MDULO DE PROYECTO

CFGS DE DIRECCIN EN SERVICIOS EN

RESTAURACIN
Cultura Biotecnolgica
DEPARTAMENTO DE HOSTELERA Y TURISMO
Autor: Rafael Cnovas Ruiz
Tutor: Luis
MDULO DE PROYECTO
CFGS DE DIRECCIN EN SERVICIOS EN
RESTAURACIN
Cultura Biotecnolgica del Cultivo de la Vid
DEPARTAMENTO DE HOSTELERA Y TURISMO
Autor: Rafael Cnovas Ruiz
Tutor: Luis Emilio Carmona Ruano
Murcia, junio 2014
CFGS DE DIRECCIN EN SERVICIOS EN
2
ndice
1. Introduccin ............................................................................................... 4
1.1. La Biotecnologa .............................................................................................. 4
1.2. Historia.............................................................................................................. 4
1.3. Importancia de la Biotecnologa...................................................................... 5
1.4. Ventajas ............................................................................................................ 6
1.5. Inconvenientes ................................................................................................. 6
2. Cmo influye la biotecnologa sobre la viticultura ................................. 7
2.1. Introduccin.................................................................................................. 7
2.2. El Vino y su Produccin................................................................................... 8
2.3. Barreras en la Implantacin de Nuevas Tecnologas .................................. 11
3. Agentes biolgicos que intervienen en la vinificacin......................... 13
4. Las Bacterias: definicin y tipos ............................................................ 14
5. Principales Bacterias que intervienen en la vinificacin ..................... 15
5.1. Clasificacin y Caractersticas de las Bacterias Acticas........................... 15
5.1.1. Evolucin en el vino.................................................................................................................16
5.1.2. Mtodos de deteccin.............................................................................................................18
5.1.3. Sistemas de Prevencin...........................................................................................................19
5.1.4. Conclusiones............................................................................................................................21
5.2. Clasificacin y caractersticas de las bacterias lcticas ............................. 21
5.2.1. Bioqumica de la fermentacin malolctica.............................................................................22
5.2.2. Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias lcticas en el vino.................23
5.2.3. Posibles perjuicios de las bacterias lcticas en los vinos.........................................................23
5.2.4. Carbamato de etilo..................................................................................................................24
5.2.5. Causas de no realizacin o retrasos de la fermentacin malolctica......................................25
6. Hongos: definicin y tipos...................................................................... 26
7. Levaduras y fermentacin ...................................................................... 27
7.1 Fisiologa de la fermentacin ......................................................................... 29
7.1.1 Saccharomyces cerevisiae, la estrella.......................................................................................29
7.1.2 Contribucin al color ................................................................................................................30
7.1.3. Parmetros bsicos para una mejor gestin...........................................................................30
7.2. Una levadura para cada tipo de vino ............................................................ 31
7.2.1. La huella gentica....................................................................................................................31
7.2.2. La evolucin de la Saccharomyces: hibridacin.......................................................................32
7.2.3. Como se trabaja.......................................................................................................................33
7.3. Modificacin gentica de levaduras vnicas................................................. 33
7.3.1. Utilizacin de levaduras seleccionadas en la vinificacin........................................................34
7.3.2. Mejora gentica de levaduras vnicas......................................................................................35
3
7.4 Desarrollo de nuevas levaduras ms eficientes ........................................... 37
7.4.1. Mejoras para las denominaciones de origen...........................................................................39
8. Conclusiones finales ............................................................................... 39
Anexo I ............................................................................................................ 41
Anexo II ........................................................................................................... 43
Anexo III .......................................................................................................... 45
Anexo IV.......................................................................................................... 48
Anexo V........................................................................................................... 49
Bibliografa...................................................................................................... 50
Webgrafa........................................................................................................ 52
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1. Introduccin
Antes de empezar a hablar sobre la biotecnologa aplicada a la viticultura,
explicaremos que es la biotecnologa como concepto general, veremos cules
son las ventajas y desventajas que tiene su aplicacin, y analizaremos la
importancia y la repercusin que tiene hoy en da. Entender primero que es la
biotecnologa nos ayudar a entender mejor las aplicaciones que tiene dentro
del mundo de la viticultura y por qu es tan necesaria.
1.1. La Biotecnologa
La biotecnologa es una tecnologa utilizada por el hombre desde hace miles de
aos y consiste principalmente en estudiar y aprovechar los mecanismos e
interacciones de los seres vivos, en especial los unicelulares. La biologa y la
microbiologa son las dos ciencias que conforman la base en la que se asienta
la biotecnologa ya que son las herramientas esenciales con las que trabaja
pero no son las nicas. Veterinaria, medicina, qumica, fsica, ingeniera,
ecologa, agronoma, virologa y gentica entre otras tambin son disciplinas de
la ciencia a las que recurre la biotecnologa. La biotecnologa hoy en da tiene
multitud de usos, pero donde se emplea ampliamente es en agricultura,
farmacia, ciencia de los alimentos, medio ambiente y medicina.
La Organizacin para la Cooperacin y Desarrollo Econmicos (OCDE) define
la biotecnologa como la aplicacin de principios de la ciencia y la ingeniera
para tratamientos de materiales orgnicos e inorgnicos por sistemas
biolgicos para producir bienes y servicios.
El ingeniero hngaro Kroli Ereki fue el primero en acuar este trmino en
1989, al cual hizo referencia en su libro Biotecnologa en la produccin crnica
y lctea de una gran explotacin agropecuaria.
1.2. Historia
El uso de la biotecnologa tiene su origen en el perodo del Neoltico cuando los
seres humanos empiezan a formar asentamientos sedentarios, criar ganado y
cultivar. A lo largo de todo este proceso que se prolong durante miles de aos,
los humanos modificaron las caractersticas genticas de los cultivos y de los
animales que criaban. Para ello creaban o buscaban entornos que reuniesen
una serie de caractersticas especiales en los cules las plantas o los animales
que crecan y se desarrollaban en estos ambientes artificiales se vean
obligados a adaptarse modificndose as su propio ADN. Ms tarde, se
seleccionaban a los mejores especmenes para crear una nueva generacin de
plantas o animales con el fin de acercarse un poco ms al producto final que se
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deseaba conseguir. En el caso de las plantas estas fueron modificadas para
incrementar su rendimiento, mejorar su sabor y alargar la campaa de cultivo.
Mucho ms tarde, en 1830, Friedrich Theodor Schwann y Matthias Jakob
Schleiden formularon juntos la teora celular. Esta estipulaba que todo ser vivo
est compuesto por clulas y en su interior se encuentran los cromosomas que
contienen a su vez el material gentico hereditario (ADN).
En el siglo XX, se hicieron descubrimientos de gran importancia en cuanto a
gentica se refiere. Las leyes de la herencia de Mendel junto con el estudio de
la biologa vegetal han permitido una gran evolucin y mejora de las plantas.
Los descubrimientos de Louis Pasteur en los campos de la medicina y
microbiologa industrial tambin supusieron un aporte importante.
El 90% de las especies vegetales destinadas al consumo humano que se
producen en la actualidad en todo el mundo, han sufrido modificaciones
genticas y pasado por procesos de hibridacin a lo largo de miles de aos por
parte de innumerables generaciones de agricultores decididos a obtener
cosechas de la manera ms eficaz y eficiente posible.
En definitiva, el objetivo que busca alcanzar la biotecnologa no es otro que el
de satisfacer las necesidades de los consumidores que demandan productos
de ms calidad, seguridad y sabor; satisfacer las necesidades de los
agricultores que buscan nuevas formas de incrementar la productividad y
aumentar el margen de beneficios; y satisfacer tambin las necesidades de los
gobiernos o instituciones privadas que tratan de acabar con el hambre en el
mundo, asegurar el futuro del medio ambiente, preservar la biodiversidad y
garantizar la salubridad y la seguridad de los alimentos.
1.3. Importancia de la Biotecnologa
El bienestar humano y la estabilidad social estn directamente relacionados
con los procesos naturales de la Tierra que sustentan la vida. Es indispensable
asegurar la calidad del aire y del agua, disponer de suelos productivos y una
biodiversidad rica en flora y en fauna para asegurar nuestra calidad de vida
actual y la de nuestros descendientes en el futuro.
Por desgracia, nos encontramos en una situacin en la que la poblacin ya
est sobre explotando los recursos de la Tierra. Si a este hecho le sumamos
que para el ao 2030 la poblacin mundial se habr duplicado para alcanzar
cerca de los diez mil millones de habitantes, llegaremos a la conclusin de que
nos encontramos ante un problema al que hay que buscarle soluciones con
carcter de urgencia. La humanidad debe responder a las crecientes presiones
que se ejercen sobre los recursos naturales de la Tierra para poder alimentar a
una poblacin que se encuentra en una continua expansin.
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Por tanto y teniendo en cuenta que se estima que las innovaciones
biotecnolgicas van a triplicar el rendimiento de las cosechas sin requerir
tierras de cultivo adicionales, diremos que la biotecnologa se convertir en la
herramienta que nos permitir salvar los bosques naturales y el hbitat de los
animales. Adems otras innovaciones podran reducir o eliminar la
dependencia en agroqumicos que contribuyen a la degradacin del medio
ambiente, mientras que otras nos ayudarn a preservar el suelo y los recursos
hdricos.
En conclusin, la importancia que tiene la investigacin y el desarrollo de la
biotecnologa y su aplicacin en la agricultura es totalmente innegable. La
mayora de los expertos estn de acuerdo en que el mundo no se puede
permitir el lujo de esperar ms. Si actuamos ahora podremos cubrir las
necesidades futuras de la humanidad, podremos alimentar al mundo durante
los siglos venideros y mejorar la calidad de vida de la poblacin mundial.
1.4. Ventajas
Se obtiene un rendimiento superior. Los cultivos de plantas transgnicas
proporcionan ms alimento utilizando menos recursos, se reduce el
nmero de cosechas perdidas por enfermedad o plagas, as como por
factores ambientales.
Se reduce el empleo de plaguicidas. Los cultivos de plantas
transgnicas son ms resistentes a las plagas contribuyendo as a
reducir el uso de plaguicidas que suelen ser causantes de grandes
daos a la salud y al medio ambiente.
Se consigue un mayor aporte de nutrientes en nuestra alimentacin. Los
productos obtenidos a partir de cultivos transgnicos pueden contener
niveles ms altos de vitaminas o protenas que los productos
convencionales, as como niveles menos elevados de alrgenos y
toxinas naturales. Adems, su predisposicin gentica permite cultivar
este tipo de productos en lugares del planeta donde las condiciones
climticas y del entorno son extremas, permitiendo as que pases que
tienen menos recursos puedan abastecer a la poblacin local.
Permite mejorar el desarrollo de nuevos materiales.
1.5. Inconvenientes
Disminucin de la mano de obra a consecuencia de la mecanizacin;
esto genera desempleo y xodo rural en muchas reas.
El acceso a las nuevas tecnologas supone una inversin de capital que
no est alcance de todo el mundo, excluyendo as a los agricultores ms
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pobres que no pueden acceder a estos recursos impidiendo su
modernizacin y dejndolos en peores condiciones para competir con
las producciones modernas.
Los cultivos transgnicos, aunque existen diferencias de opiniones entre
los expertos, pueden suponer un grave riesgo medioambiental y para la
salud.
2. Cmo influye la biotecnologa sobre la
viticultura
Una vez que ya sabemos en qu consiste la biotecnologa y comprendemos la
gran relevancia que tiene a la hora de ser aplicada en el sector agrario, nos
encontramos en disposicin de estudiar cual es la relacin que tiene con la
viticultura y cmo influye en la misma.
2.1. Introduccin
La elaboracin de vino es un proceso muy antiguo y los restos arqueolgicos
sumerios hallados en Mesopotamia que datan de hace unos 6.000 a 8.000
aos as lo demuestran. Con lo cual, la implicacin de la biotecnologa, es
decir, la utilizacin de organismos vivos en procesos industriales, que tiene en
el vino, supuso un factor clave en el desarrollo de las primeras grandes
civilizaciones. Aunque durante la mayor parte de la historia, la base de estas
prcticas biotecnolgicas fuera puramente emprica.
Casi todos los pueblos de la Tierra hicieron en la antigedad descubrimientos
similares a los de los sumerios. El vino se invent seguramente hace 6.000
aos en la zona del monte Ararat. Sin embargo, los ms recientes hallazgos
remiten a los chinos como los descubridores del vino hace 9.000 aos (vase
anexo I), en la Edad de Piedra. Los antiguos griegos y romanos sentan una
gran predileccin por el jugo fermentado de las uvas, el vino. Los romanos
fueron, pues, lo que llevaron el desarrollo y la fabricacin del vino al Rhin y
Mosel.
Hasta hoy, la forma de producir vino no ha cambiado demasiado (vase anexo
II): de uvas rojas y blancas, tras la vendimia, se obtiene por aplastamiento y
presin (prensas de vino) el mosto de la uva. Este jugo filtrado fermenta en
barriles cerrados. Antes eran barriles de madera, hoy se utilizan tanques de
acero inoxidable con capacidad de hasta 250.000 litros. Mundialmente se
producen cada ao alrededor de quinientos millones de hectolitros.
Durante el proceso de elaboracin del vino, el azcar se transforma en alcohol
a travs de la fermentacin (vase anexo III) que es el resultado final del
metabolismo de las levaduras. Un 2 o un 3% de alcohol cambia la
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permeabilidad (fluidez) de la membrana citoplasmtica de las bacterias e inhibe
con ello su crecimiento. En los climas calurosos de Oriente, el medio de
fermentacin inhibidor de microbios es una ventajosa, si no decisiva, cualidad
higinica. Gracias a la agricultura la poblacin creci enormemente. El agua
potable limpia result de repente un problema, como tambin sucedi en el
siglo XIX en Europa. Los productos de la fermentacin, cerveza, vino y vinagre,
estaban, sin embargo, exentos de grmenes peligrosos. Incluso se podan
elaborar con agua potable ligeramente contaminada, porque no solo el alcohol
sino tambin los cidos orgnicos inhiban a los patgenos existentes. El agua
no colm, pues la sed de nuestros antepasados, sino la cerveza, el vino y el
vinagre. La biotecnologa ms antigua del mundo era nutritiva, estimulante y
tambin segura un avance revolucionario, que debi ser sencillamente
favorable.
En la actualidad y en consecuencia de los avances cientficos de los ltimos
150 aos principalmente, el conocimiento emprico est siendo sustituido por
un adecuado conocimiento de los procesos que rigen estas transformaciones
biotecnolgicas. La importancia de la biotecnologa en la industria vitivincola se
ve reflejada en el creciente nmero de pases que han creado centros
especficos de biotecnologa aplicados a la industria del vino: Espaa, Francia,
Italia, Australia, Nueva Zelanda, Sudfrica, Canad, EEUU, etc. La creacin de
estas infraestructuras es un claro reflejo de la importancia que esta rea del
conocimiento tendr, a medio y largo plazo, en la industria.
