deshidratacin de la muestra hasta peso
constante a temperaturas y presiones adecuadas al tipo de muestra. Se fundamenta
entre la diferencia entre la pesada inicial y final de la muestra secada a temperatura
constante.
9


Materiales y Equipos
Estufa marca Shaker (Ifalpac)
Balanza Analtica Sartorius con aproximacin 0.1mg
Cpsulas de Porcelana
Pinzas
Desecador


Procedimiento
Secar cpsulas de porcelana durante 1 hora en estufa
Ponerlas en el desecador durante 30 minutos
Pesar cada cpsula y se le agregar 2 gramos de la muestra a analizar
Registraba el peso inicial
Secar en estufa a 105C durante tres horas la cpsula con la muestra
Pasar la cpsula con la muestra de nuevo al desecador durante 30 minutos
Pesar y registrar el peso para poder hacer el clculo del agua retirada durante el
proceso de secado.

2.2.3.3 Determinacin Carbono Orgnico Total

Mtodo Oficial: Norma AOAC 967.05
Se considera el Carbono Orgnico Total como el proveniente de cualquier estructura
orgnica, en este caso el sustrato. El mtodo utilizado para esta prueba fue el de


9
Tomado de la Ficha Tcnica de la estufa desecadora.

51






Walkley Black, que para su determinacin la muestra se oxida con cido crmico en
presencia de un exceso de cido sulfrico concentrado.
10



Materiales y Equipos
Balanza Analtica Sartorius con aproximacin 0.1mg
Vasos Precipitados de 500ml
Bureta de 10 ml
Estufa

Reactivos
Dicromato de Potasio
Difenilamina
Acido Sulfrico Concentrado
Sulfato Ferroso Amoniaco
Agua Destilada


Procedimiento
Preparacin de la Solucin Dicromato de Potasio 1N
- Secar el dicromato de Potasio en estufa a 105C por dos horas
- Disolver 12.26g de Dicromato seco en 200ml de agua ozonizada y completar el
volumen a 250 ml en un baln aforado adicionando agua destilada.

Preparacin Solucin Indicadora
- Pesar 0.025g de difenilamina y se disolver en 100ml de cido sulfrico
concentrado.

Preparacin Sulfato Ferroso Amoniacal 0.5N (Solucin Tituladora)
- Disolver 196.07g de sulfato ferroso amoniaco en 900ml de agua destilada y
completar el volumen hasta 1L.

Mtodo
- Secar las muestras a analizar (muestras de los tratamientos 1, 2 y 3) en estufa a
105C durante tres horas
- De la muestra seca pesar 0.05 g y adicionar 10ml de la solucin de dicromato de
Potasio 1N
- Adicionar 20ml de cido sulfrico concentrado
- Agitar manualmente durante 1 minuto y se dejar reaccionar durante 30 minutos.
- Agregar 200ml de agua destilada, 10 ml de cido fosfrico concentrado y cinco
gotas de la solucin indicadora


10
Tomado de Mtodos de Ensayo, Determinacin del Carbono Orgnico Total, Laboratorio de Investigacin, Facultad de Ingeniera,
Universidad de la Sabana. 2002.

52






- Realizar una titulacin con la solucin de sulfato ferroso amoniacal 0.5N hasta
que se obtener una coloracin verde brillante, que se observa fcilmente debido
a que el color vira lentamente del marrn al azul violeta, el punto final es un paso
brusco del azul violeta al verde brillante.
- Paralelamente, preparar un blanco de reactivos y titular con la misma solucin
hasta obtener el mismo color.

Clculos

Los clculos se expresaron en porcentaje de carbono orgnico total segn la
siguiente ecuacin:

% COT= (A-B)*N*0.012*100
Peso de la Muestra*4

Donde A es el volumen de la titulacin de la muestra, B es el volumen de titulacin del
blanco y N es la normalidad de la solucin tituladora, que en este caso es 0.5 N
(Solucin sulfato Ferroso Amoniacal).
2.2.3.4 Determinacin contenido de Nitrgeno

Mtodo Oficial: Kjeldahl AOAC 955.04

Muchos compuestos nitrogenados, calentados con cido sulfrico concentrado a
elevadas temperaturas y en presencia de un catalizador, se descomponen con
formacin de amoniaco, que es fijado por el cido en forma de ion amonio. Se
alcaliniza la muestra fuertemente con hidrxido sdico y se calienta a ebullicin; el
amoniaco se destila se recoge en un exceso de cido patrn y finalmente valorando por
retroceso con base patrn se obtiene la cantidad de amoniaco y de sta el contenido de
la muestra. La determinacin consta de tres etapas: Digestin, destilacin y
valoracin.
11


Equipos y materiales
Digestor buchi, marca Mettler Toledo, B-424
Destilador buchi, marca Mettler Toledo, B-324
Papel copia

Reactivos
Pastillas Kjeldahl exentas de selenio y mercurio
Acido sulfrico (99.4%)
HCl


11
Tomado de Mtodos de Ensayo, Determinacin de la cantidad de Nitrgeno, Laboratorio de Investigacin, Facultad de Ingeniera,
Universidad de la Sabana. 2002.

53






Hidrxido sdico al 32%
Acido brico al 2%
Indicador Tashiro

Procedimiento
Digestin: Pesar de 1 a 2 g de la muestra sobre papel, envolverla. Poner la muestra
en el tubo del equipo de digestin BUCHI y agregar 20 ml de cido sulfrico
concentrado y una pastilla Kjeldahl. Poner la muestra en el tubo y calentar en el
equipo por 2 horas aproximadamente o hasta que la muestra tenga un color verde
manzana.
Destilacin: Dejar enfriar la muestra sometida a digestin, pasar el tubo con la
muestra al equipo de destilacin BUCHI; y aadir al tubo 80 ml hidrxido sdico al
32% y 50 ml de agua; y al erlenmeyer donde va a ser destilada la muestra se le
agregar 75 ml de Acido Brico al 2%. Finalmente poner a destilar la muestra.
Valoracin: Al erlenmeyer donde se encontraba el destilado aadir 2 gotas de
indicador (Tashiro) y se titular con HCl 0.407 N. Esta parte es de mucho cuidado
porque el cambio de color es de un azul agua marina a un azul un poco ms oscuro,
entonces es necesario estar muy pendiente al cambio de color.

Clculos
Despus de realizar los tres pasos descritos, el porcentaje de nitrgeno se calcula
con la siguiente ecuacin:

% N = 14000* Normalidad del HCl * Volumen de la titulacin en ml
peso de la muestra en mg.

Para hallar el porcentaje de nitrgeno en cada uno de los complejos se utiliza HCl con N
= 0.407

2.2.3.5 Determinacin del Contenido de Cenizas

Mtodo oficial: AOAC 923.03.
El contenido de cenizas en un material esta definido como el residuo inorgnico que
queda despus de quemar la materia orgnica.(Ballesteros G, 1999).

Materiales y equipos
Mufla, marca Ney M-525, serie II
Balanza analtica con aproximacin a 0.1 g
Desecador
Crisoles de porcelana
Pinzas para crisol.


54







Procedimiento
Calentar el crisol por media hora en la mufla a 600C, dejar enfriar en el desecador y
pesar.
Pesar de 3 a 5 g de muestra a analizar sobre el crisol.
Introducir esta muestra en la mufla y calentar suavemente hasta carbonizarla.
Aumentar la temperatura hasta 600 C y mantener hasta que la muestra este roja o
gris. (4 a 5 horas dependiendo el tipo de muestra)
Retirar la muestra y pasar al desecador por media hora.
Pesar el crisol.

Clculos
El contenido de cenizas se calcula con la siguiente ecuacin.

% Cenizas = Peso final del crisol - Peso inicial del crisol * 100
Peso de la muestra

2.2.3.6 Determinacin Contenido de Fibra

Mtodo Oficial AOAC 962.09
Fibra cruda: La fibra cruda es determinada por una digestin secuencial de la muestra
con H2SO4 al

1,25% y despus con NaOH al 1,25%. El residuo insoluble se obtiene por
filtracin, luego es secado y pesado. All se obtiene el peso de la fibra junto con el de los
minerales. Para obtener el contenido de fibra es necesario incinerar esta muestra, donde
se elimina la fibra por incineracin, quedando solamente el residuo de las cenizas
constituido por los minerales. Por diferencia entre el peso anterior (antes de la
incineracin) y el de las cenizas se obtiene el de la fibra cruda; la cual es una medida
del contenido de celulosa y lignina en la muestra, pero los hidrocoloides, hemicelulosas
y pectinas son solubilizadas y no pueden ser detectadas. (Ferrer, J.S, 1995)

Reactivos
cido Sulfrico 5 % N
Hidrxido de Sodio 5 % N

Materiales y equipos
Equipo de digestin con condensador para beakers de 600 ml y plato calefactor de
temperatura controlada, marca Labconco.
Crisoles de porcelana
Filtros Oklahoma State con malla N 200, de acero inoxidable
Arreglo para filtro de vaco y trampa de vaco.

Procedimiento

55






Preparacin de la muestra
- Se sec la muestra.
- De la muestra tomar 2 g y extraer la grasa con ter de petrleo. Pero si el
contenido de grasa es menor del 1%, la extraccin debe ser omitida. (En este
caso no se hizo extraccin de grasa porque el contenido de aceite en la papa es
del 0.1%
12
)

Determinacin
- Transferir la muestra a un beaker de 600 ml.
- Agregar 100 ml de H2SO4 al 5% N.
- Colocar el beaker en el digestor con el plato calefactor ajustado.
- Dejar ebullir durante 30 minutos exactamente.
- Retirar el beaker del digestor y filtrar en el filtro Oklahoma.

Filtracin
- Encender el vaco e insertar el filtro en el interior del vaso del precipitado,
manteniendo la cabeza del filtro frente a la base del vaso hasta que todo el
lquido fuera removido.
- Sin retirar el filtro y el vaco, adicionar 50 - 75 ml de H2O hirviendo.
- Eliminar el agua anterior, y realizar tres lavados ms con 50 ml de la misma.
- Retirar el material (fibra) al beaker, retirando el vaco.
- Adicionar 100 ml de NaOH al 5% N, y se dejo ebullir exactamente 30 minutos.
- Retirar el beaker y se filtr como se explic.
- Realizar cuatro lavados con agua hirviendo, sin quitar el vaco.
- Retirar el exceso de agua.
- Retirar la fibra y colocar en un crisol.

Tratamiento del residuo
- Secar la fibra durante 2 horas a 130 + 2 C
- Retirar las muestras de la estufa, colocarlas en desecadores y pesarlas.
- Incinerar durante 30 minutos a 600 + 15 C
- Enfriar en desecador y pesar nuevamente

Clculos
El contenido de fibra se calcula mediante la siguiente ecuacin.

% Fibra cruda = (Peso de la fibra seca - Peso de cenizas)
Peso de la muestra

2.2.3.Mtodos enzimticos



12
Tabla de Composicin Qumica de Papa (100 gr), FEDEPAPA 2000.

56






A continuacin se describirn las metodologas utilizadas para medir la actividad
enzimtica celuloltica, que se fundamenta en la interaccin enzima - sustrato, es decir,
la adsorcin de las molculas de enzima sobre la celulosa (sustrato/tratamientos), que
se realiza mediante la cuantificacin de protena libre, que esta basado en el enlace de
la enzima con el colorante Azul Brillante Coomassie G-250


2.2.3.1. Metodologa para realizar la curva patrn de la enzima celulasa

Preparacin de la solucin 0.05 m de acetato sdico

M = N moles de soluto
Litro de solucin

Para un litro de solucin:

0.05 = N moles de soluto
1 Litro

0.05 = N moles de soluto

1 mol de Acetato Sdico = 136 g

0.05 moles de Acetato Sdico = 6.8 g

Para la preparacin de la solucin se utilizan 6.8 g de Acetato Sdico que se diluyen en
agua destilada y se completa el volumen hasta 1L en un baln aforado.

Preparacin de la solucin con Azul de Coomassie
El seguimiento de la cantidad de enzima celulasa adsorbida sobre el sustrato de cada
tratamiento se realiz mediante la cuantificacin de protena libre, por la aplicacin del
mtodo descrito por Bradford (1976). Este mtodo esta basado en el enlace de la
enzima con el colorante Azul Brillante Coomassie G-250 que produce un incremento de
la absorbancia a 595nm, segn Gonzlez G. (1999).
El reactivo del anlisis se prepara disolviendo 100mg del Azul Brillante Coomassie G-250
en 50ml de etanol (95% de Pureza). A esta disolucin se le aaden 100ml de cido
fosfrico (85% p/V). La solucin resultante se diluye hasta un volumen final de 1L, con
disolucin tampn acetato sdico 0.05M (pH=6).

