PRCTICA II: SEPARACIN DE AMINOCIDOS POR CROMATOGRAFA

Resultados:
Fase Mvil: 4.5 cm.---------------------------------Muestra Problema= 4.2 cm
Fase Mvil: 4.5 cm.---------------------------------Estndar 1 (Metionina)= 4.1 cm
Fase Mvil: 4.5 cm.---------------------------------Estndar 2 (Valina) = 4.2 cm.

Rf (Metionina)= 4.1 cm / 4.5 cm = 0.91
Rf (Valina)= 4.2 cm/ 4.5cm =0.93
Rf (Muestra)= 4.2 cm/ 4.5 cm =0.93


A D-Glucosa No presento coloracin
B Estndar 1 (Valina) Lila
C Estndar 2 (Metionina) Lila muy tenue
D Muestra Problema Lila


Discusin de resultados:
Los aminocidos con cadenas laterales apolares no tienen una alta afinidad por la silica gel de la placa, lo que origina unos valores
menores de Rf sobre todo en la fase mvil de naturaleza cida. Y en aquellos con cadenas laterales polares ascendern ms rpido que
los otros.
La coloracin lila presente en las manchas se le conoce como Prpura de Rubeman, siendo el producto de la reaccin de la Ninhidrina
con el aminocido dando lugar a este anin color violeta intenso. En esta reaccin se pierde la cadena lateral del aminocido en forma
de aldehdo.
Al determinar los factores de retencin se pudo observar que el estndar del aminocido Valina tuvo mayor factor de retencin, esto se
debe a que el sustituyente de este aminocido es de una alta polaridad lo que demuestra tener una alta afinidad con la fase estacionaria.
La glucosa no present coloracin alguna debido a que no es un aminocido.
El aminocido Metionina tuvo valores menores en el factor de retencin.
Nuestra muestra problema tuvo un recorrido semejante con el observado en el Aminocido Valina y logramos deducir que nuestra
muestra problema contena mayor concentracin de Aminocido Valina.
Por lo que hay que tener en cuenta el carcter cido de la fase mvil, ya que el factor pH incide en la afinidad de un componente con la
Silicagel; porque si fuera de carcter bsico reaccionaria con el eluyente disminuyendo las partculas que ascenderan por la capa.
Observaciones:
Despus de unos das nuestra muestra problema se despinto de la Silicagel por lo que tuvimos que sealarla con un crculo donde
levemente se vea.

Cuestionario:












1.Marcar sobre
la placa con un
lpiz una lnea y
sobre dicha
lnea ubicar 4
puntos de
descarga.
Posterior a ello
con un tubo
capilar adicionar
1 gota de los
estndares y de
la muestra (una
gota en cada
punto)
2.Previo a
meter la placa a
la cmara
cromatogrfica,
sta tuvo que
haberse llenado
con 0.5 cm de
fase mvil.
3.Colocar la
placa en la
cmara y
cerrarla.
4.El disolvente
comenzar a
ascender por la
placa.
5. Dejar hasta
que la fase
mvil llegue
~1cm antes del
fin de la placa.
6.Sacar la placa
y marcar
inmediatamente
con el lpiz
hasta donde
lleg la fase
mvil. Dejar
secar y despus
rociar con
ninhidrina 1%,
Permitir que se
seque y llevarla
al horno a
95C/5min.
Para revelarla.
Retirar con
pinzas y
despus
Procedimiento de Cromatografa en capa fina para la
identificacin de aminocidos.
2. Clculos necesarios para elaboracin de soluciones:
Para la ninhidrina al 1%:
La densidad de la ninhidrina es de 0.86 g/mL por lo que para preparar una solucin al 1% se
necesitan 0.86 gramos de polvo de ninhidrina y diluirlos en 99 mL de etanol al 70%.
Para la fase mvil: Se necesita preparar slo una pequea cantidad, por lo que se recomienda
preparar dicha fase mvil con 4 mL de butanol, 1 mL de cido actico glacial y 5 ml de agua
para tener en total 10 mL de fase mvil. Slo se necesitarn 3 mL que se tendrn que medir
con una apropiada pipeta.
Estndar de aminocido 1 al 0,5%: depender de la pureza del aminocido y de su solubilidad
en grupos polares o apolares. El estndar 1 es la valina, la cual tiene una densidad de
1.316g/mL por lo cual se tendr que medir aproximadamente 0.66 gramos de Valina en 99 mL
de un disolvente apolar para crear dicha concentracin, suponiendo una pureza de la valina al
100%.
Estndar de aminocido 2 al 0,5%: depender de la pureza del aminocido y de su solubilidad
en grupos polares o apolares. El estndar 2 es la metionina, la cual tiene una densidad de
1.34g/mL por lo cual se tendr que medir aproximadamente 0.67 gramos de Valina en 99 mL
de un disolvente polar como el agua para crear dicha concentracin, suponiendo una pureza
de la metionina al 100%.
Estndar de D-glucosa al 0,5%: la densidad de la glucosa es de 1.54 g/mL por lo que se
tendrn que medir 0.77 gramos de sta y diluirlos en 99 gramos de agua suponiendo una
pureza del 100%.

