Os sistemas de expresso indutveis, em que a ARN-polimerase de T7 transcreve sequncias

codificadoras clonadas sob o controle de um promotor T7lac

produzir eficientemente uma grande variedade de protenas em Escherichia coli. Investigao
de fatores que afetam a estabilidade, o crescimento eo
induo das estirpes de expresso de T7 em vasos de agitao, levou-se ao reconhecimento de
que a induo espordica, no intencional de expresso no complexo
meios de comunicao, anteriormente relatados por outros, quase certamente causada por
pequenas quantidades de lactose. Glicose impede a induo por
lactose por mecanismos bem estudados. Os aminocidos tambm inibem a induo de lactose
durante o crescimento de fase log, e altas taxas de arejamento
inibir a induo a baixas concentraes de lactose. Estas observaes e equilbrio metablico
do pH, permitiu o desenvolvimento de
fivel no-induo e meios de auto-induo, em que as culturas de lote crescer a densidades
elevadas. Cepas de expresso crescido a saturao
em no-induo de mdia reter plasmdeo e permanecem totalmente vivel por semanas na
geladeira, tornando mais fcil para preparar muitos
stocks congelador em aes paralelas e uso de trabalho por um perodo prolongado. -Induo
Auto permite que a triagem eficiente de muitos clones
em paralelo para expresso e solubilidade, como culturas de apenas ter de ser inoculado e
crescer at saturao, e os rendimentos de protena alvo
so tipicamente vrias vezes mais elevada do que o obtido por induo de IPTG convencional.
Meios de induo de Auto foram desenvolvidas para
marcar protenas com selenometionina, 15N ou 13C, e para a produo de protenas-alvo por
induo da arabinose de T7 ARN polimerase
do promotor pBAD em BL21-AI. Rotulagem Selenomethionine foi igualmente eficiente na
metionina comumente usado
auxotrofo B834 (DE3) (considerado Mete) ou o prototrfica BL21 (DE3).
Publicado por Elsevier Inc.

Antecedentes e introduo
Projetos de seqenciamento de DNA forneceram sequncias codificantes
por centenas de milhares de protenas a partir de
organismos em todo o espectro evolutivo. recombinante
Tecnologia de ADN torna possvel clonar estes
sequncias de codificao em vectores de expresso que podem dirigir
a produo das protenas correspondentes adequados
As clulas hospedeiras. Um sistema de expresso de T7 induzvel altamente
eficaz e amplamente utilizado para a produo de ARN e protenas
a partir de sequncias de codificao clonadas na bactria
Escherichia coli [1,2]. A sequncia de codificao para a ARN polimerase T7 est presente no
cromossoma sob
o controlo do promotor lacUV5 induzvel em hospedeiros tais
como BL21 (DE3). A sequncia que codifica para a protena desejada
(referida como a protena alvo) colocado num plasmdeo
sob o controlo de um promotor de T7, ou seja, um promotor
reconhecido especificamente por ARN polimerase T7. no
ausncia de induo do promotor lacUV5, pouco T7
Polimerase de ARN ou protena alvo deve estar presente
e as clulas devem crescer bem. No entanto, aps a adio
de um indutor, tipicamente isopropil-bD-tiogalactsido
(IPTG), uma polimerase de ARN T7 ser feito e vai transcrever quase qualquer ADN controlado
pelo promotor T7.
T7 RNA polimerase to especfico, ativo e
processadora de que a quantidade de RNA alvo produzido
pode ser comparvel quantidade de ARN ribossomal
numa clula. Se o RNA alvo contm uma sequncia de codificao
com sinais de iniciao da traduo adequados (tais como
a sequncia a montante do codo de iniciao para o T7 grande
protena da cpside), mais a sntese de protenas ir ser dirigida
para a protena alvo, que geralmente se acumula a
tornar-se uma fraco substancial da protena celular total.
Um problema na utilizao de sistemas de expresso de T7 induzvel
polimerase de ARN de T7, que activo de modo que uma pequena basal
nvel pode conduzir a expresso de protena alvo substancial
mesmo na ausncia de indutor adicionado. Se a protena alvo
seja suficientemente txica para a clula hospedeira, o estabelecimento de
o plasmdeo alvo no hospedeiro de expresso pode ser difcil
ou impossvel, ou a estirpe de expresso pode ser instvel
ou acumular mutaes [3-6]. Um meio eficaz para reduzir
basal de expresso para colocar a sequncia do operador lac
(o local de ligao para o repressor lac) apenas
a jusante do stio de iniciao de um promotor de T7, criando
um promotor T7lac [2,4]. Lac repressor ligado ao operador
seqncia interfere com a criao de um alongamento
complexo de polimerase de ARN T7 a uma lac de T7
promotor e reduz substancialmente o nvel de destino
mRNA produzido [4,7,8]. Se lac repressor suficiente
presente para saturar todos os stios de ligao na clula,
o nvel basal de protena alvo em clulas no induzidas substancialmente
reduzida, mas tanto a induo desbloqueia
lacUV5 e T7lac promotores e leva tpica
elevados nveis de expresso. Assim, os aumentos do promotor T7lac
a convenincia e aplicabilidade do sistema T7
para a expresso de uma ampla gama de protenas.
Genmica estrutural uma rea onde multi-miligrama
quantidades de muitas protenas muito diferentes so procurados
para a determinao de estruturas de protenas por cristalografia de raios-X
ou de ressonncia magntica nuclear (RMN) [9]. no
todas as protenas alvo ser bem expresso solvel e, assim
desejvel para a tela em paralelo muitas pequenas culturas
expressar diferentes protenas alvo para identificar os que so teis
para a ampliao. A dificuldade significativa em grande escala
rastreio a obteno de todas as culturas em uma comparvel
estado de crescimento, de modo que pode ser induzida ao mesmo tempo.
Diferenas no tempo de atraso ou taxa de crescimento tipicamente
gerar uma situao em que diferentes culturas ser
pronto para a induo em momentos diferentes. Mesmo se as culturas
foram crescidas em uma placa de multi-poos e densidades poderiam
ser lidas simultaneamente em um leitor de placas, um esforo considervel
seria necessria para seguir o crescimento e adicionar indutor
para cada cultura no momento adequado. Se todas as culturas
foram coletados de uma s vez, a escolha de um tempo de coleta quando
todos tinham sido induzidos a nveis ideais e nenhum tinha sofrido
supercrescimento por clulas incapazes de expressar-alvo
protena pode ser difcil ou impossvel.
Uma estratgia para a obteno de induo bastante uniforme
incubar uma placa at que todas as culturas foram cultivadas at saturao, adicionar meio
fresco, crescer para uma adequada
tempo, indutor e adicionar a todas as cavidades ao mesmo tempo. Se
todas as culturas em uma placa de saturar a densidade comparvel
e crescer aps diluio com cintica bastante semelhantes,
a variao de cultura para cultura em densidade no momento
de induo pode ser baixo o suficiente para que a maioria das culturas vontade
optimamente ser induzida. No entanto, em um teste desta estratgia,
Eu encontrei a induo involuntria descrita por
Grossman et ai. [6], que descobriu que as culturas a crescer
em certos meios complexos induzir quantidades substanciais
da protena alvo sobre abordagem de saturao, na ausncia
de indutor adicionado. Induo em saturao faria
clulas de stress para diferentes extenses, dependendo dos nveis
e induo de toxicidade relativa de protenas alvo para
as clulas hospedeiras, fazendo com que uma estratgia de saturao seguido
por diluio invivel em meios de comunicao que tm como indutor
actividade. Grossman et ai. [6] concluram que o
conhecido lactose indutor no era responsvel por no intencional
induo, mas que o AMP cclico necessria, e
eles descobriram que o uso de um mutante hospedeiro incapaz de fazer cclica
AMP melhorou a estabilidade do plasmdeo e produo de protena.
Consistente com um papel para a represso catablica,
eles tambm descobriram que a adio de 1% de glucose para o complexo
meio impedido induo involuntria. No entanto,
Observei que a adio de 1% de glicose, tambm causada saturado
culturas para se tornar muito cido, o que limita a saturao
densidade e novamente torna difcil obter
crescimento uniforme depois da diluio.
Ao investigar mais, eu achei que a mdia fez
com NZ-amina a partir de um barril de 100 libras recentemente
adquiridos para genmica estrutural trabalho mostrou induo
a saturao enquanto que a mdia idnticas feitas
do (quase esgotados) o barril do anterior
mesmo fornecedor no o fez. Triagem diferentes lotes de N-Zamine
ou outras digestes enzimticas de casena para aqueles
sem induzir o comportamento no parece ser uma
soluo atraente: alm da ineficincia bvio, tal
muitos podem no estar sempre disponveis. Para resolver o problema
espordico, induo indesejada, empreendi uma sistemtica
A anlise dos componentes do complexo e
meios definidos e seus efeitos no crescimento e induo.
O objetivo foi desenvolver formulaes para confivel
o crescimento de culturas de estirpes de expresso de T7 saturao
com pouca ou nenhuma induo e definir as condies adequadas
para o crescimento e a induo de diversas culturas, em
paralelo.

Materiais e mtodos
As estirpes bacterianas e plasmdeos
Escherichia coli utilizado para o crescimento de testes e
expresso eram principalmente BL21 (DE3) e B834 (DE3).
B834 uma modificao de restrio-defeituoso, galactosenegative,
metionina auxotrofo de E. coli B [10]. BL21 um derivado de Met + B834 obtidas por
transduo P1
[1]. Lisognios DE3 contm um derivado de fago
lambda que fornece T7 ARN polimerase por transcrio
a partir do promotor lacUV5 no cromossoma
[1]. BL21-AI (Invitrogen) um derivado de BL21
que fornece T7 ARN polimerase por transcrio
a partir do promotor de arabinose pBAD-indutvel em
cromossomo.
Sequncias que codificam para protenas alvo foram clonados sob
o controlo do promotor T7lac e a montante
sinais de iniciao da traduo do principal protena da cpside T7
[2,4,11], colocando o codo de iniciao na posio
do local NdeI de pET-13a [12] ou pET-24b
(Novagen), ou o stio Ncol de vectores prex (equivalente
para o stio Ncol de pET-11d [2]; a ser descrito em outros lugares),
todos os que conferem resistncia a canamicina.
Os plasmdeos contendo o promotor T7lac tambm conter um
cpia do gene lacl de proporcionar suficiente repressor lac
para saturar todos os stios de ligao.
Uma variedade de diferentes protenas alvo foram utilizadas em
desenvolvimento e teste de no induzir e auto-induo
meios de comunicao, incluindo um conjunto de cerca de 100 protenas de levedura clonado
para um projeto de genmica estrutural (http: // proteoma.
bnl.gov/targets.html). Por convenincia, levedura especfica
protenas mencionadas no texto so referidos pelo seu
alvo nmeros: P07 refere-se a protena de levedura YBL036C,
Protein Data Bank (PDB) 1B54, estruturalmente semelhante
o domnio N-terminal de um aminocido racemase
[13]; P19 refere-se a YBR022W protena de levedura, de desconhecido
funo; P21 refere-se a protena especificada pelo fermento
sup45 gene, um fator de liberao de traduo; Refere-se a P35
a protena especificada pelo gene de levedura hem13, APO 1TXN,
coproporfirinognio III oxidase; P89 e refere-se a levedura
protena YMR087W, PDB 1NJR, proposto a partir da sua
estrutura para ser uma ADP-ribose-100-monofosfatase
[14]. A sequncia de codificao para a espermidina humano / espermina
acetiltransferase (SSAT) foi amplificado por reversa
transcriptase e de PCR a partir de RNA total a partir de um humano
A linha de clulas (o presente tipo de Paul Freimuth) e clonado em
pET-13a. Protenas do bacterifago T7 especificadas pelos genes
10A (a principal protena da cpside do bem-expresso), e 5.3
7,7, (protenas altamente txico de funo desconhecida) [3,4]
foram expressos a partir de vectores prex.
O hospedeiro de expresso para protenas de levedura clonados era
B834 (DE3), na crena equivocada de que uma necessidade de metionina
hospedeiro seria melhor para marcar protenas com
selenometionina (SeMet) para cristalografia (ver seco
em Auto-induo para protenas de rotulagem com SeMet
para cristalografia). O plasmdeo de RIL BL21-
Gold (DE3) RIL (Stratagene) aumenta a expresso
de algumas protenas alvo de levedura por ARNt que abastecem
para cdons utilizados freqentemente em levedura, mas no E. coli. T7
protenas e outras protenas foram expressas em
Transformou-se BL21 (DE3) ou BL21-Gold (DE3) RIL (em que
Stratagene introduzido o fentipo Hte em alta
a eficincia de transformao e uma mutao endA para reduzir a actividade de
endonuclease). O plasmdeo RIL
derivado de um plasmdeo pACYC e confere resistncia
ao cloranfenicol.
Estoques Congelador para o armazenamento de longo prazo da expresso
estirpes so feitas pela adio de 0,1 ml de 100% (w / v) de glicerol
para 1 ml de cultura em fase log ou crescer at saturao em
mdia no induzindo, como PG, LSG ou MDG (Tabela
1), misturando bem, e colocar em um? C congelador? 70. subculturas
para uso como estoques de trabalho so feitas por raspagem-se
uma pequena quantidade de cultura congelada com um plstico estril
ponta da pipeta sem derreter o resto do estoque e
inoculao em meios no-induo. Aps crescimento at
saturao, tais populaes de trabalho so tipicamente estvel para
semanas na geladeira.
meios de crescimento
NZ-amina AS, uma digesto enzimtica de casena solvel
(em 100 quilos de barris) e extrato de levedura (HY-Ontem
444 em um tambor 55 libras) foram obtidos a partir da Quest
International, 5515 Carrio Blvd., Hoffman Estates, IL
60192, telefone 800-833-8308. Por convenincia, o
designao de N-Z-amina ir referir-se a N-Z-amina AS,
que pode ser substitudo por outras digestes enzimticas
de casena, como triptona, nos meios de comunicao descritos
Aqui. Pequenas quantidades de digestes enzimticas de casena ou
extracto de fermento, bem como sais, acares, aminocidos, vitaminas,
e outros componentes dos meios de crescimento foram obtidos
a partir de Difco, Sigma, Fisher ou outro bioqumica
e fornecedores de produtos qumicos. Mdia descrito anteriormente [1]
para o crescimento de E. coli e a produo de protenas-alvo
com o sistema de expresso de T7 incluem ZB (10 g de N-Zamine
e 5 g de NaCl / L), ZYB (anteriormente ZY) (10 g NZ-
amina, 5 g de extracto de levedura, e 5 g de NaCl / L), M9 (1 g
NH4Cl, 3 g de KH2PO4, 6 g de Na2HPO4, 4 g de glicose, e
1 mL de MgSO4 1 M / L) e M9ZB, a combinao
de M9 e ZB. Por convenincia, as concentraes de certos
componentes do meio so dadas em percentagem (w / v). a
meio ZY anteriormente denominada sero aqui chamados ZYB
meio para indicar a presena de 0,5% de NaCl, anlogo
ZB a forma. O nome ZY ser reservado
para 1% de N-Z-amina, 0,5% de extracto de levedura sem sal
adicionado.