Preparacin de las disoluciones de enzima Celluclast para realizar la curva patrn

La curva de calibracin se prepar tomando como patrn el propio complejo enzimtico

57






de la celulasa comercial. Para ello se prepararon disoluciones de concentracin conocida
de la enzima (ver tabla N 9), utilizando como disolvente una disolucin tampn de
acetato sdico 0.05M.





mg de
enzima
ml de solucin
0.05 M de
Acetato Sdico.
ml de solucin 0,05
M de Acetato Sdico
+ enzima
ml sln Azul
Coomassie
mg de enzima
en 5ml de sln
Coomassie
50 5 0.3 5 10
100 5 0.3 5 20
150 5 0.3 5 30
200 5 0.3 5 40
350 5 0.3 5 70
400 5 0.3 5 80
450 5 0.3 5 90
500 5 0.3 5 100
600 5 0.3 5 120
650 5 0.3 5 130
Tabla N9. Preparacin Curva de calibrado

Cada una de estas disoluciones se depositaron en celdas de lectura en el
espectofotmetro a una longitud de onda de 595 nm, para su respectiva lectura de
absorbancia. Una vez realizadas todas las lecturas, se procedi a sacar la ecuacin de la
curva de calibracin. Esta es una tcnica que requiere de bastante exactitud en cada
uno de sus pasos, lo que genero numerosas pruebas antes de llegar a datos con los que
se pudiera sacar una ecuacin vlida que describiera el comportamiento de la enzima.

2.2.3.2 Metodologa de medicin de la absorbancia para cada uno de los tratamientos

La metodologa para medir la actividad enzimtica celuloltica de los tratamientos (1, 2 y
3), consisti en:

Tomar 2.5g por muestra (da 1, 2, 4 y 7) y diluirla con 10ml de Buffer Acetato
Sdico 0.05M en tubos de ensayo para centrifuga
Mantener a una temperatura de 0C la gradilla con los tubos (sobre una bandeja
con hielo), con el fin de evitar errores en la lectura del espectofotmetro.
Realizar la centrifugacin en el equipo, (Universal 32, que es usado para separar
mezclas con una densidad de hasta 1.2 Kg/dm, donde a travs de la produccin de

58






la fuerza centrifuga, la mezcla logra separarse.
13
) a 5000 r.p.m. durante 5 minutos a
0C, segn Mendoza J. (2000).
Tomar 1,5 ml del liquido resultante de la centrifugacin de cada tratamiento,
depositar 1ml por muestra en tubos ependolf y someter a congelacin.
Realizar la medida de la actividad enzimtica en el espectofotmetro (marca Cary
Varian, clase EN 61010-1) que consiste en:
- Tomar 0.3 ml de las muestras liquidas guardadas anteriormente en los tubos
ependolf y agregar 5 ml de solucin de Azul Coomassie, homogeneizar la
solucin y realizar la respectiva lectura en el espectrofotmetro a una longitud
de onda de 595 nm, segn Gonzlez G. (1999).

Lo que sucede en este momento es que el Azul Coomassie se liga a la enzima,
entonces la absorbancia indica la cantidad adsorbida de enzima sobre el sustrato.

La metodologa para medir la actividad enzimtica celuloltica del tratamiento 4, se
realiza de una manera diferente al tratarse de un complejo enzimtico liquido. Consiste
en tomar muestras (das 1, 2, 4 y 7, 10ml) en tubos de ensayo debidamente marcados
que se sometieron a congelacin, para su posterior lectura en el espectofotmetro. La
metodologa a partir de este punto se realiz igual que el procedimiento anteriormente
nombrado.

2.2.3.3 Metodologa de la medida de absorbancia para el tratamiento con sonicacin

Se realiza una modificacin en la metodologa de la medida de la actividad enzimtica
celuloltica con el fin de obtener mejores resultados. La modificacin consiste en
realizar una sonicacin previa a la centrifugacin en el equipo Bao Ultrasonido Marca
Elma, Modelo LC 30/H, el cual convierte la energa en vibraciones mecnicas donde se
crean pequeas burbujas que sufren implosin. Este fenmeno se denomina cavitacin,
que en este caso genera un rompimiento celular previo y de esta forma se puede
realizar una mejor medida en el espectofotmetro.
Tambin se realiza una modificacin en las temperaturas, dejando como temperatura
final del proceso 55C, esto se hace con el fin de que las muestras no se secaran tanto
al final del proceso. (Ver anlisis Humedad # 3.3.2.2)

Una vez iniciado el ensayo modificado se toman muestras de la misma forma que los
anteriores. Solo que en este caso se toman solo para la medida de la actividad
enzimtica que era en lo que realmente se quera observar si existan diferencias
significativas con los ensayos anteriores.

El procedimiento consiste en:



13
Tomado del manual de funcionamiento de la Centrifuga Universal 32.

59






Pesar 2.5g de muestra y diluirla con la solucin buffer acetato 0.05M en un vaso
precipitado.
Agregar agua destilada al equipo ultrasonido.
Introducir el vaso precipitado en el equipo ultrasonido de forma que quede
parcialmente sumergido en el equipo.
Iniciar el proceso de sonicacin que tiene una duracin de 10 minutos para cada
muestra.



Una vez la muestra se encuentra sonicada se realiza el proceso de centrifugacin y
lectura en el espectrofotmetro de la misma forma que los ensayos descritos
anteriormente.

2.2.3.4 Metodologa Tratamiento Carboximetilcelulosa + Cepa

Este tratamiento se prepara de la misma forma que los anteriores, se toma como
sustrato carboximetilcelulosa y se le adiciona la misma cantidad de cepa madre que el
tratamiento 2.

2.2.3.5 Metodologa para determinar la constante de afinidad entre la enzima y el
sustrato

Para contar con buenos argumentos para la realizacin del anlisis de la medida de la
actividad enzimtica celuloltica, al tratamiento 4 se le realiz una lectura de absorbancia
en el espectofotmetro a 595 nm.; durante 2 horas, cada 5 minutos con el fin de
observar la velocidad de adsorcin de la enzima celulasa sobre el sustrato de
Carboximetilcelulosa.

El procedimiento de la lectura en el espectrofotmetro se realizo de la misma manera
que los anteriores.

Despus de tener esta tabla de datos se procede a determinar la constante de afinidad
K, esta se determina de la siguiente manera, inicialmente se calcula el Ln para cada
una de las absorbancias en los diferentes tiempos, y se realiza una grfica con estos
logaritmos naturales obtenidos frente al tiempo. La constante K esta dada entonces
por:
K = - (m)*2.302, en donde m es la pendiente obtenida en la curva.


60







2.3 DISEO EXPERIMENTAL

A continuacin se describen las consideraciones, para el desarrollo, del procedimiento
experimental, correspondientes a los tratamientos enzimticos sobre los sustratos
objetos de estudio. Es importante aclarar que no se pueden evidenciar cambios en el
comportamiento de los residuos orgnicos al someterlos a una temperatura constante
durante un periodo de tiempo determinado, debido a que esta temperatura debe variar
de acuerdo a un compostaje real para poder hacer un experimento inducido y de esta
forma tener datos reales.


2.3.1 Definicin de los tratamientos

Se realizan los siguientes tratamientos, a continuacin se explican, cuales fueron las
cantidades de sustrato, de enzima comercial y de cepa madre que se utilizan para cada
uno de los tratamientos.

2.3.1.1 Tratamiento 1

Residuo de papa (Fermentacin Endgena) + enzima comercial novozymes
Se pesan 300g de sustrato, se pasan a un vaso precipitado y se adiciona 1% (% p/p
basado en el contenido celulsico, ver anexo T)

de la enzima de celulasa. Se mezcla de
forma que quede repartida uniformemente sobre todo el sustrato. Este 1% de enzima
esta dado con respecto al material celulsico (en este caso el Carbono). Para una
cantidad de residuo de 300 g, la cantidad de carbono es de 47.85 g (de acuerdo al
contenido de carbono obtenido en la caracterizacin fisicoqumica de la mezcla de los
cuatro residuos) y el 1% de esta cantidad es 0.4785 g.

2.3.1.2 Tratamiento 2

Residuo de papa (Fermentacin Endgena)+ cepa madre
Se pesan 300g de sustrato y se adiciona la cepa madre que se haba sembrado a partir
del sustrato.
La cantidad de cepa que se adiciona es la misma cantidad de la enzima celulasa en el
tratamiento anterior (0.4785 g), con el fin de obtener una patrn de valido de
comparacin entre los tratamientos. De la misma forma los 300g se pasan a un vaso
precipitado donde la cepa madre se mezcla uniformemente sobre todo el sustrato.


61






2.3.1.3 Tratamiento 3

Residuo de papa (Fermentacin endgena)
Se pesan 300g de sustrato, se pasan a un vaso precipitado y se deja actuar el residuo
de forma individual, es decir sin agregarle ningn agente externo que pudiera afectar su
comportamiento natural.

2.3.1.4 Tratamiento 4

Carboximetilcelulosa + enzima comercial novozymes
Este es el tratamiento enzimtico blanco, que ser el patrn de comparacin de la
actividad enzimtica para los tratamientos nombrados anteriormente.

Preparacin del sustrato:

Preparar solucin Buffer Fosfato: pesar 24.2g de NaH2PO4H2O, 3.5g de Na2PO4 y en
un vaso precipitado adicionar 1.6L de agua destilada y los compuestos ya pesados
con agitacin constante, luego se mide el pH que debe ser igual a 6, y se completa
el volumen con agua destilada hasta 2L.
Medir 210ml de Buffer Fosfato y calentar hasta 85C, momento en el cual se
adicionan 10.5g de CMC, [3.5g/L] que se adicionan lentamente con agitacin
constante.
Agitar por 30 minutos, hasta formarse una solucin muy viscosa de color
transparente, a la cual se le adiciona nuevamente Buffer Fosfato hasta completar un
volumen de 300ml con un pH=6.
Al sustrato de CMC se le adiciona un 1% de la enzima celulasa (con respecto a la
cantidad de CMC). Es decir el 1% de 10.5 g de CMC, cantidad que corresponde a
0.105 g de enzima.

Al aadir esta cantidad al complejo, se observa un cambio inmediato en el sustrato ya
que paso de ser una solucin muy viscosa a una liquida, comportamiento que se explica
por la accin de la enzima celulasa que tiene un efecto pronunciado de reduccin de
viscosidad sobre sustratos celulsicos solubles.
14



2.3.2 Proceso de Compostaje I nducido

Se realiza el proceso fermentacin en estado slido (compostaje) a los 4 tratamientos
descritos anteriormente. Cada tratamiento se someti a unos tiempos y temperaturas
definidos ya en el anteproyecto de acuerdo a la bibliografa consultada.


14
Tomado de la Ficha Tcnica de Celluclast 1.5L

62







Temperatura (C) 30 45 55 70
Tiempo (das) 1 1 2 3
Das de Medicin 1 2 4 7
Tabla N 10. Tiempos y temperaturas del proceso de compostaje
Procedimiento:
El proceso tiene una duracin de 7 das y se realiza por triplicado.

Los cuatro tratamientos se colocan en la cmara de incubacin Boxcult 3000957,
que tiene un sistema de circulacin de aire que asegura la homogeneidad de la
temperatura en el interior de la cmara
15

Se toman muestras y se cambian temperaturas de los cuatro tratamientos en los
das de medicin (1, 2, 4 y 7).
La toma de muestras consiste en pesar aproximadamente 10g de cada tratamiento
(exceptuando el Blanco).
Congelar (a 0C) en bolsas de polietileno de alta densidad respectivamente
marcadas con la fecha, el nombre del tratamiento, y la temperatura, para posteriores
anlisis de las propiedades fisicoquimicas (pH, Carbono Orgnico Total, Nitrgeno,
Cenizas).
Por tratarse el blanco de un sustrato lquido se toman 10ml de muestra y se guarda
en un tubo de ensayo en congelacin (a 0C) para medir posteriormente el pH y la
actividad enzimtica.

Antes de tomar cada muestra se realiza una mezcla de cada tratamiento (cuatro veces
por semana) para obtener de esta forma una muestra homognea para hacer las
medidas correspondientes.

Resumen del ensayo de cada uno de los Tratamientos:


Tratamiento
Cantidad de
Residuo (g)
Cantidad de
Enzima (g)
Cantidad de
Enzima (l)
4 /blanco 300 0.105 87.5
1 300 0.4785 398
Tabla N 11. La densidad de la enzima Celluclast de novozymes es de 1.2 g/ml


Tratamiento
Cantidad de
Residuo (g)
Cantidad de
cepa (g)
2 300 0.4785
Tabla N 12




15
Tomado de Manual de Funcionamiento de Cmara de Incubacin Boxcult 3000957.

63






Tratamiento
Cantidad de
Residuo (g)
3 300
Tabla N 13


El siguiente cuadro muestra los das en los cuales se tomar la medida de los
parmetros fisicoqumicos y de la actividad enzimtica:

Para el tratamiento 4 se miden los siguientes parmetros: pH y Actividad enzimtica;

Para los tratamientos 1, 2, y 3 se mide: C/N, Humedad, pH, Cenizas y Actividad
enzimtica.

