CULTIVO DE LEVADURAS

SERGIO ESTEBAN ALDANA RESTREPO

CARLOS MARIO CANO JIMNEZ
PAULA ANDREA CARVAJAL RAMREZ
JENIFFER SNCHEZ ZAPATA
LABORATORIO DE BIOTECNOLOGIA
PRESENTADO A: HENRY CASTAO
UNIVERSIDAD DE CALDAS
FACULTAD DE INGENIERIA
INGENIERI DE ALIMENTOS
MANIZALES, 20
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
Aplicar conceptos bsicos de microbiologa industrial en la produccin de levaduras a partir
de un cultivo puro, mediante tcnicas que permitan medir la cantidad de biomasa
producida.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
Realizar una fermentacin aerbica para la produccin de levaduras utilizando
como sustrato un medio complejo como la melaza.
Identificar las diferentes variables que intervienen en el crecimiento de la levadura.
omparar el crecimiento de la levadura en dependencia del tipo de rgimen
temporal de la fermentacin.
CURVA DE CALIBRACI!N


!ara realizar la curva de calibracin, se ensa"an varias soluciones de concentracin
conocida " se determinan sus absorbancias. A partir de stos valores, se constru"e la curva,
apro#imndola a una lnea recta$ una vez ensa"adas las soluciones problemas, su
concentracin se averigua por interpolacin de las absorbancias de las soluciones problema
en la curva de calibracin. %e debe tener en cuenta la linealidad, que es el intervalo de
concentraciones de la solucin problema entre las cuales e#iste una relacin lineal entre
absorbancia " oncentracin.
ABSORBANCIA "#$ PPM DE
LEVADURA "Y$
0 &
0%2& '&&
0%''( (&&
0%&)' )&&
%0' *&&&
!ara obtener la cantidad de biomasa formada, se reemplazan los valores de la absorbancia+
,- )./.*0 1 (2.3(3
,- )./.*45*.6./7 1 (2.3(3
,- *(/).)22/ ppm
G*+,-./ : 8iempo de fermentacin vs. Absorbancia 5ppm7.

9n la grfica * se presenta la cintica de formacin de :iomasa a medida que transcurre el
tiempo.

TIEMPO "HORAS$ ABSORBANCIA BIOMASA
" 001 $
BIOMASA
"234$
56 *.6./ *(/).)22/ &./2.(
'5 *./2& *3&).(2) &./3('
(2 *./2. *3*6.3**. &./3)'
55 *.3*& *2**.&/6 &.6333
)6 *.(2( *'('.).6( &.6'*(
SUSTRATO CONSUMIDO
2(' g sacarosa '4*)&g ;e#osas
(3 g sacarosa 0
0- (/.26 g ;e#osas
G*+,-./ 2% 8iempo <s. ;e#osas
9n la grfica ' se presenta el consumo de sustrato a medida que avanza el tiempo de
fermentacin.
CUESTIONARIO
TIEMPO
H7*/8
9B*-: INICIALES
2 ;<
8/./*78/
2 ;<
H<:78/8
0 ..& (3 (/.26
56 ..3 (/.3 3&
'5 ../ ().3 3*.&3
(2 *& 3& 3'.62
55 *&.' 3* 32.6)
)6 *&.3 3'.3 33.'6
% E:04-=>< 4/8 ,7*1/8 ;< *<0*7;>..-?@ ;< 4/8 4<A/;>*/8%
=a ma"ora de las levaduras se reproducen por gemacin multicelular o por gemacin
polar, que es el mecanismo en el cual una porcin del protoplasma sobresale de la pared de
la clula " forma una protuberancia, la cual aumenta de tama>o " se desprende como una
nueva clula de levadura. 9n las levaduras que forman pelcula, la "ema crece a partir de
una prolongacin tubuliforme de la clula madre. 9l material nuclear replicado se reparte
entre la clula madre " la clula ?ija.
=a reproduccin se#ual de las levaduras verdaderas 5Ascom"cotina7 da lugar a la
produccin de ascosporas, desempe>ando la funcin de asca, la propia clula de la
levadura. 9n la ma"ora de las especies de levaduras verdaderas, la formacin de
ascosporas tiene lugar tras la conjugacin de dos clulas, aunque algunas pueden producir
ascosporas sin que e#ista conjugacin previa, teniendo lugar despus la conjugacin de las
ascosporas. 8anto el n@mero " el aspecto de esporas por asca, son tpicos de cada especie de
levadura, " se pueden diferenciar por su color, rugosidad o lisura de su pared " por su forma
5redondeada, ovalada, arri>onada, falciforme, forma de saturno o de sombrero, ?emisfrica,
angular7. =as clulas de algunas levaduras se transforman en clamidosporas mediante la
formacin de una gruesa pared alrededor de la clula, tal como ocurre, por ejemplo, en las
especies de los gneros andida, R?odotorula " r"ptococcus.