As composies de parte do recentemente desenvolvido
meios para o cultivo de culturas de alta densidade, sem
induo e para a auto-induo so dadas na Tabela 1.
Meios so convenientemente montado a partir de concentrado estril
solues de reserva adicionada para gua estril ou apenas ZY
antes da utilizao. As solues de padro de misturas incluem
20 P (1M Na2
HPO4, 1M KH2
PO4, e 0,5 M
(NH4) 2SO4); 50 L (0,625 M de Na2HPO4, 0,625 M
KH2PO4, 2,5 M NH 4 Cl, e Na2SO4 0,25 M); 50 M
(Na2HPO4 1,25 M, 1,25 M de KH2PO4, 2,5 M NH 4 Cl,
e Na2SO4 0,25 M); 50 5052 (25% de glicerol, 2,5% de glucose,
e 10% de um mono-hidrato de lactose); e 100 505
(50% de glicerol, 5% de glicose). O termo lactose far referncia 13C. Todos os meios contm
MgSO4 2 mM e traar de metal
misturar (apesar de mistura de metais vestigiais pode ser omitido em meios
contendo N-Z amina e extracto de levedura). abreviaturas
para componentes complexos, se houver, so colocados em frente do
carta de designao, e abreviaturas para aminocidos,
glicerol, a glucose, a lactose e so colocadas depois. Assim, Z
indica 1% de NZ-amina, Y indica 0,5% de extracto de levedura,
e P indica a composio de sais na forma ZYP.
A designao 505 refere-se a 0,5% de glicerol, 0,05% de glucose
(como em ZYM-505); 5052 refere-se a 0,5% de glicerol,
0,05% de glucose, e 0,2% de lactose (tal como no ZYP-5052); e
750.501 refere-se a 0,75% de glicerol, 0,05% de glucose, e
0,01% de lactose (em C-750501). G indica 0,5% de glucose,
como em PG; D indica 0,25% aspartato, como nos ODM;
e A indica 200 lg / ml de cada um dos 18 amino diferente
Os cidos (0,36% do total de amino cidos), tal como no PAG. O S em
LSG representa 20 mM de succinato e SM em PASM
para a selenometionina (SeMet). Os nomes de alguns
meios de comunicao tm sido encurtado de designaes anteriormente em
receitas distribudo, tal como indicado na Tabela 1.
As condies de cultura
As culturas foram cultivadas em frascos de vidro estreis, numa
shaker incubadora (srie G25 New Brunswick), geralmente
em 300-350 rpm, conforme indicado no medidor. a incubao
temperatura era de 37 C, salvo indicao contrria.
Protenas-alvo foram expressas a temperaturas to baixas
como 18? C. A configurao do padro de culturas em crescimento
em paralelo era colocar 0,5 ml de cultura em
13 100 tubos mm de cultura com tampas de plstico. quando
mais do que cerca de 0,2 ml de cultura era para ser removido
para seguir o curso de tempo de crescimento, o pH ou a induo,
1,5 ml da cultura foi cultivada em 18 150 milmetros cultura
tubos ou 5-10 ml de cultura em 125 ml Erlenmeyer
frascos. Estas configuraes desde arejamento suficiente
para sustentar o crescimento logartmica para um A600 que se aproxima
10 em meio adequado, e expresso resultados pareciam
para traduzir bem para o crescimento em volumes de cultura 400-500 ml
no de 1,8 ou 2,8-L perplexo frascos Fernbach (Blico),
conveniente para produzir quantidades de miligramas de multi-
protenas em um shaker incubadora. As maiores taxas de aerao
poderia ser obtida com um menor volume de cultura
por navio.
A medida padro de crescimento da cultura foi ptica
densidade a 600 nm (A600), aps diluio em gua a concentraes
que deu leituras abaixo de 0,25 em um 1 cm
tina caminho de comprimento em um espectrofotmetro Beckman DU 640.
O pH da cultura foi medido depois de 10 vezes
diluio em gua. A viabilidade e a estabilidade de culturas
crescidas sob diferentes condies foram testados por plaqueamento
em 1% placas de agar contendo ZB, salvo indicao em contrrio. vivel
culturas de clulas BL21 (DE3) produziu aproximadamente
2 109 colnias por mililitro por A600 mais uma vez
ampla gama, de fase log por meio denso saturado
culturas.


Ensaio de placa para a induo da polimerase de ARN T7
Para testar a induo da ARN-polimerase T7 na expresso
hospedeiros na ausncia de um plasmdeo alvo, o bacterifago
T7 mutante de deleo de 4107 foi utilizado [1]. este
mutante no tem toda a sequncia de codificao para o ARN de T7
polimerase e incapaz de formar uma placa em um gramado
de clulas, a menos que o material de acolhimento de RNA-polimerase de T7.
Quando a BL21 (DE3) cultivado e plaqueado em meios que
no tem nenhuma actividade de induo, o nvel basal de ARN de T7
polimerase baixo o suficiente para que apenas pequenas placas desenvolver
a baixa eficincia, e que normalmente levam mais de
3 h para se tornar visvel. Em contraste, quando a BL21 (DE3)
induzida por IPTG a 0,4 mM, incluindo na placa, 4107
forma eficiente as grandes placas tpicas do tipo selvagem
T7, que se tornam aparentes em menos de 2 h. esta 4107
ensaio de placas foi utilizado para testar se a polimerase de T7
foi induzida em culturas de clulas BL21 (DE3) cultivadas em diferentes
mdia.
Anlise de protenas em gel de laje
A produo da protena alvo foi seguida por electroforese em gel
de protenas celulares totais, na presena de sdio
dodecilsulfato de pr-moldado em 4-20% de poliacrilamida
gis (Cambrex). As clulas foram lisadas em Bugbuster mais Benzonase
(Novagen) em 50 mM Tris-Cl, pH 8,0, e contendo
lisozima de ovo de branca a 20 lg / ml. A lisozima
melhora a libertao de protenas grandes no solvel
frao, mas foi omitida quando se pode interferir com
Identificao de protenas de aproximadamente o mesmo tamanho, no
padro de electroforese em gel. BenzonaseTM um que ADNase
reduz a viscosidade que poderiam interferir com
de colocar as amostras ou causa bandas para difamar no gel.
Ou uma mistura de 5 lise foi adicionado diretamente a uma adequada
diluio da cultura, ou as clulas foram sedimentadas por centrifugao
1 min numa centrfuga de micro tubos (1,5 ml), o
sobrenadante aspirado, e o sedimento suspenso em 1 lise
mistura. O volume final da suspenso de clulas foi
40 ll, geralmente a uma concentrao que corresponde a uma cultura
densidade de A600? 5, mas s vezes metade ou o dobro desse
concentrao. Imediatamente aps a mistura, 20 ll de celular
suspenso foi transferida para um segundo tubo, e tanto
tubos foram deixados durante aproximadamente 30 min temperatura ambiente
para a lise. Um dos tubos foi usada como a amostra
do total de clulas, ao qual foi adicionado 10 de 3 ll carregamento
tampo (contendo sulfato de dodecilo de sdio). a outra
tubo foi centrifugado 1 min e o sobrenadante removido
com uma pipeta e misturado com outros 10 ll de
3 tampo de carregamento para constituir a frao solvel.
O sedimento (fraco insolvel) foi suspenso em 30 ll
de tampo de carga. Todos os trs tubos foram aquecidos para
1 min num banho de gua a ferver e 10 de cada ll carregado
no gel de electroforese.
Colorao rpida do gel aps electroforese utiliza o
protocolo seguinte. O gel suspenso em? 50 ml de etanol a 50%, cido actico a 10% em uma
caixa de plstico coberta,
aquecida quase at fervura num forno de microondas (com
a tampa entreaberta), e, em seguida, colocado num agitador rotativo durante pelo menos
5 min temperatura ambiente, durante as quais o gel
encolhe. O lquido eliminado e o gel suspenso
em? 50 ml de etanol a 5%, cido actico a 7,5%, e de 200 ll
uma soluo de 0,25% de azul brilhante de Coomassie, em etanol a 95%.
Aps agitao suave para dispersar a mancha, o gel
novamente aquecido at quase ferver em um forno de microondas e
colocado na cadeira de balano. O padro de protena torna-se geralmente
visvel em poucos minutos, e continua a
intensificar ao longo de algumas horas. O resultado pode ser geralmente
visualizada em menos de 30 minutos, mas o gel geralmente
abalaram durante a noite antes de digitalizar uma imagem para o
computador. Um Kimwipe colocado na soluo e bombou
durante alguns minutos, pode levar rapidamente a pequena quantidade
de excesso de corante no dissolvente.
resultados
Crescimento de sacudir as culturas de alta densidade
Agitando as culturas so convenientes para o cultivo de muitos
culturas em paralelo, e um rpido crescimento para elevadas densidades
desejvel para maximizar o rendimento e eficincia de
a produo de protenas-alvo. Meios complexos contendo
digestes enzimticas de casena e extracto de levedura so extensivamente
utilizado porque suportam o crescimento de uma ampla gama
de cepas de E. coli com diferentes necessidades nutricionais,
e culturas tipicamente crescem 2-3 vezes mais rpido do que em simples
Sais Minerais mdia com glicose como nico carbono
fonte. No entanto, os meios complexos pode variar de lote para
muito na capacidade de suportar o crescimento, e alguns meios de comunicao complexos
Verificou-se que induzem a produo de alto nvel do
protena alvo no sistema de expresso de T7 mediante abordagem
a saturao sem indutor adicionado [6]. para
determinar quais os fatores que podem limitar o crescimento de alta densidade,
e para tentar entender e gerenciar no intencional
induo, os efeitos dos diferentes componentes do crescimento
mdia sobre a densidade de saturao, taxa de crescimento e induo
foram analisadas.
Os resultados tpicos de experincias exploratrias so mostrados
Tabela 2 em culturas de clulas BL21 (DE3) cresceram durante a noite em
ZB, em que 1% de NZ-amina, a nica fonte de nutrio,
saturado a A600? 1,2 e pH? 7,9-8,2. A adio de
0,5% de extrato de levedura (para dar ZYB) mais do que duplicou o
densidade de saturao para A600? 2.8. Densidade de saturao aumentado
aproximadamente em proporo com a concentrao
de NZ-amina, at cerca de 4%, atingindo A600? 6,9 a
8%. Triplicando a concentrao de ZYB quase triplicou
a densidade de saturao para A600? 7,6. A adio de 1%
glicose a ZB, ZYB, 4 ZB ou 8 ZB teve pouco efeito sobre
densidade de saturao, aparentemente porque o cido gerado
pelo metabolismo da glicose sobrecarregado o limitado
tamponamento capacidade desses meios de comunicao e diminuio do pH o suficiente
para parar o crescimento. Embora a taxa de crescimento foi
mais lento em meio M9 (sais minerais e 0,4% de glucose), a saturao
densidade de A600? 2,5 era comparvel
ZYB. Adicionando ZB para M9 triplicou a densidade de saturao
a A600? 7,5, mas o aumento da concentrao de glicose
de M9ZB a 2% superaram a capacidade de buffer de
o tampo de fosfato 66 mM em meio M9 e parou o crescimento
a uma densidade mais baixa, A600? 5,8 e pH? 4.6.
Actividade de induo tambm foi analisada pela capacidade de
Transformou-se BL21 (DE3) de crescer at saturao para suportar a formao de placas
por 4107, um mutante de deleo de T7 completamente incapaz
para formar placas, na ausncia de RNA polimerase T7
fornecida pelo host. Meios feitas com N-Z-amina a partir de
nosso velho barril (Old ZB na Tabela 2) tiveram pouca ou nenhuma induo
actividade. Meios feitas com N-Z-amina a partir do novo
cano (a partir do qual todas as mdias foram feitas a menos que especificado
de outro modo) tinha actividade indutora significativa e maior
concentraes de NZ-amina apresentou atividade indutora superior,
, tal como avaliado pelo tamanho da placa e o tempo de aparecimento.
A adio de 1% de glicose suprimiu fortemente a actividade indutora, como encontrado
anteriormente por Grossman et ai. [6],
0,1% de glicose, mas teve pouco efeito, presumivelmente devido
foi esgotada muito antes da saturao. esta induo
atividade discutido em meios no induzindo
e Auto-induo.
O aumento da concentrao de N-Z-amina e / ou
extracto de levedura pode aumentar a densidade de saturao, mas pode
tambm aumentam a actividade indutora e caro em relao
a determinao e fornecimento precisamente o que necessrio
para o crescimento de elevada densidade. Basta adicionar 1 mM
MgSO4 para qualquer ZB ou ZY aproximadamente o dobro
a densidade de saturao (Tabela 2). Embora o excesso de glicose
induo impedido, culturas poderiam se tornar cida
suficiente para parar o crescimento. Determinao e fornecendo
o que necessrio para o crescimento de alta densidade no lote
culturas e entender e gerenciar no intencional
induo tem sido um processo iterativo. a seguir
sees resumir primeiro o meio de crescimento que resultou
e, em seguida, as experincias e fundamentos que
conduziu a eles.

Media-alta fosfato P
Totalmente definido e meios complexos P (Tabela 1) pode suportar
o crescimento de BL21 (DE3) e outras estirpes de E. coli
a densidade de saturao de A600? 10 ou maior na razoavelmente
culturas bem arejada. Em media P, uma equi-molar
mistura de Na2HPO4 e KH2PO4 fornece tamponamento
contra mudanas geradas metabolicamente no pH em ambas
direes e uma fonte de sdio, potssio e
ons de fosfato. A concentrao de fosfato
100 mM foi escolhida para fornecer o mximo de capacidade tampo
quanto possvel sem forar as clulas. fosfato superior
nveis podem ser tolerados, mas o crescimento comea a
lenta, provavelmente devido elevada fora inica.
Um suprimento adequado de nitrognio e de enxofre fornecido
por NH4SO4 25 mM. A exigncia de magnsio
ons satisfeita por MgSO4 1 mM, a concentrao dada
em receitas distribudo anteriormente, mas as receitas dada
na Tabela 1, chamada para MgSO4 2 mM, para proporcionar uma
maior almofada para o crescimento para densidades muito elevadas. rastreamento
metais so necessrios para o crescimento mximo em inteiramente definida
mdia. A concentrao combinada de glicose, glicerol,
e outros acares nas receitas dadas na Tabela 1 baixa
o suficiente para que eles devem ser esgotados antes de se tornar culturas
culturas irreversivelmente cidas e saturadas geralmente
tem um pH maior do que 6,0. Em meios totalmente definidos tais
como PAG e PA-5052, uma mistura de 18 amino purificada
cidos aumenta a taxa de crescimento, bem como contribuir para a realizao
pH aproximadamente neutro a saturao. a norma
200 lg / ml de cada um dos aminocidos suportada uma suave
curva de crescimento at saturao a densidades de pelo menos A600
? 10, enquanto que as descontinuidades eram aparentes em concentraes
de 100 lg / ml ou menos, presumivelmente devido a depleo
de um ou mais aminocidos necessria a induo
de vias de sntese. O tempo de duplicao das clulas BL21 (DE3)
em crescimento de fase log, a 37 C foi de cerca de 60 a
70 min em meio mnimo de cerca de 30 a 35 min em meios
ZY contendo ou a mistura dos 18 aminocidos purificados.