Para el blanco:

Tiempo en das Parmetro a medir:
1 2 4 7
pH X X X X
Actividad Enzimtica X X X X
Tabla N 14. Das de medicin de propiedades fsicas del Tratamiento 4


Para los tratamientos 1, 2 y 3:

Tiempo en das Parmetro a medir:
1 2 4 7
C/N X X
Humedad X X X X
Cenizas X X X X
PH X X X X
Actividad Enzimtica X X X X
Tabla N 15. Das de medicin de propiedades fsicas de los Tratamientos 1, 2 y 3


2.3.3 Diseo experimental de los tratamientos

Para cumplir con el objetivo de este trabajo se realizar el siguiente procedimiento de
diseo experimental.

Identificacin del problema.
Seleccionar un complejo enzimtico que presente las mejores condiciones de similaridad

64






con el complejo patrn (o blanco) que esta conformado por CMC (Sustrato polisacrido
especfico para determinar la accin cuantitativa de la enzima celulasa)

+ enzima
patrn (Enzima Comercial Celluclast, suministrada por la empresa Novozymes).


Factores (o tratamientos) y niveles
Tal y como se coment en la metodologa de trabajo, se realizarn cuatro ensayos, los
cuales se llamarn tratamientos en la metodologa estadstica, y estos sern observados
en 4 tiempos especficos los cuales estn directamente asociados con la temperatura,
por tanto se trabajar con dos factores (tratamientos y temperatura) y con 4 niveles de
observacin cada uno de ellos.

Tratamientos 30 45 55 70
Blanco: CMC + enzima
comercial novozymes
Residuo papa + enzima
comercial novozymes
Residuo papa +
cepa madre
Residuo papa
Temperatura

Tabla N 16. Temperaturas y Tiempos de los cuatro Tratamientos

Variables de observacin
En cada de los niveles de observacin de los tratamientos se realizarn mediciones de
las variables C/N, humedad, cenizas, pH y actividad enzimtica.

Diseo apropiado
Diseo de dos factores con interaccin. En este diseo se incluyen valores (que
representan cada una de los valores observados de las variables) del tipo y
ijk
, en donde
i = 1, 2, 3, 4 (tratamientos), j = 1, 2, 3, 4 (temperaturas), y k = 1, 2, 3 (rplicas por
experimento). El diseo se parametriza de la siguiente forma, y
ijk
= +
i
+
j
+
()
ij
+
ijk
, en donde representa la media general,
i
representa el efecto del nivel i
de los tratamientos,
j
representa el efecto del nivel j de las temperaturas, ()
ij

representa la interaccin entre los niveles i y j de los tratamientos y las temperaturas, y

ijk
representa el error aleatorio correspondiente a la observacin ijk que sigue una
distribucin normal.
Siendo "4" el nmero de niveles en los que se estudia el factor A (los tratamientos en
este caso), "4" el nmero de niveles en los que se estudia el factor B (las temperaturas
en nuestro caso) y "3" el nmero de rplicas por condicin experimental, y por cada

65






una de las variables observadas.
En este diseo el nmero de rplicas es 3 debido a que con el uso de las curvas
caractersticas de operacin, y para un nivel de = 0.10, se encuentra que con este
valor se garantiza una potencia de la prueba (probabilidad de no rechazar la hiptesis
nula si hay diferencia entre los tratamientos) de 0.95, siempre y cuando no exista un
grave error en la recoleccin de los datos. En caso contrario ser necesario repetir el
procedimiento.

De otro lado debido a la posible correlacin existente entre los datos, por provenir de
mediciones dependientes una de la otra, es necesario y obligatorio hacer pruebas
estadsticas de correlacin.





TEMPERATURAS
1 2 3 4

1
y
111
y
112
y
113
y
121
y
122
y
123
y
131
y
132
y
133
y
141
y
142
y
143


2
y
111
y
112
y
113
y
121
y
122
y
123
y
131
y
132
y
133
y
141
y
142
y
143

TRATAMIENTOS
3
y
111
y
112
y
113
y
121
y
122
y
123
y
131
y
132
y
133
y
141
y
142
y
143


4
y
111
y
112
y
113
y
121
y
122
y
123
y
131
y
132
y
133
y
141
y
142
y
143

Tabla N17





















66





























CAP TULO I I I

3. RESULTADOS Y ANLI SI S

A continuacin se presentan los resultados obtenidos y el anlisis de los mismos de
acuerdo al orden descrito en la metodologa

3.1. ESTANDARIZACI N DEL SUSTRATO

A continuacin se presentan los dos balances que se realizaron para obtener las
condiciones ptimas de C/N y humedad para iniciar el compostaje.

En el primero (Figura 7) se muestra el balance que se realiz para obtener la relacin
C/N de 27, y en el segundo (Figura 8) se muestra el balance que se realiz para
obtener una humedad del 55%.





67






Diagrama Balance 1 (Relacin C/N)

T
TXN = 0.0066
TXC = 0.1887
R
RXN = 0.0025 Residuo final 1 (RF1)
RXC = 0.0493 RF1XN = ?
C RF1XC = 27(RF1XN)
CXN = 0.0039
CXC = 0.0358
S
SXN = 0.0024
SXC = 0.0931

Figura 7. (En donde XN es la fraccin de Nitrgeno y XC es la fraccin de Carbono que corresponde a
cada uno de los residuos iniciales y al residuo final 1.)

Para realizar el balance se hace necesario suponer algunas bases de clculo, las cuales
pueden ser variadas de acuerdo a la necesidad de residuo final deseado. Estas bases
de clculo son:
T = 1000 g
S = 1500 g
RF1 = 5000 g


Clculos Balance 1 (Relacin C/ N):

Balance general:

T + R + C + S = RF1
R + C = 2500 (Ecuacin 1)

Balance de Nitrgeno:

(TXN)*(T) + (RXN)*(R) + (CXN)*(C) + (SXN)*(S) = (RF1XN)*(RF1)
0.0025R + 0.0039C - 5000(RF1XN) = -10.2 (Ecuacin 2)

Balance de Carbono:

(TXC)*(T) + (RXC)*(R) + (CXC)*(C) + (SXC)*(S) = (RF1XC)*(RF1)
0.0493R + 0.0358C - 135000(RF1XN) = - 328.35 (Ecuacin 3)


MEZCLA DE
LOS
RESIDUOS

68






Resolviendo el sistema de tres ecuaciones se obtiene:

R = 2354.77 g
C = 145.22 g
RF1XN = 3.33 * 10
-3
g.

Con estos valores se obtienen entonces las cantidades necesarias de cada uno de los
cuatro residuos para obtener una relacin C/N de 27. Las cantidades de cada residuo
con su correspondiente porcentaje se presentan a continuacin:


Residuo Cantidad (g) Porcentaje (%)
Torta de filtro prensa (T) 1000 20
Residuos del filtro parablico (R) 2354.77 47.1
Cascarilla de pelado (C) 145.23 2.9
Slivers (S) 1500 30
Es importante aclarar que las cantidades de RF1 (Residuo Final) de T (Torta de filtro prensa) y de S
(Slivers) pueden ser variadas de acuerdo a la cantidad deseada de Residuo Final.

Diagrama Balance 2 (Porcentaje de Humedad)


T = 1000
TXH = 0.5381

R = 2354.77
RXH = 0.8854
Residuo final 2 (RF2) = ?
C = 145.23 RF2XH = 0.55
CXH = 0.8804

S = 1500
SXH = 0.7874



Cantidad de agua a extraer (H) = ?

Figura 8. (En donde XH es la fraccin de agua de cada uno de los residuos iniciales y del residuo final 2.)






MEZCLA DE
LOS
RESI DUOS

69






Clculos Balance 2 (Porcentaje de Humedad)

Balance general:

T + R + C + S = RF2 + H
RF2 + H = 5000 (Ecuacin 4)

Balance de Humedad:

(TXH)*(T) + (RXH)*(R) + (CXH)*(C) + (SXH)*(S) = (RF2XH)*(RF2)
0.55(RF2) + H = 3931.97 (Ecuacin 5).

Resolviendo el sistema de dos ecuaciones se obtiene:

RF2 = 2373.4 g
H = 2626.6 g

Lo cual indica que a la cantidad de residuo final obtenida en el balance 1 (RF1) se le
debe extraer un 52.53 % de agua con lo que se obtiene una cantidad de residuo final 2
(RF2) de 2373.4 g, el cual contiene una humedad del 55%.


3.2. RESULTADOS MICROBIOLGI COS. OBTENCIN Y SEPARACIN DE LA
CEPA MADRE.

El crecimiento de mohos y levaduras, se present en las concentraciones de 10
1
y 10
-2

en el agar PDA. Una vez realizada la replica (medio czapeck + aserrn), se presentaron
colonias de hongos de diferentes tamaos, elevadas y algodonosas. El micelio presenta
un color gris verdoso con reverso negro verdoso.
Por lo tanto la morfologa que caracteriza a los hongos del sustrato identifica en la
separacin (replica en el medio czapeck) cepas de R. solani., De acuerdo con la
descripcin especfica de Parmeter y Whitney (1970).













70






















Fotografa N7. Obtencin Cepa Madre

3.3. RESULTADOS FISICOQUMICOS

3.3.1. pH
3.3.1.1. Resultados Determinacin de pH

Por tratarse de un parmetro fisicoqumico de control indispensable en un proceso de
compostaje esta determinacin se realiza en los tres ensayos para cada tratamiento
(1,2,3), paralelamente este parmetro se mide para el tratamiento 4 (complejo
enzimtico patrn: CMC+ enzima Novo) en los tres ensayos. (Anexo A)



A continuacin se muestra la tabla con los promedios obtenidos para los triplicados y
sus respectivas desviaciones. (Tabla N 18)


Convenciones:
NOVO: Tratamiento 1
CEPA: Tratamiento 2
SOLO: Tratamiento 3
BLANCO O PATRN: Tratamiento 4




71






Ensayos Tratamiento pH Desviacin
Estndar
NOVO 3.91 0,020
CEPA 3.63 0,055 E 30
SOLO 3.77 0,035
NOVO 4.73 0,551
CEPA 4.67 0,604 E 45
SOLO 4.89 0,618
NOVO 5.38 0,020
CEPA 5.00 0,031 E 55
SOLO 5.30 0,026
NOVO 5.13 0,032
CEPA 4.37 0,015 E 70
SOLO 4.68 0,020


Tratamiento
Patrn
pH Desviacin
Estndar
E 30 4.02 0.031
E 45 5.01 0.025
E 55 5.50 0.065
E 70 5.21 0.020
Tabla N 18: Promedios de los pH obtenidos en los triplicados y sus respectivas desviaciones.

3.3.1.2. Anlisis de la Determinacin del pH

Como se observa en los datos y en la grfica (Grfico N 1), los tres tratamientos,
muestran un aumento del pH desde el inicio del compostaje a 30C hasta llegar a la
temperatura de 55C (punto mximo). El incremento del pH se debe a que hubo
prdidas de cidos orgnicos y liberacin de amonaco por efecto de la descomposicin
microbiana y la ruptura de protenas, segn Ferrer J, 1997 Y Faria D, 1999.
A partir de este punto se presenta un descenso hasta final del proceso (70C),
provocado por el proceso de nitrificacin en el cual parte del amonio liberado durante el
proceso de amonificacin sufre una conversin a nitrato liberando iones hidrogeno H
+
,
segn Leal N (1999). Otra razn se debe probablemente al sistema de compostaje en el
que no se favorecen focos de alta temperatura que aceleren los procesos de
descomposicin del material, segn Faria D.(1999)

72








Error de pH = +/- 0,2
Grfico N 1: Evolucin del pH con la temperatura para cada uno de los tratamientos.

En el tratamiento 4 (Blanco), se observa la misma tendencia nombrada anteriormente,
solo que en este caso los datos del pH son mayores debido a que se trata de un
complejo enzimtico puro (CMC + enzima), lo que debe generar un comportamiento
muy similar al del pH de la enzima comercial, datos que se confirman al observar la
grfica de la influencia del pH sobre la actividad de Celluclast 1.5L de la ficha tcnica
donde se observa una tendencia similar, mostrando que el punto ptimo del pH se
encuentra en el rango de 4.5-6 a una temperatura de 55-60C.

Por lo tanto se concluye que el punto ms alto del pH de los tres tratamientos se
encuentra a una temperatura de 55C, con los valores de 5.38, 5.00 y 5.30 para los
tratamientos 1, 2 y 3 respectivamente.
De igual forma se observa que las desviaciones estndar (Grafico N 1) para cada uno
de los tratamientos con respecto al blanco son valores que tienden a cero, lo que indica
que existe similaridad para cada uno de los tratamientos con el blanco. De la misma
manera se puede observar que la desviacin ms baja la tiene le tratamiento 1, lo que
indica que en este parmetro fisicoqumico (pH) el tratamiento que se asemeja ms al
blanco es el de la enzima.