Sin embargo, los productos vitivincolas, as como el resto de alimentos
destinados al consumo humano, estn sujetos a las exigencias y desafos
actuales de calidad, seguridad y sostenibilidad medioambiental. Es por esta
razn por la que la gestin planificada, proactiva y centrada en los
requerimientos, cada vez ms exigentes de clientes y pases, se ha convertido
en imprescindible. Sin embargo, el sector de la industria alimentaria abarca una
serie de caractersticas especiales, tanto sociales, culturales, tursticas,
tcnicas, cientficas y culinarias, que comprenden prcticamente todas los
estratos de la sociedad y el grueso de la mayor parte de la historia de la
humanidad. Son precisamente estas caractersticas especiales las que hacen
que la aplicacin de los avances tecnolgicos o de gestin, entre otros, sean
muy especficos.
2.2. El Vino y su Produccin
Desde mi punto de vista, el empleo de la biotecnologa en el proceso de
elaboracin del vino da como resultado una de sus manifestaciones ms
hermosas. La agricultura de la vid y el cuidado de las condiciones para que las
fermentaciones se lleven a cabo adecuadamente durante la elaboracin del
vino son procesos biotecnolgicos muy antiguos.
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Existe un gran abismo entre la tecnologa disponible y la tecnologa empleada
en el sector vitivincola, la ausencia de control microbiolgico en el proceso de
elaboracin y produccin del vino es un claro ejemplo de ello. Y aunque es
cierto que en los ltimos veinte aos se han producido avances en el sector
vitivincola relacionados con la biotecnologa, la transferencia de conocimientos
y tecnologa no se ha llevado a cabo correctamente, los avances han sido
pocos y se han ido incorporando muy lentamente.
En el caso de las actividades vitivincolas, ciertos trabajos estudian esta tensin
entre las nuevas tecnologas agronmicas adoptadas en la etapa agrcola y los
saberes tcitos de los productores (Bocco, y cols, 2007; Bell y Giuliani, 2007).
Un aspecto que refuerza esta tensin es el rol que han jugado los avances
recientes en la biologa molecular en las tecnologas de fermentacin.
En la industria vitivincola, el cambio tecnolgico vena determinado por su
incorporacin en bienes de capital y por los saberes artesanales de los
enlogos en la seleccin de las cepas de levaduras utilizadas en la
fermentacin. No obstante, la acumulacin de capital exige avanzar en la
industrializacin de estos procesos a fin de asegurar, por un lado, la produccin
a gran escala y por el otro, reducir los tiempos de rotacin del capital. La
biotecnologa abre nuevas oportunidades en este sentido, a partir de la
identificacin, seleccin y finalmente modificacin de las levaduras y bacterias
que cumplan con estos objetivos. Esto requiere la ampliacin de las
capacidades y de los conocimientos en biologa molecular que no todas las
industrias (y empresas) tienen posibilidad de integrar.
El 90%, aproximadamente, de las bodegas espaolas son susceptibles a los
avances biotecnolgicos que aportan las investigaciones tanto de las empresas
dedicadas a este tipo de desarrollo como los centros pblicos. Por el contrario,
nicamente el 25% de las bodegas mantienen lneas para mejorar sus vinos a
partir de biotecnologa enolgica.
Aunque pueda sonar extrao, la biotecnologa enolgica tiene aplicaciones
reales en el sector. Gracias a la biotecnologa, las bodegas pueden trabajar con
levaduras que optimicen la calidad de los vinos (por ejemplo, que trabajen en
fro, eliminen problemas de reduccin o defectos del vino); se cuenta tambin
con enzimas que lleven a la extraccin de color y que sea estable; o con
tcnicas de biologa molecular para ver cmo actan las levaduras.
Uno de los temas candentes en la actualidad es la produccin de
manoprotenas, que ayudan a mejorar el volumen y la estabilidad de los vinos.
Son molculas naturales de las que se conoce ya su eficacia por parte de los
enlogos. Otra lnea actual en los laboratorios biotecnolgicos dedicados a la
enologa es la seleccin de levaduras para eliminar defectos o que marquen
ms la fruta, con capacidades enzimticas potentes.
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La industria de la viticultura destina una cuarta parte de sus recursos
econmicos a la investigacin y desarrollo. Sin embargo, el reparto de recursos
es diferente. El 90% de las bodegas utilizan la biotecnologa como recurso pero
solo un 25% tienen lneas propias de investigacin.
Durante la realizacin de este estudio se pudo observar como algunas bodegas
dejan fermentar el mosto de forma espontnea para que sean las levaduras
autctonas las que hagan el trabajo. Se les deja actuar sin tener el ms mnimo
conocimiento de su naturaleza y en ocasiones surgen problemas; menos
graves como la aparicin de aromas no deseados o la ausencia de aromas o
sabores positivos que se podan encontrar en vinos de otros aos, o problemas
realmente graves como paradas o ralentizaciones de la fermentacin.
Por lo general, no suelen haber paradas, pero los resultados de los anlisis
cientficos revelan que la presencia y la concentracin de levaduras
comerciales en el proceso de fermentacin del vino vara enormemente de una
bodega a otra o de un ao a otro. Con concentraciones altas de levaduras
comerciales se obtienen vinos bastante ms homogneos pero se pierde
tipicidad. Adems no se potencian los aromas que residen escondidos en las
levaduras autctonas de la propia via.
El sostenimiento de calidades homogneas de una campaa agrcola a otra, la
reduccin de tiempos de fermentacin y el control de desarrollos microbianos
no deseados constituyen problemas tcno-econmicos cruciales en este tipo
de industrias.
Por ello, las innovaciones en levaduras, bacterias y enzimas posibilitan mejorar
la calidad sostenida en el tiempo y responder a las crecientes exigencias de
diferenciacin. Las innovaciones en nuevas levaduras posibilitan controlar la
accin de procesos de fermentacin espontnea, con efectos sobre la calidad
que son altamente impredecibles. No obstante, existen segmentos industriales
cuya estrategia se basa en la renovacin de sabores bajo condiciones
espontneas de desarrollo de microorganismos durante la fermentacin. Este
es el caso de las bodegas boutique que optan por tecnologas artesanales,
asumiendo los riesgos de la viabilidad del producto. En los segmentos
industriales intensivos a gran escala, la lgica de acumulacin exige procesos
rpidos y confiables de fermentacin, esenciales para lograr vinos con gustos
consistentes y calidad predecible, reduciendo al mismo tiempo, los tiempos de
rotacin de capital. En estos casos se recurre a cepas de levaduras
comerciales seleccionadas (levaduras de la especie Saccharomyces
cerevisiae) y al desarrollo de enzimas (Vase anexo IV).
De esta forma, se asiste a una tensin entre la trayectoria tecnolgica
preexistente, asociada a una base estrictamente emprica limitada por el
desconocimiento de las caractersticas a nivel molecular de los
microorganismos y de su metabolismo, y los avances de la biologa molecular,
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con el mayor conocimiento de los procesos que rigen las transformaciones en
el proceso de fermentacin.
Existen tcnicas diferentes a las basadas en el ADN recombinante que utilizan
la biologa molecular para la identificacin, diferenciacin y seguimiento de los
microorganismos involucrados en los procesos fermentativos, apoyadas en
tcnicas convencionales de seleccin (Anexo IV).
Cambiando ligeramente de contexto, observamos que en las bodegas donde
se elaboran vinos mediante crianza biolgica, finos o manzanillas, se sabe que
las levaduras que forman el velo de flor son distintas en cada bota. Por esta
razn, como bien saben ya los profesionales de las bodegas de Jerez o
Sanlcar de Barrameda, hay botas que desprenden mejores aromas que otras.
Botas donde el vino envejece de manera distinta, mejor, con ms cuerpo,
inevitablemente este vino acabar mezclndose con el resto de botas, donde
no se encuentran estas caractersticas. Sera interesante conocer qu clase de
levaduras son las responsables de las caractersticas distintivas de la bota
buena y de esta manera conseguir que el resto de botas cuenten con la
presencia de estas mismas levaduras para obtener un mejor producto ms
uniforme o acelerar la crianza y conseguir as una mayor calidad en un tiempo
ms reducido.
Un mayor control microbiolgico permitira a las bodegas identificar y
diferenciar las distintas clases de levaduras que confluyen en la fermentacin
del vino. Hoy en da contamos con un extenso catlogo de tcnicas de biologa
molecular que sirven a este efecto y que solo falta que las bodegas empiecen a
aplicar.
2.3. Barreras en la Implantacin de Nuevas Tecnologas
El sector bodeguero y vitivincola es un sector muy tradicional que an no es
plenamente consciente de la importancia que tiene la aplicacin de la
biotecnologa en sus sistemas de produccin. La administracin pblica ha
hecho un gran esfuerzo en las ltimas dcadas para implantar un modelo de
transferencia tecnolgica destinado a la innovacin y aumento de la
competitividad de las empresas. Sin embargo, la falta de inercia que este
modelo tiene en nuestro pas se debe fundamentalmente al poco calado que ha
tenido entre sus destinatarios. La ausencia de una comunicacin adecuada
entre investigadores y empresas ha ayudado a que esto sea posible. No
obstante, la administracin pblica considera que los investigadores y las
empresas se deben reunir para abordar estrategias conjuntas que permitan
acelerar el proceso de llevar el conocimiento y las innovaciones tecnolgicas a
los usuarios. Lamentablemente, son pocas las ocasiones en las que esto
sucede impidiendo de esta forma desarrollar proyectos conjuntos que puedan
llevarse a una fase de explotacin de resultados exitosa.
12
Ambas partes se siguen viendo como agentes totalmente independientes.
Cuando los investigadores consideran a las empresas como entidades
totalmente ajenas que alivian la falta de personal cientfico en el sistema
espaol de I+D+i a cambio de unos cuantos anlisis, los proyectos de
desarrollo tecnolgico y transferencia de conocimientos acaban fracasando.
Por otro lado, cuando son las empresas las que ven a los investigadores como
instrumentos para conseguir subvenciones de I+D+i y justificar departamentos
de I+D+i formados por una habitacin vaca, entonces los proyectos de
desarrollo tecnolgico y transferencia de conocimientos terminan fracasando.
Si hasta el momento la mayora de los proyectos de desarrollo tecnolgico y
transferencia de conocimientos en el sector vitivincola no han cuajado en la
innovacin de las bodegas, habr que empezar a preguntarse en cuantos
casos se parti de la premisa adecuada y en cuantos casos se parti de las
absurdas concepciones de cada agente anteriormente citadas.
A pesar de que las capacidades y el nivel en general de nuestros cientficos es
bastante bueno, son muchos los factores que quedan fuera de este estudio y
que han dado lugar a que la cultura cientfica no haya calado en nuestra
sociedad al mismo nivel que en otras que viven ms pendientes de la ciencia y
los descubrimientos que se hacen en este campo. Y al igual que los
ciudadanos, las empresas no tienen una relacin fluida con el mundo cientfico.
Esta situacin supone un importante obstculo para que las empresas
depositen su confianza en los cientficos como fuente de soluciones efectivas.
Tambin impide que las empresas maduren aspectos clave de la planificacin
de estrategias para solucionar problemas de carcter financiero, como
evaluacin de casos de xito, gastos asociados, tiempo estimado de
recuperacin del dinero invertido, adecuado seguimiento de las actividades,
etc. Por tanto, para eliminar esta barrera es necesario que exista un mayor
acercamiento entre el mundo empresarial y la ciencia, y que se creen iniciativas
que fomenten el contacto entre estos dos mundos. Para alcanzar este objetivo
podran crearse centros tecnolgicos que sirvan como lugar de encuentro y
nexo permanente de empresarios, en este caso del sector agroalimentario, y
cientficos. En este tipo de centros las empresas tendran la posibilidad de
acceder a los ltimos avances tecnolgicos y acceder a toda la informacin
relacionada con su sector. Del mismo modo, los cientficos tendran la
posibilidad de entender y analizar junto a las empresas cuales son los
problemas sobre los que se debe actuar para dar con soluciones ms efectivas
y acordes con su magnitud.
La Asociacin Espaola de Bioempresas (ASEBIO) llev a cabo hace unos
aos, durante la ltima legislatura Socialista, una iniciativa que recibi fondos
del Ministerio de Industria, Comercio y Turismo, y que consista en la
realizacin de diagnsticos tecnolgicos y desarrollo de planes de implantacin
de soluciones biotecnolgicas en sectores consolidados.
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Las conclusiones que se obtuvieron de esta iniciativa, denominada
Innoempresa, fueron de lo ms interesantes. Se pudo apreciar, por ejemplo,
que el sector ms activo en cuanto a participacin fue el agroalimentario, lo que
indica que este sector est especialmente necesitado de biosoluciones. Ms
concretamente, el sector bodeguero tuvo una participacin muy activa en las
jornadas sectoriales organizadas por ASEBIO y algunas bodegas participaron
tambin en las jornadas como receptoras de diagnsticos y planes de
implementacin durante el desarrollo del programa. Y aunque las bodegas
tenan claras sus necesidades, fue realmente complicado hacer que
comprendiesen los conceptos cientficos bsicos que apoyaban las
biosoluciones planteadas. Deban entender que la ciencia y la tecnologa
cambian a un ritmo vertiginoso, lo que hace que sea vital para el futuro de las
empresas estar pendientes de las ltimas novedades y actualizar tanto sus
equipos como los conceptos de trabajo.
La formacin continua y el reciclaje de los profesionales del sector vitivincola
facilitara la apertura de debates y la creacin de mesas de negociacin entre
los centros productores de conocimiento y las empresas con el fin de impulsar
un mayor nmero de iniciativas innovadoras de transferencia de tecnologa.
Las universidades, por ejemplo, podran hacerse eco de esta necesidad e
implantar cursos de formacin continua destinados a profesionales de
empresas de su entorno en sectores clave.
Las bodegas, tanto las que ya estn consolidadas como los pequeos
productores que necesiten innovar o resolver problemas para adaptarse a
nuevas situaciones pueden acudir a cualquiera de las empresas de base
tecnolgica especializadas en el sector que han proliferado durante los ltimos
aos. Donde adems podrn exponer sus problemas y recibir soluciones en un
lenguaje entendible, o reflexionar sobre temas concernientes al sector con
tcnicos especializados en la materia.
3.Agentes biolgicos que intervienen en la
vinificacin
A continuacin y despus de haber explicado cual es la relacin que vincula la
biotecnologa con el mundo del vino, nos centraremos y hablaremos de los
principales protagonistas responsables directos de la vinificacin que no son ni
ms ni menos que un grupo de fungidos y de bacterias.
Los hongos que encontramos en este proceso pertenecen al grupo de las
levaduras que son las que se encargan de la fermentacin alcohlica. Y dentro
del grupo de las bacterias encontramos que son las bacterias lcticas las que
se encargan de la fermentacin malolctica. As mismo, tambin contamos con
un grupo de bacterias llamadas acticas que se encargan de estropear el vino.