As receitas de media P tm sido amplamente distribudos
e utilizados com sucesso para crescer culturas estveis de banco
Estirpes de expresso de T7 e para produzir protenas-alvo
pela auto-induo.
Fosfato de alta promove a resistncia canamicina
Os vectores de expresso que conferem resistncia a canamicina
Foram selecionados para o nosso trabalho genmica estrutural, a
evitar possvel crescimento de culturas induzidas por clulas
que tenham perdido o plasmdeo. Tal crescimento excessivo pode ocorrer quando
Os vectores de expresso confere resistncia a ampicilina, porque
secretado b-lactamase pode degradar todos os ampicilina
na forma [1,2]. No entanto, fiquei surpreso ao
achar que BL21 (DE3) sem qualquer plasmdeo cresceu a alta
overnight densidade a 37 C em auto-induo de ZYP-5052
meio contendo 25 lg / ml de canamicina, uma concentrao
mata-los de forma eficiente, em que ZB ou ZYB culturas ou placas. As culturas que cresceram
teve eficincia de revestimento tpicos
e manteve-se sensveis a 25 lg / ml de canamicina
em placas ZYB. Alm disso, a BL21 (DE3) chapeado directamente
em ZP ou ZPG placas contendo 25 lg / ml de canamicina
formaram colnias menores, mas uniformes eficincia normais,
indicando que todas as clulas sobreviveram e cresceram em
estes meios.
Testes sistemticos revelou que o aumento da resistncia
canamicina devido a altas concentraes de fosfato
combinada com aminocidos e talvez outros
nutrientes em rich media. A uma concentrao de canamicina
de 25 lg / ml, BL21 (DE3) no cresceu em ZYB, que
fosfato adicionado no tem, nem no mnimo PG, o qual
contm 100 mM de fosfato, mas que cresceram muito bem em
PAG totalmente definido, o qual contm 100 mM de ambas
fosfato e aminocidos purificados. Crescimento a 25 lg /
ml tambm foi observada em outros meios de comunicao que contm relativamente
elevadas concentraes de fosfato e de aminocidos
cidos, tais como M9ZB (fosfato 64 mM) e ptimo
caldo (fosfato 89 mM) [15] (TRB aqui abreviado
para evitar confuso com caldo triptona (TB)). Na rico
meios de comunicao, quanto maior a concentrao de fosfato, o
quanto maior a concentrao de canamicina necessria para evitar
clulas de crescimento e matam: BL21 (DE3) no conseguiu crescer
em M9ZB e TRB a 50 lg / ml e foi morto de forma eficaz
em 100 lg / mL; Culturas PAG ainda se tornou turva numa
concentrao de canamicina 50 lg / ml, matando foi um pouco
mais rpido do que o crescimento em 100 lg / ml e assassinato foi
eficaz na 200 lg / mL; Culturas ZYP-5052 tornou-se ainda
turva a 100 lg / ml, matando foi ligeiramente mais rpido do que
crescimento em 200 lg / ml, e foi eficaz em matar
400 lg / ml. Apesar de muitas estirpes de expresso no induzidas
so relativamente estveis, mesmo na ausncia de antibitico selectivo,
Tendo em meios ricos em que a BL21 (DE3) mais
sensveis canamicina parecia prefervel recorrer
a concentraes to altas quanto 400 lg / ml quando a seleo
necessria. Algumas tentativas para desenvolver uma mistura de aminocidos
que promova o crescimento rpido sem substancialmente
aumento da resistncia canamicina no foram
bem sucedida. A reduo da concentrao de fosfato no
meio de crescimento parecia a forma mais atraente de aumentar
a sensibilidade a canamicina.
Baixa M de fosfato e L mdia
Conforme descrito na prxima seo, as culturas podem ser
cresceu a altas densidades com tamponamento apenas o mnimo de
pH de fosfato ou outros tampes. Os conjuntos M e L
dos meios de comunicao (Tabela 1) tm concentraes de fosfato de
50 e 25 mM, respectivamente. A sua composio de sal
foi modificado a partir do que utilizado em meio de P para permitir independente
variao de fosfato, sulfato, e de amnio
ies, que til para testar os requisitos nutricionais
e para marcao isotpica. No induzir e auto-induo
L mdia (25 mM fosfato) foram testados extensivamente
e so satisfatrios para a maioria dos fins, mas a mdia M (50 mM fosfato) tm variaes
menores em pH
durante o crescimento e so atualmente utilizados para o trabalho de rotina.
BL21 (DE3) morto quase to rpido quanto ele se divide em ZYM-
5052 contendo canamicina a 50 lg / ml e morto
bastante eficaz em 100 lg / ml. Uma concentrao de canamicina
de 100 lg / ml foi adotado para o trabalho de rotina.
O controle metablico de pH
As culturas que crescem em meios contendo glucose (e em
que nenhum outro nutriente limitante) vai continuar a crescer
at que a glicose se esgotar ou o cido gerado
pelo metabolismo de glicose for superior a tamponamento
a capacidade do meio e faz com que o pH caia para
um nvel que impede o crescimento. Enquanto glucose suficiente
est presente no meio de crescimento, o catabolismo de outras
fontes de carbono e de energia que poderia equilibrar o cido
gerado pelo metabolismo da glicose impedida pela
o fosfoenolpiruvato / phosphotransferase carboidrato
sistema (PTS), agindo atravs da represso catablica
e indutor excluso [16-20]. Na ausncia de
glicose, glicerol pode apoiar sobre o crescimento de forma to eficaz
mas suprime a utilizao de outras fontes de carbono menos dramaticamente
de glicose por um mecanismo que afecta cclico
A produo de AMP [21]. O excesso de glicerol tambm pode gerar
cido suficiente para parar o crescimento, mas, em contraste com a glucose,
a presena de glicerol no suprime a induo
actividade encontrado no meio complexo.
Outro fator com uma profunda influncia sobre o crescimento
a disponibilidade de oxignio. Se a cultura se torna
o suficiente para que o consumo de oxignio densa excede a taxa
de aerao no reservatrio, gatilhos de limitao de oxignio agitao
respostas regulatrias complexas que tentam ajustar
as capacidades metablicas da clula para a disponibilidade de
oxignio e as fontes de carbono e de energia no meio
[22]. Quanto maior a taxa de aerao (oxigenao ou)
quanto maior for a densidade da cultura atingiu antes
limitao de oxignio provoca essas reaes. produo de cido
a partir da glicose ou glicerol parece aumentar, como resultado
das alteraes metablicas como oxignio torna
limitar.
Os desequilbrios das necessidades de energia e de carbono no crescimento
com glicose como fonte de carbono e energia so tipicamente
corrigida pela excreo de acetato e outros compostos
para o meio [23-25]. Se a glicose se esgotar antes
o meio fica muito longe do equilbrio, o acetato excretado
e outras fontes de carbono e de energia que pode ser
presente no meio pode, ento, ser metabolizado, o qual
pode devolver o pH do meio para o neutro ou alcalino
gama. A diminuio do pH sobre o metabolismo de glicerol
tambm pode ser invertida por um metabolismo do carbono e outros
fontes de energia no meio. Excurses de externo
pH fora do intervalo neutro em ambos o cido ou alcalino
lado tambm induzem respostas regulatrias complexas [26].
O controlo rigoroso da ordem de catabolismo de
diferentes fontes de carbono e de energia no meio de crescimento,
juntamente com as respostas regulatrias complexas para
outras condies ambientais, torn-lo um desafio para
desenvolver meios de comunicao, em que o pH se mantm numa gama que
suporta o crescimento a altas densidades celulares em sacudir embarcaes.
O fosfato 100 mM em meio P fornece o suficiente
capacidade tampo para permitir o crescimento de esgotamento de
0,5% de glucose com uma densidade maior do que saturao
A600? 5 enquanto se mantm o pH acima de 6,0. No entanto, significativa
aumento da concentrao de glicose ou diminuies
em concentrao de fosfato produzido geralmente culturas
que saturado em pH baixo e perdeu a viabilidade dentro de horas
ou dias. Numa tentativa de proporcionar um tampo forte
contra a diminuio do pH, o que permitiria o uso de
as concentraes de glicose e glicerol maior ou menor
As concentraes de fosfato, cidos orgnicos com relativamente
pKa elevado foram testadas quanto sua capacidade para tamponar o meio
e, assim, permitir o crescimento de maior densidade.
cidos orgnicos
Succinato foi encontrado para ser eficaz na luta contra a
cido gerado pela glucose em meio mnimo G (que
tem apenas 25 mM de fosfato). evidente a partir dos resultados
mostrados na Tabela 3 que, em vez de actuar simplesmente como um tampo,
succinato como glicose metabolizada aproxima depleo
durante o crescimento: culturas alcanar uma densidade maior saturao
e um pH maior do que na ausncia de succinato. a
taxa de crescimento e as variaes de pH durante o crescimento (no
mostrados) so consistentes com a glucose ser metabolizado
em primeiro lugar e, em seguida, succinato, como a glicose esgotada. aproximadamente
20 mM de succinato parece ideal para o equilbrio
0,5% (28 mM) de glicose, geralmente produzindo culturas saturadas
com um pH prximo da neutralidade. substancialmente maior
As concentraes de succinato pode fazer com que o pH subir bem
alm de 8,0, o que pode forar as clulas e reduzir a viabilidade.
A presena de succinato no causa detectvel
induo da polimerase de ARN T7, como medido pela
Ensaio de placa 4107 e, tal como indicado pela viabilidade e
estabilidade de culturas saturadas de estirpes que expressam
protenas-alvo altamente txico. As culturas que saturam entre
pH? 6 e? 7,5 so estveis por semanas na geladeira
com pouca perda de viabilidade ou aumento do tempo de latncia
quando crescer subculturas. Fumarato, DL-malato, e
citrato tambm foram capazes de equilibrar o cido produzido pela
glucose em muito da mesma maneira como o succinato. adicionado acetato
foi eficaz em menor grau. maleato desde
algum tampo contra a queda do pH, mas era txico a
Transformou-se BL21 (DE3) a um pH baixo, pelo menos em alguns meios.
aminocidos
NZ-amina, extracto de levedura ou uma mistura de 18 amino puro
cidos (sem Y, C) aumentam o ritmo de crescimento e de saturao
densidade dos meios de comunicao ou de glucose contendo glicerol.
A absoro de aminocidos a partir do meio e incorporao
directamente em protenas poupa as clulas a partir de ter de
fazer enzimas para vias metablicas inteiras e desvio
carbono a partir de glucose em sntese de protenas, em vez de produo de energia ou outros
metabolitos. Se o
concentrao de aminocidos elevada o suficiente, pelo menos
alguns deles permanecer para ser catabolizado para o carbono
e energia aps a glicose esgotada, fazendo subir o pH
e potencialmente equilbrio cido gerado a partir da glicose.
Em contraste com NZ-amina, os aminocidos purificados contribuiu
nenhuma atividade de induo quando adicionado ao meio definido.
Para determinar quais os aminocidos so os mais eficazes em
equilbrio do pH, cada um dos 18 aminocidos puros utilizados na
a mistura foi testado individualmente, a uma concentrao de 0,25% para a capacidade para
equilibrar o cido gerado pela
0,5% de glucose em meio L (25 mM de fosfato) (Tabela
4). O cido mais eficaz amino nico foi aspartato,
seguido por serina, asparagina, glicina, glutamato e,
todos os quais o aumento da densidade de saturao de 60-115%
e produziu um valor de pH> 6,2 a saturao (em comparao com
pH? 4,1 em si mesmo glicose). Por comparao, 20 mM de succinato
(0,24%) o aumento da densidade de saturao em 90% e
produzido um pH de 6,8 a saturao, e a mistura de
18 aminocidos (0,27%), aumento da densidade de saturao de 75% e um pH produzido? 5,7.
Dos outros aminocidos, s
glutamina e prolina produzida tanto quanto um aumento de 25%
na densidade de saturao e apenas alanina produzida
um pH> 4,0, a saturao. Dos aminocidos que falharam
para equilibrar o pH a uma concentrao de 0,25%, apenas alanina
foi eficaz em pH de equilbrio, quando testados a 0,5%. vrios
aminocidos aumentou substancialmente o atraso ou diminuio
a taxa de crescimento em meio mnimo LG, a maioria
nomeadamente serina, alanina, leucina, valina e, presumivelmente
reprimindo vias metablicas que se sobrepem [27,28].
A adio de 0,01% de cada um de leucina, isoleucina e valina
crescimento normal restaurada, na presena de 0,25% de serina
(O lento crescimento da histidina pode refletir um baixo pH
o meio.)
Para determinar quais os aminocidos so mais eficazmente
utilizado como uma fonte de carbono e energia para BL21 (DE3),
as culturas foram cultivadas em meio L com aminocidos como
nica fonte de carbono (Tabela 4). Uma mistura do 18 amino
cidos, cada um a 100 lg / ml (0,18% do total de cidos aminados) foi
fornecida a promover um crescimento e para atenuar possvel
Efeitos inibitrios dos aminocidos individuais, o que
foram adicionados a uma concentrao de 0,5%. A mistura de
18 aminocidos por si s para o crescimento A600 suportadas
? 1,4 com um pH final? 6.8. Dos aminocidos individuais, prolina, foi o mais eficaz de carbono e
energia
fonte, de suporte do crescimento para A600? 9,6 e pH? 7,0,
comparvel ao A600? 9,0 e pH? 5,7 suportado por
0,5% de glicerol. Outros aminocidos que um aumento substancial
a densidade de saturao foram serina, glutamato,
alanina e aspartato, com aumentos menores, por treonina
e asparagina. Cada um destes aminocidos tambm aumentou
o pH final, pelo menos um pouco, o que indica que
que foram metabolizados. O pH final? 5.2 do histidine-
contendo cultura representou uma diminuio substancial
a partir de um pH inicial estimada como sendo? 6,0 pela
reconstituio (versus? 6.6 para os outros aminocidos),
sugerindo que o metabolismo diminui a de histidina
pH da cultura. Os restantes aminocidos individuais
no afetou significativamente ou A600 ou pH, sugerindo
que no foram significativamente catabolizada. A credibilidade
teste de triptofano no foi feito.
As exigncias nutricionais mnimas para o crescimento de alta
densidade
Equilbrio metablico do pH, foi possvel testar
a exigncia de qualquer fosfato de nutrientes incluindo
para suportar o crescimento de BL21 (DE3), sem a complicao da cultura se tornar demasiado
cida ou bsica para
o crescimento ideal. Uma srie de testes de sais minerais mdia
com glicose ou glicerol como fonte de carbono primrio estabelecida
concentraes de nutrientes que limitam o crescimento para baixo
densidades, o que poderia ser extrapolado para determinar
As concentraes mnimas necessrias para aproximados
crescimento a altas densidades de saturao. A Tabela 3 mostra os resultados
de uma srie de testes de requisitos mnimos para
de enxofre, azoto, fsforo, magnsio e em modificado
Meio LG, na ausncia ou na presena de 25 mM de succinato.