Por otro lado al observar las grficas de los triplicados (Anexo B) para cada tratamiento
se observa que no existen diferencias entre los ensayos.
Evolucin del pH frente a la Temperatura
3,50
4,00
4,50
5,00
5,50
6,00
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
p
H
Tratamiento1
Tratamiento2
Tratamiento3
Tratamiento4
Tratamientos Desviacin Estndar
4 -- 3 0,6146
4 -- 2 0,6323
4 -- 1 0,6003

73







3.3.2. Humedad

3.3.2.1. Resultados en la Determinacin de la Humedad

Por tratarse de un parmetro fisicoqumico de control importante en un proceso de
compostaje esta prueba se realiz en los tres ensayos para cada tratamiento (Anexo C)
A continuacin se muestra la tabla con los promedios de los triplicados y las respectivas
desviaciones. (Tabla N19)


Ensayos Tratamiento % Humedad
media (Bh)
Desviacin
Estndar
NOVO 70.48% 0,031
CEPA 69.33% 0,030 E 30
SOLO 65.58% 0,028
NOVO 61.72% 0,045
CEPA 64.23% 0,007 E 45
SOLO 60.44% 0,026
NOVO 49.23% 0,096
CEPA 54.11% 0,030 E 55
SOLO 39.52% 0,078
NOVO 10.41% 0,004
CEPA 9.71% 0,005 E 70
SOLO 10.36% 0,007
Tabla N19: Promedios de los triplicados y las respectivas desviaciones para la determinacin de
humedad.
3.3.2.2. Anlisis en la Determinacin de la Humedad

En los datos y en la grfica (Grfico N 2) de los tres tratamientos se observa
claramente como la humedad disminuye con el aumento de la temperatura, la humedad
al inicio (30C) se encuentra entre un rango de 65 a 70% para los tres tratamientos,
adecuado para garantizar un proceso eficiente en el consumo de oxgeno segn Ferrer
J.(1997) Seguido el proceso, la humedad va en descenso, en teora, segn Emison,
(2000). Los valores de humedad para que pueda darse una fermentacin aerobia estn
entre el 30 y el 70%, siempre que se asegure una buena aireacin. Por esta razn se
realizaban volteos en cada tratamiento 4 veces por semana en cada ensayo. En la
prctica, se deben evitar valores altos, pues se desplazara el aire de los espacios entre
partculas del residuo, y el proceso pasara a anaerobio. Si, por contrario, la humedad es
demasiado baja, bajar la actividad de los microorganismos, no permitiendo un buen

74






desarrollo del proceso de compostaje. Los valores ptimos estn entre el 40 y el 60%,
que se presentan en las temperaturas de 45 55C.

Por lo tanto la humedad en el proceso de compostaje para los tres tratamientos solo se
encontr dentro de los rangos normales hasta una temperatura de 55C, porque al
finalizar el proceso (70C) se encuentran humedades muy bajas en donde no se
presenta una actividad microbiana baja, por esta razn sera conveniente realizar
cambios en la temperatura final del proceso, con el fin de evitar que se presenten
cambios bruscos en la humedad que no permitan un buen desarrollo durante el proceso
de compostaje.

Error Humedad = +/- 2%
Grfico N 2: Evolucin de la humedad frente a la temperatura en los tres tratamientos

Al observar las grficas para cada tratamiento se observa que no existen diferencias
entre los ensayos de los tratamientos 2 y 3. Sin embargo se presentaron algunas
diferencias en el tratamiento 1 que indican que se pudo haber cometido algn error en
la lectura de los pesos y en el clculo de la humedad. (Anexo D)

3.3.3. Carbono Orgnico Total
3.3.3.1. Resultados de la Determinacin de Carbono Orgnico Total

La cuantificacin de carbono se realiz en tres etapas del proceso diferentes, la primera
fue al inicio de los ensayos con el sustrato balanceado a temperatura ambiente, la
segunda para los tres tratamientos a 30C y por ltimo la cuantificacin para los tres
tratamientos a 70C. Se realizaron al inicio y al final del tratamiento (30 y 70C) debido
a que es una media de control que solo es necesaria en estas dos etapas para controlar
Evolucin de la Humedad frente a la Temperatura
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
%


d
e

H
u
m
e
d
a
d
Tratamiento1
Tratamiento2
Tratamiento3

75






la relacin C/N, parmetro indispensable durante el proceso de compostaje.
Los resultados obtenidos en las pruebas de carbono orgnico total se observan en el
Anexo F.
A continuacin se muestra la tabla con los promedios obtenidos para los tres ensayos y
sus respectivas desviaciones (Tabla N20)

Ensayos Tratamientos
gC/100g muestra
hmeda
gC/100g
muestra seca
Desviacin
Estndar
INICIAL 15.91 3.79 --
NOVO 15.19 3.62 --
CEPA 15.14 2.80 -- E 30
SOLO 15.14 2.53 --
NOVO 7.14 0.50 0.040
CEPA 7.22 0.50 0.061 E 70
SOLO 7.04 0.49 0.046
Tabla N 20: Promedios del contenido de carbono en base seca de los tres ensayos y sus respectivas
desviaciones.

3.3.3.2. Anlisis de la Determinacin de Carbono Orgnico Total

El contenido de carbono para el sustrato balanceado fue de 3.79% (Base seca). Seguido
de los tratamientos a 30C, que presentaron una disminucin obtenindose los valores
de 3.62, 2.80 y 2.53% correspondientes a los tratamientos 1, 2 y 3. Al comparar estos
valores con los correspondientes al final del proceso (70C), para cada tratamiento, se
observ una notable disminucin en el porcentaje de carbono orgnico total, presentado
valores de 0.50, 0.50 y 0.49%, correspondientes a los tratamientos 1, 2 y 3 (Grfico N
3).

Los datos muestran una disminucin significativa del %COT durante el proceso de
compostaje para los tres tratamientos que si se comparan con la bibliografa muestran
una tendencia vlida, ya que al avanzar el perodo de compostaje el contenido de
carbono orgnico total (COT) debe disminuir debido a su mineralizacin, segn Madrid
C. y colaboradores (2001). Esta disminucin se debe a que las dos terceras partes del
carbono consumidos durante el proceso son transformadas a anhdrido carbnico (CO
2
),
el cual se desprende, mientras que la otra tercera parte se combina con el hidrgeno en
el sistema vital del proceso segn Breidenback A. W., indicando una biodegradacin
aerbica de los diferentes tratamientos, segn Jos R. Ferrer

y colaboradores (1997).
Tambin el carbono orgnico total es fuente de energa para los microorganismos,
segn Emison (2000).

Como se observa en la grfica, el porcentaje ms alto de carbono a 30C, lo present el
tratamiento1 (3.62%), seguido del tratamiento 2 (2.80%) y por ltimo el tratamiento 3
(2.53%). A la temperatura de 70C, el tratamiento 1 y el 2 presentan la misma cantidad
de carbono (0.5 %), seguido muy de cerca el tratamiento 3 con un 0.49%.

76










Error COT = +/- 0.01 %
Grfico N 3: Cantidad de carbono orgnico total (BS) para los tres tratamientos.

Al observar las grficas de los triplicados para la determinacin de carbono, se observa
que no hay diferencias significativas entre los ensayos que se realizaron para cada
tratamiento, indicando as las condiciones de similaridad entre los mismos. (Anexo F)


3.3.4. Nitrgeno

3.3.4.1. Resultados en la Determinacin del Nitrgeno

Los resultados obtenidos para cada uno de los ensayos se muestran en el Anexo G.
A continuacin se muestran los promedios de los porcentajes de Nitrgeno (en base
seca) y sus respectivas desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los
triplicados. (Tabla N 21)
Tabla N 21: Promedios de los porcentajes de Nitrgeno (en base seca) y sus respectivas desviaciones
estndar

Temp C NOVO DESV ESTANDAR. CEPA DESV ESTANDAR. SOLO DESV ESTANDAR.
30 2,21 --- 2,69 --- 2,41 ---
70 0,50 0,041 0,64 0,088 0,66 0,069
g N por 100 g producto seco
Evolucin de la cantidad de Carbono Orgnico Total frente a la Temperatura
-0,005
0
0,005
0,01
0,015
0,02
0,025
0,03
0,035
0,04
0,045
20 C 30 C 70 C
Temperatura
C
o
n
t
e
n
i
d
o

d
e

C
a
r
b
o
n
o

e
n

B
s
Tratamiento1
Tratamiento2
Tratamiento3
Muestra inicial

77






De acuerdo a la tabla anterior, se puede observar que las desviaciones se encuentran
entre 0.041 y 0.088, lo que indica que los datos obtenidos para cada uno de los
tratamientos no presentan una desviacin significativa.

Los grficos para cada uno de los tratamientos con sus respectivos triplicados se
muestran en el Anexo H.

3.3.4.1. Anlisis en la Determinacin del Nitrgeno

A continuacin se muestra el grfico con la evolucin del porcentaje de N (BS) para los
tres tratamientos (Grfico N 4)


Error N (BS) = +/- 0,3 %
Grfico N 4: Evolucin de la cantidad de N (BS) para los tres tratamientos.

En el grfico anterior se puede observar que para los tres tratamientos el porcentaje de
nitrgeno en base seca disminuye. El compostaje para los tres tratamientos se inici con
un % N (BS) de 2.12; a 30 C ste porcentaje se mantuvo entre 2.21 y 2.41 y
finalmente a 70 C termin entre 0.5 y 0.66. Estos resultados, son los esperados en un
proceso de compostaje, ya que en los tres tratamientos se presenta una fermentacin
endgena, en donde las bacterias y los hongos que llevan a cabo el proceso de
compostaje, utilizan el nitrgeno para construir sus cuerpos y de esta forma crecen
poblacionalmente. (Emison, 2000). De igual forma la degradacin de la celulosa,
tambin justifica el descenso de la cantidad de nitrgeno, ya que este ltimo se hace
necesario en el rompimiento de las cadenas celulsicas, pues los microorganismos
requieren 1 parte de Nitrgeno, por cada 35 partes de celulosa degradada. (Leconte,
2000).


Evolucin de la cantidad de N (BS) frente a la
temperatura

0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
30 70
Temperatura (C)
g

N

/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o

s
e
c
o
Tratamiento1 Tratamiento2 Tratamiento3

78






3.3.5. Relacin C/ N
3.3.5.1. Resultados de la Relacin C/N

Los resultados obtenidos en la determinacin de la relacin Carbono/Nitrgeno se
muestran en el Anexo 9
A continuacin se muestran los promedios de la relacin C/N (en base hmeda) y sus
respectivas desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los triplicados (Tabla
N 22)
Tabla N 22: Promedios de la relacin C/N (en base hmeda) y sus respectivas desviaciones estndar,
con los resultados obtenidos en los triplicados

De acuerdo a la tabla anterior, se puede observar que las desviaciones se encuentran
entre 0.25 y 0.36, lo que indica que los datos obtenidos para cada uno de los
tratamientos no presentan desviacin.

Los grficos para cada uno de los tratamientos con sus respectivos triplicados se
muestran en el Anexo J.






















Temp C NOVO DESV ESTANDAR. CEPA DESV ESTANDAR. SOLO DESV ESTANDAR.
30 22,93 -- 20,22 -- 19,80 --
70 15,90 0,47 12,57 0,25 11,88 0,36
Relacin C / N

79









3.3.5.2. Anlisis de la Relacin C/N

A continuacin en el Grfico N 5 se observa la relacin C/N de 30 a 70 C.




Error C/N = +/- 2
Grfico N 5: Evolucin de la relacin C/N de 30 a 70 C.

Con respecto a la relacin (C/N), se observ que la muestra original tena una relacin
27.92, el cual era un valor adecuado para un compostaje eficiente, ya que la relacin
ptima inicial se ha establecido en el rango 25-30. Esta relacin, a 30C, disminuy a
22.93, 20.22 y 19.80 y a 70C hay un descenso a 15.90, 12.57 y 11.88 para los
tratamientos 1, 2 y 3, respectivamente. Los valores finales de esta relacin tambin se
mantuvieron dentro del rango ptimo que se encuentra entre 10-15. (Ferrer,J.R.,1997)
Es importante aclarar que cuando la relacin C/N, con la cual se inicia el compostaje es
elevada (>30), se disminuye la actividad biolgica; por esta razn es preciso iniciar el
proceso dentro del rango ptimo para tener un buen compostaje. (Emison, 2000)







Relacin C/N vs T
0
5
10
15
20
25
30
30 70
Temperatura (C)
R
e
l
a
c
i

n

C
/
N
Tratamiento1 Tratamiento2 Tratamiento3

80







3.3.6. Cenizas

3.3.6.1. Resultados en la Determinacin de las cenizas

Las cantidades de ceniza que se obtuvieron para cada uno de los tratamientos se
encuentran referenciadas en el Anexo 11
A continuacin se muestran los promedios de los porcentajes de cenizas (en base seca)
y sus respectivas desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los
triplicados.(Tabla N 23)

Tabla N 23: Promedios de los porcentajes de cenizas (en base seca) y sus respectivas desviaciones
estndar, con los resultados obtenidos en los triplicados

De acuerdo a la tabla anterior, se puede observar que las desviaciones se encuentran
entre 0.044 y 0.592, lo que indica que los datos obtenidos para cada uno de los
tratamientos no presentan una desviacin significativa.
Los grficos para cada uno de los tratamientos con sus respectivos triplicados se
muestran en el Anexo L.