2% R<4/.-7@< <@ 4/ 8-2>-<@B< B/C4/ 4/ .71078-.-?@ 0*71<;-7 ;< 4/ 1<4/D/ ;< ./E/%
COMPONENTE CONSTITUYENTES CONTENIDO
C7107@<@B<8
M/F7*<8
Aateria seca /)B
%acarosa 2B
Azucares reductores 2C3B pDp
%ustancias disueltas
5diferentes azucares7
(C)B pDp
Agua *6B
Erasas &.(&B
enizas .B
C7@B<@-;7
D<
M-@<*/4<8
alcio &./(B
Aagnesio &.23B
Fsforo &.&)B
!otasio 2.6/B
C7@B<@-;7
D<
A1-@7+.-;78
Elicina &.*&B
=eucina &.&*B
=isina &.&*B
8reonina &.&6B
<alina &.&'B
C7@B<@-;7
D<
V-B/1-@/8
olina 6&& ppm
Giacina ().)6 ppm
Acido pantotenico ('..& ppm
!irido#ina (( ppm
Riboflavina (.(& ppm
8iamina &.)) ppm
Fuente+ Fajardo, %armiento 5'&&/7.
G% H>I ,>@.-?@ .>104<@ <@ <4 1<;-7 ;< .>4B-A7 ./;/ >@7 ;< 478 .7104<1<@B78
@>B*-.-7@/4<8
C47*>*7 ,<**-B-.7 F<C4G : act@a como antimictico, evitando la propagacin en el medio de
microorganismos que compitan con las levaduras por el alimento.
F78,/B7 B*-87;-.7 F 4/ >*</: sirve como fuente de fosforo " nitrgeno, estas son
sustancias nutritivas, las cuales se usan para el crecimiento " desarrollo de la levadura.
O2 + 9n presencia de o#igeno la fermentacin se caracteriza por la produccin de biomasa, "
en ausencia generalmente se produce etanol, esto ?ace del o#igeno un factor de especial
importancia en el cultivo de levaduras.
M<4/D/ ;< ./E/: =a composicin de las melazas es mu" ?eterognea " puede variar
considerablemente dependiendo de la variedad de ca>a de az@car, suelo, clima, etc.$ !or
otro lado se caracteriza por ser una mezcla compleja que contiene sacarosa, az@car
invertido, sales " otros compuestos solubles en lcali que fermentan con gran facilidad, por
estas razones presenta todas las condiciones optimas para el desarrollo de las levaduras "
adicionalmente cuenta con un bajo costo, lo que la convierte en un medio de cultivo ideal.
Agua 5;'H7+ para que las enzimas puedan actuar ?ace falta el agua para que puedan
difundirse a travs de la pared o la membrana que rodea la clula de levadura.
5% JP7*=>< <8 -107*B/@B< /.-;-,-./* 4/ 1<4/D/K JP7*=>< 478 A/47*<8 ;< 0H @7 ;<C<@
;< 8<* 1<@7*<8 / 5%0K
=a acidificacin de la melaza es importante porque el crecimiento de levaduras se ve
favorecido a un p; pr#imo a (.& " no se desarrolla bien en medio alcalino a menos que se
?a"an adaptado al mismo. A pesar de la tolerancia bastante amplia de las la levaduras para
las variaciones de p; a partir de los sustratos ?abitualmente usados en los medios de
cultivo forman productos en espacial cidos que influ"en en el crecimiento celular,
produccin enzimtica " utilizacin de glucosa. 9n algunas investigaciones se ?a observado
que con un p; inicial del medio a valores entre (.& " (.3 se obtiene mejor crecimiento "
utilizacin de glucosa.
'% JH>I B*/@8,7*1/.-7@<8 7.>**<@ ;>*/@B< 4/ <8B<*-4-D/.-?@ ;<4 178B7K JC?17
/,<.B/@ <8B/8 B*/@8,7*1/.-7@<8 4/ ./4-;/; ;<4 1<;-7 F 4/ ./0/.-;/; ;< .*<.-1-<@B7
;< 4/8 4<A/;>*/8K
9l aumento de temperatura durante la esterilizacin del mosto puede provocar una
caramelizacin de los azucares, as como una disminucin de los carbo?idratos presentes en
este$ si no se tiene un total control en la relacin tiempo temperatura, el proceso de
esterilizacin afectara las caractersticas del medio de cultivo, disminu"endo la calidad " la
cantidad de biomasa formada, incluso impidiendo su crecimiento. %in embargo es necesario
aclarar que la esterilizacin es indispensable, para lograr reducir o eliminar
microorganismos indeseados que se encuentren en el mosto " que puedan competir con las
levaduras por el alimento, disminu"endo de esta manera el rendimiento de biomasa
formada.