As culturas foram inoculadas com uma diluio de 1000 vezes
de BL21 (DE3), que tinha sido cultivada at saturao em
PG, e 0,5 ml foram cultivadas em culturas de 13 100 milmetros
tubos em um incubador com agitao por 14-15 horas a 37 C. concluses
a partir destes e semelhantes experincias esto resumidos
nas sees seguintes.
enxofre
Transio de 0,026 mM de sulfato no inculo suportada
crescimento a A600? com pH 0,7? 6,7. a necessidade
para sulfato saturado a cerca de 0,5 mM, em que
Transformou-se BL21 (DE3) cresceram para A600? 6,1 a pH? 6,7. Um sulfato
concentrao de 0,5 mM ou maior a um pH prximo do neutro
Tambm foi suficiente para produzir culturas muito estveis, tal como medido
pela viabilidade aps trs semanas na geladeira.
O Na2SO4 5 mM em L e M media e 25 mM
(NH4) 2SO4 em media P deve fornecer enxofre suficiente para
apoiar o crescimento a altas densidades em frascos agitados.
nitrognio
Densidade de saturao continuou a aumentar com NH4Cl
concentrao at, pelo menos, 50 mM, que apoiou
crescimento a A600? 5,5 a pH? 7.1. Culturas mantidas alta
viabilidade por pelo menos trs semanas na geladeira pelo
NH4Cl concentraes de 20 mM ou superior e o pH perto
neutro. Em meio mnimo, em que o pH foi mantido
prximo do neutro, NH 50 mM
4 apoiada reproducibly
crescimento ligeiramente superior do que a densidade a 25 mM e
Por conseguinte, a concentrao do padro usado em P, M,
e L mdia. No entanto, NH4Cl 25 mM, suficiente para
a maioria dos propsitos, incluindo a rotulagem de protenas com 15N
para estudos de RMN.
fosfato
O reporte de 0,1 mM de fosfato no inoculo suportada
crescimento a A600? 0,8 a pH? 6,7. A presena de
1 mM de fosfato no meio de crescimento para suportada
A600? 3,8 a pH? 6.4, mas a necessidade de fosfato fez
no aparecem para saturar at 10-15 mM em A600? 5,9
e pH? 8,2. Clulas de E. coli tem respostas regulatrias complexas
quando o fosfato se torne limitante no meio
[29] e usos alternativos de fosfato interno
pode contribuir para o aumento, relativamente lento, em saturao
densidade entre 1 e 10 mM de fosfato. o tamponamento
capacidade de fosfato no meio no
reduzir significativamente o aumento do pH devido a metabolismo succinato at 35-50 mM de
fosfato. o mnimo
concentrao de fosfato nos meios apresentados na Tabela 1
de 25 mM, para tentar evitar a limitao de que o fosfato
induziria os mecanismos de resposta. experimentos em
que as densidades de saturao foram empurrados bem acima A600
? 10 ocasionalmente sugeriu que, mesmo 25 mM fosfato
pode tornar-se limitante em densidades realizveis em
sacudindo embarcaes.
magnsio
Nenhum crescimento de BL21 (DE3) foi evidente na ausncia
de magnsio, mas, curiosamente, culturas contendo
apenas limitando quantidades de magnsio cresceu para muito
densidades mais elevadas (5 a 10 vezes) quando o meio de crescimento
continham succinato do que quando isso no aconteceu. A necessidade
magnsio apareceu para saturar a 0,5 mM, o que deu
A600? 6,4 e pH? 6,2. No entanto, a viabilidade aps trs
semanas, no frigorfico pareceu permanecer um pouco
mais elevada em culturas cultivadas em MgSO4 1-2 mM do que nas
as cultivadas em concentraes mais baixas. nveis de magnsio
to elevada como 10 mM (a maior concentrao testada)
no mostraram inibio do crescimento. anteriormente distribudo
receitas para mdio P contm magnsio 1 mM, mas
2 mM (como indicado na Tabela 1) podem proporcionar uma maior margem
para o crescimento para densidades muito elevadas.
Os metais trao
Meios totalmente definidos feitos a partir de componentes purificados
contm metais contaminantes vestigiais em quantidades suficientes
para suportar o crescimento de densidade moderada, mas no suficiente
para o crescimento de alta densidade com uma boa expresso do alvo
protenas por auto-induo. A Tabela 5 resume os resultados
a partir de uma experincia de auto-induo para testar o
efeitos de metais trao. Nesta experincia, a expresso
tenso saturada em ZYP-5052 no A600? 18 com o alvo
protena expressa em nveis elevados. Em PA- ligeiramente modificada
5052, sem traos de metais adicionados, a saturao era a A600
? 4,4 com pouca expresso da protena alvo. A adio de
traos de metais sobre triplicado a densidade de saturao, para A600
? 13, e permitiu a expresso de alto nvel da protena alvo.
Cultura Claramente, uma deficincia de metais vestigiais limitado
crescimento e da auto-induo de protena alvo neste totalmente
meio definido.
Ies metlicos individuais foram testados em concentraes de
1, 10, e 100 lm para a capacidade de aumentar a densidade de saturao
e para a possvel toxicidade (Tabela 5). Os metais vestigiais
foram escolhidos como sendo susceptveis de ter uma associao funcional
com protenas ou participar em algum processo biolgico.
ons de ferro de 10 e 100 lm aumento da saturao
densidade de A600? 13, mas uma IM aumentou a densidade apenas
a A600? 7.8. Ies de mangans 1, 10, 100 e IM tambm
aumento da densidade de saturao para A600? 13, assim como o cobalto
ons em 1 e 10 ML. No entanto, 10 ons de cobalto LM
causou um atraso de cerca de uma hora antes de atingir o normal
taxa de crescimento, e 100 lm cobalto impediu o crescimento. Zinco
ies parecia ter apenas um ligeiro efeito estimulador, e nquel, molibdato de clcio, cobre,
selenato ou borato
ainda menos. Selenato no parecem ser txicas em
10 IM, mas impedido o crescimento a 100 lM.
Muitas protenas de funo desconhecida esto a ser produzidos
em genmica projetos estruturais, qualquer um dos quais
pode ter um ligante de metal insuspeita. As protenas alvo
de 50000 Da produzido a 100 mg / L que tem uma concentrao
de 2 IM e protenas de 10.000 Da concentrao
de 10 lM. O 1 concentrao do metal mistura
fontes de ferro 50 IM, IM, 20 clcio, 10 IM mangans
e zinco, e 2 IM cobalto, cobre, nquel, molibdato,
selenato e borato, valores que no so txicos para
mas o crescimento pode saturar os locais de ligao em potenciais
muitas protenas alvo. claro que, se uma protena alvo
conhecida por ter um ligando de metal, a concentrao apropriada
de metal especfico que pode ser adicionado. concentraes
entre cerca de 0,1 e 2 mistura de metal suportado
mxima densidade de saturao, 5 foi ligeiramente inibidora
e 10 marcadamente desacelerou o crescimento, mas a cultura ainda atingido
de alta densidade e um nvel elevado de auto-induo.
ferro
As concentraes de 0,05 mistura de metal ou inferior no
apoiar o crescimento de alta densidade em meio definido e
produzidos apenas baixos nveis de protena alvo por auto-induo,
principalmente devido a uma deficincia em ferro. no
presena de 0,02 mistura de metal, uma concentrao de ferro
5 IM foi suficiente para o crescimento mximo e auto-induo num meio definido sem
aminocidos mas
10 IM foi necessrio na presena de aminocidos. a
mais alta concentrao de ferro testados, 500 lM, no mostrou
evidncia de toxicidade. Em meio definido contendo
100 lm FeCl3, a omisso da mistura de metal apenas ligeiramente
diminuiu a densidade mxima e o nvel de destino
protena produzida por auto-induo, de modo 100 lm FeCl3
pode ser suficiente para muitas finalidades, se uma mistura de metal adequado
no est disponvel.
Em contraste com os resultados resumidos na Tabela 5,
mangans ou de cobalto, por si s ou em combinao, no fez
compensar uma deficincia em ferro em experincias subsequentes.
A diferena que os suportes utilizados nos testes
relatado na Tabela 5 continha sete diferentes vitaminas
mas as experincias posteriores no continha adio de vitaminas.
Quer a presena de vitaminas poderiam explicar
a diferena no foi testado.
meios complexos
Testes de exigncias nutricionais para o crescimento de
Transformou-se BL21 (DE3) de alta densidade em meios complexos indicam
que a mdia contendo apenas ZY deficiente em magnsio,
fosfato, de carbono, e fontes de energia, bem
como a capacidade para tamponar as alteraes de pH que ocorrem durante a
crescimento. As elevadas concentraes de aminocidos no ZY
est quase garantida para fornecer nitrognio suficiente
e enxofre, mas a conhecida variabilidade de lote para lote
faz parecer prudente adicionar 0,2 mistura de metal, ou, pelo menos, 10 lM de um sal de
ferro, para assegurar que os requisitos de rastreio do metal
sejam atendidas. Os sais minerais de componentes P, M ou
Mdia L esto includos em todas as formulaes de complexo
mdia na Tabela 1 para garantir que os requisitos mnimos
para o crescimento de alta densidade e auto-induo sejam atendidas.
Meios totalmente definidos foram formuladas com wellmetabolized
aminocidos, em concentraes suficientemente altas
para atingir densidades de saturao iguais ou maiores do que
os obtidos em meios complexos. No entanto, o extracto de levedura
parece fornecer algo que permite ligeiramente
crescimento inicial mais rpida do que naqueles totalmente definida
mdia. A adio de vitaminas, purinas, e pirimidinas
para o meio definido teve pouco efeito sobre a taxa de crescimento ou
densidade de saturao. O extracto de levedura fornece uma variedade de
metablitos, incluindo gorduras e hidratos de carbono complexos,
qualquer dos quais pode ser responsvel por um pouco mais rpido
taxa de crescimento inicial.
Mdia no-induo
Alm disso a nova barril de N-Z-amina, uma amostra de
Bacto triptona (Disco) tambm apresentou atividade indutora, sugerindo
que a actividade de indutor pode ser bastante comum em
digestes enzimticas de casena. A adio de excesso de glicose
aos meios de comunicao complexo que impede a induo de atividade
induo de protenas alvo [6], mas, eventualmente, culturas
tornar-se cido suficiente para parar o crescimento e pode perder a sua viabilidade.
Em concentraes de glicose intermdios, tornou-se culturas
induzida se o pH subiu em saturao, indicando
glicose que foi descarregada, mas no se ficou a cultura
cido, indicando que a glucose se manteve na cultura.
A taxa de arejamento tambm tem um efeito substancial sobre a saturao
densidade, acidez e de induo. Parecia difcil
ou impossvel formular meios complexos, em que as culturas
crescer at saturao de forma confivel e sem induo
no se tornam assim como cido para reduzir a viabilidade. Portanto,
os meios de comunicao no-indutores apresentados na Tabela 1 so totalmente definidos,
feito com componentes purificados que no tm
actividade indutora detectvel.
Atualmente usamos meio dos ODM para o crescimento de rotina
de (DE3) no induziu a expresso de culturas BL21
cepas, mas j usou PG e LSG extensivamente
para esta finalidade. Estes meios suportar o crescimento
de BL21 (DE3) com um tempo de duplicao de aproximadamente um
hora. Sendo meios mnimos, devem ser adequadamente
cepas suplementadas quando crescem com nutricional
requisitos, tais como B834 (DE3). culturas overnight
tipicamente saturar a A600? de 5 a 9 e um pH prximo do neutro
sem induo detectvel da protena alvo. quando
crescido a saturao nesses meios, at mesmo cepas que expressam
altamente txicos das protenas alvo permanecer estvel e vivel
por semanas na geladeira, e subculturas crescer
com pouco ou nenhum lag. Isto faz com que seja conveniente para crescer
ambas as unidades populacionais congeladores e culturas de trabalho durante a noite para
saturao, enquanto que anteriormente, tentamos coletar culturas em fase de registro para
minimizar eventuais instabilidades se
a protena alvo txico para o hospedeiro. As clulas que se instalam
de culturas de trabalho armazenados no refrigerador normalmente
dispersam facilmente, mas, ocasionalmente, eles tm sido pegajoso
e mais difceis de dispersar. A razo para esta ocasional
viscosidade no foi determinada, mas pode ser
associada com um pH ligeiramente alcalino, o saturado
a cultura.
As placas de agar feitas com completamente definido no induzindo
mdia, como MDAG ou PAG permitiu o isolamento
de alguns BL21 (DE3) transformantes que no puderam
formam colnias nas placas ZYB que costumamos usar para
seleco. Aparentemente, a actividade indutora em ZYB
placas causada expresso suficiente do alvo altamente txico
protena para evitar a formao de colnias, mas a falta de
actividade indutora nos MDAG ou PAG placas permitidos
colnias para placas form.MDAG ou PAG so ricos o suficiente
que os clones incuos formar colnias em-los quase como
rapidamente em placas ZYB.
Auto-induo
Induo involuntria quase certamente devido lactose em
o meio
Meios feitas com N-Z-amina a partir do barril de idade fez
no tem actividade de induo. Aparentemente, algo no
nova N-Z-amina foi causando induo (em vez
algo no antigo induo NZ-amina preveno)
porque o aumento da concentrao de novo NZ-amina
no meio tambm aumentou a actividade de induo, como
julgado por 4107 o tamanho da placa e o tempo de aparecimento (Tabela
2). Grossman et ai. [6] concluiu que no intencional
induo no foi devida presena da lactose na
mdio. No entanto, parece razovel para testar se
adio de lactose a mdia fez com NZ-amina a partir de
o tambor de idade produziria induzindo comportamento semelhante
ao observado em meios feitos a partir da nova barril. de fato,
os resultados resumidos na Tabela 6 mostram que
faz. Como esperado, a induo de no B834 (DE3) P35 era
evidente na ausncia de lactose adicionada. o menor
concentrao de lactose testados neste conjunto, 0,005%
(139 lm), deu um elevado nvel de induo de protena P35,
mas a densidade da cultura, a viabilidade e manuteno das
plasmdeo eram todos comparvel ao que foi encontrado no
ausncia de lactose adicionada. Aparentemente, a protena P35
no muito txica para o cell.With quantidades crescentes de lactose,
produo da protena P35 e manteve-se elevada a
densidade das culturas saturadas diminuiu ligeiramente,
mas a viabilidade diminuiu substancialmente, particularmente em
0,05% de lactose e superior. A estas concentraes mais elevadas de lactose,
a maioria das clulas sobreviventes tinham perdido a expresso
plasmdeo. Os elevados nveis de induo so conhecidos
matar as clulas que transportam um plasmdeo de cpias mltiplas, com um promotor de T7,
mesmo que a protena alvo incua [1,3].

Outras experincias (no mostrado) foi encontrado que a produo
de protena P35 continuava a ser sentida com to pouco
como 0,003% (83 ML) lactose, e detectvel em manchada
gis em 0,001% (28 ML), mas no em 0,0003% (8,3 ME).