Temperatura
(C)
Complejo
g Ceniza/ 100 g
de producto seco
Desv. estndar
del triplicado
NOVO 3,155 0,592
CEPA 3,529 0,533 30
SOLO 3,274 0,083
NOVO 3,871 0,201
CEPA 3,561 0,133 45
SOLO 3,540 0,101
NOVO 4,529 0,044
CEPA 4,097 0,492 55
SOLO 3,718 0,551
NOVO 4,568 0,175
CEPA 4,245 0,223 70
SOLO 4,161 0,328

81







3.3.6.2. Anlisis en la Determinacin de las cenizas

A continuacin en el Grfico N 6 se observa el cambio del contenido de cenizas (BS)
respecto a la temperatura.
Error Cenizas = +/- 0,1 %
Grfico N 6: Evolucin del contenido de cenizas (BS).

La mezcla balanceada empieza con un porcentaje de 2.685; a 30 C los complejos
mantienen un porcentaje entre 3.155 y 3.274, y finalmente a 70C, los complejos
mantienen un porcentaje de cenizas entre 4.161 y 4.568; de acuerdo a estos resultados
se observa que el porcentaje de cenizas en base seca aumenta para los tres complejos.
Esto se presenta porque a medida que se desarrolla el compostaje, el avance del
proceso de mineralizacin (Transformacin del nitrgeno orgnico en amonio (NH4+)
mediante la accin de los microorganismos) de elementos como el nitrgeno, de igual
forma asciende.
Un factor importante a considerar en la mineralizacin de la materia orgnica es su
relacin C/N, generalmente con una relacin de 20-25 o menor, se produce
mineralizacin, mientras que si los valores de este cociente son ms altos, entonces los
microorganismos que degradan esta materia orgnica consumen ms amonio que el que
se produce en la descomposicin y el resultado es una inmovilizacin neta de N
(proceso inverso a la mineralizacin).

3.3.7. Fibra

3.3.7.1. Resultados en la Determinacin de la fibra
Las cantidades de fibra seca que se obtuvieron para cada uno de los tratamientos se
encuentran referenciadas en el Anexo M.
Evolucin del contenido de cenizas (BS) frente a la temperatura
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (C)
g

C
e
n
i
z
a
/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o

s
e
c
o
Tratamiento1 Tratamiento2 Tratamiento3

82









A continuacin se muestran los promedios de los porcentajes de fibra (en base seca) y
sus respectivas desviaciones estndar, con los resultados obtenidos en los
triplicados.(Tabla N 24)

Tabla N 24: Promedios de los porcentajes de fibra (en base seca) y sus respectivas desviaciones
estndar, con los resultados obtenidos en los triplicados.

De acuerdo a la tabla anterior, se puede observar que las desviaciones se encuentran
entre 0.059 y 0.107, lo que indica que los datos obtenidos para cada uno de los
tratamientos no presentan desviacin.


3.3.7.2. Anlisis en la Determinacin de fibra seca

A continuacin en el Grfico N 7 se observa la evolucin del contenido de fibra seca
(BS) desde la mezcla inicial hasta la finalizacin del compostaje (70C).


Error Fibra (BS) = +/- 0,2 %
Grfico N 7: Evolucin del contenido de fibra seca (BS) desde la mezcla inicial hasta la finalizacin del
compostaje (70C).
MEZCLA INICIAL 20 3,502 ---
NOVO 70 0,884 0,107
CEPA 70 0,689 0,059
SOLO 70 1,077 0,148
Complejo Temperatura
C
g Fibra seca/ 100 g de
producto seco
Desviacin
estndar
Tabla de Resultados
g de fibra seca/100 g de producto seco vs T
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
MEZCLA
INICIAL
Tratamiento1 Tratamiento2 Tratamiento3
g

d
e

f
i
b
r
a

s
e
c
a
/
1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o

s
e
c
o
20 C 70 C

83








El compostaje se inici con un porcentaje de fibra en base seca de 3.502 y finaliz, a
70C, con un porcentaje de 0.884, 0.689 y 1.077, para los tratamientos: 1, 2 y 3,
respectivamente. De acuerdo al cuadro anterior se puede observar que el contenido de
fibra descendi en un 80.32% para el tratamiento2, y en un 69.24% para el
tratamiento3, lo que muestra que el rompimiento de celulosa (constituyente
fundamental de la fibra) en cadenas ms pequeas se present en mayor proporcin en
el tratamiento2 que en el tratamiento3. Lo cual ratifica, los resultados obtenidos en la
actividad enzimtica celuloltica, pues en ellos, se observa que la actividad enzimtica
ms alta la presenta el tratamiento 2 y la ms baja la presenta el tratamiento3.

Si se observa la metodologa utilizada para hallar % fibra cruda, (ver metodologa
fisicoqumica), esta prueba, da una medida del contenido de celulosa y lignina en la
muestra, pero los hidrocoloides, hemicelulosas y pectinas son solubilizadas y no pueden
ser detectadas, por esta razn el contenido de fibra en el tratamiento2 da menor
cuando en su actividad enzimtica es mayor, de forma inversa ocurre en el
tratamiento3; su cantidad de fibra al final (70C) es la mayor comparada con el resto
de tratamientos; y su actividad enzimtica es la ms baja (79.9 mg/ml). ( HART, F.L,
1991).

3.4. RESULTADOS ACTIVIDAD ENZIMTICA

3.4.1 Curva Patrn
3.4.1.1. Resultados en el proceso de obtencin de la curva de actividad enzimtica

A continuacin se muestra la tabla en con las absorbancias obtenidas a diferentes
concentraciones de enzima (cantidad de enzima absorbida por el sustrato). (Tabla N
25)

Tabla N 25: Absorbancias a las diferentes concentraciones de enzima.
La curva que se obtuvo de acuerdo a la tabla anterior, es la siguiente (Grfico N 8)

Grfico N 8: Curva de absorbancia frente a la cantidad de enzima absorbida por el sustrato



10 1.2021
20 1.2325
30 1.2910
40 1.3185
70 1.3296
80 1.3521
90 1.3964
100 1.4287
120 1.4673
130 1.4965
Concentracin
(mg de Enzima)
Absorbancia
Absorbancia frente a la cantidad de enzima absorbida por
el sustrato.
y =0,0022x +1,1969
R
2
=0,9593
1,0000
1,2000
1,4000
1,6000
0 20 40 60 80 100 120 140
Enzima absorbida por el sustrato
A
b
s
o
r
b
a
n
c
i
a

85






3.4.1.2. Anlisis en el proceso de obtencin de la curva de actividad enzimtica

En la grfica se observa la curva de calibracin para los valores medios de los valores de
absorbancia corregidos por el blanco (Ab), en funcin de la concentracin de enzima
(g/ml). Como se puede observar la curva de calibracin tiene un comportamiento lineal,
dentro de los mrgenes establecidos experimentalmente, y la relacin es la siguiente:

Ab = 0.0022 [enzima]+1.1969, r= 0.9593

Donde: Ab, representa el valor de absorbancia corregido por el blanco y determinado
espectrofotomtricamente a la longitud de onda de 595 nm, [enzima], el valor de la
concentracin de enzima comercial de la disolucin expresado en g/ml y r, el valor de
coeficiente de correlacin.

3.4.2. Medida de la actividad enzimtica en los tratamientos

3.4.2.1. Resultados de la medida de la actividad enzimtica en los tratamientos

Los resultados de absorbancia (que son proporcionales a la cantidad de complejo
enzima - sustrato) obtenidos para cada uno de los tratamientos se muestran en el
Anexo N)








86






A continuacin la Tabla N 26 muestra los promedios de las concentraciones
enzimticas con las respectivas desviaciones de los resultados obtenidos en los
triplicados.

Tabla N 26. Promedios de las concentraciones enzimticas con las respectivas desviaciones de los
resultados obtenidos en los triplicados.

Los grficos de los triplicados para cada uno de los tratamientos se muestran en el
Anexo O.












20 (Ambiente) MEZCLA INI 21.864
BLANCO 141.939 3.433
NOVO 38.545 6.026
CEPA 47.106 1.921
SOLO 25.045 0.909
BLANCO 147.220 6.949
NOVO 55.348 4.124
CEPA 59.235 1.491
SOLO 38.288 1.772
BLANCO 172.758 7.012
NOVO 108.712 4.972
CEPA 127.152 2.435
SOLO 79.909 1.507
BLANCO 154.591 3.633
NOVO 81.712 5.720
CEPA 116.015 5.859
SOLO 73.515 3.865
70
TEMP C
Tratamiento Enzima
Absorbida(mg/ml)
Promedios con Desviaciones
30
45
55
Desviacin

87






3.4.2.2. Anlisis de la medida de la actividad enzimtica en los tratamientos

A continuacin se muestra el (Grfico 9) de la evolucin de la concentracin del
complejo enzima - sustrato adsorbida sobre el sustrato, a travs de la temperatura para
cada uno de los tratamientos.

Error Actividad Enzimtica = +/- 10 mg/ml
Grfico 9: Evolucin de la enzima absorbida por el sustrato a travs de la temperatura para cada uno de
los tratamientos.

En la grfica anterior se observa que la absorcin de enzima al sustrato que se presenta
en mayor cantidad en los 3 tratamientos, es la del tratamiento de cepa; seguida de la
del tratamiento con la enzima y finalmente, la que menor actividad enzimtica presenta
es la de la fermentacin endgena.
De igual forma se observa que los tres tratamientos presentan el mismo
comportamiento del patrn. Inician en 30C con una actividad relativamente baja,
continan con una actividad a una temperatura de 45 C ms alta y alcanzan su pico en
55 C (temperatura que de acuerdo a la enzima celluclast es la de mayor actividad
enzimtica) y finalmente en 70C la actividad desciende para los tres tratamientos.

A continuacin se presenta la Tabla N 27 que expresa la diferencia en % de actividad
enzimtica entre tratamientos para poder tener una mejor interpretacin de lo que
sucede con la actividad enzimtica.

Evolucin de la Actividad enzimatica frente a la temperatura
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (C)
E
n
z
i
m
a

a
b
s
o
r
b
i
d
a

p
o
r

e
l

s
u
s
t
r
a
t
o

(
m
g
/
m
l
)
Tratamiento4 Tratamiento1 Tratamiento2 Tratamiento3

88






Tabla N 27 Diferencia en % de actividad enzimtica entre tratamientos

De acuerdo a estos porcentajes se puede observar que entre el tratamiento 2 y 1 las
diferencias se encuentran entre el 28 y el 41%, mientras que las diferencias entre los
tratamientos 2 y 3, y 1 y 3 se encuentran entre el 54 y el 80%, de esta forma se
observa de una manera ms palpable que el tratamiento 1 no tiene ninguna diferencia
con el tratamiento 2, lo que indica que en el momento de realizar un compostaje lo
mejor es aislar la cepa y sembrarla. Por otro lado el tratamiento2 y el tratamiento3, si
presentan un porcentaje alto de diferencia (54-88%), lo que indica que es mejor realizar
un compostaje iniciando con una siembra de cepa que se haya aislado posteriormente
que hacerlo sin la cepa. Y por ltimo entre el tratamiento 1 y el 3, la diferencia que se
presenta tambin es alta (36-53.9%) lo que muestra que es mejor aadir enzima al
tratamiento que dejarlo con su fermentacin endgena.


3.4.3. Medida de la absorbancia en el ensayo con sonicacin

3.4.3.1. Resultados de la medida de la absorbancia en el ensayo con sonicacin

Los resultados obtenidos al utilizar el proceso de sonicacin se muestran el Anexo P.


3.4.3.2. Anlisis de la medida de la absorbancia en el ensayo con sonicacin

A continuacin se muestra un cuadro (Tabla N 28) comparativo con las respectivas
desviaciones estndar entre la cantidad de enzima - sustrato adsorbida respecto del
tratamiento con sonicacin y sin sonicacin.

T1-T2 T2-T3 T1-T3
30 18,17 88,08 53,90
45 7,02 54,71 44,56
55 16,96 59,12 36,04
70 41,98 57,81 11,15
% de diferencia entre tratamientos
Temperatura C

89






Tabla N 28: Cuadro comparativo con las respectivas desviaciones estndar entre la medida de actividad
enzimtica con sonicacin y sin sonicacin

Las desviaciones estndar se encuentran entre 4.457 y 6.359, lo que indica que si existe
diferencia al realizar el ensayo de sonicacin, debido ninguna de estas desviaciones
tiende a cero. En los grficos se observa que la medida de la actividad enzimtica es
mayor en los ensayos con sonicacin, comparados con los que no tienen este proceso
de rompimiento celular, esto se debe a que en los ensayos en los cuales no se hizo la
sonicacin, la lectura de la actividad enzimtica es ms baja, porque el desprendimiento
del complejo enzima-sustrato a la solucin buffer, no se da en su totalidad.