)% C7@ C/8< <@ 4/ ,-2>*/ G -@;-=>< 478 B-<1078 <@ 478 .>/4<8 8< A<*-,-./ ./;/ >@/ ;< 4/8
,/8<8 ;< .*<.-1-<@B7 ;< 4/ 4<A/;>*/%
*. Fase de crecimiento e#ponencial+ &C (. ?oras
'. Fase estacionaria+ 3& 1 /' ?oras
2. Fase de Auerte+ /' 1 *6) ?oras
(% A*2>1<@B< =>< B-07 ;< ,<*1<@B/.-?@ 0*<8<@B7 <4 .>4B-A7 ;< 4<A/;>*/% C7@,*7@B< 4/
B<7*L/ F ;< 078-C4<8 <:04-./.-7@<8 8- @7 M/F .7-@.-;<@.-/ .7@ 4/ 0*/.B-./
%e presento una fermentacin aerobia, "a que el birreactor contaba con una membrana la
cual permita el paso de o#igeno de manera activa, sin la presencia de o#igeno en el medio
se presenta una fermentacin anaerbica cu"o resultado es etanol en lugar de biomasa que
es el producto de inters para este caso.
9n la fermentacin aerobia, el aceptor final de electrones es el o#igeno$ es imprescindible
su presencia para el desarrollo de microorganismos " la produccin del compuesto deseado.
9n este tipo de procesos, se produce fundamentalmente biomasa, di#ido de carbono "
agua.
6% S- 8< .7@8-;<*/ / 478 <*4<@1<F<*8 .717 C-7**</.B7*<8, .4/8-,-=>< <4 8-8B<1/ ;<
,<*1<@B/.-?@ ;< /.><*;7 / 478 8-2>-<@B<8 .*-B<*-78: 07* ,/8<, 07* *I2-1<@ B<107*/4
F 07* 8>1-@-8B*7 ;< <@<*2L/%
P7* ,/8< 7 07* 47B<8: 9l sistema de operacin de la fermentacin fue cultivo por lotes, "a
que se trato de un sistema cerrado, porque despus de iniciado el proceso 5al mezclar los
nutrimentos " la levadura7, solo se adiciona o#igeno, antiespumantes " bases o cidos para
el control de p;. =a fermentacin se lleva a acabo en un periodo definido, durante el cual
Fase
4
Fase
2
Fase
3
varia la composicin del medio de cultivo, la concentracin de biomasa " la de metabolitos.
Iespus, se interrumpe el proceso " se recupera el producto.
F<*1<@B/.-?@ 07* *I2-1<@ B<107*/4: 9s la forma como se organiza el proceso en el
tiempo.
9l rgimen que se da en la fermentacin es bsicamente laminar$ se podra decir que las
burbujas de la aireacin podran permitir un paso del rgimen laminar a turbulento, pero
como el motor utilizado no es mu" grande " los requerimientos aerobios se satisfacen con
esa cantidad de o#igeno, podemos considerar que las burbujas no afectan el rgimen de la
fermentacin.
F<*1<@B/.-?@ 07* 8>1-@-8B*7 ;< <@<*2L/: el suministro de energa que se podra dar en la
fermentacin seria de calor 5Jt7, agitacin entre otros.
9l calor no se da durante la fermentacin, pues aunque se esterilizo la solucin, esto ocurri
antes de la inoculacin, por tanto antes de la fermentacin " no intervino en esta.
!or agitacin tampoco ?ubo un suministro de energa, pues aunque se podra decir que las
burbujas suministraron esta energa, estas no eran mu" grandes ni con muc?a turbulencia,
por tanto se pueden obviar.
&% P*707@2/ >@ 17;<47 1/B<1+B-.7 =>< ;<8.*-C/ <4 .7107*B/1-<@B7 ;<4 .>4B-A7 ;<
4<A/;>*/%
9l modelo propuesto es el obtenido e#perimentalmente+
%in embargo e#isten en la teora modelos que describen el comportamiento del cultivo de
levaduras, como+
M7;<47 ;< M/4BM>8
M7;<47 ;< M7@7;
ANLISIS DE RESULTADOS
Ie acuerdo a la grfica *, se puede observar la cintica de formacin de biomasa, a partir
de ella se evidencian tres fases de crecimiento de las levaduras, la fase e#ponencial de
crecimiento, la fase estacionaria " la fase de muerte. Ie acuerdo a sta grfica, no se
encontr la fase de adaptacin o de latencia, esto ?ace que el proceso sea ms eficiente,
debido a que la levadura en el tiempo &, empez a crecer.