14
4. Las Bacterias: definicin y tipos
Antes de centrarnos en las bacterias acticas que son unos de los organismos
principalmente responsables de intervenir de forma negativa en el proceso de
elaboracin del vino, o de las bacterias lcticas que por el contrario resultan
beneficiosas y hacen una gran aportacin positiva, repasaremos el concepto de
bacteria de una forma general para as comprender mejor su interaccin con el
mosto de la uva.
El primer concepto que hay que saber y tener en cuenta sobre las bacterias es
que son procariotas, es decir, su informacin gentica no est localizada en un
ncleo celular sino que se encuentra libre en el citoplasma como ADN de doble
hebra en forma de anillo.
Les faltan los tpicos orgnulos subcelulares de las eucariotas (levaduras,
clulas de plantas y animales superiores), como las mitocondrias (para la
respiracin celular) o los cloroplastos (para la fotosntesis) y el retculo
endoplasmtico.
Las bacterias viven predominantemente de modo hetertrofo, es decir, captan
su energa de la materia orgnica. Sin embargo, tambin existen algunos tipos
que pueden captar energa fotosintticamente o de enlaces inorgnicos (por
ejemplo azufre) mediante quimiosntesis.
Entre las bacterias hay unicelulares mviles e inmviles (por ejemplo pequeos
bacilos), pero tambin pluricelulares, por ejemplo asociaciones celulares del
gnero Nocardia y redes similares a hilos de hongos (micelios) del tipo de
Streptomyces.
A los bacilos y cocos gramnegativos aerbicos pertenecen Pseudomonas
(utilizacin de hidrocarburos, oxidacin de esteroides) y Acetobacter (formacin
de cido actico), Rhizobium (oxidacin del nitrgeno) y Methylophilus
(protena unicelular, oxidacin de metanol).
Los bacilos gramnegativos anaerbicos facultativos son, por el contrario, las
bacterias intestinales Escherichia coli, los animales de compaa del ingeniero
gentico.
Bacilus (produccin de enzimas) y Clostridium (produccin de acetona y
butanol) pertenecen a los bacilos y cocos grampositivos formadores de
esporas.
Los cocos grampositivos son los formadores de cido lctico, como
Streptococcus, Staphylococcus (intoxicacin de alimentos), Propionibacterium
(vitamina B12, preparacin de queso), Nocardia (oxidacin de hidrocarburos) y
estreptomicetos (antibiticos, enzimas).
15
Lactobacillus (formacin de cido lctico) se encuentra entre las bacterias
grampositivas no formadoras de esporas.
Las bacterias producen un gran dao al causar enfermedades y estropear
alimentos, pero sin embargo tambin tienen un enorme significado econmico
en los procesos biotecnolgicos.
5. Principales Bacterias que intervienen en
la vinificacin
5.1. Clasificacin y Caractersticas de las Bacterias Acticas
En primer lugar hay que sealar que en los ltimos tiempos la clasificacin de
las bacterias acticas ha variado enormemente. Esto se debe a la constante
modernizacin de los equipos que emplean los cientficos en los laboratorios y
que obligan a revisar esta clasificacin peridicamente. Actualmente podemos
encontrar bajo el nombre de bacterias acticas al grupo de bacterias
pertenecientes a los siguientes gneros: Acetobacter, Acidicaldus, Acidiphilium,
Acidisphaera, Acidocella, Acidomonas, Asaia, Belnapia, Craurococcus,
Gluconacetobacter, Gluconobacter, Kozakia, Leahibacter, Muricoccus,
Neoasaia, Oleomonas, Paracraurococcus, Rhudopila, Roseococcus,
Rubritepida, Saccharibacter, Stella, Swaminathania, Teichococcus y Zavarzinia.
Dentro del mundo enolgico, las especies ms conocidas son Acetobacteraceti,
Acetobacter pasteurianus y Gluconobacter oxydans. Otras especies que
tambin han sido asociadas a las uvas y al mosto son Gluconacetobacter
hanseni (Du Toit y Lambrechts 2002; Du Toit y Pretorius 2002).
Para entender cmo actan estas bacterias en el vino y saber por qu afectan
tan negativamente al resultado final, es importante que sepamos primero que
son. Las bacterias acticas son un grupo de microorganismos presentes de
forma natural en el mosto y que pueden causar problemas durante la
elaboracin y el envejecimiento del vino. Las BA son metablicamente activas
desde el momento en que se inicia el desarrollo de la uva en el campo hasta
que el vino llega al consumidor, generando una serie de compuestos no
deseados que tendrn consecuencias en la calidad del producto final. En un
proceso que se da sobre todo en las bayas, las bacterias acticas pueden
convertir la glucosa y fructosa en cido glucnico y oxofructosa,
respectivamente. De igual manera, las BA pueden metabolizar algunas
hexosas como manitol, manosa o ribosa.
A todo hay que sumar que su asociacin con las levaduras de la uva, pueden
producir cido actico y acetaldehdo, lo que incrementa la acidez voltil del
mosto. La acumulacin de estos metabolitos suele depender de la cepa, del
estado de la uva y de la concentracin de los diferentes azcares. Al igual que
16
en el caso de las levaduras, la poblacin de las BA es mayor cuando la uva
est daada, ya que las bacterias pueden acceder fcilmente al interior de la
uva, rica en nutrientes.
Por otro lado tenemos que en la bodega, la consecuencia ms conocida de la
actividad de las BA es el picado actico del vino. Este proceso se caracteriza
por la oxidacin del etanol en cido actico, lo que puede elevar la acidez
voltil del vino hasta valores de 0,8 g actico/l. Esto tiene consecuencias
organolpticas de sobra conocidas por todos los enlogos. La velocidad de
este proceso est determinada por la especie, la cantidad de BA presentes en
el vino y por las caractersticas del vino. En las BA, este proceso metablico se
favorece cuando la concentracin en oxgeno es baja.
Durante el proceso de transformacin del etanol a cido actico se puede
obtener un metabolito intermedio llamado acetaldehdo y que se puede
encontrar libre en el medio. La concentracin de este compuesto vara mucho
entre los diferentes tipos de vinos, pero puede llegar a valores de 200 mg/l.
Como norma general, podemos decir que se produce acetaldehdo cuando hay
poco oxgeno disuelto en el medio y cuando la concentracin de etanol es alta;
justo las condiciones que se dan en el vino. Sensorialmente, el acetaldehdo da
un carcter oxidado al vino a partir de 50 mg/l.
Hay que tener en cuenta que las BA pueden utilizar tambin el glicerol como
fuente de carbono, generando principalmente dihidroxiacetona. De esta
manera, se reduce en el vino la concentracin de glicerol obtenido durante la
fermentacin alcohlica. Tambin se pueden incrementar los niveles de acetato
de etilo y de acetona, lo que aporta al vino aromas similares a la mantequilla.
Sin embargo, los efectos negativos en el sabor no son los nicos efectos que
causados por los compuestos resultantes del metabolismo de las BA. Algunos
compuestos, como la dihidroxiacetona, el acetaldehdo y la 5-oxofructosa,
actan como compuestos quelantes (secuestrantes) del dixido de azufre,
reduciendo la concentracin de SO2 libre en el medio y debilitando el poder de
accin antimicrobiana y antioxidante de este aditivo. Las bacterias del gnero
Gluconobacter son grandes productores de este tipo de compuestos (Barbe y
cols., 2001). Y para terminar mencionaremos que algunas BA tienen la
capacidad de liberar en el vino cadenas de polisacridos, lo que incrementa su
viscosidad y filtracin del mosto y del vino.
5.1.1. Evolucin en el vino
A continuacin estudiaremos brevemente cul es la evolucin que sufren las
BA a lo largo del proceso de elaboracin del vino ya que es muy importante
tener una serie de conceptos claros para entender cmo podemos actuar sobre
estos pequeos microorganismos y evitar as defectos en el producto final.
17
En primer lugar hay que saber que las bacterias acticas representan
aproximadamente ms del 68% del total de las bacterias presentes en la uva
en el momento de la recogida, dependiendo del estado sanitario general de
sta (Barbe y cols., 2001). Actualmente no existe un consenso entre los
investigadores y no se ponen de acuerdo en cmo se desarrolla la evolucin de
las diferentes poblaciones de bacterias acticas durante los primeros das de la
vinificacin. Para Gonzlez y cols. (2004), el nmero de BA creca nada ms
comenzar la vinificacin, mientras que para Joyeux y cols. (1984) este
descendera (Ver tabla 1). Sin embargo, ambas investigaciones coinciden en
que la concentracin de BA desciende drsticamente durante la fermentacin
alcohlica. Pero finalmente, la concentracin de BA se mantiene estable y por
debajo de los 1.000 CFU/ml a lo largo de la fermentacin malolctica y la
crianza en barrica.
Las bacterias acticas son aerobias
obligadas, lo que significa que necesitan
oxgeno en el medio para su crecimiento y su
actividad metablica. Durante la fermentacin
alcohlica, el oxgeno presente en el mosto
se agota a gran velocidad, lo que mantiene a
la poblacin de BA bajo control. Sin embargo,
cualquier tratamiento que incluya agitacin u
oxigenacin favorecer el crecimiento de las
BA. En la tabla 1, hay un ejemplo del efecto
de las operaciones de vinificacin sobre las
poblaciones de bacterias acticas. Tras el
trasiego, cuando el vino se oxigena, se
observa que el nmero de clulas capaces
de formar colonias se multiplica por 1.000.
Al comenzar la fermentacin malolctica
pueden superar los 105 CFU/ml, lo que
conlleva a un aumento en los niveles de
concentracin de cido actico (Gonzles y
cols., 2005). Datos similares se han obtenido
en experimentos a escala de laboratorio
(Joyeux y cols., 1984). Con respecto a la
guarda, los mismos autores han propuesto que la tasa de penetracin del
oxgeno en la barrica (unos30 mg/l por ao) es suficiente para mantener
poblaciones pequeas de bacterias acticas.
A lo largo de la vinificacin se puede observar como la especie de BA
predominante en el medio es una u otra dependiendo de la fase en la que se
encuentre o de las caractersticas del mismo entorno. En las uvas sanas, por
ejemplo, la poblacin de bacterias acticas inicial estara compuesta
CFU/ml
Mosto 16.000
Fermentacin alcohlica
Tras 3 das 3.000
Tras 7 das 100
En el da 10
Antes del trasiego 20
Tras el trasiego 30.000
Fermentacin malolctica
Al comienzo 400
Al final (3 meses) 120
Envejecimiento en barrica
Tras 4 meses 160
Tras 6 meses 900
Tras 9 meses 600
Tras 11 meses 600
TABLA 1. Evolucin de la
poblacin de bacterias acticas
durante la elaboracin de vino
tinto (adaptado de Joyeux y cols,
1984).
18
fundamentalmente por G.oxydans, mientras que las uvas con botrytis tambin
acogen cepas de A. aceti y A. pasteurianus (Gonzlez y cols., 2005; joyeux y
cols., 1984). En el mosto, al principio de la fermentacin, predominan cepas de
G. oxydans, pero desaparece tras la fermentacin alcohlica debido a la poca
resistencia al etanol de esta bacteria (Gonzles y cols., 2004; Drysdale y Fleet,
1989). Al final en la fermentacin contamos con la presencia de cepas de A.
aceti y de A. pasteurianus, ya que presentan gran resistencia al etanol y a las
condiciones de microaerobiosis.
5.1.2. Mtodos de deteccin
En este apartado veremos algunos de los mtodos ms conocidos que existen
para detectar la presencia de bacterias acticas en el vino que se est
produciendo. Algunos de estos mtodos de deteccin son el sistema GYC, el
sistema Manitol o el sistema Agar carbonato. Sin embargo, el empleo de estos
sistemas clsicos de deteccin pueden acarrear una serie de inconvenientes,
sobre todo en muestras procedentes de vinagres. Cuando Bartwosky y cols.
(2003) intentaron aislar bacterias acticas a partir de vino embotellado,
comprobaron que no se reproducan en los medios ms comunes para las
bacterias. Es por ello que se han desarrollado tcnicas de doble capa de agar y
cido actico que presentan unas condiciones generales en el medio
favorables para su reproduccin (Entani y cols., 1985).
Hasta no hace mucho, la clasificacin de las bacterias acticas se haca en
funcin de sus caractersticas fenotpicas, como la apariencia y la fisiologa. Sin
embargo estas caractersticas pueden variar entre cepas de la misma especie
de BA, lo que complica su identificacin y obliga a realizar muchas pruebas.
Actualmente, la mayora de las especies bacterianas se clasifican de acuerdo a
la secuencia del gen 16S. Este gen, como ya sabemos, se encuentra junto con
el resto de genes presente en el ADN de las bacterias. Otras zonas que se
suelen estudiar son las comprendidas entre los genes 16S y 23S.
Es curioso ver como en el caso de las bacterias acticas, se da una situacin
especial. El gen 16S es una zona que conserva muy bien los rasgos a nivel de
especie, lo que permite de una forma eficaz la identificacin de las BA para
Poblet y cols. (2000) y para Ruiz y cols. (2000), mientras que para Trcek y cols.
(2000) esta zona estara excesivamente conservada. Por otra parte la zona
16S-23S presenta una secuencia muy variable, demasiado variable para Ruiz y
cols. (2000) pero sin embargo, para Trcek y cols. (2002), esta zona es la
apropiada.
Tambin existen otros genes como el gen adhA que se han investigado como
posibles objetivos para discriminar las especies pero los resultados obtenidos
no han mejorado con respecto a los obtenidos en los fragmentos 16S y 23S
(Trcek, 2005). Recientemente, se han desarrollado mtodos de real-time PCR
para cuantificar bacterias acticas que, segn los investigadores, pueden
19
detectar niveles de 10 clulas/ml (Gammon y cols., 2007; Gonzlez y cols.,
2007). Estas investigaciones han permitido a los laboratorios de anlisis
desarrollar tcnicas de deteccin e identificacin rpida para las bacterias
acticas presentes en el vino, ayudando a los enlogos a evaluar el riesgo de
picado actico de sus vinos.
5.1.3. Sistemas de Prevencin
Como ya hemos visto anteriormente, las condiciones que se dan en el vino no
impiden el desarrollo y proliferacin de las bacterias acticas. Estas bacterias
resisten altas concentraciones de etanol, se desarrollan adecuadamente en
temperaturas de entre 18 y 30 C, a partir de los 10 C inician su actividad
metablica, y ni el pH del vino ni las concentraciones de dixido de azufre
(SO2) habitualmente utilizadas en bodega impiden su proliferacin.
