LABORATORIO DE MICROBIOLOGA GENERAL

Informe N 2: Flora normal y fisiotaxonoma de bacterias Gram positivo

Autores: Viviana Vives y Claudia Iturriaga

Profesores: Matas Jofr
Nicols Villagra
Carrera: Ingeniera en Biotecnologa y Bioqumica

Curso: BIO-253

Seccin: 4

Fecha de entrega: 3/5/2011







Resumen
En el organismo humano y de muchos animales existen zonas estriles como senos nasales,
bronquios, trquea y pulmones, y zonas donde se desarrolla la flora normal del organismo, boca,
faringe, odos y nariz, entro otros. La flora normal es beneficiosa en algunos casos, pues las
actividades metablicas de algunos microorganismos pueden facilitar la digestin de productos no
atacables por los fermentos digestivos, adems de actuar como barrera defensiva impidiendo o
dificultando la colonizacin por bacterias exgenas, en especial las patgenas.
1,2
Dentro de la flora
normal se encuentra una gran variedad de bacterias Gram positivas como Staphylococcus
epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, entre otros
3
. En algunas situaciones
puntuales en que el sistema inmune est deprimido o existe una proliferacin anormal de stas
bacterias se pueden generar patologas. En este punto es importante poder aislarlas e
identificarlas para un correcto tratamiento de la infeccin.




Introduccin
Los laboratorios de microbiologa
cumplen una funcin de vital importancia
para la identificacin de bacterias, en el
caso de que se presenten algn tipo de
patologa. Para el anlisis e identificacin
de una muestra bacteriana se sigue
cierto protocolo, de manera que se
pueda obtener la informacin necesaria
para elaborar el tratamiento adecuado.
ste consta principalmente de la siembra
y obtencin de un cultivo puro, una
observacin macroscpica, microscpica
por tinciones y los procesos necesarios
para la identificacin fisiotaxonomica,
como reacciones metablicas especficas
a travs de medios de cultivo selectivos
y/o diferenciales y estudios de
sensibilidad a agentes microbianos.
En el caso de los medios de cultivo es
muy importante tener presentes las
caractersticas metablicas y/o
estructurales de las bacterias, ya que
stos permitirn clasificarlas y
diferenciarlas entre s. As la eleccin y la
interpretacin del cultivo son de vital
importancia en el momento de querer
identificar microorganismos. Un ejemplo
de esto son los medios enriquecidos que
constan de los nutrientes esenciales, mas
componentes especiales, como sangre el
Agar sangre. Otro ejemplo son los
medios diferenciales como Agar
MacConkey y Citrato de Simmons que
permiten establecer si una bacteria
desarrolla una determinada funcin
metablica o no
4
. El agar corriente y el
agar sangre son los medios de cultivo
utilizados en este practico. El agar
corriente solo nos permite el desarrollo
de bacterias con nutrientes esenciales
mientras que el agar sangre nos da
informacin de cmo es el
comportamiento hemoltico de las
bacterias ya sea produciendo una
hemolisis alfa (destruccin parcial de
eritrocitos, color verdosa), beta
(destruccin total de la colonia) o gamma
(no se produce hemolisis).
5

Para identificar ms especficamente a
una bacteria, como gnero y especie, se
deben realizar pruebas bioqumicas
como la prueba de la catalasa. En el caso
de la identificacin de bacterias Gram
positivas de la flora bacteriana normal
humana, sta prueba es crucial ya que la
familia Micrococcaceae se caracteriza
por ser catalasa positiva adems de ser
cocacceas y agruparse en staphylos
(racimos)
6
, mientras que la familia
Streptococcaceae se caracteriza por ser
catalasa negativa y agruparse en streptos
(cadenas)
7
. En el prctico adems se
realiz el test de latex como prueba de la
coagulasa, que es una enzima presente
en Staphylococcus aureus, el test de latex
para streptococcus, el test de CAMP que
identifica streptococcus con grupo
serolgico B y las pruebas de
sensibilidad a antimicrobianos o
antibiograma en la cual se siembra un
csped bacteriano y estudia in vitro el
comportamiento de los antimicrobianos
frente a la bacteria en estudio El objetivo
principal de ste prctico es identificar
mediante pruebas bioqumicas y
sensibilidad antimicrobiana cocaceas
Gram positivo de una muestra problema
y de una muestra de flora normal de la
boca.