=as fases de crecimiento son confusas. Iebido a los intervalos de tiempo es posible que los
anlisis de los datos sean inapropiados, sin embargo, es una buena apro#imacin. Ie la
grfica * puede observarse que la fase de crecimiento e#ponencial la cual esta influenciada
por las condiciones optimas que se le proporcionaron5 el medio de cultivo que en este caso
es melaza " tiene los suficientes requerimientos en fosforo, azucares, nitrgeno " dems
sustancias que son necesarias para la formacin de la biomasa, as como la aireacin , en
donde esta la presencia de o#igeno contribu"endo de esta manera a que no se forme alco?ol
etlico, quien en condiciones anaerbicas se obtiene en una reaccin bioqumica , mas bien
conocida como el ciclo de reps, esto facilita la formacin de biomasa7, se encuentra o se
da en las primeras 3& ?oras, " tiene una tendencia lineal ?asta un lmite de concentracin de
levaduras$ a partir de a? se estabiliza el crecimiento, empezando la fase estacionaria la cual
se puede dar por dos circunstancias+ la primera es el consumo total del sustrato, en donde
las levaduras no van a tener mas alimento " empiezan a tratar de sobrevivir en estas
condiciones " se dan reacciones bioqumicas que por lo general terminan en la emanacin
o e#pulsin de to#inas que tienen olores " sabores e#tra>os , " la segunda puede ser por
presencia de in?ibidores o saturacin de sustrato "a que algunos A.H no soportan altas
concentraciones de este en el medio, aquel fenmeno es conocido como represin
catablica, en nuestro caso sucede lo primero, "a que en los estudios reportados no se
presenta la represin catablica en el A.H que estamos cultivando ,el segundo periodo se
da durante un periodo corto de tiempo 5apro#imadamente de '& ?oras7.
=a fase de muerte de las levaduras se dio en un tiempo de .6 ?oras apro#imadamente, sin
embargo la prdida en la concentracin de levadura no fue tan significativa. 9l fenmeno
ocurre por falta de alimento o sustrato, donde naturalmente los A.H mueren.
=a grfica de consumo de sustrato 5grfica '7 evidencia claramente cmo a partir de que
aumenta el tiempo de fermentacin, aumenta la concentracin de ?e#osas o producto en la
muestra $ es mu" com@n que muc?as reacciones bioqumicas, tengan tanto produccin de
biomasa como de producto, pero es un parmetro critico a nivel industrial, "a que en la
produccin de biomasa lo que se espera es que se obtenga un ,#s m#imo el cual es la
relacin entre, produccin de biomasaDconsumo de sustrato, pero al e#istir un ,ps que es la
relacin entre, generacin de productoDconsumo de sustrato, diferente de cero, quiere decir
que e#isten enzimas que estn contribu"endo a procesos de ?idrlisis como lo es en este
caso, en el cual no se esta garantizando que todo el sustrato sea utilizado para la generacin
de nuestro producto de inters, en estos casos se puede entrar a analizar que factores
in?ibidores puedo agregar al proceso industrial, "a sean los manejos de la temperatura para
desnaturalizacin de enzimas, o la adicin de sustancias qumicas in?ibidoras de estas
mismas.
CONCLUSIONES
!ara realizar e#itosamente una fermentacin por lotes, es necesario conocer la curva de
crecimiento del microorganismo$ al saber el comportamiento de su crecimiento, se
pueden manipular las condiciones de manera que se obtenga el producto deseado, para
aumentar la cantidad de biomasa, se buscan las condiciones de ma"or produccin de
clulas.
=a melaza de ca>a es un medio ideal para el cultivo de levaduras, no solo por su gran
contenido de nutrientes sino tambin por su bajo costo, sin embargo al ser un medio tan
complejo se debe tener especial cuidado en el momento de su acondicionamiento para
lograr brindarle a las levaduras las condiciones ptimas para su desarrollo.
=a formacin de biomasa se da mediante un metabolismo tipo respiratorio, "a que es
necesaria la presencia de o#igeno en procesos como este para la generacin de biomasa
celular, " no de sustancias secundarias como lo puede llegar a ser la presencia de
alco?ol etlico.
Al ser una reaccin por lotes, el tiempo es un parmetro primordial, para la medicin de
todos los aspectos de importancia, "a que en el intervalo de tiempo de reaccin
estipulado evaluamos el comportamiento de esta misma.
=os modelos, como el de maltus " monod, son ?erramientas cuantificativas de vital
importancia para la modelacin de alguna reaccin de inters por lotes, "a que nos
pueden a"udar a predecir el comportamiento del montaje que va a ser objeto de estudio.
RECOMENDACIONES
%e debe realizar una adecuada esterilizacin de todos los componentes del proceso que
estn en contacto con el cultivo, para garantizar de esta manera las condiciones
aspticas del mismo " evitar contaminaciones.
=os instrumentos de laboratorio deben estar debidamente calibrados, para una
obtencin mu" favorable de los datos.
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