Las grficas comparativas del procedimiento con sonicacin y sin sonicacin se
muestran en el Anexo 17


3.4.4. Medida de la absorbancia en el complejo CMC + cepa

3.4.4.1. Resultados de la medida de la absorbancia en el complejo CMC + cepa

Tabla de los promedios de las concentraciones enzimticas con las respectivas
desviaciones de los resultados obtenidos en los triplicados (Tabla N 29)

Tabla N 29: Promedios de las concentraciones enzimticas con las respectivas desviaciones de los
resultados obtenidos en los triplicados



TEMP C PROM. CONC (mg/ml) DESV. ESTNDAR
30 112,470 4,860
45 130,197 4,731
55 142,773 4,545
70 130,500 2,405
NOVO 1,301 47,318 38,545 6,203
CEPA 1,320 55,955 47,106 6,257
SOLO 1,271 33,682 25,045 6,107
NOVO 1,335 62,773 55,348 5,250
CEPA 1,347 68,227 59,235 6,359
SOLO 1,295 44,591 38,288 4,457
NOVO 1,453 116,409 108,712 5,443
CEPA 1,494 135,045 127,152 5,582
SOLO 1,391 88,227 79,909 5,882
CON SONICACIN VS SIN SONICACIN
DESV.
ESTNDAR
55
45
30
TEMP C MUESTRA ABS CONC (mg/ml) CON
SONICACIN
CONC (mg/ml) SIN
SONICACIN

90








3.4.4.2. Anlisis de la medida de la absorbancia en el tratamiento CMC + cepa
A continuacin se muestra un grfico (Grfico N 10) con la actividad enzimtica CMC +
cepa comparada con los dems tratamientos



Error actividad Enzimtica = +/- 10 mg/ml
Grfico N 10: Actividad enzimtica CMC + cepa comparada con los dems tratamientos


De acuerdo a los resultados obtenidos en este grfico; se observa nuevamente que la
cepa si posee actividad enzimtica, como se muestra en el tratamiento 2 y en el
tratamiento de cepa + CMC. Este tratamiento 2 presenta la mayor actividad celuloltica
(112 142 mg/ml) al ser comparado con el blanco o patrn, y en este grfico anterior
el complejo de CMC + CEPA muestra la mayor actividad enzimtica comparada con el
blanco o patrn.

3.4.5 Determinacin de la constante de afinidad
3.4.5.1 Resultados de la determinacin de la constante de afinidad.

A continuacin se presenta la tabla de datos obtenida en la lectura realizada durante 2
horas cada 5 minutos para este tratamiento.




Evolucin de la Actividad enzimatica frente a la temperatura
0
50
100
150
200
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (C)
E
n
z
i
m
a

a
b
s
o
r
b
i
d
a

p
o
r

e
l
s
u
s
t
r
a
t
o

(
m
g
/
m
l
)
Tratamiento4 Tratamiento1 Tratamiento2 Tratamiento3 CMC + Cepa

91






Tabla N 30: Lectura realizada durante 2 horas cada 5 minutos (CMC + Novozymes)




















Tiempo Promedio Absorbancia Ln (Abs)
0 1,5627 1,5629 1,5632 1,563 0,1939
5 1,5577 1,5579 1,5582 1,558 0,1925
10 1,5588 1,5585 1,5585 1,559 0,1927
15 1,5567 1,5567 1,557 1,557 0,1922
20 1,5556 1,5555 1,5558 1,556 0,1919
25 1,5489 1,5496 1,5498 1,549 0,1902
30 1,5452 1,5454 1,5454 1,545 0,1890
35 1,545 1,5447 1,5442 1,545 0,1888
40 1,5401 1,5402 1,5407 1,540 0,1876
45 1,5338 1,5341 1,5343 1,534 0,1858
50 1,5317 1,5321 1,5324 1,532 0,1853
55 1,5338 1,5338 1,5336 1,534 0,1857
60 1,527 1,527 1,527 1,527 0,1838
65 1,5259 1,5261 1,5263 1,526 0,1836
70 1,5235 1,5237 1,5235 1,524 0,1829
75 1,5244 1,5247 1,5247 1,525 0,1832
80 1,521 1,5208 1,5206 1,521 0,1821
85 1,5225 1,5217 1,5209 1,522 0,1823
90 1,5183 1,5186 1,5188 1,519 0,1814
95 1,5165 1,5166 1,5166 1,517 0,1809
100 1,5148 1,5153 1,5155 1,515 0,1805
105 1,5137 1,5137 1,5139 1,514 0,1801
110 1,5126 1,5126 1,5126 1,513 0,1797
115 1,511 1,5109 1,5109 1,511 0,1792
120 1,5091 1,5091 1,5093 1,509 0,1787
Absorbancia

92







A continuacin se presenta la grfica obtenida con su respectiva ecuacin:

Grfico N 11: Comportamiento de la enzima Celluclast frente al tiempo.

3.4.5.2. Anlisis de la determinacin de la constante de afinidad.

De acuerdo a la grfica y a la ecuacin obtenida se determin la siguiente constante de
afinidad K = -( -0.0001*2.303) = 2.3 * 10
-4
. El valor de esta constante indica que la
afinidad de la enzima con el sustrato esta dentro del rango normal establecido para este
tratamiento, el cual se encuentra entre 2.0 * 10
-4
y 2.5 *10
-5
. Reportado para estudios
con sustratos slidos, segn Lee R, (2002).


3.4.6 Resultados y Anlisis del diseo experimental

De acuerdo con el objetivo experimental, se tienen los siguientes resultados, obtenidos
con el uso del software estadstico SAS y Splus.

Verificacin del ajuste del modelo propuesto
Como primera medida, se propone un modelo en donde se tiene que la actividad
enzimtica, depende del tratamiento al cual es sometido a diferentes temperaturas.
Estadsticamente, el modelo tiene la forma:
y
ijk
= +
i
+
j
+
ijk


The GLM Pr ocedur e
Dependent Var i abl e: Act i vi dad
Sumof
Sour ce DF Squar es Mean Squar e F Val ue Pr > F
Ln (Enzima Adsorbida) frente al tiempo
y = -0,0001x + 0,1931
R
2
= 0,9682
0,1760
0,1780
0,1800
0,1820
0,1840
0,1860
0,1880
0,1900
0,1920
0,1940
0,1960
0 20 40 60 80 100 120
Tiempo en minutos
L
n

(
E
n
z
i
m
a

C
e
l
l
u
c
l
a
s
t

a
d
s
o
r
b
i
d
a
s
o
b
r
e

e
l

s
u
s
t
r
a
t
o

C
M
C
)


93






Model 6 95819. 7725 15969. 9621 137. 64 <. 0001
Er r or 41 4756. 9896 116. 0241
Cor r ect ed Tot al 47 100576. 7621





R- Squar e Coef f Var Root MSE Act i vi dad Mean
0. 952703 11. 74723 10. 77145 91. 69354

Sour ce DF Type I SS Mean Squar e F Val ue Pr > F
TRATAMI ENTO 3 68979. 14432 22993. 04811 198. 17 <. 0001
Temper at ur a 3 26840. 62817 8946. 87606 77. 11 <. 0001

De los resultados anteriores se puede notar que el valor de R
2
explica el 95.27% la
variabilidad de los datos, (en otras palabras, por los menos los factores tratamiento y
temperatura). Esto implica en primera instancia que al parecer el modelo propuesto
es adecuado para explicar el comportamiento de la variabilidad de la actividad
enzimtica.
Tambin se puede verificar el p-valor, el cual indica que la probabilidad de rechazar
la hiptesis que los tratamientos y la temperatura no explican el comportamiento de
la actividad enzimtica es menor que 0.0001, el cual a su vez es menor que 0.05 que
es el nivel de significancia con el que se est trabajando.
Sin embargo, esto no es suficiente para concluir, es necesario revisar otras pruebas
que se mostrarn a continuacin.

Pruebas de normalidad y homogeneidad de varianza

Test s f or Nor mal i t y

Test - - St at i st i c- - - - - - - - p Val ue- - - - - -
Shapi r o- Wi l k W 0. 977706 Pr < W 0. 7871
Kol mogor ov- Smi r nov D 0. 093601 Pr > D >0. 8500
Ander son- Dar l i ng A- Sq 0. 250286 Pr > A- Sq >0. 7500

Uno de los supuestos sobre los cuales est construida la teora estadstica es el
hecho que los residuales del modelo propuesto obedecen a una distribucin normal
con media cero y varianza
2
constante.

o Prueba grfica

The UNI VARI ATE Pr ocedur e
Var i abl e: r

Nor mal Pr obabi l i t y Pl ot
21+ ++*
| *+
17+ * *+
| ++
13+ ****
| ++
9+ **
| **
5+ **
| **
1+ ***
| **
- 3+ **
| ***
- 7+ +*
| +***
- 11+ ****
| ***
- 15+ *++
| *++
- 19+ * ++

94






+- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +- - - - +
- 2 - 1 0 +1 +2





o Prueba de Shapiro Wilks
Tenemos que para la hiptesis nula planteada, residuales con distribucin normal, el
coeficiente W (0.9770) al compararlo con el coeficiente W
tabla
(0.929) con nivel de
significancia 0.01 y n = 48 es mayor que el calculado, por tanto existe evidencia para
afirmar con un nivel de significancia del 0.01 que los residuales provienen de una
poblacin que tiene distribucin normal.

o Prueba de Kolmogorov Smirnov
Tenemos que para la hiptesis nula planteada, residuales con distribucin normal, el
coeficiente D (0.0936) al compararlo con el coeficiente D
tabla
(0.1488) con nivel de
significancia 0.01 y n = 48 es menor que el calculado, por tanto existe evidencia para
afirmar con un nivel de significancia del 0.01 que los residuales provienen de una
poblacin que tiene distribucin normal.

o Prueba de Anderson Darling
Tenemos que para la hiptesis nula planteada, residuales con distribucin normal, el
coeficiente A
2
(0.2501) al verificarlo con el p-valor, se encuentra que la probabilidad de
no-rechazar la hiptesis de datos provenientes de una distribucin normal es mayor que
0.75 con un nivel de significancia de 0.10, por tanto, existe evidencia para afirmar con
un nivel de significancia del 0.10 que los residuales provienen de una poblacin que
tiene distribucin normal.

o Prueba de Bartlett de homogeneidad de varianza
Tenemos que para las hiptesis planteadas, varianza de cada tratamiento igual una con
la otra, vs. varianza de al menos un tratamiento diferente de las otras, se tiene H
0
:
1
2
=

2
2
=
3
2
=
4
2
=
2
vs. H
0
: al menos un
i
2
diferente, el estadstico de prueba
( ) ( )
( )
( )
2
1 4
1
4
1
4
1
2 2
4
1
1
1
1
1
1 4 3
1
1
ln 1 ln 1

=
=
= =

k
i
i
i i
i
i i p
i
i
r
r
s r s r
Q
Q = 1.39545
3
2
= 2.353
Indica que la hiptesis de homogeneidad dentro del grupo de varianzas no se debe
rechazar, ya que el Q calculado es menor que el valor
3
2
, por tanto existe evidencia con
un nivel de significancia de 0.05 que la varianza es homognea.


95








Pruebas de autocorrelacin
Uno de los supuestos en el modelo de regresin es que los trminos de error
i
y
j
,
asociados con la i-sima y j-sima observacin son no correlacionados. Sin
embargo, al recolectar los datos y al hacer el diseo del experimento, se nota cierta
correlacin de los datos ya que el experimento se monta modificando las
temperaturas sobre la muestra. Por esta razn se propone la verificacin de la
existencia de correlacin con la prueba de Durbin-Watson.
Planteamos la hiptesis nula de errores no correlacionados vs. la hiptesis alternativa
correlacin mayor que cero, y ahora verificaremos si la hiptesis es rechazada o no.


The AUTOREG Pr ocedur e

Dependent Var i abl e Act i vi dad

Or di nar y Least Squar es Est i mat es

SSE 35216. 6225 DFE 45
MSE 782. 59161 Root MSE 27. 97484
SBC 464. 539181 AI C 458. 925578
Regr ess R- Squar e 0. 6499 Tot al R- Squar e 0. 6499
Durbin-Watson 2.0735

Al revisar los resultados encontrados se nota que como d
U
= xxx < DW = 2.0735 <
4 d
L
= xxx existe evidencia estadstica para no rechazar la hiptesis de no
correlacin de los residuales con un nivel de significancia 0.05. Los valores d
U
y d
L

son tomados de una tabla llamada tabla de DurbinWatson.