O limite de deteco do ensaio utilizados por Grossman
et ai. [6] para testar possvel lactose na sua induo
meio foi indicado por eles a ser de 0,002%, na gama
onde foi observada a induo da protena P35. Concluo
que a induo no intencional descrito por Grossman et
ai. e observado por ns em media feitos com N-Z-amina
do nosso novo barril devido a pequenas quantidades de lactose
no meio. Isto parece perfeitamente razovel, como N-Zamine
uma digesto enzimtica da casena, uma protena do leite,
e leite contm lactose. A casena seria
purificadas antes da digesto, mas diferentes quantidades vestigiais
de lactose restante no produto final presumivelmente conta
para as diferenas na actividade indutora em diferentes
lotes de N-Z-amina ou triptona. A constatao de que a glicose
impede a induo involuntria tambm consistente com um
grande corpo de trabalho que mostra que a presena de glicose
na forma impede a absoro e utilizao de lactose
[16-20]. Em retrospecto, tivemos sorte que o barril
de NZ-amina utilizada para a maioria do nosso trabalho anterior em
desenvolver o sistema de expresso T7 teve baixa o suficiente
nveis de lactose para ser livre de induo no intencional.
Aminocidos suprimir a induo por lactose em fase log
crescimento
Embora a presena de uma pequena quantidade de lactose
a mdio explica a maioria das observaes relacionadas com
induo involuntria, pareceu curioso que
B834 (DE3) P35 poderia crescer a densidade relativamente alta em
ZYP contendo 0,05-1% de lactose, apesar de nveis elevados
induo de matar as clulas (Tabela 6). Com efeito, a ttulo
por A600 indicou que mais de 90% das clulas na
culturas saturadas foram incapazes de formar uma colnia.
Resultados semelhantes foram obtidos com B834 (DE3) RIL produzir
P21 protena alvo de levedura, que foi utilizado para uma
explorao extensiva dos fenmenos de induo. total
protenas de clulas que crescem em ZYP contendo 0,5% de lactose no mostrou protena P21
detectvel na fase log precoce, mas
rpida, a produo de alto nvel, como a taxa de crescimento retardado
na aproximao saturao (Fig. 1A), semelhante temporizao
observado por Grossman et ai. [6]. O decurso de tempo
parecia semelhante se o meio continha 0,1, 0,2,
0,5, 1 ou 1,5% de lactose, com induo em cada caso comeando
no A600? 1 e alcanando um nvel mximo de P21
protena por A600 a A600? 3, a qual foi mantida a
A600? 5 a 6 Quando a incubao foi continuada durante 15 h
durante a noite, novos aumentos na densidade de cultivo foram
maior quanto maior for a concentrao de lactose, atingindo
to alta quanto A600? em 14,8 1,5% de lactose. No entanto, o
quantidade de protena alvo por A600 foi muito reduzida
(Fig. 1A), e os ttulos mostrou que a densidade aumenta
principalmente devido a sobrecrescimento da cultura por clulas
que tinham perdido o plasmdeo. Tal pode ocorrer em sobrecrescimento
Meio ZYP mesmo na concentrao de canamicina
100 lg / ml utilizadas nestas experincias (ver seco de alta
fosfato promove a resistncia canamicina).
Algo em meio ZYP impede a induo por
lactose, durante a fase logartmica de crescimento. concebvel, pequeno
quantidades de glicose ou outros acares podem ser PTS
responsvel, mas NZ-amina e extrato de levedura so ambos
rica em aminocidos e pareceu possvel que amino
cidos de alguma forma a prevenir ou modular os nveis letais de
expresso que de outro modo seriam induzidas pela lactose.
Meio P contendo 1,25% de glicerol como um tomo de carbono e energia
fonte foi utilizada para testar a capacidade de amino purificada
cidos para permitir o crescimento na presena de 0,1% de lactose
(Tabela 7). No foi aparente crescimento na ausncia de
aminocidos, de acordo com a incapacidade de glicerol para
evitar induo lactose que forte o suficiente para impedir
o crescimento celular. No entanto, a adio de 18 aminocidos,
cada um a uma concentrao de 100 lg / ml, o crescimento permitido
de alta densidade com induo cheio de protena P21. de
trs subgrupos de aminocidos, apenas o grupo contendo
serina apoiou o crescimento durante a noite, assim como serina-se
mas no a outros aminocidos em que subgrupo.
Embora, serina parece ser a mais eficaz amino
cido em suprimir a induo e permitir o crescimento em
a presena de lactose, a combinao de 17 aminocidos que faltam serina promoveu o
crescimento na presena de
lactose quase to bem como 18 aminocidos, incluindo serina.
Aparentemente, algo sobre a absoro e metabolismo
de aminocidos durante impede o crescimento de fase log
ou modula a induo lactose da protena alvo suficientemente
para permitir que as clulas a crescer, mas esta inibio relaxado
e induo full-blown ocorre na abordagem
a saturao.
Regulao metablica permite auto-induo
O reconhecimento de que a lactose pode induzir a produo de
alvo protena, mas impedido de o fazer por compostos
que pode ser esgotada durante o crescimento abriu a
possibilidade de desenvolvimento de mdia em que a protena alvo
produzido automaticamente, sem a necessidade de monitorar
crescimento e adicionar indutor no momento adequado. Eu chamo isso de
auto-induo. Idealmente, a expresso estirpe seria
crescer na forma de auto-induo, sem expressar
at que a protena alvo, em vez de alta densidade, em que a depleo de factores inibidores
permitiriam a lactose presente no
o meio para induzir a expresso, produzindo altas concentraes
da protena alvo.
Fatores que afetam a eficincia ea confiabilidade do
auto-induo em culturas de alta densidade foram examinados
sistematicamente em B834 (DE3) e BL21 (DE3), inicialmente
testando a expresso da protena P21 alvo fermento sobre
uma grande variedade de condies e, em seguida, expandir a outra
protenas, incluindo protenas que so do bacterifago T7
conhecida por ser altamente txica para a bactria hospedeira. a
experimentos e concluses esto resumidos na seguinte
sees.
Fontes de carbono e energia para a produo de alto nvel de
protena alvo por auto-induo
Tal como descrito em meios complexos, crescimento em ZYP
limitada pela falta de uma fonte de carbono e energia. glicose
pode suportar o crescimento de alta densidade, mas muita glicose
impede a induo pela lactose. Lactose em si pode
suportar o crescimento de BL21 (DE3), mas os produtos iniciais
catabolismo de lactose so a glicose e galactose,
e, desde BL21 e B834 no pode utilizar a galactose, a metade
de carbono e de energia da lactose no est disponvel. talvez
mais importante, a ARN-polimerase de T7 pode induzido
assim ser mais activo que a transcrio e a sntese de protenas
na clula dirigida a protenas alvo [1]. este
competio pode limitar a produo de b-galactosidase
e permease de lactose, limitando assim a capacidade de lactose
para servir como uma fonte de carbono e energia para continuou
a produo de protenas-alvo.
Glicerol suporta o crescimento to bem quanto a glicose
e no impede a induo por lactose. culturas suplementadas
com glicerol crescer at densidades muito mais elevadas
antes e aps a induo do que com lactose como carbono
e uma fonte de energia (por exemplo, comparar Figuras 1A e
B). Transformou-se BL21 (DE3) podem crescer na outra carbono econmico
e fontes de energia, incluindo a frutose, maltose, e sorbitol
(mas no a sacarose). Em testes limitado, maltose e sorbitol
deu um crescimento um pouco inconsistente e induo,
no oferecendo vantagens aparentes sobre glicerol. Portanto,
glicerol foi escolhido como fonte de carbono e energia
para ambos os meios de auto-induo totalmente definidos e complexos.
Muitas combinaes de glicerol, a glucose, a lactose,
e aminocidos purificados foram testados para optimizar a autoinduo
e confiabilidade na produo de altas concentraes
da protena alvo por volume de cultura.
O padro de mistura de 5,052 a 0,5% de glicerol, 0,05%
glucose, e 0,2% de lactose produziu auto-induo de confiana
de uma grande variedade de protenas numa variedade de suportes
e as condies de crescimento (Tabela 1). ZYM-5052 ou ZYP-
5052 uma boa escolha para a primeira tentativa de expressar quase
qualquer nova protena alvo. Culturas induzida pela Auto com
protenas altamente expressos, tais como a protena da cpside e T7
protena P21 de levedura, podendo atingir densidades superiores
A600? De 20, mais de duas vezes a densidade de clulas BL21 (DE3) ou B834 (DE3) se crescido
no mesmo meio.
Observaes em microscpio de clulas de tais altamente
culturas que expressam sugeriu que as clulas induzidas continuou
a prolongar-se de forma bastante uniforme, sem presumivelmente
diviso.
Para algumas protenas alvo, maior o glicerol e / ou de amino
As concentraes de cido pode produzir maiores densidades de cultura
e as concentraes da protena alvo, se o arejamento e
outros componentes do meio so adequadas para manter
pH. Auto-culturas induzidas que expressam a protena da cpside de T7
atingiram densidades de cultura de A600> 40 em menos
de 24 h em ZYP-5052 suplementado com um total de 2%
glicerol e 25 mM de succinato de culturas bem arejadas
(Fig. 1C). Comparativamente, altas densidades tambm foram
alcanado em meio totalmente definido suplementado com purificada
aminocidos que fornecem carbono e energia.
Efeito da aerao no calendrio eo nvel de auto-induo de
protena alvo
Ao testar o efeito de diferentes concentraes de lactose
e glicerol a induo da protena p21 em ZYP
mdia, uma diferena significativa foi observada no
quantidade de protena produzida na ZYP contendo
1,875% de glicerol, mas no de lactose adicionada em duas diferentes
dias. A nica diferena bvia entre as culturas
parecia ser o nvel de arejamento: um padro de 0,5 ml
da cultura em um tubo de 13 100 milmetros atingiu a saturao no
A600? 13,9 e pH? 5,6 com um elevado nvel de protena alvo,
mas uma cultura de 5 ml num balo de Erlenmeyer de 125 ml, reduzida
para um altamente gaseificadas 1,5 ml por amostragem, atingiu
saturao no A600? 20,0 e pH? 6.7 com mal
protena alvo detectvel.
Para testar mais sistematicamente como crescimento e protenas
produo so afetados pelo nvel de aerao, uma vezes mil
diluio de B834 (DE3) RIL / P21 em 80 ml contendo ZYP
0,625% de glicerol, mas no de lactose foi adicionada distribudo
como 0,25, 0,5, 1 ou 2 ml em 13 amostras 100 mm e os tubos
2,5, 5, 10, 20 ou? 39 amostras ml em 125 ml Erlenmeyer
frascos, os quais foram todos cultivados a 37 C na incubadora
shaker a 325 rpm para fornecer uma gama bastante ampla de taxas
de arejamento. O curso de tempo de crescimento e produo de protenas
em que o balo contendo 5 ml ou
mais de cultura foi seguido por retirar cerca
12 amostras, totalizando cerca de 4 ml de cada um, o que
produzida uma muito alta taxa de arejamento por todo o caminho at saturao
para a cultura de 5 ml num frasco de 125 ml. duas vezes
pontos e um volume total de cerca de 75-215 ll
Foram amostrados das culturas restantes antes da saturao.
As culturas saturadas tambm foram tituladas com e
sem canamicina para testar a viabilidade e plasmdeo
reteno. Densidades de saturao e pH, destino relativo
Os nveis de protena, e os ttulos so dados na Tabela 8.
Como mostrado na Tabela 8, o nvel de protena alvo e
viabilidade de culturas saturadas que variavam fortemente com
A taxa de arejamento: as maiores taxas de aerao no deu nenhuma produo aparente da
protena P21 ou morte de clulas
e as menores taxas de aerao produziram nveis muito elevados
de protena P21 e morte substancial de clulas. a
diferentes culturas cujas densidades foram medidos no
fase de crescimento (no representada) tinha aproximadamente o mesmo crescimento
taxa de A600? 1.0, onde a falta de oxignio comearam a limitar
taxa de crescimento nas culturas com as menores taxas de aerao.
A cultura mais altamente gaseificado cujo crescimento
taxa foi seguido (5 ml reduzido para? de 1 ml em 125 ml de uma
frasco) manteve um aumento gradual desacelerao, mas constante
densidade em todo o caminho at saturao em A600
? 14,3, com pouco induo da protena alvo. a menos
bem arejado cultura cuja taxa de crescimento foi seguido
(? 39 ml em um frasco de 125 ml) comeou a produo significativa
da protena alvo por A600? 1.5 e tinha acumulado
altos nveis de A600? 3. O tempo de duplicao da cultura
era? 33 min entre A600 de 0,1 e 1, mas abrandou
acentuadamente para? 150 min entre A600, de 3 e 5 No
prxima 13 h depois de atingir A600? 5,3, a densidade da cultura
atingiu 10,2, sem diminuio aparente na quantidade
de direcionar protena por A600. Neste ponto, essencialmente nenhuma
As clulas que continham o plasmdeo foram capazes de formar uma colnia,
e as clulas que tinham perdido plasmdeo ainda no tinha coberto
a cultura. Taxas intermedirias de aerao deu
crescimento e induo de comportamento entre intermedirio
esses dois extremos. O padro de 0,5 ml em culturas
13 tubos de 100 milmetros apareceu para fornecer aerao comparvel
de cerca de 5-10 ml de culturas em 125 ml de Erlenmeyer
frascos, considerando que? 4 ml da cultura foi removido do
a cultura de 10 ml a seguir a taxa de crescimento neste experimento.
Neste conjunto de culturas, o glicerol, provavelmente, se tornou
esgotada nos nveis mais elevados de aerao, e, com exceo
para os mais baixos nveis de aerao, a maioria das culturas, em ltima instncia
atingiu aproximadamente a mesma densidade de saturao e o pH at
embora as quantidades de protena alvo diferiam significativamente.
A incapacidade de produzir a protena alvo no mais alto
taxa de arejamento na experincia acima foi devido
a baixa concentrao de lactose contribudo pelo NZ-
amina. A Tabela 9 mostra as densidades de saturao, os nveis da protena alvo e ttulos
alcanados em saturao para dois
conjuntos de culturas crescidas em ZYP contendo 0,625% de glicerol
e diferentes concentraes de lactose. No primeiro
set, 0,5 ml culturas foram cultivadas em 13 100 tubos mm,
fornecendo o padro, razoavelmente boa taxa de aerao;
no segundo set, as culturas de 1,5 ml foram cultivadas em
125 ml frascos Erlenmeyer, proporcionando uma taxa ainda maior
de arejamento. No primeiro set, a protena alvo foi altamente induzido
mesmo na ausncia da lactose adicionado. Na maior
segundo conjunto altamente gaseificado, pouco a induo de protena alvo
ou morte celular era evidente a 0,001% ou menos acrescentou
quantidades de lactose e apenas mnimas de protena alvo ou
morte celular eram aparentes entre 0,002 e 0,01% de lactose.
Os elevados nveis tpicos de protena alvo e substancial
morte celular observada com 0,5 ml de uma 13 100 milmetros
tubo foram produzidos apenas em 0,05% de lactose ou superior.
Claramente, quanto maior for a taxa de arejamento a mais de lactose
necessria para induzir a produo de protenas de alto nvel
auto-induo de mdia. A concentrao de 0,2% de lactose
escolhido para a mdia auto-induo parece provvel que seja elevado
o suficiente para induzir a expresso de protena alvo completa em quase
qualquer taxa de arejamento que podero ser encontrados com
sacudindo embarcaes.