Actualmente, no se conoce ningn sistema que permita, a nivel industrial,
eliminar las BA de una bodega, y mucho menos de la uva. Pero podemos
frenar su proliferacin hasta niveles peligrosos, evitando las consecuencias
negativas que repercuten en el vino. Los puntos clave que hay que tener en
cuenta para tener bajo control la actividad de las BA son:
- El oxgeno. Este es el autntico factor que delimita su crecimiento. La
ausencia de oxgeno no acaba con las bacterias, pero impide su normal
desarrollo y afecta de manera importante a su metabolismo. As pues, el
riesgo de contaminacin crece con los tratamientos que oxigenan el
vino, los que retrasan la fermentacin y los que permiten al mosto entrar
en contacto con el aire. Por esta razn, es de gran importancia iniciar la
fermentacin alcohlica con prontitud, terminarla de la forma correcta y
ser cuidadoso con los tratamientos que recibe el vino durante la
fermentacin y la guarda.
- La limpieza y desinfeccin de las instalaciones, incluyendo
maquinaria, depsitos, barricas, botellas y dems elementos de las
bodegas. De esta manera, reduciremos la concentracin de BA inicial y
la presencia de cepas resistentes. Llevar a cabo este proceso en
superficies porosas, como pueden ser el interior de las barricas, entraa
mayor dificultad.
- Las uvas suelen estar contaminadas con BA. Sin embargo, la
concentracin de BA es mayor en uvas daadas que en uvas sanas, por
lo que la utilizacin en el proceso de vinificacin de uvas en buenas
condiciones higinicas permite reducir los niveles iniciales de BA.
- Los ni veles de azcar residual deben estar bajo control en los vinos,
ya que con niveles altos de azcar residual se aumenta la probabilidad
20
de que aparezcan bacterias perjudiciales capaces de alterar al producto
dando como resultado un producto de poca calidad.
- El embotellado es uno de los momentos clave para evitar la
proliferacin de bacterias acticas durante el envejecimiento del vino ya
que la transmisin de oxgeno, y con ello la actividad de las bacterias
acticas, va a depender del tipo de material en el que envasemos
nuestro vino. As pues, el uso de materiales plsticos (PET o formatos
tipo Bag-in box) se ha visto limitado por su alta transmisin de oxgeno a
travs de este material pero actualmente se est investigando para
mejorar este aspecto.
- El tipo de corcho que se emplee en el embotellado afectar en gran
medida a la calidad del vino. El corcho natural presenta unos niveles
bajos de porosidad frente al oxgeno, lo que favorece la conservacin del
vino. Sin embargo permite la entrada de cantidades justas de aire para
que respire el vino y consiga un mejor sabor de envejecimiento. Por otro
lado, los tapones sintticos flojos pueden hacer que el oxgeno se filtre
en el vino y, como resultado, que la bebida se avinagre. El corcho
convencional, adems, es un material que no se expande. Las botellas
de vidrio suelen contraerse o expandirse dependiendo de la temperatura
y los nicos que se adaptan a estos mnimos movimientos son los
corchos naturales.
- El almacenamiento y el transporte. Un espacio excesivo entre el
corcho y el vino, tras el embotellado, puede estimular la actividad de las
bacterias acticas. As mismo, almacenar la botella verticalmente y con
el tapn hacia arriba, o almacenarla a temperaturas inadecuadas, puede
favorecer el picado del vino. Diversas investigaciones apuntan a que las
BA son muy poco activas a temperaturas por debajo de 10C.
Una vez ha comenzado, el picado actico echar a perder casi con total
seguridad el vino dejndonos un escaso margen de actuacin para revertir la
situacin. En el caso de que la contaminacin se encuentre en fase inicial, se
puede intentar una filtracin esterilizante, seguida de una sulfitacin adecuada
y la guarda del vino en botellas perfectamente limpias. Si la contaminacin est
en un grado avanzado, donde la concentracin de actico es alta y se percibe
con facilidad, el vino es difcilmente recuperable y deberamos pensar en
destinarlo a la elaboracin de vinagre o destilacin.
Por ltimo, me gustara llamar la atencin sobre ciertas prcticas tecnolgicas
que se dan en el mundo del vino y que favorecen el crecimiento y la actividad
de estas bacterias. Entre ellas, estn la baja sulfitacin del mosto, el abuso de
los trasiegos, la falta de filtracin, el uso de corchos de mala calidad, los
retrasos en el rellenado de cubas y todos los tratamientos que implican un
retraso en la fermentacin alcohlica o la oxigenacin excesiva del vino. Un
21
claro ejemplo es la aireacin, que aunque es una prctica que facilita el
correcto desarrollo del color del vino, tambin posibilita la proliferacin de
bacterias acticas. Es labor de cada enlogo por tanto, analizar los pros y
contras de estas prcticas de acuerdo al vino que quiere obtener, apoyndose
en las tcnicas actuales disponibles para detectar y cuantificar el desarrollo de
las bacterias que pueden echar a perder un buen vino.
5.1.4. Conclusiones
Nuestros vinos no estn a salvo ni en las barricas ni en las botellas. Visto de
forma general, las BA estn presentes desde el momento en que se recoge la
uva, pueden sobrevivir durante la vinificacin y aguantan el embotellado y la
guarda del vino. Pero contamos con la ventaja de que necesitan oxgeno para
desarrollarse y reproducirse. As pues, una correcta seleccin de la uva, un
proceso de vinificacin correcto y el cuidado durante el embotellado ayudarn a
reducir el nivel de concentracin inicial de bacterias acticas e impedirn su
crecimiento. Para evitar el picado actico del vino, debemos prestar especial
atencin a la limpieza e higiene en nuestras bodegas, a los tratamientos que
pueden oxigenar el vino y al mantenimiento de las condiciones de anoxia
durante la vinificacin. Al tratar con las BA y haciendo alusin al refranero
espaol, prevenir es primordial ya que curar es casi imposible.
5.2. Clasificacin y caractersticas de las bacterias lcticas
La principal fermentacin del vino es la alcohlica, producida por las levaduras.
Ahora bien, como el mosto y los recipientes donde tiene lugar la vinificacin no
son estriles, aparte de las levaduras (autctonas o comerciales) tambin hay
otros microorganismos, como las bacterias acticas y las bacterias lcticas. El
papel beneficioso ms conocido de las bacterias lcticas en los vinos es la
fermentacin malolctica, que da lugar a una desacidificacin del vino.
Las bacterias lcticas o bacterias del cido lctico son bacterias grampositivas
de bajo contenido en G+C. Tienen en comn el hecho de producir cido lctico
a partir de azcares, debido a su metabolismo exclusivamente fermentativo,
sobre todo la fermentacin lctica. Por eso son anaerobias, aunque tambin
toleran la presencia de oxgeno. Son, por tanto, anaerobias aerotolerantes.
Desde el punto de vista metablico, tienen unos requerimientos nutritivos
complejos (aminocidos, vitaminas, etc.)
El nmero de bacterias lcticas presentes durante la fermentacin alcohlica
normalmente es muy bajo, como mucho 100 por ml, ya que la mayora son
inhibidas por el etanol y por el SO2 aadido al mosto para controlar la poblacin
bacteriana, especialmente las acticas. Cuando la alcohlica termina y las
levaduras mueren, algunas bacterias lcticas pueden prosperar y conseguir un
cierto crecimiento, en ocasiones, hasta 10 millones por ml. Estas bacterias
lcticas producen algunas transformaciones en el vino, de las cuales la ms
22
interesante es la llamada fermentacin malolctica (FML). Las bacterias
lcticas que se pueden aislar en muestras de mostos y vinos son de los
gneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Weisella y, sobre todo, de
Oenococcus oeni (vase anexo V).
5.2.1. Bioqumica de la fermentacin malolctica
El papel ms beneficioso conocido de las bacterias lcticas en los vinos es la
FML, que da lugar a una desadificacin del vino. El mosto de la mayora de las
uvas, excepto los de climas muy clidos, contienen una cierta cantidad de
cido L-mlico (1-5 g/l), que tiene un sabor fuerte y spero. Normalmente,
despus de la fermentacin alcohlica, si bien muy ocasionalmente de forma
simultnea a esta, las bacterias lcticas como O.oeni pueden realizar esta
FML, que es la descarboxilacin de L-mlico en L-lctico, con desprendimiento
de CO2 que aparece como pequeas burbujas en el vino. Esta reaccin es
llevada a cabo porque dichas bacterias tienen la enzima malolctica, que
requiere MN++ y NAD+. Como el mlico es dicarboxlico y el lctico es
monocarboxlico, esto conlleva una reduccin de la acidez, de 0,1 a 0,5
unidades de pH.
Desde el punto de vista metablico, la FML no es una fermentacin clsica
como la misma lctica donde se utilizan azcares como sustratos y obtienen
ATP por fosforilacin a nivel de sustrato en las reacciones de la gluclisis. La
FML solamente es una descarboxilacin que no parece que conlleve, en
principio, ningn beneficio energtico a las clulas que la realizan, y donde el
nico beneficio aparente sera la subida del pH externo. Sin embargo, se ha
descubierto que la FML es una de las fermentaciones peculiares con ATP
sintasa, ya que la salida del L-lctico de las clulas se efecta mediante un
simport con protones, y que paralelamente hay una entrada de protones a favor
de gradiente (el pH externo es 3-4 y el interior es superior a 6), mediante una
ATP sintasa, que lo acopla a la sntesis de ATP.
As pues, O.oeni puede obtener algunos ATP por la descarboxilacin del mlico
en un medio como el vino donde prcticamente no hay azcares. Estos ATP,
junto con algunos nutrientes remanentes de los restos de las levaduras,
pueden permitir un ligero crecimiento de estas bacterias en el vino.
Desde el punto de vista enolgico, esta desadificacin del vino conlleva al
mismo tiempo una mejora en su calidad, al reducir la sensacin de aspereza
del mlico. Adems, el cido L-lctico que aparece es ms agradable y suave
al gusto de cualquier paladar.
23
5.2.2. Otros aspectos beneficiosos del metabolismo de las bacterias
lcticas en el vino
Un aspecto interesante desde el punto de vista enolgico consecuencia de la
pequea subida de pH de la FML es que el color del vino tinto, debido sobre
todo a los antocianos como la malvidina, evoluciona hacia tonalidades menos
intensas y no tan rojas, lo que los hace ms interesantes visualmente.
Desde el punto de vista organolptico, la FML conlleva una mejora del vino
porque adems de la desacidificacin, el desarrollo de las bacterias provoca
cambios en los contenidos de los diversos compuestos orgnicos del vino.
Aparte del L-mlico, el ctrico es otro importante cido orgnico metabolizado
por las bacterias lcticas del vino. Se ha comprobado que O.oeni, al igual que
muchas otras bacterias, capta el citrato y lo metaboliza dando lugar a diversos
compuestos. De todos estos, el diacetilo se considera el ms importante por su
aroma a mantequilla o nata (aromas lcteos) que caracteriza a muchos vinos
que han realizado FML. Aparece en pequeas concentraciones (hasta 2mg/l)
aunque tiene un umbral de deteccin sensorial muy bajo. El diacetilo se forma
qumicamente por descarboxilacin oxidativa del alfa-acetolactato, un
intermediario inestable. Por otro lado, en funcin de las condiciones, el diacetilo
puede ser utilizado por las mismas bacterias convirtindolo en acetona y 2,3-
butanodiol, mucho menos aromticos.
Las bacterias lcticas del vino tambin pueden producir pequeas cantidades
de exopolisacridos, que se unen con los taninos, responsables de la
astringencia de los vinos jvenes, con lo cual baja la astringencia y el vino se
vuelve ms agradable.
Otro beneficio muy importante es la estabilidad microbiolgica que se consigue
con la FML. Los vinos donde esta ha tenido lugar pueden ser embotellados sin
el riesgo de un posible desarrollo bacteriano posterior, que podra dar lugar a la
formacin de CO2. Las bacterias lcticas agotan el mlico y otros nutrientes
como los azcares, con lo cual es mucho ms difcil el crecimiento posterior de
otras bacterias.
5.2.3. Posibles perjuicios de las bacterias lcticas en los vinos
En algunas ocasiones, el desarrollo de las bacterias lcticas puede tener
consecuencias negativas para la calidad de los vinos. Afortunadamente, la
mayora de estos casos se producen de forma muy espordica, sobre todo
cuando ha habido otros problemas previos a la fermentacin o de poco control
de la vinificacin.
De estos posibles perjuicios, el ms frecuente es el picado lctico, debido a la
produccin bacteriana de una cierta cantidad de lctico y tambin de actico.
Cuando en el vino hay azcares residuales que las levaduras no hayan
24
consumido por diversos problemas de paradas de la fermentacin alcohlica,
las bacterias pueden consumirlos y proliferar, haciendo la fermentacin lctica
y, por tanto, produciendo lctico. En este caso se produce D-lctico, mientras
que en la FML a partir de L-mlico aparece L-lctico. Dado que Oenococcus,
Leuconostoc y algunos Lactobacillus (como L.brevis y L. hilgardil) hacen la
fermentacin heterolctica, adems de lctico producen cido actico a partir
de azcares. Sin embargo, las especies homofermentativas como Pediococcus
y otros lactobacillus tambin pueden producir cido actico a partir de
pentosas.
En algunos vinos poco cidos, la FML llevada a cabo por las bacterias lcticas
puede dar lugar a una desacidificacin excesiva, lo que no es conveniente
porque parte del carcter del vino se pierde si es poco cido y, adems, el pH
ms alto puede favorecer el crecimiento de otras bacterias prejudiciales.
Solo hay dos compuestos en el vino que puedan ser txicos para los humanos
y sean debidos a las bacterias lcticas: las aminas bigenas y el carbamato de
etilo. Las aminas bigenas pueden llegar ocasionalmente en algunos vinos a
ms de 10 mg/l y su consumo puede comportar varias patologas, desde
migraas hasta trastornos cardacos. Las principales aminas bigenas
asociadas al vino son la putrescina, histamina, tiramina y cadaverina. Son el
producto de la descarboxilacin de diferentes aminocidos presentes en el
vino. Se han caracterizado diversas especies de bacterias lcticas como
productoras de aminas bigenas, que incluyen L. hilgardii, L. brevis, L. buchneri
y Pediococcus parvulus. Dichas especies son consideradas como
contaminantes durante el proceso de vinificacin, por lo que generalmente la
aparicin de aminas bigenas se asocia a falta de higiene en las prcticas
enolgicas. Algunas cepas de O. oeni tambin pueden producir ciertas
cantidades de aminas bigenas como histamina y, en menor grado, putrescina,
aunque las especies mayoritariamente responsables de elevados contenidos
de estas aminas bigenas en vino son L. hilgardii y P. parvulus. La deteccin
de los genes que codifican los enzimas responsables de la produccin de
aminas bigenas, como el de la histidina descarboxilasa (hdc) en el caso de la
histaminas, puede ser una herramienta para la seleccin de cepas de O. oeni
que carezcan de estos genes.