Pruebas de diferencias entre los tratamientos
Una vez verificados cada uno de los supuestos sobre los cuales est construida la
teora estadstica que sustenta el modelo propuesto, procedemos ahora s, a probar
la hiptesis de inters del experimento, existencia o no de diferencia entre los
distintos tratamientos en los diferentes niveles de temperatura, y diferencias con el
tratamiento control (o blanco).

The GLM Pr ocedur e
Dunnet t ' s t Test s f or Act i vi d
NOTE: Thi s t est cont r ol s t he Type I exper i ment wi se er r or f or compar i sons of al l t r eat ment s
agai nst a cont r ol .

Al pha 0. 05
Er r or Degr ees of Fr eedom 41
Er r or Mean Squar e 116. 0241
Cr i t i cal Val ue of Dunnet t ' s t 2. 43916
Mi ni mumSi gni f i cant Di f f er ence 10. 726

Compar i sons si gni f i cant at t he 0. 05 l evel ar e i ndi cat ed by ***.

Di f f er ence
TRAT Bet ween Si mul t aneous 95%
Compar i son Means Conf i dence Li mi t s
3 - 1 - 66. 751 - 77. 477 - 56. 025 ***
2 - 1 - 83. 049 - 93. 775 - 72. 323 ***
4 - 1 - 99. 939 - 110. 665 - 89. 213 ***

96








CONCLUSI ONES

El estudio de la actividad enzimtica celuloltica en la etapa termfila del sustrato se
analiz en relacin con los diferentes parmetros fisicoqumicos medidos, los resultados
y anlisis generan las siguientes conclusiones:

Se determinaron las cantidades especficas de materia prima que constituyan un
sustrato y las condiciones adecuadas (pH, Carbono, Nitrgeno y humedad) en las
cuales se realiza la fermentacin en estado slido (compostaje).

Se dise un experimento inducido de un sistema de compostaje a nivel de
laboratorio, para simular y controlar las condiciones de actividad enzimtica
celuloltica en la etapa termfila (45 C 70 C). Comparado con un diseo
blanco o patrn (Complejo Enzimtico: CMC
16
+ enzima patrn
17
).

Se definieron las metodologas de medicin cuantitativa de la actividad
celuloltica, las cuales se consideran pueden ser utilizadas en otros tipos de
sustrato.

Se obtuvo en el espectofotmetro la curva patrn de calibracin de la enzima
celulasa para posteriormente realizar el clculo de la actividad celuloltica en los
diferentes complejos enzimticos a montar; obteniendo un r = 0.9593 que se
encuentra dentro de los mrgenes establecidos experimentalmente.

Se determin cuantitativamente la actividad celuloltica durante la etapa termfila
en cada uno de los tratamientos. Observando que el tratamiento que presenta las
mejores condiciones de similitud con el patrn es el tratamiento 2.

Se midieron las transformaciones bioqumicas que se presentan durante el
proceso con los siguientes parmetros: humedad, pH, relacin C/N y cenizas. El
pH tuvo un aumento hasta la temperatura de 55C y luego present un descenso
hasta la temperatura de 60C, la relacin C/N disminuy a lo largo del proceso, el
contenido de cenizas aument, y la humedad disminuy. El comportamiento de
estos parmetros fisicoqumicos se encontr dentro de los rangos establecidos
para que se desarrolle el compostaje a excepcin de la humedad, pues al final del
proceso (70C), el contenido de agua en las muestras fue muy bajo, lo que
afect el desarrollo natural del compostaje.



16
CMC carboximetilcelulosa: Sustrato polisacrido especfico para determinar la accin cuantitativa de la enzima celulasa.
17
Enzima Comercial Celluclast, suministrada por la empresa Novozymes

97






RECOMENDACI ONES

Como recomendaciones para la elaboracin de futuros trabajos de grado e
investigaciones ms finas en torno a la medida de la actividad enzimtica celuloltica se
recomienda:

Aspectos a Cuidar:
Se recomienda en la metodologa de cuantificacin de la actividad enzimtica, que si
si el azul Coomassie se va a mantener en nevera (4C), en el momento en el cual se
va a realizar la lectura en el espectofotmetro, es conveniente calentar el reactivo a
temperatura ambiente, para tener una mejor lectura en el equipo.

Para Investigaciones Posteriores:

Al finalizar el proceso de compostaje el contenido de agua en los tres tratamientos
fue muy bajo, lo que trajo como consecuencia que se presentara ningn actividad
microbiana baja, por esta razn seria conveniente realizar cambios en las
condiciones de operacin del proceso con el fin de evitar que se presenten cambios
bruscos en la humedad que no permitan un buen desarrollo durante el proceso de
compostaje.

Desarrollar una medida espectofotomtrica de la actividad enzimtica a diferentes
temperaturas.

En este estudio se observ que la cepa extrada en la siembra del sustrato
balanceado de papa R - 12, posee una actividad enzimtica alta, comparada con el
tratamiento patrn (CMC + enzima Novo) y los otros tratamientos, es preciso
realizar un estudio especfico sobre esta cepa para poder determinar su clase y
condiciones ptimas de actividad.

Es conveniente investigar una metodologa para leer absorbancias en fibra, ya que
sta no es soluble, y su lectura en el espectofotmetro no es posible.











98






BI BLI OGRAF A

AUBERT, C. El huerto biolgico. Ed. Integral Barcelona 1998.
BALLESTEROS G, BENDECK, M Variacin de parmetros fisicoqumicos durante un
proceso de compostaje .Revista Colombiana de Quimica, volumen 28, N1. 1999.
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1995.pg 12-18.
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99






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2000.
www.abcagro.com
www.emison.com (activo, marzo 2002)
www.redepapa.org









100






ANEXOS

DATOS PRIMARI OS DE LOS RESULTADOS EXPERIMENTALES

ANEXO A


Tabla de resultados. Determinacin del pH para los tratamientos 1, 2 y 3
Ensayos Tratamientos pH
NOVO 3.91
CEPA 3.69 E1 30
SOLO 3.77
NOVO 3.89
CEPA 3.58 E2 30
SOLO 3.74
NOVO 3.93
CEPA 3.64 E3 30
SOLO 3.81
NOVO 4.89
CEPA 4.70 E1 45
SOLO 4.89
NOVO 4.88
CEPA 4.67 E2 45
SOLO 4.87
NOVO 4.90
CEPA 4.65 E3 45
SOLO 4.92
NOVO 5.40
CEPA 5.03 E1 55
SOLO 5.31
NOVO 5.36
CEPA 5.01 E2 55
SOLO 5.32
NOVO 5.38
CEPA 4.97 E3 55
SOLO 5.27
NOVO 5.17
CEPA 4.38 E1 70
SOLO 4.68
NOVO 5.12
CEPA 4.36 E2 70
SOLO 4.66
NOVO 5.11
CEPA 4.39 E3 70
SOLO 4.70


101










Tabla de resultados. Determinacin del pH para el blanco o patrn


Complejo
Patrn
pH
E1 30 4.01
E2 30 4.05
E3 30 3.99
E1 45 4.98
E2 45 5.01
E3 45 5.03
E1 55 5.50
E2 55 5.56
E3 55 5.43
E1 70 5.23
E2 70 5.19
E3 70 5.21






























102









ANEXO B
Grficas de los triplicados en la determinacin de pH para cada tratamiento.

Grfica N1

Grfica N2



Ensayos pH Tratamiento1
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
4,80
5,00
5,20
5,40
5,60
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
p
H
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3
Ensayos pH Tratamiento2
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
4,80
5,00
5,20
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
p
H
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3

103









Grfica N3



Grfica N4





Ensayos pH Tratamiento3
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
4,80
5,00
5,20
5,40
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
p
H
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3
Ensayos pH Tratamiento4
3,80
4,00
4,20
4,40
4,60
4,80
5,00
5,20
5,40
5,60
5,80
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
p
H
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3

104








ANEXO C
Desecacin en estufa (Determinacin de Humedad)
Ensayo Peso Cpsula
(g)
Peso Residuo
(g)
Peso Cpsula +
Residuo (g)
Peso Residuo
Seco (g)
Peso Agua Retirada
(g)
% Humedad
E1 30 N 32.3354 2.0212 32.9451 0.6097 1.4115 70.08%
E1 30 C 25.9244 2.0012 26.4861 0.5617 1.4395 72.18%
E1 30 S 27.1188 2.0898 27.7876 0.6688 1.421 68.25%
E2 30 N 32.0854 2.0207 32.7451 0.6597 1.361 67.60%
E2 30 C 25.6744 2.0007 26.2861 0.6117 1.389 69.68%
E2 30 S 26.8688 2.0893 27.5876 0.7188 1.3705 65.85%
E2 45 N 33.2455 2.0475 34.1753 0.9298 1.1177 54.84%
E2 45 C 26.1055 2.08 26.8063 0.7008 1.3792 66.56%
E2 45 S 32.9285 2.0394 33.7549 0.8264 1.213 59.73%
E2 55 N 31.8800 2.0419 32.8202 0.9402 1.1017 54.20%
E2 55 C 31.4984 2.0124 32.3638 0.8654 1.147 57.25%
E2 55 S 32.4783 2.0067 33.7133 1.235 0.7717 38.71%
E3 30 N 24.5644 2.0022 25.0949 0.5305 1.4717 73.75%
E3 30 C 31.8224 2.0683 32.5278 0.7054 1.3629 66.14%
E3 30 S 26.0570 2.0048 26.8107 0.7537 1.2511 62.66%
E3 45 N 31.8967 2.016 32.5783 0.6816 1.3344 66.44%
E3 45 C 31.8759 2.066 32.6913 0.8154 1.2506 60.78%
E3 45 S 32.9047 2.0403 33.7886 0.8839 1.1564 56.93%
E3 55 N 39.5823 2.0918 40.8821 1.2998 0.792 38.11%
E3 55 C 31.4799 2.0368 32.4283 0.9484 1.0884 53.69%
E3 55 S 31.8069 2.0581 33.2074 1.4005 0.6576 32.20%









105







ANEXO D
Grfico con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin de
humedad.

Grfica N5

Grfica N6



Ensayos Humedad Tratamiento1
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
%

H
u
m
e
d
a
d
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3
Ensayos Humedad Tratamiento3
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
H
u
m
e
d
a
d
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3

106












Grfica N7





















Ensayos Humedad Tratamiento2
0,00%
10,00%
20,00%
30,00%
40,00%
50,00%
60,00%
70,00%
80,00%
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura
H
u
m
e
d
a
d
Ensayo1
Ensayo2
Ensayo3

107













ANEXO E

Tabla de resultados. Determinacin de Carbono
Ensayos Peso Muestra
Seca (g)
Volumen
Titulacin Blanco
(ml)
Volumen Titulacin
Ensayo (ml)
% de Carbono
Bh
g C/100g
muestra seca
Bs
E 30 N 0.0316 9.1 9.3 15.19 3.62
E 30 C 0.0317 9.1 9.3 15.14 2.80
E 30 S 0.0317 9.1 9.3 15.14 2.53
E1 70 N 0.0309 9.1 9.2 7.77 0.54
E1 70 C 0.0384 9.1 9.2 6.25 0.43
E1 70 S 0.0343 9.1 9.2 7.00 0.48
E2 70 N 0.0342 9.1 9.2 7.02 0.49
E2 70 C 0.0309 9.1 9.2 7.77 0.54
E2 70 S 0.0309 9.1 9.2 7.77 0.54
E3 70 N 0.0362 9.1 9.2 6.63 0.46
E3 70 C 0.0314 9.1 9.2 7.64 0.53
E3 70 S 0.0377 9.1 9.2 6.37 0.45


















108















ANEXO F

Grficas de los triplicados en la determinacin de carbono.
Grfica N8
Grfica N9

Tratamiento1 gC/100g muestra seca Vs Temperatura
0,00%
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
2,50%
3,00%
3,50%
4,00%
Temperatura
g
C
/
1
0
0
g

m
u
e
s
t
r
a

s
e
c
a
Ensayo1 3,62% 0,54%
Ensayo2 3,62% 0,49%
Ensayo3 3,62% 0,46%
30 70
Tratamiento2 % COT Bs Vs Temperatura
0, 00%
0, 50%
1, 00%
1, 50%
2, 00%
2, 50%
3, 00%
Temperatura
g
C
/
1
0
0
g

m
u
e
s
t
r
a

s
e
c
a
Ensayo1 2, 80% 0, 43%
Ensayo2 2, 80% 0, 54%
Ensayo3 2, 80% 0, 53%
30 70

109












Grfica N10




















Tratamiento3 gC/100g muestra seca Vs Temperatura
0,00%
0,50%
1,00%
1,50%
2,00%
2,50%
3,00%
Temperatura
g
C
/
1
0
0
g

m
u
e
s
t
r
a

s
e
c
a
Ensayo1 2,53% 0,48%
Ensayo2 2,53% 0,54%
Ensayo3 2,53% 0,45%
30 70

110













ANEXO G
Resultados Determinacin de Nitrgeno

Normalidad HCl = 0.407






















E1 20 (ambiente) MEZCLA INICIAL 1,995 1995 0,20 0,57 73,01
NOVO 1,978 1978 0,23 0,66 70,08
CEPA 1,895 1895 0,25 0,75 72,18
SOLO 2,012 2012 0,27 0,76 68,25
NOVO 2,02 2020 0,17 0,48 10,07
CEPA 1,988 1988 0,17 0,49 9,17
SOLO 2,001 2001 0,20 0,57 9,81
NOVO 1,995 1995 0,16 0,46 10,77
CEPA 1,989 1989 0,22 0,63 10,03
SOLO 2,052 2052 0,24 0,67 10,14
NOVO 1,952 1952 0,14 0,41 10,39
CEPA 1,968 1968 0,21 0,61 9,92
SOLO 1,986 1986 0,19 0,55 11,14
30
70
70
70
E1
E2
E3
E1
g agua por 100 g
producto humedo
g N por 100 g
producto humedo
N de Ensayo Temperatura
(C)
Complejo Peso muestra
(g)
Peso muestra
(mg)
Titulacin
(ml)

111















ANEXO H

Grficos con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin del
porcentaje de Nitrgeno (BS).

