Sesin 2:

Fundamentos de Microscopa ptica

Nicols Ubero Pascal
Tcnicas de Microscopa aplicada a las Ciencias Forenses
Adaptacin Open Course Ware (OCW)
Mster Ciencias Forenses
Universidad de Murcia
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Nicols Ubero Pascal
2
Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
Nota informativa del autor de la presentacin
Las imgenes, ilustraciones y/o esquemas que aparecen en esta presentacin pueden no
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The title of that slide is:
Crditos de las Ilustraciones
Pictures Copyright
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Microscopa ptica:
instrumentacin y
principios
Autor:
David R. Caprette,
Ph.D.
Adaptacin:
Nicols Ubero
Compound Microscope, circa 1751
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Microscopio ptico compuesto
Ocular
(adaptador para
los ojos)
Objetivo
Platina mvil
condensador
Control de
iluminacin
Lente de campo
(fuente luminosa)
Macromtrico
Micromtrico
Estativo
Cabezal
Revolver
Nicols Ubero Pascal
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
Fundamentos tcnicos de la microscopa ptica
Aumentos
Campo visual
Resolucin
Contraste
Profundidad de
campo
Enfoque
Iluminacin ptica (lentes)
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Refraccin
Onda
incidente
Cristal Aire
La onda se comprime y se
dobla en el lmite del medio
que produce la desaceleracin
La luz se dobla en ngulo cuando incide
en una supercie
La
componente
que incide
primero
se ralentiza
primero
Al igual que un vehculo cambia su
direccin cuando entra en un terreno de
gravilla
Pavimento
consolidado
Pavimento
suelto
Esta primera
rueda frena
Eje
perpendicular
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Aumentos y Orientacin I
Objeto
real
Imagen
proyectada
Direccin de
la luz
Posicin
actual
Imagen
aparente
Direccin del
movimiento
Direccin
aparente
arriba
abajo
izquierda derecha
Una lente biconvexa
curva la luz en la misma
direccin cuando entra
y cuando sale
rpido lento rpido
Punto focal
Las lneas de puntos son
perpendiculares a la
superficie de la lente
Frog gastrula, saggital section; arrow indicates
yolk plug
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Aumentos y Orientacin II
object
focal
point
Por qu una lente de aumento simple
no produce una imagen invertida?
Con el objeto ms cerca de la lente que del punto focal,
los rayos de luz divergen dando al observador la ilusin
de que est viendo un objeto ms grande, ms alejado,
pero en la misma orientacin..
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Aumentos
40x 100x 400x
Aumentos nales
usando una lente
simple (por ejemplo un
estereomicroscopio)
La misma imgen:
usando un
microscopio ptico
compuesto
40x 100x 400x
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Resolucin
Resolucin (d) =
0.61"
n sin !
" = Longitud de onda de la luz; n = ndice de refraccin
5 m 2 m
1 m 0.4 m
0.2 m
Escala de
resolucin
terica
Escala de
resolucin
de una 1
m
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40x
1000x
400x
100x
Volumen de espacio observado
Volumen tridimensional
Teniendo en cuenta los cambios del aumento
Grosor del portaobjeto
normal
1 mm
cubreobjeto (#1) 0.15
mm thick
Profundidad de una
tpica muestra
montada en humedat
0.1 mm
Profundidad de campo
a diferentes aumentos
40x
100x
400x
1000x
escala = 5 mm
Campo visual y profundidad de campo
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Campo visual e intensidad de la luz
Campo aparente:
(izquierda) Sin ajustar el brillo
(derecha) Despus de compensar
con el control de intensidad
Demasiado
brillante
Demasido
oscuro
Demasido
oscuro
Correcto correcto Correcto
100x 400x 1,000x
Aumento final
Aumento del objetivo
100x 40x 10x
2 mm 0.5 mm 0.2 mm
Dimetro de
campo real
rea 3 mm
2
0.2 mm
2
0.03 mm
2
Quantity of
light
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El contraste y el condensador
Vista lateral del condensador
Vista superior de un condensador con
selector de filtros
Apertura del condensador: tres posiciones
Totalmente
cerrado
Totalmente
abierto
Resoluciny
contraste
optimizados
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Contraste y variacin en el condensador
Tres imgenes de Paramecium caudatum (vacuolas alimentarias con clulas de levadura)
Contraste bajo Contraste ptimo Alto contraste
A
B
(Izquierda) Bacillus thuringinensis con
endosporas: (A) campo claro; (B)
Contraste de fases (400x)
(derecha) Pseudopodo de Chaos
(Pelomyxa) carolinensis: (C) campo
claro; (D) campo oscuro (100x)
D
C
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Enfocando multiples surperficies
Condensador
abierto para una
mayor claridad
Foco inicial por
encima de la
preparacin
Esquema no a
escala
objetivo
Preparacin
Direccin del
enfoque
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Observando a travs del especimen
Clulas superiores enfocadas
Enfocando a travs de un filamento de Spirogyra (400x)
Cloroplastos enfocados justo
debajo de la pared celular
Aproximadamente a la
mitad de la clula
Enfoque en el centro de la
clula
Alcanzando el fondo Cloroplastos enfocados justo
encima de la pared celular
Siguiente
paso
Siguiente
paso
Siguiente
paso
Siguiente
paso
Siguiente
paso
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Microscopa con aceite de inmersin
Diffraccin
severa que
compromete una
buena
resolucin
Aumentos en seco
A: Bacteria at 400x
Aumentos en seco
mostrando una imagen
borrosa (Resolucin
pobre)
Aceite de inmersin
La difraccin es
minimizada con el
uso de aceite de
inmersin
B: Bacteria at 1000x Con
un objetivo de inmersin
(Porcin central del
campo de visin de A)
A B
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Uso del objetivo de inmersin
Enfocar en seco con el
objetivo de mayor
aumento.
Mover el revlver y
dejarlo en una posicin
entre dos objetivos
Colocar una gota de
aceite de inmersin
sobre el espcimen
Colocar cuidadosamente el
objetivo de inmersin sobre el
espcimen
Y ya se puede
observar
1
2 3 4
5
La punta del objetivo debe
estar completamente
embebida en el aceite.
Disposicin de aceite sobre el cubreobjetos
Colocacin de aceite sobre un frotis (sin cubreobjetos)
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Enfoque con un objetivo de inmersin
Demasiado lejos,
mover la platina hacia
arriba
Demasiado cerca
mover la platina hacia
abajo
Correcto solo es
necesario un buen
enfoque
Imagen no visible Imagen no visible
Alto o bajo
correcto
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Ajuste de los oculares
Enfoque del ocular
(girar para enfocar)
centro
Separacin de los ojos
Ajustar para una sola imagen
Totalmente
cerrado
Totalmente
abierto
Imagen doble
Girar para extender el
tubo del ocular
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Lentes sucias?
Si ve marcas contra un campo
vaco, mueva la muestra de
izquierda a derecha