A incluso de glucose nos meios de auto-induo e
expresso de protenas txicas
Trabalhadores anteriores utilizaram a lactose para induzir a expresso
de protenas-alvo em cepas de expresso T7 em fermentadores,
adio de lactose aps a glucose foi empobrecido [30]
ou usando uma fermentao descontinua com alimentao, com misturas de lactose
e glucose, o que pareceu proporcionar taxas mais baixas
de induo e uma melhor solubilidade da protena alvo
[31]. No entanto, em testes se misturas de glucose
e lactose poderia produzir taxas de produo de intermedirios
em meios de auto-induo, foi claro que a presena
de glicose completamente prevenida por induo
lactose e que a produo da protena alvo ocorrido
somente aps a glucose foi esgotado. Estas observaes esto de acordo com uma riqueza de
exibio literatura anterior
que a glucose no meio de lactose impede
induo do opero lac [16-20].
Como a glicose tanto evita lactose de induzir
a expresso da protena alvo e, preferencialmente, metabolizado
durante o crescimento, eu esperava que simplesmente ajustando
a concentrao de glicose em meios contendo um
induzindo a concentrao de lactose pode permitir a auto-induo
em qualquer densidade desejada para um crescimento activo
a cultura. No entanto, a concluso de que os aminocidos e oxignio
modular o nvel de induo de protenas alvo lactose
significava que afinar a densidade da cultura em
que auto-induo ocorreu no foi simples,
particularmente em rich media. Mdia contendo amino
cidos e lactose, mas sem glicose frequentemente apresentaram uma relativamente
retardar a produo de protenas-alvo bem antes de um rpido,
induo de alto nvel, que coincidiu com a desacelerao
crescimento devido limitao de oxignio. No entanto, a presena
de glucose sempre fortemente impedida produo de destino
protena. Portanto, uma boa abordagem parece ser
para incluir glicose em meios de auto-induo a uma concentrao
que no iria ser esgotado at a cultura
tinha crescido a densidade moderada, de preferncia imediatamente antes
a depleo de oxignio que parece provocar alto nvel
a produo de protenas-alvo. Os efeitos de diferentes concentraes
de glicose no nvel da protena alvo acumulada
foram testados em diferentes totalmente definido e
meios complexos, em culturas de 0,5 ml padro em 13 100
tubos, em cursos de tempo com maiores volumes de cultura,
e em diferentes nveis de aerao. A concentrao de glucose
de 0,05% parece ser eficaz durante um intervalo de condies
e foi selecionado para incluso no autoinducing
mdia dadas na Tabela 1.


Uma questo importante saber se a presena de
0,05% de glucose impede completamente a lactose de aumentar
o nvel basal de protena alvo nos estgios iniciais de
o crescimento em meios de auto-induo. Quando as protenas alvo
so altamente txicos para a clula, at mesmo um pequeno aumento na basal
expresso mais que mantida em meios no induzindo
pode ter um efeito significativo sobre a capacidade de uma expresso
estirpe para crescer e manter os plasmdeos at indutveis
auto-induo ocorre. Este foi testado com
Os clones capazes de expressar o gene de T7 5,3 e 7,7, protenas
cujas funes so desconhecidas, mas que so
altamente txico para BL21 (DE3) e de difcil manuteno
e expressar [3,4]. Certos clones de plasmdeo capaz de
7.7 expressando protenas eram txicas o suficiente para que
BL21 (DE3) no foram obtidos transformantes em ZYB
placas, que tinha actividade indutora, mas eles foram obtidos
em placas PAG totalmente definidos, que carecem de induo
actividade. Estas estirpes de expresso foram estavelmente mantido
em PG e MDG mdia no-induo, e poderia ser
cresceu e auto-induzida em PA-5052, ZYP-5052, e
Mdia ZYM-5052 para produzir uma forte banda dupla na
a posio aproximada esperado para a protena em 7,7
padres eletroforticos de protenas celulares totais.
A protena 5.3 ainda mais txico para BL21 (DE3), e
Os clones capazes de expressar o que poderia ser obtido apenas em
Os vectores especificamente modificado para aceitar e expressar altamente
protenas txicas (a ser descrito em outro lugar). Mais uma vez, estes
estirpes de expresso foram estveis em meios no induzindo
e podem ser cultivadas e induzidas em meios de auto-induo.
Auto-induo da ativa 5.3 protena causou a cultura
para parar o aumento da densidade alm A600? 0,5 a
1,5, presumivelmente devido ao efeito txico do alvo
protena no host. A protena mutante de 5,3 com uma nica substituio de aminocido
produzido um relativamente forte
banda na posio aproximada esperado para 5,3 protena
em padres eletroforticos de protenas celulares totais.
No entanto, de tipo selvagem 5.3 protena no foi detectado, presumivelmente
porque a sntese proteica interrompida antes suficiente
5.3 protena acumulada para se tornar visvel ao longo
o fundo. Claramente, a expresso basal de protena alvo
em meios de auto-induo, contendo 0,05% de glucose
baixo o suficiente nos estgios iniciais de crescimento que as cepas
capaz de expressar protenas alvo que so altamente
txico para BL21 (DE3) podem ser cultivadas e a protena alvo expresso
em meios de auto-induo.
-Auto induo amplamente aplicvel e geralmente superior
a induo com IPTG para a produo de protenas
-Induo Auto mais conveniente do que a induo IPTG
porque a estirpe de expresso simplesmente inoculados
em meio de auto-induo e crescer at saturao
sem a necessidade de seguir o crescimento da cultura e adicionar indutor
no momento adequado. Alm disso, a densidade da cultura
e a concentrao de protena alvo por volume de cultura
normalmente so consideravelmente mais elevados do que o que tinha sido
obteno por induo IPTG. Portanto, mesmo que o
fenmeno de auto-induo estava sendo explorado e
media estavam sendo otimizado, auto-induo estava sendo
aplicada com grande xito para a produo de protenas
de interesse para ns e para os colegas em nosso departamento.
No entanto, uma comparao mais sistemtica e mais ampla
de auto-induo e induo com IPTG foi realizada.
Na mo eram cepas de expresso para a primeira centena
ou protenas de levedura de modo seleccionado para a genmica estrutural
projeto piloto. As sequncias de codificao foram clonadas no
pET-13a ou pET-28b, ambos transcrever o alvo
a partir de um promotor T7lac. O anfitrio expresso era
B834 (DE3), com ou sem o plasmdeo RIL que fornecimentos
tRNAs para cdons raramente utilizados por E. coli. a presena
de RIL aumentou substancialmente a produo de
vrias das protenas alvo de levedura e no diminuir
a produo de qualquer. Todos estes clones j tinha
foram testadas para a expresso de protenas e solubilidade alvo
por induo de IPTG convencional em M9ZYB em
ambos com 37 e 20 C.
No total, 72 dos clones de levedura foram testados quanto expresso
e solubilidade da protena alvo por auto-induo,
a maioria deles em ambos os 37 e 20 C, e o
os resultados foram comparados com as indues IPTG anteriores.
Durante 14 clones, IPTG e auto-induo foram
directamente comparados na mesma experincia. Em geral,
o nvel de expresso por A600 de densidade da cultura e
a solubilidade de protenas alvo parecia ser comparvel
se a expresso foi induzida pela adio de IPTG ou
pela auto-induo. As culturas de auto-induzido tipicamente
tinham uma densidade consideravelmente mais elevados e, portanto, tambm
tinham concentraes consideravelmente mais elevadas de protena alvo
por mililitro de cultura.

A incubao continuou de culturas de auto-induzido para
vrias horas aps a induo completa geralmente parecia
pouco efeito sobre a solubilidade ou o nvel de protena alvo por
A600 de densidade da cultura, a cultura foi se numa
meio onde a densidade manteve-se constante ou continuada
para aumentar lentamente aps a induo completa. esta estabilidade
de culturas de auto-induzido ou a saturao perto, juntamente
com relativa uniformidade das culturas de inoculao
crescer at saturao em meio no-induo, torna
conveniente para rastrear muitas estirpes em paralelo para expresso
e solubilidade (ou maiores culturas de purificao)
simplesmente atravs da incubao de diluies de 1000 vezes durante a noite a
37 C, ou um pouco mais longo, a 20 C. Culturas induzidas com IPTG,
Por outro lado, foram recolhidos normalmente 3 h depois
induo a 37 C para evitar o crescimento excessivo por improdutivo
clulas. Ocasionalmente, a incubao continuou durante muitos
horas a 37 C reduziu a solubilidade aparente do alvo
protena numa cultura induzida com IPTG ou auto-induzido
ou ambos. Nos raros casos em que tal comportamento foi observado,
a protena alvo apareceu solvel em paralelo
20? Induo C.
importante notar que a auto-induo e saturao
ocorrem frequentemente consideravelmente mais elevada em densidade
20 C do que a 37 C (talvez devido maior solubilidade
de oxignio a uma temperatura inferior). maior saturao
combinada com densidades de crescimento mais lento em 20? meio C
que as culturas podem ser bastante denso, aps incubao durante a noite
mas ainda no ser induzida, de modo que deve ser tomado cuidado para no
recolher as culturas de baixa temperatura, antes de ter saturado.
O tempo de incubao pode ser encurtado atravs da incubao
a 37 C durante algumas horas, at que as culturas se tornam
levemente turva, e em seguida, transferir a 20 C por auto-induo.
Auto-induo tornou-se o procedimento padro
no nosso laboratrio para testes de expresso e solubilidade
de protenas produzidas por estirpes de expresso de T7 e para
produo de protenas-alvo em grandes quantidades para a purificao.
Induo IPTG raramente ou nunca mais usado.
Vrias protenas de levedura foram produzidos por auto-induo
e purificado para uma possvel a determinao da estrutura.
Trs que proporcionou cristais apropriados para a determinao da estrutura
foram rotuladas com SeMet por auto-induo (como
estruturas descritas na prxima seo) e produziram
(P35, PDB 1TXN; P89, PDB 1NJR e P96, PDB
1NKQ), assim como a protena SSAT humana (atravs
colaborao com J. Flanagan e M. Bewley).
Dax Fu deste departamento (comunicao pessoal
e [32]) revelou que o aumento da auto-induo
os rendimentos de cinco membrana integral bacteriana diferente
protenas de cerca de 10 vezes sobre a induo de IPTG anterior,
a cerca de 30-50 mg / l. At agora, ele tem
determinada a estrutura de um deles. receitas
e protocolos de auto-induo foram distribudos
para muitos outros laboratrios, incluindo estrutural
centros de genmica, e esto provando ser altamente
bem sucedida.

-Induo Auto para marcar protenas com SeMet para
cristalografia
Marcar protenas com SeMet um padro e til
maneira de obter as fases de determinao da estrutura
por cristalografia de raios X [33]. Auto-induo parecia
promissora como uma forma de produzir SeMet alvo marcado
protenas de forma simples e eficiente. Esperando que a metionina
requerendo hospedeira seria necessria para a incorporao eficiente
de SeMet, eu comecei com B834 (DE3), que
tinha uma exigncia de metionina gentipo desconhecido
[10]. No entanto, descobriu-se que a rotulagem SeMet
igualmente eficiente em BL21 (DE3).
A concentrao de metionina necessria para o crescimento
e auto-induo de B834 (DE3) RIL / P21 foi testado em
uma auto-induo de meio completamente definido para comparvel
PA-5052. Culturas cresceu taxa normal at o
metionina foi empobrecido, quando a densidade da cultura
abruptamente interrompido aumentando. Concentraes iguais
ou maior do que 100? lg / ml de metionina foram saturando
para o crescimento de A600? 10,6. A produo da protena alvo
no foi aparente em concentraes de metionina menos
do que? 40 lg / ml (onde a densidade parado de aumentar a
A600? 3,8) mas aumentaram com a concentrao de metionina
at que a quantidade mxima de protena alvo por A600
foi alcanado em aproximadamente 90 lg / ml. Tal como para o complexo
componentes, NZ-amina fornecido quantidades saturantes de
metionina mas extrato de levedura no. Crescimento em YP-
5052 parou no A600? 3.9 sem induo da meta
protena, equivalente a 40 lg / ml de metionina?; alm
de 100 lg / ml de metionina ao meio permitido
saturao em A600? 9,5 com uma induo completa. a concentrao
de metionina nesta srie de extracto de levedura,
embora no o suficiente para apoiar a boa auto-induo,
provavelmente muito alto para torn-lo um complemento til no
media auto-induo para marcao com SeMet.
Crescimento e de auto-induo de SeMet estimulada pela
metionina
B834 (DE3) que expressa a protena de levedura P07 alvo,
que j havia sido marcado com SeMet no
processo de determinao de estrutura [13], foi utilizado para testar
o potencial de marcao com SeMet na auto-induo
meios comparveis PA-5052. A substituio total do
metionina por SeMet no foi eficaz: concentraes SeMet
de 50 ou 100 lg / ml crescimento suportado relativamente
fracamente, a A600 de menos do que 2, com a ausncia de induo de destino
protena, e 150 e 200 lg / ml crescimento totalmente evitadas.
Para testar se pequenas quantidades de metionina
pode atenuar os efeitos txicos de SeMet, crescimento e
auto-induo foram testados em PA-5052 contendo 5-
30 lg / ml metionina mais 50-200 lg / ml SeMet. de fato,
culturas contendo at 150 lg / ml SeMet atingido
A600? Para 5? 8 (bastante mais elevado do que com
ou a metionina ou SeMet sozinho) e induzida grande
quantidades de protena alvo. No entanto, os efeitos txicos de 200 lg / ml SeMet superou at
30 lg / mL de metionina,
reduzir a densidade de saturao para A600? 1,9 e impedindo
auto-induo. Ambos SeMet e metionina
parecem ser utilizado em todas as fases de crescimento, porque o crescimento
taxa de 30 lg / ml de metionina foi reduzida pela presena
de 100 lg / ml SeMet, e a curva de crescimento no parecia
tem uma descontinuidade que pode indicar uma forte preferencial
usar de metionina, at esgotamento. o estimulador
efeito de metionina no crescimento e na auto-induo
100 lg / ml SeMet foi comparvel entre 10 e
30 lg / ml metionina, mas foi significativamente diminuda
em 5 lg / ml.
Estes resultados sugerem que a auto-induo pode
produzir protena alvo com a substituio de mais de 90%
de metionina por SeMet, se a metionina necessrio
estimular o crescimento e auto-induo poderia ser inferior a
10% da quantidade de SeMet no meio. Para testar o
nvel de incorporao de SeMet na protena alvo, 100-
culturas ml de B834 (DE3) expressando sua marcada com P07
foram cultivadas num meio definido comparveis a PA-5052,
contendo 200 ou lg / ml de metionina ou 10 lg / ml
metionina e 100 lg / ml SeMet. As culturas saturado
no A600? 8,8 e 6,7 e rendeu 2,8 e 1,9 mg
de protena purificada P07, respectivamente. A espectroscopia de massa
determinado que a protena P07 do SeMet contendo-
cultura foi mais do que 90% marcado com SeMet.