Grfica N11


Grfica N12



g N / 100 g de producto seco vs T - Tratamiento1
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
30 70
Temperatura (C)
g

N

/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o
s
e
c
o
E1 E2 E3
g N / 100 g de producto seco - Tratamiento3
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
30 70
Temperatura (C)
g

N

/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o
s
e
c
o
E1 E2 E3

112






Grfica N13





























g N / 100 g de producto seco vs T - Tratamiento2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
30 70
Temperatura (C)
g

N

/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o
s
e
c
o
E1 E2 E3

113









ANEXO I

Tabla de Resultados. Relacin C/N


















E1 20 (Ambiente) MEZCLA INICIAL
0,57 15,95 27,92
NOVO 0,66 15,19 22,93
CEPA 0,75 15,14 20,22
SOLO 0,76 15,14 19,80
NOVO 0,48 7,77 16,11
CEPA 0,49 6,25 12,83
SOLO 0,57 7,00 12,29
NOVO 0,46 7,02 15,36
CEPA 0,63 7,77 12,33
SOLO 0,67 7,77 11,66
NOVO 0,41 6,63 16,22
CEPA 0,61 7,64 12,57
SOLO 0,55 6,37 11,69
g N por 100 g
producto humedo
g C por 100 g
producto humedo
Relacin
C/ N
70
70
E1
E1
E2
E3
30
70
N de
Ensayo
Temperatura
(C)
Complejo

114






ANEXO J

Grficos con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin de la
relacin C/N.
Grfica N14


Grfica N15





Relacin C/N vs T - Tratamiento1
0
5
10
15
20
25
30 70
Temperatura (C)
R
e
l
a
c
i

n

C
/
N
E1 E2 E3
Relacin C/N vs T - Tratamiento2
0
5
10
15
20
25
30 70
Temperatura (C)
R
e
l
a
c
i

n

C
/
N
E1 E2 E3

115







Grfica N16
























R e l aci n C/ N vs T - T ra t a m i e n t o 3
0
5
1 0
1 5
2 0
2 5
30 70
T em p er at u r a ( C)
R
e
l
a
c
i

n

C
/
N
E 1 E 2 E 3

116







ANEXO K
Las cantidades de ceniza que obtenidas para cada uno de los tratamientos.















20 (Ambiente) MUESTRA INICIAL 17,139 3,519 17,165 0,725 73,01 2,685
NOVO 17,551 3,091 17,579 0,920 70,08 3,076
CEPA 19,269 3,080 19,302 1,081 72,18 3,887
SOLO 17,230 2,998 17,261 1,048 68,25 3,299
NOVO 17,171 3,033 17,213 1,405 63,87 3,887
CEPA 17,684 3,021 17,722 1,271 65,35 3,669
SOLO 15,710 3,023 15,749 1,287 64,66 3,641
NOVO 17,488 3,068 17,550 2,018 55,37 4,521
CEPA 17,154 3,071 17,207 1,742 51,39 3,583
SOLO 16,751 3,016 16,812 2,023 47,66 3,864
NOVO 17,693 3,031 17,814 3,995 10,07 4,442
CEPA 17,566 3,068 17,680 3,739 9,17 4,117
SOLO 13,503 3,145 13,623 3,797 9,81 4,209
NOVO 16,639 3,019 16,665 0,845 67,6 2,607
CEPA 20,680 3,099 20,708 0,884 69,68 2,916
SOLO 16,682 3,032 16,717 1,141 65,85 3,342
NOVO 12,768 3,022 12,818 1,654 54,84 3,663
CEPA 14,989 3,088 15,026 1,205 66,56 3,603
SOLO 16,595 3,030 16,638 1,426 59,73 3,541
NOVO 17,929 3,210 17,995 2,056 54,2 4,489
CEPA 15,401 3,009 15,454 1,772 57,25 4,144
SOLO 18,353 3,028 18,431 2,563 38,71 4,181
NOVO 17,691 3,025 17,820 4,255 10,77 4,768
CEPA 17,691 3,031 17,814 4,051 10,03 4,503
SOLO 14,735 3,007 14,838 3,426 10,14 3,812
NOVO 18,462 3,163 18,494 0,993 73,75 3,782
CEPA 17,858 3,060 17,897 1,281 66,14 3,784
SOLO 17,777 2,963 17,812 1,188 62,66 3,181
NOVO 16,869 3,109 16,912 1,364 66,44 4,064
CEPA 18,470 3,004 18,510 1,338 60,78 3,412
SOLO 17,230 2,998 17,274 1,481 56,93 3,439
NOVO 31,841 3,089 31,928 2,833 38,11 4,577
CEPA 16,613 3,052 16,678 2,113 53,69 4,563
SOLO 17,712 3,018 17,776 2,107 32,2 3,108
NOVO 17,698 3,029 17,820 4,028 10,39 4,495
CEPA 26,010 3,110 26,126 3,707 9,92 4,115
SOLO 32,882 3,047 33,002 3,965 11,14 4,462
g de agua/ 100 g de
producto hmedo
g Ceni za/ 100 g de
producto seco
Peso
cri sol (g)
Peso
muestra (g)
Peso cri sol y
ceni za (g)
g Ceni za/ 100 g de
producto hmedo
E1
N de
Ensayo
Temperatura
(C)
Compl ej o
70
30
45
55
70
55
70
E2
30
45
Tabl a de datos
E3
30
45
55

117








ANEXO L

Grficos con los triplicados para cada uno de los tratamientos en la determinacin de
cenizas.


Grfica N17

Grfica N18



g Ceniza/ 100 g de producto seco vs T - Tratamiento1
3
4
5
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (C)
g

C
e
n
i
z
a
/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o

s
e
c
o
E1 E2 E3
g Ceniza/ 100 g de producto seco vs T - Tratamiento2
3
4
5
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (C)
g

C
e
n
i
z
a
/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o

s
e
c
o

E1 E2 E3

118







Grfica N19





























g Ceniza/ 100 g de producto seco vs T -
Tratamiento3
3
4
5
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (C)
g

C
e
n
i
z
a
/

1
0
0

g

d
e

p
r
o
d
u
c
t
o

s
e
c
o

E1 E2 E3




ANEXO M
Tabla de Resultados. Porcentaje de fibra seca.



20 (Ambiente) MEZCLA INICIAL 2,116 73,01 21,926 21,970 21,950 0,0437 0,024
NOVO 2,220 10,07 21,885 21,996 21,980 0,1114 0,095
CEPA 2,107 9,17 21,834 21,860 21,848 0,0258 0,014
SOLO 2,160 9,81 22,221 22,365 22,347 0,1436 0,126
NOVO 2,120 10,77 22,308 22,348 22,329 0,040 0,021
CEPA 2,240 10,03 22,490 22,522 22,507 0,032 0,017
SOLO 2,190 10,14 22,836 22,878 22,854 0,042 0,018
NOVO 2,113 10,39 22,071 22,105 22,089 0,034 0,018
CEPA 2,230 9,92 22,187 22,258 22,244 0,071 0,057
SOLO 2,175 11,14 22,529 22,622 22,601 0,093 0,072
E3
E2
Peso fibra
seca (g)
Peso de
cenizas (g)
E1
70
Complejo Peso
muestra (g)
g de agua / 100
g de producto
N de
Ensayo
Temperatur
a C
70
70
Tabla de datos
Peso
crisol i
Peso crisol
con fibra (g)
Peso crisol
con ceniza
ANEXO N
Resultados de absorbancia (cantidad de enzima adherida al sustrato) obtenidos para
cada uno de los tratamientos.
N DE ENSAYO TEMPERATURA C COMPLEJO ABSORBANCIA CONC. (mg/ml )
20 (Ambiente) MEZCLA INICIAL 1,245 21,864
BLANCO 1,511 142,591
NOVO 1,279 37,318
CEPA 1,305 49,136
SOLO 1,250 24,136
BLANCO 1,513 143,659
NOVO 1,309 50,955
CEPA 1,328 59,614
SOLO 1,278 36,864
BLANCO 1,575 171,955
NOVO 1,435 108,227
CEPA 1,472 125,045
SOLO 1,375 80,955
BLANCO 1,536 153,955
NOVO 1,365 76,409
CEPA 1,466 122,455
SOLO 1,359 73,636
BLANCO 1,516 145,000
NOVO 1,270 33,227
CEPA 1,300 46,864
SOLO 1,252 25,045
BLANCO 1,538 155,227
NOVO 1,320 55,955
CEPA 1,330 60,500
SOLO 1,286 40,273
BLANCO 1,563 166,182
NOVO 1,426 104,000
CEPA 1,483 129,818
SOLO 1,374 80,591
BLANCO 1,546 158,500
NOVO 1,375 80,955
CEPA 1,441 111,000
SOLO 1,367 77,318
BLANCO 1,501 138,227
NOVO 1,296 45,091
CEPA 1,297 45,318
SOLO 1,254 25,955
BLANCO 1,511 142,773
NOVO 1,327 59,136
CEPA 1,324 57,591
SOLO 1,280 37,727
BLANCO 1,593 180,136
NOVO 1,448 113,909
CEPA 1,475 126,591
SOLO 1,369 78,182
BLANCO 1,530 151,318
NOVO 1,390 87,773
CEPA 1,449 114,591
SOLO 1,350 69,591
E1
30
30
45
45
55
70
E2
55
70
E3
30
45
55
70
ANEXO O

Actividad enzimtica por triplicado para cada uno de los tratamientos.
Grfico N20

Grfico N21







Actividad Enzimtica (Blanco)
0
50
100
150
200
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temper at ur a (C)
E
n
z
i
m
a

a
d
s
o
r
b
i
d
a

(
m
g
/
m
l
E1 E2 E3
Actividad Enzimtica Tratamiento1
0
20
40
60
80
100
120
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temper at ur a (C)
E
n
z
i
m
a

a
d
s
o
r
b
i
d
a

(
m
g
/
m
l
E1 E2 E3

122






Grfico N22


Grfico N23










Actividad Enzimtica Tratamiento2
0
20
40
60
80
100
120
140
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temper at ur a (C)
E
n
z
i
m
a

a
d
s
o
r
b
i
d
a

(
m
g
/
m
l
E1 E2 E3
Actividad Enzimtica Tratamiento3
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temper at ur a (C)
E
n
z
i
m
a

a
d
s
o
r
b
i
d
a

(
m
g
/
m
l
)
E1 E2 E3

123









ANEXO P

Resultados de la medida de absorbancia obtenidos al utilizar el ultrasonido.



























TEMP C MUESTRA ABS CONC (mg/ml)
NOVO 1,301 47,318
CEPA 1,320 55,955
SOLO 1,271 33,682
NOVO 1,335 62,773
CEPA 1,347 68,227
SOLO 1,295 44,591
NOVO 1,453 116,409
CEPA 1,494 135,045
SOLO 1,391 88,227
SONICACIN
55
45
30

124











ANEXO Q
Grficas comparativas del procedimiento con sonicacin y sin sonicacin.

Grfico N24

Grfico N25





Actividad enzimatica - NOVO
0
50
100
150
30 35 40 45 50 55
Temper at ur a (C)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

d
e

e
n
z
i
m
a

(
m
g
/
m
l
)
Novo Novo(S)
Actividad enzimatica - CEPA
0
20
40
60
80
100
120
140
160
30 35 40 45 50 55
Temperatura (C)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

d
e

e
n
z
i
m
a

(
m
g
/
m
l
)
Cepa Cepa(S)

125






Grfico N26








Actividad enzimatica - SOLO
0
20
40
60
80
100
30 35 40 45 50 55
Temper at ur a (C)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
c
i

n

d
e

e
n
z
i
m
a

(
m
g
/
m
l
)
Solo Solo(S)