5.2.4. Carbamato de etilo
Otro compuesto txico, el carbamato de etilo, cancergeno de carcter
genotxico, es detectado en algunos vinos en concentraciones muy bajas
(unos 20 g/l). Aunque el principal precursor del carbamato de etilo en vino por
reaccin con el etanol es la urea excretada por las levaduras, otros precursores
del carbamato de etilo que tambin reaccionan con el mismo son los productos
de degradacin de la arginina (como la citrulina) por parte de diversas especies
de bacterias lcticas mediante la va de la arginina deiminasa (ADI). O. oeni
25
presenta una capacidad variable de degradacin de arginina y los genes de la
ruta ADI se encuentran en gran cantidad de sus cepas. Sin embargo, algunas
cepas de especies consideradas contaminantes, como L. brevis y L. buchneri,
acumulan mayores cantidades de citrulina que O.oeni.
Por otra parte, se ha comprobado que el cido L-mlico inhibe el consumo de
arginina. As pues, un buen control del momento de finalizacin de la FML e
inmediata estabilizacin del vino es clave para evitar el consumo de arginina y
la posible acumulacin de precursores de carbamato de etilo.
5.2.5. Causas de no realizacin o retrasos de la fermentacin malolctica
El vino es un medio hostil para los microorganismos, en general, y para las
bacterias lcticas en particular. A diferencia del mosto que es un medio rico en
componentes nutritivos (fundamentalmente azcares), el vino es un medio
mnimo, y con los problemas agravantes de contener etanol, que es un buen
antimicrobiano, tener un pH relativamente cido, y con una cierta concentracin
de sulfuroso aadido durante la vinificacin.
El pH del vino es uno de los principales factores que afectan al comportamiento
de las bacterias lcticas. Si bien su pH ptimo es alrededor de 4,5, pueden
efectuar la FML a pH normales de los vinos (alrededor de 3,5), pero tienen
muchas dificultades a pH inferiores a 3,2. En cuanto el etanol, por encima del
10%, la reduccin de la actividad de la FML ya empieza a ser manifiesta, dando
lugar a retrasos en su finalizacin cuanto ms etanol tiene el vino, si bien esta
influencia depende mucho de las cepas. As pues, O. oeni se caracteriza por
ser ms resistente, a diferencia de varios Lactobacillus que resultan ms
afectados. En cualquier caso, la concentracin mxima de etanol que permite
la realizacin de la FML es del 15% (v/v).
En los ltimos aos, se han realizado numerosos estudios sobre la respuesta
de O. oeni a los factores de estrs asociados al vino, como el elevado
contenido en etanol o el bajo pH. En este sentido, han sido caracterizadas
diversas protenas de estrs, como Hsp18, y reguladoras como CtsR. Han sido
tambin descritos otros mecanismo que ayudan a O. oeni a sobrevivir en
condiciones desfavorables en funcin de las condiciones del medio y del
estado de crecimiento. Respecto a la respuesta al pH cido, los genes
involucrados seran los relacionados con la degradacin de cidos presentes
en el vino, como el mlico y el ctrico, asociados a bombas de protones que
ayudan a mantener la homeostasis del pH interno. El sistema ATPasa de
membrana responde a la demanda de transporte de protones acoplada al
catabolismo de sustratos, con la consiguiente produccin de energa para la
clula. As pues, la actividad ATPasa y los mecanismos asociados a esta,
como la propia FML, contribuiran a evitar la acidificacin del medio interno
favoreciendo el crecimiento celular.
26
Respecto a la toxicidad del etanol, esta se asocia al aumento de permeabilidad
de la membrana celular a modificaciones en la composicin lipdica. El
aumento de la permeabilidad supone un incremento del transporte pasivo hacia
el interior de la clula, provocando una acidificacin del medio interno. As
pues, los mecanismos que contribuyen a la respuesta al pH cido estaran
tambin relacionados con la tolerancia al etanol. Por otra parte, los cambios
fsicos y de composicin en la membrana celular son cruciales para la defensa
contra agentes de estrs externos.
La respuesta asociada al estrs es variable dependiendo de la cepa de O. oeni
y se ha observado que los niveles de transcripcin de determinados genes
puede ser un indicador del comportamiento metablico durante la FML de
dichas cepas.
6. Hongos: definicin y tipos
Antes de empezar a hablar de las levaduras que son las responsables de la
fermentacin del azcar del mosto de la uva en alcohol, primero hablaremos de
los hongos para entender mejor el comportamiento y el funcionamiento de las
mismas.
Los hongos desempean un papel destacado en los ciclos de la naturaleza,
sobre todo en los procesos de descomposicin de la materia orgnica. Se han
clasificado hasta ahora aproximadamente 70.000 hongos. Las levaduras
pertenecen, como todos los hongos, a las clulas eucariotas, es decir, su
material gentico est concentrado en un ncleo celular. Son hongos
productores de esporas (endomicetos).
A partir de las levaduras salvajes se obtienen cultivos de levaduras que tienen
un gran significado industrial, como las levaduras de cerveza (por ejemplo
Saccharomyces carlsbergensis), levaduras de vino y de pan (S. cerevisiae) y
levaduras del forraje (Candida). Candida utilis crece sobre las aguas residuales
de sulfito de las fbricas de celulosa como levadura de forraje. Candida
maltosa se alimenta de alcanos (parafinas) del petrleo y puede generar
forraje. Trichosporon cutaneum es un importante aerbico que se encuentra en
aguas residuales, que incluso puede degradar fenol un veneno para otros
hongos. Trichosporon y las levaduras Arxula adeninivorans se utilizan como
sensores microbianos en aguas residuales.
Los mohos pertenecen a los mohos con sacos esporales o esporangios en
forma de manguera (ascomicetos), que con 20.000 tipos es el grupo
mayoritario de los hongos. Tienen, en contraste con las levaduras
redondeadas, largas clulas estiradas, y viven principalmente estrictamente
aerbicos. Los mohos forman esporas asexualmente mediante divisin de los
ncleos celulares de los sacos esporales, que en general se expanden en el
27
aire del micelio. Las esporas maduras se propagan con facilidad con el viento.
Si caen en un sustrato apropiado, germinan y forman nuevos micelios.
Muchos hongos se clasifican segn su apariencia (morfologa) y el color de sus
sacos esporales (esporangios), porque el micelio generalmente es difcil de
distinguir, pues es incoloro y representa un desorden en forma de tubo. Puesto
que los hongos ms importantes industrialmente se introducen (sumergen)
principalmente en tanques como grumos mviles de micelios, no forman
esporas.
En cuanto a la alimentacin, los mohos son similares a las levaduras, aunque
se tratan ms verstilmente. As, algunos pueden en contraste con las
levaduras crecer tambin sobre celulosa (Trichoderma reesi) o lignina
(Phanaerochaete chrysosporium).
Los mohos del gnero Asperggillus (mohos con esporangios en forma de
regadera) y Penicillium (mohos con esporangio en forma de pincel) son la base
para muchas fermentaciones, particularmente para la degradacin del almidn
y las protenas en la cebada, el arroz, y las habas de soja.
Otros mohos con esporangio en forma de pincel ayudan a producir quesos
como el camembert y el roquefort. Las amilasas y proteasas generadas por
hongos se obtienen tambin como preparados enzimticos industriales.
7. Levaduras y fermentacin
Las levaduras se encuentran entre los hongos (fungi), en concreto pertenecen
a la clase de los hongos con micelio tabicado (Ascomycetes), el tipo ms
abundante de la clasificacin de los hongos.
En contraste con las bacterias procariotas, las eucariotas tienen una estructura
celular compleja (comportamientos como mitocondrias) y un autntico ncleo
celular. Se denominan tambin hongos productores de esporas, porque se
multiplican sobre todo asexualmente (vegetativos) mediante esporulacin. Sin
embargo, tambin se pueden reproducir sexualmente por copulacin de dos
clulas esporas haploides, stos tienen una composicin cromosmica
completa simple. Las levaduras se clasifican segn el tipo de reproduccin de
los diferentes tipos de hongos.
Las levaduras constan de una nica clula. Esta clula madre forma en la
esporulacin varias protuberancias, brotes hijos, que se separan, son a su vez
viables y pueden formar nuevas clulas. Crecen de modo hetertrofo (a partir
de nutrientes, sin fotosntesis) preferentemente a valores de pH cidos. Su
pared celular consta, como la sustancia del esqueleto de los insectos, de
quitina, y adems de hemicelulosa.
28
Pasemos ahora a la bioqumica, para responder a una pregunta vital de las
clulas de levadura. Las levaduras pueden vivir como respiradores (aerbicos)
o fermentadores (anerbicos), y por lo tanto son aerbicos facultativos. En
presencia de oxgeno las levaduras crecen esplndidamente, con la respiracin
convierten el azcar en CO2 y agua, y producen con ello energa, que utilizan
para el crecimiento y la produccin de nuevas clulas.
Si se detiene el suministro de aire a las levaduras, los microbios interrumpen su
metabolismo de fermentacin en la medida de la necesidad. La fermentacin
les ayuda a sobrevivir en tiempos hostiles, a pesar de ser energticamente
desfavorable. Louis Pasteur descubri en 1861 que una levadura sin oxgeno
utilizaba ms glucosa. Esto se denomin efecto Pasteur. Las levaduras en
condiciones anaerbicas procesan ms molculas de azcar para compensar
las prdidas de energa. Puesto que no hay ms oxgeno para utilizar, tampoco
puede quemarse en la cadena de respiracin con el cofactor NADH + H+
acumulado. La transformacin de glucosa permanece, por lo tanto, en la fase
de piruvato.
La clula transforma piruvato en acetaldehdo. Con ello se libera CO2. El ciclo
de Krebs ya no puede ser utilizado. Para utilizar el NADH + H+ acumulado, que
no puede reoxidarse a NAD+ en la combustin fra debido a la deficiencia de
O2, a la clula le queda solamente un camino: utiliza la alcoholdeshidrigenasa y
forma, a partir de acetaldehdo, con la utilizacin de NADH + H+, etano y
NAD+.
La glucosa se quema finalmente de modo incompleto a alcohol y CO2. En la
fermentacin de una molcula de glucosa se originan solo de una a cuatro
molculas de moneda de cambio energtico ATP (en lugar de un mximo de
38 en la respiracin con oxgeno); esto es suficiente para sobrevivir.
El alcohol no es, por lo tanto, un placer para la levadura, ms bien una
necesidad, pero muere si el contenido de alcohol supera un determinado valor.
Contrariamente a la opinin clsica, el etanol tambin puede producirse
aerbicamente (efecto Crabtree) si el medio de alimentacin contiene ms de
100 mg de glucosa por litro, En esta reaccin en exceso el piruvato no se
oxida siguiendo el ciclo de Krebs, sino que se reduce a etanol.
Con la ayuda de los modernos chips gnticos para ARNm de levadura (un
cido nucleico de una nica hebra, que desde el ADN del ncleo celular
alcanza los ribosomas con las instrucciones de construccin para las protenas,
se observa que cuando hay deficiencia de oxgeno las levaduras anaerbicas
producen otras enzimas diferentes a las de las levaduras aerbicas. Es decir,
los genes (ADN) se escogen de manera diferente y expresan diferentes
protenas, segn la situacin oxgeno de la clula de levadura.
29
Otros fermentadores, las bacterias, forman cido lctico (Lactobacillus), cido
butrico (Clostridium butyricum), cido propinico (Propionibacterium), acetona
y butanol (Clostridium acetobutylicum), as como otros productos con gasto de
ATP, y los secretan.
Los productos de la fermentacin se forman, pues, en grandes cantidades, ya
que solo la transformacin libera mucha ms cantidad de alimentos en
ausencia de oxgeno que energa requerida en forma de ATP de las clulas.
Ahora est claro por qu los primeros procesos de biotecnologa que utilizaron
los humanos fueron la fermentacin del alcohol y del cido lctico: las
fermentaciones liberan grandes cantidades de producto en un perodo de
tiempo muy corto y son, por lo tanto, altamente efectivas.
7.1 Fisiologa de la fermentacin
Andrew Markides es Doctorado en Microbiologa y Director General del
laboratorio de investigacin de Lallemand en Australia. Durante un seminario
organizado por Lallemand en Burdeos (Francia), Markides acab con la
discusin cultivos seleccionados versus indgenas, explicando las diferencias
en la fermentacin.
No es una versus la otra, respondi a la pregunta de los periodistas presentes
en el seminario. El problema con las levaduras indgenas es su
impredecibilidad, en trminos del comienzo y la finalizacin de la fermentacin.
Las levaduras seleccionadas, en cambio, tienen caractersticas y
comportamientos de fermentacin conocidos. Se pueden variar los niveles de
inoculacin para conseguir distintos tipos de fermentacin. sta es la
diferencia, detall.
La vieja disputa que enfrenta a las levaduras seleccionadas con las indgenas,
pierde todo su sentido cuando se tiene en cuenta que ni si quiera las levaduras
seleccionadas son capaces de crear un vino uniforme que tenga el mismo
sabor o estilo en todo el mundo. La regionalidad del mosto de la uva en
combinacin con cualquier levadura, ser lo que de la caracterstica al vino,
recalc Markides.
No obstante, estudios realizados indican que las levaduras seleccionadas,
como las cerevisiae o las bayannus, aportan carcter, complejidad y peso en el
paladar. Las bayannus, adems, tienen el potencial de producir un cctel de
componentes aromticos que parecen aportar carcter al vino.
7.1.1 Saccharomyces cerevisiae, la estrella
A la hora de elaborar un vino, los enlogos se enfrentan a un elemento de
conflicto y a una pregunta: debemos intervenir o dejar que la naturaleza
acte? Ante esta cuestin, lo ms importante anota el investigador es el
30
conocimiento prctico, de esta manera podemos identificar y manejar los
riesgos.
Cuando se trata de la fermentacin, el enlogo se permite una expresin
artstica, minimizando los niveles de riesgo y decide si usar levaduras
indgenas o levaduras seleccionadas. Cuando se utiliza un 100% de levaduras
indgenas, si la fermentacin se desva hacia otros metabolismos no deseados,
muchas veces es necesaria una intervencin. En este caso se introducen
levaduras seleccionadas.
Markides explic que hoy se conocen 700 especies de levaduras para vinos, de
las cuales solamente 70 crecen en viedos y la ms difcil de encontrar es la
Saccharomyces cerevisiae. Esta levadura, segn se ha observado en
laboratorio, permanece activa hasta el final de la fermentacin alcohlica,
permitiendo predecir que llegar exitosamente a buen trmino, lo cual ayuda a
minimizar los riesgos.
La S. cerevisiae permite, adems, equilibrar los sabores sobre-maduros o
verdes de los varietales y los fenoles. Para una cosecha con mucha madurez,
en la fermentacin se usan levaduras que no extraen tantos fenoles, que
reducen la percepcin de lo verde y si tiene mucha azcar por gran madurez,
son capaces de metabolizar esa cantidad, detall.