Sustancia Peso
molecular
Temperatura
de ebullicin
Temperatura
de fusin
Estado fsico a
25C
Solubilidad
Ninhidrina 178.15g/mol N/A 250C Slido Blanco
amarillento
20g/L en agua
Valina 119.15g/mol N/A 25C Formando
protenas
Insoluble en
agua
Metionina 149.21g/mol N/A 281C Formando
protenas
Soluble en
agua
D-glucosa 180.1g/mol N/A 150C Slido blanco Soluble en
agua
Agua 18g/mol 100C 0C Lquido
transparente
Soluble en
agua
butanol 74012g/mol 118C -89C lquido 79 gramos por
litro de agua
Etanol 46.07g/mol 78C -114C Lquido Miscible
cido Actico
Glacial
60.05g/mol 118C 17C lquido Miscible
3. Diferencia entre principios de separacin: adsorcin, intercambio inico, exclusin y afinidad.

Separacin por adsorcin:
En esta, la separacin depende de los equilibrios de adsorcin-desorcin de los componentes de la
mezcla, entre la fase estacionaria slida y la fase mvil lquida o gaseosa. La fuerza con que es
adsorbido un componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la
polaridad de la fase mvil. En general, cuanto ms polar es un compuesto, ms fcilmente ser
adsorbido. La cromatografa de adsorcin es una tcnica que est particularmente bien adaptada
para la separacin de compuestos de baja y media polaridad. La separacin de compuestos muy
polares mediante cromatografa de adsorcin requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la
utilizacin de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos para la
preparacin de la muestra a fin de reducir su polaridad.
Separacin por intercambio inico:
Las separaciones por intercambio inico se llevan a cabo con materiales insolubles y de textura
porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociados a iones lbiles capaces de intercambiarse
con los del medio que les rodea, por lo que, inevitablemente este tipo de cromatografa ha de
realizarse en medio lquido. La cromatografa de intercambio inico es utilizable para la separacin
de sustancias inicas, tanto orgnicas como inorgnicas. Las separaciones por intercambio inico
estn basadas en los diferentes equilibrios de reparto de los iones de la mezcla entre el material
cambiador y la disolucin. En general, se utilizan tres tipos de materiales para la cromatografa de
intercambio inico: resinas, geles y celulosas. La diferencia principal entre ellos reside en su
microestructura, ya que generalmente, las resinas presentan un tamao de poro mucho menor,
siendo apropiadas para la separacin de sustancias de pequeo volumen molar. Otras diferencias
existentes entre los diferentes materiales para el intercambio inico son debidas a la naturaleza de
los grupos cambiadores (fuerza del grupo cambiador) y al nmero de stos por unidad de peso de
material (capacidad de cambio).
Separacin por exclusin:
Consiste en la separacin de las molculas basndose en su tamao en lugar de su solubildad o
polaridad. Las fases estacionarias utilizadas para este tipo de cromatografa son inorgnicas
(zeolitas), o geles orgnicos compatibles con disolventes acuosos (agarosa, poliacrilamida) u
orgnicos (copolmeros estireno/divinilbenceno). Estas fases estacionarias poseen cavidades en las
cuales las molculas de los compuestos a separar pueden penetrar y ser retenidas, siendo las
molculas mayores las eluidas de la columna en primer lugar; el rango de trabajo de estas fases
estacionarias se define como el intervalo de pesos moleculares que pueden ser separados; otro
parmetro que caracteriza a este tipo de fases es su lmite de exclusin, que se define como el peso
molecular a partir del cual los compuestos pasarn a travs del lecho estacionario sin experimentar
retencin.
Separacin por afinidad:
La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o
capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en la
columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha unido
covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen al ligando
son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado retenida en la
columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene bien ligando libre u
otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.