... si se mueven,
las manchas
estn en la
preparacin
... si se mueven
indica que las
marcas estn en
el ocular
Si las marcas no estn en
la preparacin, girar el
ocular
Manchas fuera de foco pueden
aparecer en el condesador. Para
saberlo
...si alejamos el
condensador
estas estarn
mas fuera de foco
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Comparacin de los
distintos tipos de
microscopa ptica
Dave Caprette
Autor:
David R. Caprette,
Ph.D.
Adaptacin:
Nicols Ubero
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Comparacin de los tipos de microscopa ptica
Spirogyra Bacillus
Campo
claro
Campo
oscuro
Contraste
fases
D.I.C.,
(off axis
condenser)
Amoeba proteus
(top) bright field
(bottom) D.I.C.
400x
100x except as noted 400x 40x
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Microscopa de campo claro
Fuente de
iluminacin
Filtro de luz de da
Condensador
platina
muestra
Objetivo
Control de diafragma
Campo
claro
Imagen de la
muestra*
Dimetro del
campo visual
*Volvox (fixed and stained)
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Microscopa de campo oscuro
Fuente
luminosa
Filtro luz de da
condensador
Platina
muestra
Objetivo
Campo
oscuro
Imagen de la
muestra*
Dimetro del
campo visual
*yeast cells in suspension
Luz
dispersat
Filtro opaco
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Microscopa de contraste de fase
(Fuente de luz no mostrada)
Condensador
Platina
muestra
Objetivo
(no se
esquematizan
todos sus
componentes
halo
Membrana
plasmtica
Muestra: Chaos (pelomyxa) carolinensis
pseudopodium, 400x
Diafragma
anular
Luz alterada
por la muestra
Placa de fase
Luz no
obstaculizada
Diafragma visto
desde arriba
Imagen
proyectada
plasmagel
plasmasol con
grnulos
Vacuola
allimentaria
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Microscopa Contraste Interdiferencial
(Nomarski)
Direccin de la vibracin (luz que llega al
observador)
(a) luz blanca (no polarizada)
(b) Filtro polarizador
(c) Luz polarizada
(a) (b) (c)
Polarized light
Amoeba proteus (100x):
(a) imagen de campo claro; (b)
D.I.C. Efecto obtenido al ajustar el
condensador
a
b
Nicols Ubero Pascal
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
Otros ejemplos: Huevo de insecto con campo claro
N. Ubero-Pascal
Nicols Ubero Pascal
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
N. Ubero-Pascal
Huevo de insecto con campo oscuro
A
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
N. Ubero-Pascal
Huevo de insecto con contraste de fases
B
Nicols Ubero Pascal
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
N. Ubero-Pascal
Detalle de un huevo de insecto con contraste de fases
C
Nicols Ubero Pascal
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
N. Ubero-Pascal
Huevo de insecto con contraste interdiferencial (DIC) Nomarski
D
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Tcnicas de microscopa aplicadas a las Ciencias Forenses: Sesin 2 Mster en Ciencias Forenses
Crditos de las Ilustraciones / Pictures copyright
Logo Portada OCW-UM. Autor: Universidad de Murcia: Direccin web: http://ocw.um.es/
Logo encabezamiento. Autor: Musarumana: Direccin web: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Microscopio_gif.jpg
Diapositivas 3-4 y 6-27 adaptadas de las presentaciones de D.R. Caprette: Light Microscopy: Instrumentation and Principles y Light Microscopy: comparison of
optics, publicadas on line en BioEd Online. Disponible en la pgina web: http://www.bioedonline.org/presentations/index.cfm#presentation32
Las figuras A, B, C y D de las pginas 29 a32 son de Nicols Ubero