7.1.2 Contribucin al color
Consultado sobre este punto, Markides respondi que la contribucin de la
levadura a las caractersticas del vino es significante. La respuesta, sin
embargo, es difcil, porque el proceso de hacer el vino es realmente complejo.
La fruta importa, si no importara tendramos azcar, agua y levaduras, pero eso
no dara estructura al vino. Sin embargo, estamos en condiciones de asegurar
que las levaduras pueden demorar la desaparicin del color en el vino, la
oxidacin. Tambin existe al menos un 5% de levaduras en la fermentacin
que ayuda a estabilizar el color de los vinos tintos, aunque no tiene la habilidad
de corregir un error en el origen del color, explic.
7.1.3. Parmetros bsicos para una mejor gestin
Parmetros bsicos para optimizar el rendimiento de las levaduras
seleccionadas: concentracin acuosa ms azcar significa menos agua,
amenazando el estado del microbio, su vitalidad y viabilidad.
PH. Las levaduras prefieren pH ms elevados. Un pH bajo con alcohol
es malo para los microbios.
Temperatura. Afecta a la energa de biomolculas.
Oxgeno. Es bueno para las levaduras.
31
Tipo de alimento y concentracin. Apoya el crecimiento microbiolgico,
la vitalidad y el mantenimiento de la clula.
Para obtener los mejores resultados posibles, el enlogo debe manejar su
sinergia entre el mosto de uva y el ambiente de fermentacin, con el
comportamiento de la levadura. Aumentar los niveles de azcar reduce las
posibilidades de sobrevivir de las clulas. La levadura tiene la capacidad de
mejorar su pH cuando el pH del mosto de uva es muy alto o bajo. En cuanto al
oxgeno, si en alguna etapa de la fermentacin se puede introducir, esto
ayudar a la levadura a producir elementos dentro de la membrana, que son
vitales para su salud. Est demostrado que la introduccin de un poco de
oxgeno en las ltimas etapas del desarrollo de la levadura es vital para su
sanidad y estimulacin.
Otro punto a tener en cuenta es que la falta de oxgeno durante la fermentacin
alcohlica resulta en la reduccin de la sntesis de protena, llegndole a la
clula menos azcar y aumentando la posibilidad de incidencias de
fermentacin incompleta.
La inclusin de nitrgeno inorgnico est siendo estudiada, explic Markides.
En cuanto a los tiempos de fermentacin es necesario evitar que sean rpidos.
Tambin es imperioso evitar los demasiado largos. Con levaduras indgenas, la
S. cerevisiae domina la fermentacin en el jugo de uva una vez que el alcohol
excede 3 4% en volumen, detall.
7.2. Una levadura para cada tipo de vino
El doctor Sakkie Pretorius, Director General del Instituto Australiano de
Investigacin vincola (AWRI por sus siglas en ingls de Australian Wine
Research Institute) fue invitado a disertar en el seminario sobre Levaduras
Seleccionadas, organizado por la empresa Lallemand en Burdeos (Francia) a
mediados de junio pasado, al que asisti prensa especializada de todo el
mundo.
La conferencia de Pretorius se bas en las nuevas investigaciones llevadas a
cabo por el AWRI en base a las conjunciones de componentes de levaduras
seleccionadas que permiten incorporar modificaciones a los vinos durante la
fermentacin, para lograr los resultados deseados por el enlogo.
Esto, teniendo en cuenta que son combinaciones de componentes de
levaduras, y no levaduras modificadas genticamente.
7.2.1. La huella gentica
El material gentico bsico, la huella gentica (genmics) es el foco de
investigacin en fermentacin en estos das. Los metabolitos explic
Pretorius abarcan todo lo metablico que un organismo es capaz de producir.
32
Cuando bebemos un vino, lo que bebemos es la conjuncin del metabolismo
de la uva y de la levadura
Los estudios cientficos sobre los metabolitos o diferentes conjunciones
metablicas, han llevado al AWRI a desarrollar diferentes caminos para ayudar
a dar forma a un vino en cuanto a calidad, aromas y sabores, mediante la
correcta utilizacin de determinadas levaduras seleccionadas (Saccharomyces
cerevisiae).
Cuando hablamos de carcter aromtico en un vino nos referimos a esto que
en la jerga normal llamamos aromas frutales, tropicales, etctera.
Las levaduras le dan carcter a un vino, pero es la uva la que aporta la
estructura bsica, aclara Pretorius. Partiendo de aqu, puntualiza que las
ltimas investigaciones sostienen que lo que genera pequeas diferencias
entre un vino y otro es el aporte de los metabolitos (compuestos generados por
el metabolismo de los seres vivos), pequeas partes que vienen tanto de la uva
como de las levaduras.
Existen cientos de componentes que generan diferentes caractersticas en el
vino, de hecho si bien conocemos algunos de los componentes aromticos en
los blancos se han caracterizado 14 compuestos con impacto en el aroma
prcticamente no sabemos nada acerca de los componentes aromticos en los
vinos tintos.
7.2.2. La evolucin de la Saccharomyces: hibridacin
El trabajo con combinaciones de levaduras, o desarrollo de cepas, ha llevado a
los investigadores a obtener grandes avances en la utilizacin de determinados
componentes para obtener mejores aromas en un vino.
El doctor Sakkie Pretorius explic el proceso. La clula madre de una levadura
tiene como funcin transformar el azcar, el nitrgeno, el fosfato, el sulfuro, el
oxgeno y los minerales en etanol y CO2. A travs de un proceso denominado
gluclisis tambin se descomponen los precursores de los sabores,
denominados terpenos.
La levadura convierte los compuestos no voltiles (no aromticos) en
componentes que podemos percibir mediante el olfato. Todo el proceso se
explica a fin de llegar a la conclusin de que en este punto la levadura ha
producido ms glicerol que alcohol, logrando un efecto contrario al que se
espera, ya que el glicerol es positivo para los aromas del vino. Pretorius
puntualiza en este sentido que la fisiologa de la levadura para obtener lo que
se quiere de un vino puede ser manipulada por el hombre.
Con este fin se han desarrollado varios mtodos para desarrollar diferentes
cepas de levaduras: seleccin de cepas, evolucin direccionada, mitognesis
33
(mutar componentes), hibridacin (tcnica que se emplea para cruzar
diferentes especies de levaduras) e ingeniera gentica (la nica tcnica
utilizada para modificar genticamente el ADN y lograr los OMGs).
7.2.3. Como se trabaja
El cruce o mezcla de levaduras ha logrado excelente resultados en laboratorio.
Cruzando levaduras podemos satisfacer ciertas preferencias del mercado,
explic el doctor Pretorius. Por ejemplo, si se quiere obtener un vino con menos
alcohol y ms afrutado, se pueden realizar cruces de cepas de levaduras que
le brindan al enlogo las herramientas para lograr lo que desea. Las levaduras
as desarrolladas permiten, adems, proteger a los vinos del exceso de sulfuro
de hidrgeno, el H2S, responsable del olor a podredumbre o humedad.
Mediante la inoculacin con mezclas de levaduras es posible adems, sumar al
vino componentes que permitan la aparicin de aromas a frutos frescos. En el
laboratorio han logrado, adems, que tres mezclas de levaduras redujeran un
2,7% el nivel total de alcohol de un vino. Estas combinaciones de levaduras no
son mgicas, pero mejoran mucho el producto en la direccin deseada,
aseguran los investigadores de AWRI.
7.3. Modificacin gentica de levaduras vnicas
La fermentacin del mosto en vino es una reaccin microbiolgica compleja en
la que se produce un desarrollo secuencial de levaduras y bacterias lcticas.
Tradicionalmente, el vino se produce por la fermentacin natural llevada a cabo
por las levaduras. El origen de estas levaduras puede estar en la superficie de
los hollejos de las uvas o el ambiente de la bodega (maquinaria,
fermentadores, etc.). La dinmica de la flora responsable del proceso
fermentativo del mosto ha sido objeto de numerosos estudios.
La microflora presente en la superficie de la piel de la uva se ve afectada por
un gran nmero de factores que influyen en la proporcin de las diferentes
especies presentes. Entre estos factores se incluyen la temperatura, la
pluviosidad y otras influencias climticas, el grado de madurez de la cosecha,
el uso de fungicidas, el dao fsico debido a hongos, insectos, y la variedad de
uva. Por otro lado, cuando la superficie de la maquinaria de la bodega, como
prensas, tanques, fermentadores y bombas, entre otros elementos, entra en
contacto con el mosto de uva constituye otra fuente de aporte de levaduras.
Esta flora residente en el ambiente de la bodega est formada
mayoritariamente por S. cervisiae, aunque tambin se han aislado especies de
los gneros Candida, Pichia, Hansenula, y Brettanomyces. Sin embargo, la
especie Saccharomyces Cerevisiae es la responsable de la fermentacin
alcohlica a pesar de que sus niveles en la uva son bajos, alrededor de 50
clulas/ml, durante la fermentacin se multiplica rpidamente y desplaza a
otros microorganismos que eventualmente invaden el mosto. No obstante,
34
variaciones en la flora inicial pueden influir en la calidad del vino y dar lugar a
cambios en la acidez voltil y a sabores y olores desagradables.
7.3.1. Utilizacin de levaduras seleccionadas en la vinificacin
Desde el punto de vista microbiolgico, la variabilidad en la flora levaduriforme
de los mostos puede solventarse adicionando en cada campaa de vendimia
un inculo microbiano que, al ser mayoritario, normalice la flora inicial y, de
esta forma, d lugar a una fermentacin homognea ao tras ao. Aunque
cultivos lquidos de levadura vnica han sido utilizados desde 1930 (Instituto
Laclaire, Francia), las levaduras vnicas secas no aparecieron hasta mediados
de los aos cincuenta, cuando de forma independiente varios laboratorios
europeos, canadienses y estadounidenses llevaron a cabo una seleccin de
levaduras vnicas que posteriormente utilizaron como inculo en
fermentaciones dirigidas. Todos ellos concluyeron que las levaduras vnicas
seleccionadas crecan bien en una fermentacin de mosto y que producan un
buen vino. Desde entonces, en varias zonas de Europa, Estados Unidos,
Canad y Australia se realizan fermentaciones utilizando cultivos iniciadores.
Hoy se comercializan ms de cien cepas diferentes pertenecientes
principalmente a seis casas comerciales.
Aunque pueden producirse diferencias en la diversidad microbiana del mosto
inicial, ya no solo entre regiones vitivincolas distintas, sino tambin dentro de la
misma bodega en diferentes vendimias, la utilizacin de levaduras
seleccionadas produce fermentaciones controladas y, como consecuencia de
esta prctica, el vino mantiene sus caractersticas sensoriales tpicas en cada
regin. Segn Cuinier, la utilizacin de levaduras seleccionadas puede evitar
alteraciones qumicas y microbiolgicas en las primeras fases de la
fermentacin, como paradas espontneas, o mejorar la composicin qumica e
influir en la calidad, tanto gustativa como aromtica del vino. Por esta razn, en
los ltimos aos, se ha extendido el uso de levaduras autctonas de cada
regin.
Los estudios de identificacin y caracterizacin de las diferentes especies de
levaduras, as como de las cepas que pertenecen a una misma especie han
estado basados en criterios morfolgicos y fisiolgicos. Estas caractersticas
pueden variar en funcin de las condiciones de cultivo y, en ocasiones, las
especies han sido delimitadas por una nica caracterstica fisiolgica, que en
algunos casos estaba controlada por un solo gen. Ms recientemente se han
desarrollado tcnicas de biologa molecular que se presentan como una
alternativa a los mtodos tradicionales para la caracterizacin e identificacin
de levaduras.
Por otra parte, tambin resulta interesante la caracterizacin de cepas de
levaduras con dos fines: en primer lugar, para controlar el proceso de
elaboracin de levaduras secas activas y, en segundo lugar, para comprobar la
35
implantacin de las levaduras comerciales durante la fermentacin alcohlica
en la bodega. Se han desarrollado diversas tcnicas moleculares para la
caracterizacin de cepas vnicas. Querol y cols. han desarrollado un mtodo de
anlisis del ADN mitocondrial (mtADN) que evita la utilizacin de gradiantes en
cloruro de cesio y el uso de una ultracentrfuga, factor limitante para su
utilizacin en la industria. Esta tcnica rpida permite el anlisis de un mayor
nmero de cepas en menos tiempo, y su aplicacin resulta ideal en la industria
por su rapidez, seguridad y economa, y por no requerir material sofisticado ni
personal muy especializado. Mediante esta tcnica Querol y cols. han mostrado
la implantacin y el papel de una levadura seca activa (LSA) que haba sido
inoculada en las fermentaciones de dos bodegas distintas. Se demostr que la
cepa inoculada competa con las cepas naturales pero no suprima
completamente su crecimiento hasta varios das despus de haber sido
inoculada. Sin embargo, el predominio de la cepa inoculada era evidente en
ambas bodegas y represent el 68,09% y el 89,46% de las colonias aisladas en
la fase final de la fermentacin.
El uso de levaduras inoculadas y la demostracin formal mediante tcnicas
moleculares de su imposicin, junto con los avances en biotecnologa, abren la
puerta a la modificacin gentica de las levaduras vnicas.
7.3.2. Mejora gentica de levaduras vnicas
Las caractersticas genticas de una levadura vnica pueden ser modificadas
segn las necesidades de la industria vitivincola. Se han desarrollado diversas
levaduras utilizando tcnicas clsicas como la induccin y seleccin de
mutantes, y la hibridacin y fusin de protoplastos. Sin embargo, la aplicacin
de las tcnicas de ADN recombinante se presenta como un enfoque ms
sencillo y preciso, tal como veremos a continuacin.
Los pasos bsicos para clonar un gen y transformar una levadura vnica son:
a) Identificacin del gen que le va a conferir una caracterstica nueva a la
levadura y aislamiento del fragmento de ADN forneo.
b) Identificacin y linearizacin mediante el uso de enzimas de restriccin
del vector (plsmido) que va a servir para introducir el nuevo gen en la
levadura (dicho plsmido posee sistemas de seleccin para las
levaduras transformadas o modificadas genticamente)
c) Transformacin de la levadura, es decir, introduccin del vector con el
gen en el interior celular
d) Seleccin de las levaduras transformadas, aquellas que han incorporado
el plsmido con el nuevo gen.
36
Estos sistemas estn basados mayoritariamente en resistencias a antibiticos.
Estos plsmidos pueden permanecer de forma independiente en la clula o
pueden ser <<integrativos>>, o sea que el nuevo gen se integra en una zona
concreta del genoma de la levadura eliminando el ADN no necesario del vector
y los genes responsables de las resistencias a antibiticos.