4. Esquematice los tipos de cromatografa de forma detallada.

La cromatografa de filtracin en gel es una tcnica que permite separarmolculas en funcin
de su tamao molecular. La capacidad separadora reside fundamentalmente en el gel cuya
matriz consta de un gran nmero de esferas porosas microscpicas. Cada gel se caracteriza
por un rango de fraccionamiento que depende del tamao de sus poros.
Cromatografa Interaccin hidrofbica (HIC)
La tcnica de Interaccin Hidrofbica (HIC) separa las protenas en base a su hidrofobicidad
superficial, y se caracteriza por la adsorcin de las biomolculas a la superficie dbilmente
hidrofbica de la resina en una solucin fuertemente salina y su posterior elucin mediante
una gradiente salino negativo.
Dicho gradiente suele iniciarse con una solucin de 2-4M de Sulfato Amnico, Sulfato Sdico,
etc., disminuyendo gradualmente la concentracin hasta niveles de 0.1-1.0M.
A pesar de que el mecanismo de separacin es similar al de la fase reversa, su selectividad es
diferente, con lo que ambas tcnicas pueden ser consideradas como complementarias.

La cromatografa de intercambio inico (o cromatografa inica) es un proceso que permite la
separacin de iones y molculas polares basado en las propiedades de carga de las molculas.
Puede ser usada en casi cualquier tipo de molcula cargada, incluyendo grandes protenas,
pequeos nucletidos y aminocidos. La solucin que debe inyectarse es usualmente llamada
"muestra" y los componentes separados individualmente son llamados analitos. Es usada a
menudo en purificacin de protenas, anlisis de agua o control de calidad.
La Cromatografa de Afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o
capacidad de unin a un determinado ligando. En este caso, las protenas que se retienen en
la columna son aquellas que se unen especficamente a un ligando que previamente se ha
unido covalentemente a la matriz de la columna. Despus de que las protenas que no se unen
al ligando son lavadas o eluidas a travs de la columna, la protena de inters que ha quedado
retenida en la columna se eluye o libera mediante el empleo de una solucin que contiene
bien ligando libre u otro compuesto que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.
Naturaleza de fase estacionaria=solido
Se trata de un tipo especial de cromatografa de adsorcin slido-lquido en la que la sustancia
de naturaleza bioqumica (anticuerpos, cofactores, inhibidores enzimticos, lectinas y otras
molculas) denominadas ligandos de afinidad y enlazados qumicamente en soportes slidos
adecuados, retienen a los solutos (analitos), tambin de naturaleza bioqumica, de manera
reversible y selectiva. Las separaciones se basan en el acoplamiento llave-cerradura tpico
de la biologa molecular.

La cromatografa en fase reversa (RPC) permite separar molculas en base a su polaridad. El
principio de la cromatografa en fase reversa es semejante al de la cromatografa en capa fina.
Sin embargo, aqu la fase estacionaria es de partculas de slica qumicamente modificadas con
hidrocarburos saturados, insaturados o aromticos de diferentes tipos. Esto convierte a la fase
estacionaria en una matriz apolar. Por lo tanto, para este tipo de cromatografas se emplean
mezclas de solventes polares, tales como agua, acetonitrilo, acetato de etilo, acetona y
alcoholes alifticos.
5. Indique la diferencia entre: tiempo de retencin, factor de retencin, eluyente, eluente y series
eluotrpicas.
La retencin relativa o factor de selectividad, de dos solutos, donde el soluto
1 eluye antes del soluto 2, es
= k2 / k1 = K2 / K1 = VR,2 / VR,1= tR,2/ tR,1
La retencin relativa depende de 1) la naturaleza de las fases estacionaria y mvil, y 2) la
temperatura de operacin de la columna. Al escoger un par de fases para los solutos
adyacentes ms difciles de separar se debe ser tan selectivo como sea posible.
Eluyente: relativo a la capacidad de una sustancia para limpiar o diluir
Efluente: es la fase mvil que atraviesa la columna.
Una serie eluotrpica es un listado de varios compuestos ordenados segn su poder
de elucin para un adsorbente dado. Tales series son tiles para deteruminar
los disolventes necesarios en la cromatografa de una mezcla de compuestos qumicos.
Normalmente tales series comienzan con disolventes no-polares, como el n-hexano, y
finalizan en disolventes polares como metanol o agua. El orden de disolventes en una serie
eluotrpica depende a la vez de la fase estacionaria as como del compuesto empleado para
determinar el orden
Conclusiones:
Se cumpli el objetivo establecido de separar los aminocidos presentes en una mezcla por
medio de la tcnica cromatogrfica de capa fina; al comparar los Rf de cada solucin estndar y la
muestra problema se lleg a la conclusin de que el factor de retencin de la muestra es igual al del
estndar de la Valina, por lo que se presume nuestra muestra problema fue valina. Gracias!