Alvo levedura protena P89 era apenas parcialmente solvel
mas havia sido purificada a partir de culturas de auto-induzida e
cristalizado, por isso foi um bom candidato para a rotulagem SeMet
pela auto-induo. No entanto, o teste de cultura de 0,5 ml
no meio utilizado para SeMet rotulagem de P07 produzido
em vez de pequenas quantidades de P89 solvel. Na tentativa de
melhorar o rendimento, a diferentes concentraes de metionina
e SeMet foram julgados juntamente com diferentes concentraes
dos outros 17 aminocidos, mais uma mistura de
9 vitaminas. Curiosamente, as vitaminas no teve nenhum efeito na
Se PA-5052, mas aumentou significativamente tanto a saturao
densidade e nvel de P89 produzido pela auto-induo
na presena de SeMet. Testes do indivduo
vitaminas demonstraram que a vitamina B12 foi a nica
necessria para a estimulao: a mistura dos outros 8 vitaminas
desde que nenhum estmulo. To pouco como 3 nM vitamina
B12 foi suficiente para proporcionar a estimulao mxima.
Crescimento e auto-induo do B834 (DE3) RIL / P89 em
400 ml PASM-5052 (o qual contm metionina 10 lg / ml,
125 lg / ml SeMet, e 100 nM de vitamina B12) produzido
4 mg de protena purificada, SeMet suficientes para
faseamento e estrutura determinao [14].
B834 um mutante METE
Em experincias de controlo, verificou-se que o
presena de vitamina B12 no meio permite que o normal
crescimento de B834 (DE3), na ausncia de metionina. este
resultado inesperado demonstra que a deficincia de metionina
de B834 devido a uma mutao no METE, que especifica
a metilase homocistena vitamina B12-independentes de E. coli, o qual catalisa o ltimo passo
da metionina
sntese [34]. (Os relatrios anteriores [35,36], que um B834
metB mutante no forneceu dados de apoio e deve
estar incorrecto.) de E. coli tambm contm uma vitamina B12-dependente
methylase homocistena, especificado por metanfetamina. No entanto,
uma vez que a E. coli no capaz de sintetizar vitamina
B12, esta enzima ativa somente quando a vitamina B12 est presente
no meio de crescimento. As concentraes de vitamina
B12 maior do que? 0.75 nM mxima permitida crescimento
e auto-induo do B834 (DE3) RIL / P21 na PA-5052
sem metionina.
A descoberta de que o B834 um mutante sugere um Mete
possvel explicao para a estimulao do crescimento e
auto-induo por vitamina B12, na presena, mas no
a ausncia de SeMet. A presena de metionina em
o meio de crescimento reprime a sntese de toda a
enzimas especfico para a sntese de metionina, excepto para
a enzima metanfetamina [34]. SeMet parece provvel que tenha o
mesmo efeito, uma vez que a sua presena no meio de crescimento
inibe o crescimento de BL21 (DE3) e B834 (DE3) para
aproximadamente o mesmo grau, embora a BL21 (DE3) seria
Ser competente para sintetizar metionina. um
importante papel para a metionina a incorporao
S-adenosilmetionina, um doador de metilo, em que as reaces
gerar S-adenosilhomocisteina como um produto, que
em ltima anlise, a homocistena metabolizado [37]. desde
metionina no txico, concentraes no crescimento
meio pode ser feita sempre alto o suficiente para suprir todas
das necessidades de metionina sem reciclagem de homocistena.
No entanto, para as concentraes em que pode SeMet
ser tolerada no meio de crescimento, uma frao substancial
pode vir a acabar em Se-homocistena, e
o restante SeMet pode ser insuficiente para a continuao
o crescimento e a sntese de protenas alvo. o estimulador
efeito da vitamina B12 pode ser devida sua activao do
Meth methyltransferase homocistena, que regenera
SeMet de Se-homocistena. Se esta interpretao
est correto, vitamina B12 tambm pode ser esperado para estimular
crescimento e da auto-induo de protenas-alvo em
Transformou-se BL21 (DE3) que cresce na presena de SeMet. alguns
estimulao da protena alvo pela presena de vitamina
B12 em PASM-5052 foi evidente em um teste com
Transformou-se BL21 (DE3) P19 mas no num segundo teste. vitamina B12
est includo na PASM-5052 a uma concentrao de 100 nM.
Rotulagem SeMet em BL21 (DE3)
A substituio de SeMet eficiente para metionina em
B834 (DE3) na presena de vitamina B12 reforado a
concluso de que a combinao de 10 lg / ml de metionina
e 125 lg / ml SeMet em PASM-5052 deve reprimir a
sntese endgena de metionina. Portanto, SeMet
rotulagem por auto-induo em BL21 (DE3), o que faz
no necessitam de metionina para o crescimento, deve ser to eficiente
como em B834 (DE3). Na verdade, auto-induo de humano
espermidina / espermina-acetil-transferase (SSAT) em
PASM-5052 produzida maior do que 90% de substituio de SeMet para se produzido a partir
de metionina
B834 (DE3) RIL ou BL21-Gold (DE3) RIL. Assim, o alvo
protenas podem ser eficientemente marcada com SeMet por autoinduo
em BL21 (DE3), e a utilizao de B834 (DE3)
no necessrio.
Generalidade de rotulagem SeMet
Para explorar a utilidade geral de auto-induo para
SeMet rotulagem, a produo e solubilidade de protenas alvo
em PASM-5052 em relao ao ZYP-5052 e PA-5052
foram testados por 10 protenas diferentes expressos em levedura
B834 (DE3) RIL pela auto-induo de culturas cultivadas
a partir de diluies de 1000 vezes, tanto a 37 e 20 C. (Neste
set, PASM-5052 continha 100 lg / ml SeMet.) Todos
a 37? culturas C pareceu ser saturado e foram
amostrados para eletroforese em gel depois de uma noite
incubao de 14 h. Os 20? Culturas em C-5052 ZYP
e foram amostrados PA-5052, aps 22 h, mas SeMet aparece
para inibir o crescimento muito mais fortemente a 20? C
do que a 37 C, e a 20? culturas C PASM-5052 foram
no amostrados at 65 horas e novamente s 85 h. Todos menos um
destas protenas alvo 10 pareceu ser produzido
to bem e tm solubilidade comparvel
PASM-5052 como nos outros dois meios de comunicao em ambas as temperaturas.
Estes resultados indicam que a auto-induo de
PASM-5052 deve ser geralmente til para rotulagem SeMet
de protenas alvo.
Uma concentrao de SeMet 125 lg / ml foi escolhido para
Meio PASM-5052, porque parece suficiente, mas
no muito superior ao montante necessrio para o suporte
crescimento e de auto-induo, na presena de 10 lg / ml
metionina e 100 nM de vitamina B12. As culturas cultivadas
em concentraes significativamente mais elevadas de SeMet tendiam
para se tornar uma cor marrom alaranjada na incubao prolongada
a saturao. O rendimento dos poucos SeMet marcado
protenas que foram produzidas por auto-induo de PASM-
5052 para a determinao da estrutura foi comparvel
para a produo das protenas no marcadas.
Auto-induo de protenas de etiquetagem com 15N e 13C para
NMR
Determinao de estruturas de protenas por RMN requer
quantidades substanciais de protena marcada com 15N ou 13C.
Auto-induo em meio mnimo totalmente definido potencialmente
muito eficientes na incorporao de rtulos isotpicos em
a protena alvo. Protenas-alvo pode ser uniformemente marcado
com 15N utilizando simplesmente marcada com 15N (NH4) 2SO4 em P
5052 ou de NH 4 Cl em N-5052 ou LS-5052. Auto-induo
com uma protena alvo bem expressa quase esgotar
o io de amnio 50 mM em estes meios, de modo que o uso de
istopo dever ser muito eficiente. Reduo abaixo de cerca
25 mM de amnio reduz significativamente a quantidade
protena alvo de bem-expresso obtido.
O glicerol pode ser utilizado como uma fonte de 13C para rotulagem
alvejar protenas produzidas por auto-induo. A glicose, a fonte mais econmica, no pode
ser utilizado porque
impede auto-induo. Felizmente, 13C glicerol relativamente
econmico e, sem dvida, se tornaria
mais barato se o uso aumentado. A glicose na auto-induo
mdio ter sido esgotadas pelo destino tempo
sntese da protena inicia, mas o metabolismo a lactose
necessria para a auto-induo e alguns de carbono a partir de lactose
provvel que esteja disponvel para incorporao em alvo
protena, pelo menos nas fases iniciais da sntese. a
media auto-induo de costume conter 0,2% de lactose e
0,5% de glicerol, a concentrao mxima escolhida para assegurar
produo de protena alvo mesmo com as maiores taxas de
aerao e fazer com que seja improvvel que a cultura vai
irreversivelmente cido mesmo com taxas relativamente baixas de aerao.
Para a etiquetagem de 13C eficiente de protena alvo, o fluxo de
carbono a partir de glicerol em protena alvo deve ser maximizada
e o fluxo a partir da lactose minimizada.
Como discutido na seo Efeito da aerao sobre
temporizao e nvel de auto-induo de protena alvo,
a concentrao de lactose necessria para induo mxima
de protena alvo diminui com a diminuio da taxa de
arejamento. Utilizando um meio mnimo contendo
Fosfato 100 mM para o bem buffering, auto-induo
de protena da cpside de T7 foi seguido como uma funo de
a diminuio da concentrao de lactose para as diferentes taxas
de arejamento fornecida por diferentes volumes de cultura
em 13 100 tubos mm. Concentraes crescentes de
glicerol tambm foram testados. Com base nesses testes, o
auto-induo de meio C-750.501 (Tabela 1) deve fornecer
boa etiquetagem 13C da protena alvo a partir de glicerol.
Este meio contm 0,75% de glicerol e 0,01% de lactose,
assim quase todo o carbono que entra protena alvo
deve ser derivado de glicerol. Induo de alta nvel
Obteve-se a uma taxa de arejamento de 0,75 ml entregue
culturas em 13 100 ml tubos, a aerao um pouco menor
taxa do que com o padro de 0,5 ml por tubo. induzida
culturas saturado a A600? 10 em menos de 24 h
a 37 C com um pH geralmente acima de 6,0. estas condies
parece provvel para escalar a cerca de 200-400 ml de cultura
em um frasco de Erlenmeyer de 1 L unbaffled ou talvez
tanto quanto um L em 1,8 L perplexo frasco Fernbach. desde
nosso projeto de genmica estrutural no envolve
NMR, eu no testei se a eficincia de 13C
rotulagem nesta forma adequado para a determinao da estrutura.
No entanto, a receita foi distribuda para
vrios grupos de RMN na esperana de que ele vai ser til.
Um ensaio de incorporao de 13C em funo da concentrao de lactose
pode encontrar concentraes de lactose que maiores
e maiores taxas de aerao tambm fornecer satisfatria
rotulagem.
Auto-induo com arabinose
Os sistemas de expresso em que a transcrio controlada
pelo promotor pBAD do opero de arabinose
tem relativamente uma expresso basal baixa, o que pode torn-los teis para a manuteno e
expresso de genes txicos
[38,39]. A protena AraC regula o promotor pBAD
tanto positiva como negativamente, e de expresso basal
ainda mais reduzida na presena de glicose.
A expresso a partir do promotor induzida por pBAD
arabinose e modulado pela represso catablica. no
menos, dois grupos relataram em sistemas de expresso
que a sequncia de ARN-polimerase T7 foi
colocado sob o controlo do promotor pBAD [40,41],
e Invitrogen comercializa BL21-AI, em que o pBAD
promotor pode expressar a ARN-polimerase de T7 a partir do
cromossoma de BL21. Expresso basal de ARN de T7
polimerase do promotor pBAD em BL21-AI esperado
para ser mais baixa do que a partir do promotor lacUV5
em BL21 (DE3), o que provavelmente intrinsecamente permevel porque
actividade b-galactosidase necessria para converter a lactose
para allolactose, o indutor natural lactose
opero [42]. Portanto, os clones que expressam altamente txico
protenas-alvo a partir de um promotor de T7 pode ser mantida
e expressa mais facilmente em BL21-AI do que em
Transformou-se BL21 (DE3). De facto, vrios clones capazes de expressar
o altamente txico gene T7 5,3 protena que no podia
ser estabelecida em BL21 (DE3) foram prontamente estabelecida
em BL21-AI.
Quando a transcrio do gene alvo a partir de um T7lac
promotor, como nos clones de expresso que est a utilizar, cheia
expresso requer tanto a induo da polimerase de ARN T7
e libertar do repressor lac a partir do seu local de ligao no
T7lac promotor. Em BL21 (DE3), ambos os eventos so desencadeados
pela libertao do repressor lac, que convencionalmente
induzido por IPTG ou auto-induzida pela presena de
lactose no meio. A combinao de expresso T7
Polimerase de ARN a partir de um promotor pBAD no cromossoma
e o gene alvo a partir do promotor T7lac
em um multi-cpia plasmdeo fornece controle suficiente para que
auto-induo da produo de protenas-alvo vivel
em BL21-AI. Auto-induo da protena da cpside T7 em
BL21-AI em ZYM-5052 e 0,05% de L-arabinose mostrou
protena da cpside dificilmente detectvel no A600? 2,7, um distinto
banda que aumentou de forma constante a nveis elevados entre A600
? 4 e? 10, e uma quantidade aproximadamente constante
por A600 durante a continuao do aumento da densidade de cultura para
A600? 26 (Fig. 1E). Auto-induo do gene T7 txico
5.3 protena parou o crescimento no A600? 1.7 5.3 sem protena
aparente nos padres de gel, de acordo com os resultados obtidos
em BL21 (DE3). A presena de 0,05% de glucose em
a forma de auto-induo foi necessrio para permitir
crescimento do clone de 5,3 na presena de 0,05% de arabinose,
e o crescimento foi quase to rpida como na ausncia
de arabinose. Aparentemente, necessria a presena de glicose
e suficiente para evitar a induo significativa pela
arabinose em BL21-AI nos estgios iniciais de crescimento em
a forma de auto-induo. Em contraste com os resultados obtidos
em BL21 (DE3), a protena do gene de T7 7,7 no foi
aparente acima do fundo sobre a auto-induo
em BL21-AI.

As concentraes de L-arabinose entre 0,01 e 0,5%
todos induzida expresso de alto nvel da protena da cpside de T7
em ZYM-5052 (o qual contm lactose para induzir
desobstruo do promotor T7lac). protena da cpside
era detectvel na presena de arabinose e ausncia
de lactose, mas muito menos do que foi produzido na presena
de ambos, proporcionando uma medida de quo eficazmente
ligado lac repressor bloqueia a transcrio a partir do
T7lac promotor (a ser descrito em outro lugar).
Para obter uma comparao mais ampla de auto-induo em
BL21 (DE3) e BL21-AI, 42 clones diferentes de levedura
sequncias codificantes sob o controlo do promotor T7lac,
que eram conhecidos por ser bem expressa em BL21 (DE3)
RIL, tambm foram colocados em BL21-AI / RIL. em paralelo
tubos, os clones de clulas BL21 (DE3) RIL foram auto-induzida em
ZYM-5052 e os clones BL21-AI / EIR foram induzidas por auto
em ZYM-5052 contendo 0,05% de L-arabinose. nveis
de protena alvo foram geralmente comparveis nos dois
hospedeiros, embora alguns clones pareciam ser expressa a
um nvel ligeiramente mais elevado ou seja ligeiramente mais solvel numa
hospedar ou outro. Se estas diferenas representam
variao experimental ou so mais significativas no tem
sido explorado. No entanto, claro que a auto-induo
a partir dos promotores e pBAD T7lac geralmente eficaz
para a produo de protenas-alvo em BL21-AI.