Siguiendo esta metodologa es posible construir cepas que expresen
actividades metablicas de inters o que ejerzan efectos beneficiosos en las
caractersticas organolpticas de los vinos. Se han desarrollado diversas
levaduras vnicas recombinantes. Por ejemplo, se han diseado levaduras
vnicas que, al contener los genes que codifican los factores killer K1 y K2,
presentan una ventaja ecolgica evidente, ya que las levaduras vnicas solo
expresan el factor K1 y, por tanto, son resistentes nicamente a este factor
killer. Otro ejemplo es la construccin de cepas de laboratorio de
Saccharomyces cerevisiae que, al expresar el gen de la L(+)- lactato
deshidrogenasa de Lactobacillus casei, pueden llevar a cabo una fermentacin
mixta (lactoalcohlica) y por ello solventar el problema de baja acidez de los
vinos de regiones clidas. Aparte de la fermentacin alcohlica, la fermentacin
malolctica es un proceso tecnolgico de gran importancia en enologa.
Mediante su uso se logra desacidificar los vinos tintos y algunos vinos blancos
en regiones fras. Esta fermentacin la llevan a cabo bacterias cido lcticas,
sobre todo Oenococcus oeni, y rebaja la acidez de los vinos al descarboxilar el
cido L-mlico a cido L-lctico. La reaccin est catalizada por el llamado
enzima mlico que ha sido purificado de varias bacterias cido lcticas. Los
genes correspondientes han sido clonados a partir de aislados de Lactobacillus
delbruecki, lactobacillus lactis y Oenococcus oeni. Las cepas de S. cerevisiae
no pueden metabolizar el melato del mosto, por lo que la idea de expresar el
gen que codifica el enzima mlico en la levadura vnica ha sido un objetivo
prioritario de la biotecnologa enolgica. De hecho, durante los ltimos aos
varios grupos han informado sobre la construccin de levaduras vnicas que, si
bien expresaban eficazmente genes bacterianos que codifican la enzima
mlica, no daban lugar a la desadificacin. Recientemente se ha conseguido
una va eficaz de degradacin de mlico en S. cerevisiae. Para ello se ha
construido una levadura recombinante que porta un gen de la levadura
Schizosaccharomyces pombe, que codifica un malato permeasa y el gen de L.
lactis que codifica la enzima mlica. Esta levadura es capaz de fermentar 4,5
g/L de malato en mostos artificiales en tan solo cuatro das.
Otro ejemplo interesante del uso de las tcnicas de ingeniera gentica en
enologa lo constituye la construccin de levaduras vnicas recombinantes que
expresan genes que codifican celulasas y hemicelulasas. Es una prctica
habitual en las bodegas la adicin de estas enzimas para solventar problemas
de filtracin o incrementar aromas afrutados, pero la heterogeneidad de las
preparaciones comerciales (una mezcla de enzimas que vara segn el lote) h
37
ha hecho de su uso algo imprescindible. En el laboratorio del Instituto de
Agroqumica y Tecnologa de los Alimentos (IATA) se han construido diversas
levaduras vnicas recombinantes que contienen genes de hongos filamentosos
que codifican beta-(1,4)-endoglucanasa, alfa-L-arabinofuranosidasa, beta-
glucosidasa, endoxilanasas y alfa-ramniosidasas. Todas estas levaduras son
capaces de secretar las enzimas correspondientes al mosto en cantidades
suficientes para llevar a cabo el proceso tecnolgico y producir vino en
cantidades suficientes para llevar a cabo el proceso tecnolgico y producir vino
con adecuadas caractersticas organolpticas. Tambin se ha desarrollado una
levadura recombinante que contiene un gen fngico que codifica una pectato
liasa til para solventar problemas de filtracin. Todas estas cepas se pueden
usar como herramientas para investigar el papel individual que desempea
cada enzima en el proceso de vinificacin. En la actualidad se est investigado
sobre la utilidad de enzimas puras y la combinacin de enzimas ms adecuada,
dependiendo de las variedades de uva. Otra de las lneas de investigacin del
grupo, recientemente iniciada, consiste en aumentar la produccin de los
aromas secundarios mediante el incremento de la capacidad de sntesis de
estrs por parte de la levadura durante la fermentacin alcohlica.
La modificacin gentica de las levaduras vnicas exige conocer promotores de
genes de levaduras que se expresen especficamente durante determinados
tiempos de fermentacin. Estos promotores se pueden comparar con los
interruptores de la luz que encienden o apagan, es decir, que permiten que el
gen codifique o no lo haga para la protena de inters. Por ello, diversos
trabajos de investigacin tienen como objetivo entender la regulacin de la
expresin gnica en S.cerevisiae durante la vinificacin. En la actualidad se
dispone de varios promotores que se inducen especficamente durante la
prefermentacin, fermentacin tumultuosa o posfermentacin. Por otra parte,
estos estudios nos han permitido constatar que a nivel de expresin gnica, las
levaduras se comportan de forma muy distinta en condiciones de laboratorio o
en vinificacin, incluso se pueden observar diferencias segn la variedad de
mosto que se vaya a fermentar.
Por ltimo, merece una mencin especial el reciente desarrollo de protocolos
de transformacin para levaduras vnicas que rinden levaduras recombinantes
GRAS (de Generally Recognized As Safe) mediante sistemas de integracin en
el genoma de las levaduras evitando el uso de resistencias a antibiticos, uno
de los mayores problemas en el uso de microorganismos modificados
genticamente.
7.4 Desarrollo de nuevas levaduras ms eficientes
Investigadores del Departamento de Bioqumica y Biologa Molecular de la
Universitat de Valncia han logrado obtener, mediante procesos de
modificacin gentica, levaduras industriales ms eficientes para mejorar y
38
agilizar la fermentacin de los vinos. El Grupo de Biotecnologa de Levaduras
Vnicas, dirigido por la profesora Emilia Matallana, investiga la levadura
Saccharomyces cerevisiae, un microorganismo imprescindible para la
fermentacin, pues es el responsable directo de la transformacin de los
azcares presentes en el mosto del uva en alcohol.
Matallana argumenta que el papel de esta levadura es esencial, porque sin
ella no hay fermentacin, ni vino, pero adems, contribuye a las propiedades
del vino mediante productos que vierte durante su crecimiento.
Saccharomyces cerevisiae aporta, por ejemplo, el glicerol, el alcohol, un
alcohol que determina el cuerpo del caldo, adems de multitud de compuestos
aromticos que se suman a los procedentes por la variedad de uva.
Estas lneas de investigacin lideradas por la UV son vitales para la industria
enolgica actual, ya que las empresas del sector apenas realizan
fermentaciones espontneas, dependientes de la flora microbiana natural
presente en las uvas y en la maquinaria de las bodegas, como antiguamente.
Hoy en da la produccin de vino se basa en fermentaciones inoculadas, es
decir, llevadas a cabo por levaduras vnicas naturales que han sido purificadas,
producidas industrialmente y comercializadas. La ventaja de esta prctica es la
garanta de una fermentacin rpida, con menos riesgos de paradas y
contaminaciones microbianas indeseadas, como tambin una mayor
reproducibilidad en la calidad de los vinos, destaca Matallana.
Paralelamente, esta prctica permite el uso de levaduras concretas, distintas y
adecuadas para la produccin de distintos tipos de vinos o en funcin de las
caractersticas de cada cosecha. De esta forma, pueden escogerse levaduras
comerciales ptimas para la fermentacin de mostos procedentes de cosechas
con un alto grado de maduracin y, por tanto, muy ricos en azcares. Tambin
es posible identificar levaduras adecuadas para llevar a cabo las vinificaciones
en fro, prctica muy innovadora en la enologa actual, o levaduras que
producen vinos de propiedades organolpticas deseables y, al mismo tiempo,
apreciadas por el consumidor.
El grupo de la UV, en el que tambin participa el profesor Agustn Aranda,
investiga, desde hace ms de una dcada, los mecanismos que permiten a las
levaduras del vino adaptarse a las condiciones adversas a las que se enfrentan
durante las diferentes fases de uso industrial. Mediante estos avances,
estamos mejorando la eficiencia de las levaduras vnicas en la industria
enolgica, a travs de dos vas: la seleccin de levaduras naturales con mejor
adaptacin tecnolgica o su manipulacin gentica para adaptarlas al estrs,
apunta Aranda. De hecho, recientemente, estos cientficos han conseguido
datos interesantes sobre la implicacin de ciertos genes en la adaptacin al
estrs que sufren durante la vinificacin debido, por ejemplo, a la alta
concentracin de alcohol o el agotamiento de nutrientes del mosto. Adems,
39
han logrado mejoras en la fermentacin de las levaduras, gracias a la
manipulacin de genes implicados en la adaptacin a condiciones de estrs
oxidativo. Sus resultados han sido publicados este ao en la revista Applied
Microbiology and Biotechnology.
7.4.1. Mejoras para las denominaciones de origen
Otra de las iniciativas de este grupo de cientficos de la UV es abordar una
caracterizacin de diferentes levaduras vnicas, tanto comerciales como no,
desde el punto de vista de su capacidad de adaptacin al estrs. Con ello, se
podran identificar y escoger levaduras de cada denominacin de origen, que
presentarn una ptima adecuacin tecnolgica, tanto para la produccin de
las levaduras a escala industrial como para la elaboracin del vino, aade
Emilia Matallana. En consecuencia, las bodegas podran utilizar estas
levaduras para llevar a cabo fermentaciones con mayor estabilidad
microbiolgica y, por tanto, ms seguras, mientras usan levaduras autctonas
que contribuyen a garantizar las continuidad de las propiedades y de la calidad
tpicas de cada vino.
8. Conclusiones finales
En los ltimos aos se ha ido conformando una industria vitivincola a nivel
global. Como consecuencia, la industria de vinos local enfrenta un proceso de
intensa restructuracin. La mayor presin competitiva da lugar a estrategias
tecnolgicas heterogneas, en las que las empresas responden con distinto
grado de esfuerzo tecnolgico y vinculacin con instituciones cientficas, en
funcin de sus capacidades tecnolgicas acumuladas.
La biologa molecular abre oportunidades mayores para aumentar la calidad,
consistencia y diferenciacin de los productos finales a partir de innovaciones
en los procesos de fermentacin. La realizacin de estudio nos ha permitido
apreciar que las empresas se caracterizan por adoptar las nuevas tcnicas a
partir de la compra de estos ingredientes, reproduciendo el patrn de
comportamiento tecnolgico determinado por los proveedores en el cual las
empresas usuarias no controlan ni la direccin ni el ritmo del cambio
tecnolgico.
Por su parte las capacidades tecnolgicas de las empresas locales, ya sea en
el desarrollo o en la adaptacin de estos ingredientes, son limitadas. A
excepcin de las casas matrices de las grandes multinacionales, no intervienen
en procesos de aprendizaje junto a los proveedores. En los casos
excepcionales en los cuales existieron desarrollos puntuales, las empresas
debieron recurrir a capacidades externas en microbiologa, como lo evidencia
una de las principales empresas locales con estrategias de innovacin de
40
productos orientadas a nichos de diferenciacin. En estos casos las empresas
de consultora con cientficos extranjeros o con instituciones locales.
Como resultado de las limitaciones de economas de escala en activos crticos
para la fabricacin de levaduras y otros ingredientes, no hay un segmento de
empresas locales que produzca levaduras ni bacterias adaptadas a
condiciones locales. De esta forma, si bien existe un fuerte potencial para
desarrollar levaduras asociado a la existencia de una infraestructura de Ciencia
y Tcnica con capacidades en estas reas y con desarrollos autctonos a
escala de laboratorio, no se ha conformado un sistema nacional de innovacin.
La ausencia de vinculaciones proveedor-usuario en la etapa de escalado y
fabricacin de ingredientes, y un dbil desarrollo institucional que asegure un
reparto de excedentes consistente con la innovacin de los institutos pblicos.
En este contexto, estos desarrollos con en gran parte impulsados a partir de
contratos de vinculacin con empresas multinacionales que absorben los
desarrollos locales de cepas, ampliando sus bibliotecas de microorganismos en
el marco de su estrategia global.
41
Anexo I
Patrick McGovern, de la Universidad de Pennsylvania, trabaja combinando la
qumica analtica con la arqueologa e investiga las pistas del vino. En estos
momentos se est realizando una investigacin detectivesca-histrica sobre la
prpura de los emperadores obtenida del molusco Murex trunculus. MaGovern
defiende la hiptesis de No: el bblico No lleg a la tierra en el monte
Ararat, actualmente al este de Turqua, y empez el cultivo de la vid. La
agricultura se estableci en realidad en Ararat, con la domesticacin del trigo.
El vino eurasitico natural (Vitis vinfera sylvestris) se encuentra desde Espaa
hasta Asia Central. La elaboracin de vino procede de estos vinos naturales.
McGovern busca en las montaas turcas Taurus (donde nace el Tigris) el lugar
donde pudo tener su origen el vino natural. Jos Vouillamoz, del Instituto
Italiano Agrario di San Michele allAdige, en Trento, y Ali Ergl de la
Universidad de Ankara, estn en el equipo de ADN. El equipo colecciona todas
las posibilidades de cultivadores de vino locales. Se quieres seguir el origen de
la formacin del vino.
Los investigadores buscan tambin fragmentos de arcilla con restos de vino.
Un indicio potente corresponde al tartrato (cido tartrico), investigado en su
tiempo por Louis Pasteur, que se encuentra en el vino. Hace diez aos, Patrick
McGovern crea ya que las pistas ms antigua del vino y de la cerveza de
cebada son de hace 7400 aos, en el pueblo iran Hajii Firuz Tepe.
Sin embargo, ahora se han encontrado en Jiahu, en la provincia Henan de
China, los ms antiguos huesos oraculares, con caracteres chinos, y flautas
de huesos de ave y fragmentos de arcilla. Se tomaron 16 fragmentos de arcilla
de 9000 aos de antigedad con restos de vino del Museo de Pennsylvania de
Arqueologa y Antropologa, en Filadelfia. Adems, 90 recipientes de bronce
cerrados de la Dinasta Shang.
Combinando la cromatografa de gas y de lquido, la espectometra de
infrarrojos y el anlisis de istopos, se observ que el vino contena una mezcla
compleja de arroz fermentado, cera de abejas, frutas de espino 8 que
mostraron un alto contenido de azcar y posiblemente las levaduras para la
fermentacin) y vino natural.
6000 aos ms tarde, en la Dinasta Shang, la enologa haba hecho avances
considerables. El vino del emperador Shang de los recipientes de bronce
contiene restos de flores (crisantemos), resina de pino (que recuerda la
moderna resina griega), restos de alcanfor, aceitunas, taninos cidos y tambin
ajenjo (que ms tarde tomaron fatalmente los bebedores de absenta de la Belle
poque parisina de Toulouse-Lautrec).
42
McGovern no prob el vino de Shang aromtico, pues los recipientes contienen
hasta un 20% de plomo Interesante! El vino, como se sabe, es cido, y por
ello disuelve los metales de modo sobresaliente. Como los romanos de clase
alta con sus tazas de plomo, los emperadores chinos tambin debieron
envenenarse: con sntomas de calambres hasta locura. El plomo es, como
todos los metales pesados, un potente inhibidor para las enzimas, pues los
metales pesados atacan los puentes disulfuro de las protenas.