Outros meios de crescimento
Culturas de alta densidade para a preparao de plasmdeos
As condies de cultura de alta densidade desenvolvidos para
auto-induo, tambm so convenientes para a preparao de
DNAs de plasmdeo. Rich media, tais como suporte ZYM-505
crescimento das estirpes com plasmdeos que trabalhamos com
densidades de cultura de A600? 10 ou superior quando 1.5-
2,5 ml de cultura desenvolvida num tubo de 18 150 milmetros agitado
a 300-350 rpm. A lactose omitido, a menos que de auto-induo
desejado. A presena de 0,05% de glucose, assegura
crescimento inicial rpida com pequeno atraso. Normalmente, os rendimentos de
DNA de plasmdeo foram vrias vezes maior do que o obtido
em meios utilizados anteriormente com esta finalidade, e
um nico tubo de microcentrfuga de 1,5 ml, mais geralmente fornece
DNA de plasmdeo do que o necessrio para a maioria dos propsitos. adequado
aerao garante crescimento a altas densidades, mas ainda moderada
aerao d altos rendimentos. John Dunn desta
departamento (comunicao pessoal) usar auto-induo
mdia para obter altos rendimentos de um plasmdeo de cpia nica
que transporta uma origem de replicao induzvel sob
controlo de um promotor lac.
Mdia complexas utilizadas normalmente podem ser deficientes em
magnsio
Como este artigo estava sendo escrito, pensei para comparar
densidades de cultura obtidos em ZYM-505 com timo caldo (TRB) e 2 YT, rich media
comumente utilizado para
colheitas de elevada densidade para a preparao de ADN de plasmdeo [15].
Todos os trs meios de conter uma digesto enzimtica da casena
mais de extracto de levedura, mas em diferentes concentraes:
2 YT contm 16 g de triptona, 10 g de extracto de levedura, e
5 g de NaCl / L, enquanto TRB contm 12 g de triptona e
24 g de extracto de levedura, 89 mM de fosfato de glicerol e 4 ml
(= 0,5% w / v) por litro. TRB tem vrios dos mesmos componentes
como ZYM-505, mas numa concentrao significativamente mais elevada
de extracto de levedura. Tendo anteriormente que
ZY era deficiente em magnsio, eu testei 2 YT e
TRB como descrito e contendo tambm 2 mM de MgSO4.
Os resultados so mostrados na Tabela 10.
O resultado mais surpreendente foi a de que a adio de magnsio
para TRB feita a partir de um produto comercial (Gibco / BRL)
aumento da densidade da cultura a partir de A600? 3,6 a? 18,6.
A estimulao da adio de magnsio de 2 YT
(feita a partir de nossos prprios barris de NZ-amina e extrato de levedura)
no foi to grande, passando de A600? 5,7 a
? 8.3. A diferena indica que a N-Z amina e
extrato de levedura, provavelmente, tinham nveis mais elevados de magnsio
do que os lotes utilizados para fazer o produto de Gibco / BRL,
e, de facto, TRB feito dos seus componentes produzidos
um A600 consideravelmente maior? 12,5, aumentando para? 18,1
com magnsio adicionado. Titulao do TRB de Gibco /
BRL indicou que MgSO4 0,5 mM foi suficiente para
saturar o requisito de crescimento. Estes resultados confirmam
que digere enzimticos de casena ou de extrato de levedura so
susceptvel de ser deficiente em magnsio necessria para o mximo
crescimento (em graus diferentes em lotes diferentes), e que 1-
2 mM de io de magnsio deve ser adicionado ao meio complexo
feitos com estes componentes para garantir a mxima
crescimento.
Os 50% mais elevada densidade de saturao em TRB + magnsio
(A600? 18.5) em relao ZYM-505 (A600? 12) devido
o maior do que 2 vezes maior concentrao de complexo
componentes em TRB. Um aumento semelhante podia ser alcanado
mais economicamente atravs do aumento da concentrao de glicerol
de ZYM-505, talvez equilibrar o pH pela adio de succinato
ou um grupo amino de baixo custo e bem metabolizada
cido tal como aspartato ou glutamato.



ISCUSS
O fenmeno da induo involuntria foi espordica,
sendo encontrada em alguns lotes de meios complexos, mas
no outros [6]. Alm disso, diferentes pores do
mesma cultura pode produzir amplamente diferentes nveis de
a protena alvo, dependendo da taxa de arejamento (Tabela
8). A percepo de que a lactose responsvel por no intencional
induo, foi possvel desenvolver no induzindo
media em que as estirpes de expresso T7 permanecer
estvel e vivel todo o caminho at saturao, e fivel
meios de auto-induo que produzem de alta densidade, fullyinduced
culturas completamente autnoma. Este foi um
processo iterativo, factores que limitam o crescimento de endereamento
a alta densidade em modo de lote, afetam a viabilidade ou
a estabilidade de estirpes de expresso, ou influenciar o nvel de
a produo de protenas-alvo. Curiosamente, a falta de
magnsio limita o crescimento nos lotes tpicos de tradicional
rich media, tais como caldo de triptona ou LB (e mais recente
mdia, como excelente caldo). Com uma quantidade suficiente de
nutrientes, os principais fatores limitantes tornou manuteno
de um pH prximo do neutro e a disponibilidade de oxignio
medida que a cultura se torna denso o suficiente para que a taxa
de arejamento se torna limitativo. Os meios apresentados na Tabela
1 foram formulados para dar no induzidas fivel
culturas e boa auto-induo atravs de uma variedade de condies.
Atualmente usamos MDG como a no-induo
mdio para o cultivo de culturas para as aes do congelador ou
aes, placas MDAG trabalhando para selecionar linhagens que
expressar protenas alvo altamente txicos, ZYM-5052 para
auto-induo, e ZYM-505 para o cultivo de alta densidade
culturas para preparao de plasmdeos.
A descoberta surpreendente de que a elevada concentrao de fosfato
em rich media oferece resistncia substancial
canamicina levou formulao de fosfato de baixa
mdia em que o equilbrio metablico mantm
o pH do meio prximo do neutro. O crescimento em glicose
ou glicerol produz cido enquanto o crescimento em amino
cidos ou intermedirios do ciclo do cido tricarboxlico, como
succinato, fumarato, malato ou citrato aumenta a
pH. Embora, a presena de limites de glicose ou de glicerol
o catabolismo destes outro carbono e energia
fontes [16-21], misturas adequadas podem suportar
crescimento a altas densidades com excurses apenas moderados
para pH cido seguido de saturao ou prorrogado
crescimento lento prximo de pH neutro. Ao aumentar o
As concentraes de glicerol e de aminocidos bem acima
os indicados na Tabela 1, a auto-induo de bem-expressa
protenas-alvo tem produzido densidades de cultura
de A600> 50 em tremendo batelada, comparvel
o que tem sido relatada em um fermentador de [31]. potencialmente,
auto-induo poderia produzir protenas economicamente em
uma escala comercial, como culturas de alta densidade totalmente induzido
para a protena alvo pode ser obtido sem complexo
controles de processos em mdia feito inteiramente de
componentes de baixo custo, tais como sais minerais e misturas de glucose, glicerol, lactose, e
suplementados
com fumarato, succinato ou glutamato.
-Auto induo depende de mecanismos bactrias usam
para regular o uso de fontes atuais de carbono e energia
no meio de crescimento. Se a glicose est presente, catabolito
represso e excluso indutor impedir a absoro de
lactose por permease lactose, o produto de Lacy,
pensado para ser o nico meio de absoro de lactose em
clulas do tipo selvagem [16-20]. Quando a glucose se esgota, a lactose
pode ser tomada por uma pequena quantidade de Lacy presente em
As clulas no induzidas e convertido para allolactose, o singular
indutor, por b-galactosidase, o produto de lacZ [42,43].
Assim, a induo do opero lac por lactose deve exigir
a presena de, pelo menos, uma pequena quantidade de lactose
permease e b-galactosidase nas clulas no induzidas, e
auto-induo no deve ser eficaz com as estirpes que
falta de qualquer uma destas atividades. Contrariamente a esta expectativa,
Grossman et ai. [6] observada expresso de lacZ
a partir do promotor T7lac num plasmdeo de cpias mltiplas mediante
abordagem de saturao em BL26 (DE3), um derivado de
BL21 a partir do qual o operon lac foi excludo [4].
Talvez as mudanas que ocorrem na abordagem saturao
tornar as clulas permevel a lactose por algum outro mecanismo
[6].
A presena de 0,05% de glucose em meios de auto-induo
bloqueia a induo por lactose na fase inicial de
crescimento de forma to eficaz que at mesmo cepas capazes de
expressando protenas alvo altamente txicos para a clula hospedeira
podem crescer e manter o plasmdeo funcional at induo.
Na verdade, a expresso basal pode ser baixo o suficiente para que
antibitico pode no ser necessrio na auto-induo
meio para se obter a produo de alto nvel do alvo muitos
protenas.
Contendo uma fonte de carbono e energia para alm de lactose
para suportar o crescimento contnuo e produo de destino
protena aumenta aps a induo de alto nvel
a produo de protenas-alvo de expresso T7
cepas. Polimerase de ARN T7 to activo que a induo
pode direcionar mais a transcrio e traduo para o alvo
protena [1], o que pode interferir com a induo completa
da capacidade de metabolizar a lactose para produzir energia. glicerol
no interferem com a induo de protena alvo, e
sua presena nos meios de comunicao de auto-induo mais do que duplicou
o rendimento da protena-alvo relativamente ao que foi obtido
com quantidades equivalentes de lactose como a energia primria
fonte.
Na ausncia de glicose, aminocidos parecem
modular ou prevenir a induo de protenas-alvo por lactose
nas fases iniciais de crescimento, at que o crescimento abranda medida
oxignio torna-se limitante sobre abordagem da saturao.
Mecanismos complexos alterar o metabolismo em resposta
a amino cido disponibilidade e nveis de oxignio [22,44],
mas eu no estava ciente de que eles so conhecidos para prevenir a lactose
utilizao. Serina parece ser particularmente eficaz
na preveno da induo de protenas-alvo por
lactose na fase log, mas at mesmo altas concentraes de serina no impedem a induo
como aproximar culturas
saturao. Curiosamente, serina o primeiro aminocido
para ser descarregada durante o crescimento, a mistura de amino
cidos presentes em uma digesto trptica de casena [24,25]. talvez
a capacidade de prevenir a induo est relacionada com a necessidade de
nveis mais elevados de allolactose para induzir a expresso a partir de
o promotor T7lac num plasmdeo de cpias mltiplas, porque
nveis mais elevados do que o normal de repressor lac esto presentes
para assegurar a saturao de todos os stios de ligao do repressor
[2,4]. Desacelerao do crescimento na limitao de oxignio pode
permitir que os nveis mais elevados de allolactose para acumular, porque
do aumento da absoro de lactose do meio, diminuio
catabolismo de allolactose ou alguma outra mudana
que promove a induo.
Embora, desenvolvida para a expresso de protenas alvo
no sistema de expresso de T7 indutivel por IPTG, auto-induo
poderia, em princpio, ser desenvolvido para qualquer expresso
sistema em que os elementos de conduo de expresso
a protena alvo induzida por uma mudana no metabolismo
estado que provocado pelo crescimento de uma cultura. este
poderia incluir no s os promotores cujas induo
prevenida pela represso catablica ou excluso indutor
mas tambm, por exemplo, promotores activados pela abordagem
a saturao, a limitao de oxignio, ou o esgotamento de um composto
(tais como metionina), cuja via de sntese
bloqueado pela presena no meio. basta adicionar
0,05% de L-arabinose para a mdia auto-induo de Mesa
1 permite que eles sejam utilizados para a produo de protenas-alvo
em BL21-AI, em que o ARN-polimerase de T7
expresso a partir do cromossoma da arabinose induzvel
pBAD promotor. Consistente com a geral
ver que o promotor pBAD tem menor expresso basal
que o promotor lacUV5, plasmdeos expressando
protenas de bacterifago T7, que so altamente txicos para o
clula hospedeira foram mais facilmente tolerada em BL21-AI de
em BL21 (DE3). Nvel de expresso e de solubilidade
a maioria das protenas alvo testadas eram comparveis no
dois hosts.
Auto-induo provou ser til em geral para
produo de uma grande variedade de protenas, incluindo a membrana
protenas. A estabilidade e a viabilidade das culturas cultivadas em
meios no induzir torna possvel trabalhar com
muitas tenses em paralelo ao longo de um perodo de semanas. retransformao
ou listando fora culturas para uma 'nova'
colnia single, uma prtica lamentvel e tedioso em
muitos laboratrios, quase nunca necessria para reproducibly
expressando nveis elevados de protena alvo. culturas para
auto-induo so simplesmente inoculadas e crescer at saturao,
que muito mais conveniente do que IPTG
induo, e especialmente conveniente para a produo elevada
teste de muitas protenas alvo para a expresso de diferentes
e solubilidade. A cultura de alta densidades atingido pela
auto-induo produzir mais protena alvo por volume
da cultura de induo de IPTG e tambm fazer eficiente
uso de reagentes caros ao rotular com SeMet ou
istopos. Auto-induo conveniente, eficaz e econmico para a produo de protenas em
quase qualquer escala,
a partir de anlise de protenas individuais em pequenos laboratrios
a produo de muitas protenas diferentes em grandes projetos,
e, possivelmente, at mesmo para a produo de protenas em
escala comercial.
Agradecimentos
Sou grato pelo entusiasmo e peritos tcnicos
apoio dos meus colegas de trabalho e colegas. Os clones para
expressando protenas de levedura de genmica estrutural foram
construdos e testados por induo de IPTG para a expresso
e solubilidade por Sue-Ellen Gerchman, com a ajuda
nas fases posteriores de Eileen Matz, que construiu
os clones de T7 e protenas humanas. Auto-induo
e purificao de protenas normais e SeMet marcados levedura
Foi por Helen Kycia. Nancy Manning realizada
analisa eletrofortica gel inumervel de protena
expresso e solubilidade em culturas de auto-induzido.
As estruturas de protenas de levedura foram determinadas por S.
Swaminathan, S. Eswaramoorthy, e D. Kumaran.
Trabalho em SSAT humana foi realizado em colaborao com John
Flanagan, Maria Bewley, e Vito Graziano, que executou
as medies de espectroscopia de massa para determinar
nveis de substituies SeMet. O trabalho foi
suportado pelo Office of Biolgica e Ambiental
Pesquisa do Departamento de Energia dos Estados Unidos ea
Protena Estrutura Iniciativa do Instituto Nacional de
Cincias Mdicas Gerais dos Institutos Nacionais de
Sade, como parte do genoma estrutural de Nova York
Research Consortium.