Algunas bebidas chinas de 9000 aos de antigedad se preparaban con mijo
de pancula, y esto es asombroso, pues las mismas trazas de mijo se
descubrieron tambin en los vinos iranes de 7500 aos de antigedad. Parece
ser que se desarroll un intercambio de ideas en Asia Central.
Para Patrick McGovern, el estudio del vino con todas sus conexiones sociales y
econmicas es la puerta a las civilizaciones antigas: una botella de Merlot o
Shiraz nos puede ayudar hoy a entender los sentimientos de la historia.
43
Anexo II
Para la preparacin del vino primero se aplastan las uvas en las prensas. En la
fabricacin del vino blanco sigue enseguida el prensado (prensas) o el pisado,
y el jugo (mosto) se separa del raspn, los hollejos y las semillas (como
residuo, denominado orujo). La adicin de pectinasas incrementa el
rendimiento del jugo considerablemente y conduce a un mosto ms claro. En la
produccin de vino tinto se mantiene sin separar el prensado directo del
fermentado principal, pues el colorante de las antocianas est localizado
principalmente en los hollejos de las uvas rojas y azules, y pasan a la
disolucin con la formacin de alcohol. Por ello este prensado se separa tras 4
o 5 das en reposo.
La fermentacin tiene lugar a travs de la parte exterior de las semillas de la
uva por las bacterias de ello o por la inoculacin y calidad tras una anterior
pasteurizacin mediante la adicin de cultivos purificados de levadura (cepas
de Saccharomyces cerevisiae). El proceso transcurre con una enorme
formacin de espuma. El mosto del vino as originado, que nubla las clulas
de levadura, en algunas zonas es apreciado como bebida. Durante los cuatro a
ocho das que dura la fermentacin principal se utiliza casi el azcar total. Las
protenas y pectinas se segregan en forma insoluble y se unen con las
levaduras como almacenadoras de los restos descritos, que se separan del
vino. En el primer ao, en una lenta posfermentacin en las fras bodegas
fermentan an el azcar restante (crecimiento); entonces se origina un
segundo almacenamiento. Simultneamente se forman en el vino los
materiales aromticos que originan el bouquet (aroma, flores). El vino joven
disponible tras la terminacin de la fermentacin se tapa hemticamente, antes
de rellenar los barriles de almacenamiento ensulfatados, en los cuales (de vez
en cuando con aireacin temporal) se consigue su maduracin. Durante este
tiempo empieza tambin el tratamiento en la bodega. ste sirve en primera
instancia para aumentar la durabilidad (por ejemplo mediante azufre, pues el
dixido de azufre es ms venenoso para las bacterias que para las levaduras) y
la clasificacin. Los principales vinos tienen un contenido en etanol entre el 10
y el 12%.
Un proceso ms importante es la transformacin del cido mlico (malato),
mediante bacterias lcticas, a cido lctico (lactato) esencialmente dbil. Sin
esta fermentacin malo-lctica los vinos alemanes, debido a su alto contenido
cido (de 8 a 10 g/l), no podran beberse.
La diferenciacin de los vinos tiene lugar segn el color (principalmente vino
blanco y tinto), el origen y el tipo de vid (por ejemplo Riesling, Trollinger,
Sptburgunder, Silvaner). El contenido restante de azcar se produce
interrumpiendo la fermentacin o la adicin del mosto: seco (max. 9 g/l),
semiseco (max. 18 g/l) y dulce (ms de 18 g/l) y dulce (ms de 18 g/l). Los
44
vinos fortificados o generosos, como Madeira, Jerez, Oporto o Vermut, son
vinos a los cuales se aade azcar, etanol y a veces hierbas. Los microbios no
intervienen de ninguna forma.
El champn y otros vinos espumosos requieren una fermentacin doble. Se
incluye deliberadamente CO2 dentro de la botella. A una mezcla de vino blanco
se le aade jarabe de azcar y se rellenan botellas tapndolas con fuertes
tapones de corcho. Las botellas se almacenan en un estante (plpito), donde el
vino puede fermentar lentamente. Una levadura de champn especial crece en
el interior de la botella. Durante meses se dejan depositar lentamente, con las
botellas boca abajo. Las levaduras y los residuos se almacenan entonces sobre
el corcho. En ese momento se reemplaza rpidamente el corcho y se aade
jarabe de azcar y brandy. As se origina un vino noble duradero, que gotea
con lgrima fina durante largo tiempo despus de abrirlo. En el vino espumoso,
en cambio, se aade CO2 bajo presin a un vino tranquilo.
El famoso coac se descubri a principios del siglo XV por los cultivadores de
vino en la Charante francesa, cuando debieron responder a la menor cantidad
de su vino frente a la calidad del vino de la vecina regin de Burdeos. Tuvieron
la idea de destilar su vino. Ms tarde el producto se destil incluso dos veces,
una tras otra. Tambin todava hoy el coac joven viene con un contenido de
alcohol del 70% en barriles de roble Limousin, donde madura parcialmente
durante aos hasta alcanzar la grandeza completa, asumiendo el color del
tonel y el sabor. Solamente despus se diluye a un 40%.
45
Anexo III
A mediados del siglo XIX, 200 aos despus de que Leeuwenhoek descubriese
los primeros microbios, prosigui el desarrollo industrial de las grandes
fbricas. Tampoco el alcohol se produca ya en pequeas familias
emprendedoras, sino al por mayor. Cada vez se necesitaban ms
urgentemente, por lo tanto, conocimientos exactos sobre los procesos de
fermentacin, para evitar fracasos costosos.
En la ciudad francesa de Lille, en el ao 1856, un conocedor, Monsieur Bigo,
visitante de una fbrica de alcohol, habl con el profesor de qumica Louis
Pasteur sobre una rara enfermedad que atacaba a muchos de sus barriles de
alcohol. Del jugo de azcar de remolacha no se formaba sino un lquido gris,
viscoso, con olor a cido. Pasteur empaquet su microscopio y se fue a la
fbrica. All tom muestras de barriles enfermos y sanos. El alcohol sano
contiene, como se analiz mediante observacin microscpica, pequeas
esferas amarillas, las levaduras que formaban racimos. Como con los
grmenes, brotaban semillas desde la parte lateral de las pequeas bolas. Las
levaduras, pues, vivan. Su vida causaba la conversin de azcar en el alcohol.
Despus Pasteur investig la masa viscosa. No descubri en ella ninguna
levadura, pero sin embargo s pequeos puntos grises. Cada punto contena
una estructura tangible de palitos temblones, millones de palitos en cada punto
gris. La materia cida, que producan los palitos, se demostr por anlisis
qumico que era cido lctico (lactato).
Pasteur dej caer unas gotas del lquido que contena los palitos en una botella
con una disolucin clara de levaduras y azcar. Tras un tiempo breve tambin
haban desaparecido aqu las levaduras, y los palitos dominaban el campo. Se
creaba de nuevo cido lctico en lugar de alcohol.
Los palitos descubiertos eran bacterias. Tomaron su nombre de su forma: la
palabra griega para palito es bakterion. Las bacterias producan obviamente
cido lctico mediante la fermentacin lctica del azcar, mientras que las
levaduras fermentaban a alcohol y al gas dixido de carbono.
Poco despus del descubrimiento de las bacterias lcticas en los barriles de
alcohol, Louis Pasteur fue requerido por los viticultores en Arbois (el padre de
Pasteur haba sido curtidor en Arbois). Ellos tenan problemas con la
fermentacin del vino. Una y otra vez obtenan del jugo de las mejores uvas un
vino graso, denso, amargo. Tambin aqu encontr Pasteur, en el caprichoso
vino, en lugar de levaduras pequeas bacterias, que sin embargo formaban
estructuras como un collar de perlas. Pasteur descubri en sus investigaciones
bsicas los diferentes tipos de bacterias que arruinaban el vino. Finalmente
pudo pronosticar a los perplejos viticultores qu sabor tendra una muestra de
vino, sin que tuviesen que pagar previamente! Para ello observ la muestra
46
bajo el microscopio y determin el tipo de levadura o de bacteria. Pasteur
encontr que es suficiente calentar brevemente el vino para matar las
bacterias. La misma tcnica tambin era apropiada para proteger la leche de
agriarse. Este proceso, con el cual se mata la mayora de microorganismos
contenidos en una sustancia, se denomina hoy, en honor a Pasteur,
pasteurizacin.
La pregunta sobre la naturaleza de la fermentacin no preocup solamente a
Pasteur. En 1810 Joseph Louis Gay-Lussac (1778-1850) demostr que en la
fermentacin de jugo de uva a partir de azcar de uva (glucosa) se origina
alcohol etlico y el gas dixido de carbono. A mediados del siglo XIX, el famoso
qumico alemn Justus von Liebig (1803-1873) propuso una teora. Aleg que
para la formacin de alcohol intervena un puro proceso qumico y no un
proceso biolgico. Liebig encontr sencillamente ridculo que la fermentacin
fuera producida por pequeos seres microscpicos. Ms bien deberan ser
vibraciones en la descomposicin de la materia orgnica sobre la
transferencia de azcar y su transformacin a CO2 y a alcohol. En todas las
fermentaciones alcohlicas se encontraban sin embargo, levaduras, o sea
seres vivos.
Louis Pasteur, todava al principio de su carrera cientfica, empez una lucha
cientfica vehemente con la autoridad internacional Justus von Liebig: Sin
levaduras vivas no hay alcohol! insista tercamente Pasteur. Liebig se burl por
otro lado: Cierta gente que piensa que el proceso de fermentacin se debe a
animalcules (animalitos), se parecen a los nios que creen que la circulacin
del ro Rhin la producen las palas de las ruedas de los molinos de agua que se
encuentran en su orilla. La disputa se inclin hacia un lado y hacia el otro
durante aos. Finalmente se decidi tras la muerte de ambos.
Pasteur divulg en 1876 los resultados de dos dcadas en un libro de
envergadura. La fermentacin es la respiracin sin oxgeno, aclar Pasteur.
Sirve como impulso de los seres vivos, para generar energa. Todos los seres
vivos requieren energa para la vida. Obtienen esta energa en su metabolismo
principalmente mediante la asimilacin de azcares, grasa y protenas en sus
clulas corporales. El azcar, por ejemplo, se quema en las clulas
produciendo dixido de carbono y agua como desecho. Ambos productos
abandonan las clulas. La energa liberada entonces es utilizada por el cuerpo,
por ejemplo, para el movimiento de sus msculos. Para esta combustin fra
las clulas necesitan el oxgeno del aire, como es necesario en la combustin
caliente de la madera a ceniza. Sin oxgeno, los animales y las plantas
superiores no pueden generar energa y por consiguiente no viven. Los
microorganismos poseen, en cambio, un tipo de respiracin de emergencia en
ausencia de oxgeno: la fermentacin. Seguramente esta solucin de
emergencia proviene de los inicios de la vida, pues en la Tierra an no haba
oxgeno. Se liber ms tarde por las plantas a partir de agua (fotosntesis).
47
Antes, en una atmsfera pobre en oxgeno, la fermentacin fue para los
microbios antiguos la forma normal de obtener energa.
Tena razn Pasteur, pues, al decir que sin microbios no es posible la
fermentacin? Moritz Traube (1826-1894), un estudiante de Liebig, dijo ya en
1858 que las fermentaciones no vienen necesariamente de la actividad de las
levaduras, sino que ms bien constan de procesos qumicos, que son
reductores. Traube caracteriz los fermentos por primera vez como materiales
proteicas que actan catalticamente, como molculas qumicas definidas, que
pueden actuar por su propia oxidacin y reduccin en los organismos, pero
tambin en reacciones de oxidacin y reduccin fuera de las clulas vivas.
Dividi los fermentos, en consecuencia, segn el tipo de reaccin. Ms tarde
seal la necesidad de contacto molecular directo entre la enzima y el sustrato
para la reaccin. Has ahora no se menciona en la bibliografa de la historia de
la bioqumica que l ya formul las consideraciones cualitativas para la cintica
de las reacciones, y por primera vez la dependencia del tiempo de reaccin y la
cantidad de fermento.
En 1897. Eduard Buchner (1860-1917) realiz el experimento decisivo, que
acab con la lucha entre Liebig y Pasteur.
48
Anexo IV
Durante los ltimos 20 aos, como resultado de la difusin del nuevo
paradigma tecnolgico, el proceso de vinificacin se han transformado, el
enlogo necesita herramientas eficaces para conseguir los vinos que ha
planificado. Los avances biotecnolgicos en enologa permiten resolver tres
tipos de problemas tcnicos en el proceso de fermentacin (Combina, 2007):
La seleccin de levaduras y bacterias lcticas: la levadura es la
responsable de la mayor parte de la transformacin del azcar del mosto
de la uva en etanol durante la primera fermentacin. La seleccin de
levaduras permite aumentar la calidad y consistencia del vino. Durante la
elaboracin del vino, se realiza una segunda fermentacin a partir de
bacterias lcticas. Por estos motivos las bodegas utilizan en forma
creciente levaduras y bacterias comerciales.
El mejoramiento del proceso de fermentacin a partir del desarrollo
de enzimas: la I+D en enzimas busca reducir los tiempos de produccin
y lograr mejores caractersticas del producto final. Al acelerar los
procesos de clarificacin durante la fermentacin y la maduracin, las
enzimas aumentan la rentabilidad, y al mejorar las caractersticas de
color y aroma durante la maceracin permiten lograr una diferenciacin
de producto consistente en el tiempo.
Desarrollo de bio-controladores para evitar la formacin de
compuestos txicos y defectos en los vinos: existen levaduras que
pueden inhibir el desarrollo de ciertos microorganismos en el mosto del
vino que generan defectos en el sabor del vino o que justifican la
aplicacin de barreras para-arancelarias en la Unin Europea.
49
Anexo V
Oenococcus oeni es la principal especie de este gnero, nombre que fue
propuesto para la especie conocida hasta entonces como Leuconostoc eonos.
Ates se consideraban Leuconostoc porque son cocos y realizan la fermentacin
heterolctica, o sea, que fermentan los azcares produciendo otros
compuestos adems de cido lctico, sobre todo CO2 y tambin cido actico y
etanol en pequeas cantidades. Sin embargo, Oenococcus tiene unas
caractersticas exclusivas, que lo hacen diferente de Leuconostoc: su hbitat es
exclusivamente el mosto y el vino, pueden crecer al pH del vino (entre 3 y 4), y
toleran el etanol, un 10% (v/v) y ms. O.oeni es la especie predominante en la
FML de vinos, si bien en algunos casos se ha comprobado que esta
fermentacin la realizan otras especies, como Lactobacillus plantarum.
El dato ms relevante para proponer que Oenococcus era otro gnero distinto
fue la comprobacin, por comparacin de las secuencias del ARN ribosomal,
de que filognticamente est bien separado de Leuconostoc y otras especies
de bacterias lcticas.
50
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