Metodologa
En la primera parte del prctico, se
realizaron dos siembras de flora normal
obtenida de la boca de un integrante del
grupo. La segunda parte consisti en
realizar un anlisis macroscpico,
tinciones para anlisis microscpico,
pruebas bioqumicas y de sensibilidad
ante antimicrobianos para la
identificacin de una muestra problema.
La tercera parte del practico consisti en
tomar algunas colonias representativas
del cultivo de flora normal realizado en la
parte uno e identificarlo mediantes un
anlisis macroscpico, tinciones para
anlisis microscpico y pruebas
bioqumicas. Se utilizaron los siguientes
materiales: portaobjetos, agua, cristal
violeta, lugol, safranina, agar sangre, agar
corriente, agar Mueller-Hinton, trulas
estriles, asas de platino, asas de
plstico, test de ltex para coagulasa,
agua oxigenada 30%, discos de
antibitico, papel milimetrado, pinzas,
mechero Bunsen y para la observacin de
las muestras teidas se utiliz
microscopio ptico.
1) Siembra de flora normal.
Se humedeci con suero fisiolgico una
trula estril y se desliz por la mucosa
yugal derecha o mejilla derecha. A
continuacin de sembr con movimiento
zig-zag en placa de agar corriente. Se
repiti el proceso y se sembr en placa
de agar sangre.
Condiciones de cultivo: por 48 hrs. a 37C
2) Anlisis de muestra problema.
N muestra problema: 5 - Agar sangre
A la muestra problema se le realizaron
los siguientes anlisis:
a) Anlisis macroscpico de colonias.
b) Anlisis microscpico por tincin de
Gram: Se esteriliz el asa, se enfri y se
tom una muestra desde el cultivo en
para la muestra problema llevndola al
portaobjetos, donde previamente se
haba colocado una gota de agua, luego
se agreg cristal violeta, se esper 3
min., en seguida se agreg lugol, se
esper 2 min. y se lav con la solucin de
alcohol-cetona y luego agua. Finalmente
se agreg safranina al 1%, se lav, se
sec y se observ con el microscopio
ptico con objetivo 100X.
c) Test de catalasa: con un asa de
plstico se tom una colonia del cultivo y
se mezcl con una gota de agua
oxigenada al 30% previamente colocada
en un portaobjetos.
d) Test de coagulasa: Se tom una tira
reactiva del test de ltex para coagulasa,
a sta se le agreg una gota de solucin
de anticuerpos del test de aglutinacin
para Staphylococcus. Luego se tom un
par de colonias desde el cultivo con un
mondadientes de plstico y se mezcl
con el reactivo agitando constantemente.
e) Test de susceptibilidad a agentes
microbianos: Se mezcl una cantidad
importante de colonias bacterianas con
un caldo, hasta que la turbidez alcanzara
un estndar que haba en el
laboratorio. Luego con una trula estril
se sembr a los largo de todo el medio
de cultivo de Mueller-Hinton 3 veces con
movimientos zig-zag. Finalmente se
seleccionaron 4 discos de
antimicrobianos para Staphylococcus.
Eritromicina
Penicilina
Oxacilina
Clindamicina
Adems se utiliz un quinto disco
correspondiente a la Novobiocina, que
adems de dar un halo caracterstico de
inhibicin permite identificar una especie
de Staphylococcus de otra.
Cada disco de antimicrobiano se tom
con una pinza previamente esterilizada y
enfriada, y se coloc suavemente sobre
el cultivo, con su parte protuberante
hacia ste.
Cabe destacar que adems se analiz la
hemlisis del cultivo.
3) Anlisis de siembras de flora
bacteriana normal.
Se seleccionaron colonias caractersticas
o aquellas que se apreciaban en mayor
nmero desde ambos cultivos y se les
realizaron los procedimientos a;b; y c de
la actividad nmero 2. Adems se analiz
la hemlisis del cultivo en agar sangre.



























En todas las actividades se observaron e
interpretaron los resultados.
















Fig. 1: Esquema de el procedimiento seguido en el laboratorio para la identificacin de la muestra problema N5. Las
figuran en naranjo indican que se fue el resultado obtenido para la muestra problema. Los azules son los valores
descartados.
Resultados
1) Siembra de flora normal:
En ambas siembras, se observan cultivos
mixtos, no hay un solo tipo de colonias
presentes. Es importante observar que
en el agar corriente crecieron slo
colonias de tamao pequeo mientras
que en el agar sangre hay una gran
diferencia de tamao entre las colonias
presentes. El anlisis microscpico y
macroscpico de las colonias se realiz
sobre colonias especficas y no sobre una
mezcla de ellas.
Agar sangre: Colonias ms grandes

Fig2 Placa de agar sangre para cultivo de flora
normal de mucosa yugal derecha.
Agar corriente: colonias de tonalidad
amarilla.

Fig3 Placa de agar corriente para cultivo de flora
normal de mucosa yugal derecha.

2) Anlisis de muestra problema:

Fig4 Placa de agar sangre correspondiente a la
muestra problema.
a) Anlisis macroscpico: La elevacin de
la colonia as como su consistencia no se
pudieron reportar debido a que su
tamao era muy reducido.
Tabla N1: Anlisis macroscpico de MP.
Muestra problema
Tamao Pequeo
Forma Circular
Elevacin -
Margen Entero
Color Blanco
Superficie Brillante
Densidad Opaca
b) Anlisis microscpico: Se observa
claramente que la muestra problema
corresponde a una coccea, agrupada en
racimos o staphilos, tambin podemos
confirmar que efectivamente es una
bacteria Gram positiva por el color
violceo que adquiri luego de la tincin
de Gram.

Fig5 Microscopa ptica con aumento 1000X, de una
colonia aislada de la muestra problema preparada con
tincin de Gram.
c) Test de la catalasa: El test de la
catalasa, dio resultados muy rpidos. Al
momento del contacto de la bacteria con
el agua oxigenada, comenzaron a
formarse burbujas.

Fig6
8
Resultados posibles para el test de la catalasa en
bacterias. El que est encerrado en rojo se considera
positivo, o sea que la bacteria posee la enzima.
Por lo tanto se considera que el test es
positivo para la enzima catalasa. De esta
manera si seguimos la Fig.1 podemos
descartar que nuestra muestra problema
corresponde a un Streptococo, y
confirmamos, lo que la microscopa con
tincin de Gram nos mostr. La bacteria
es un Staphylococo.
d) Test de coagulasa: En el caso de ste
test, el procedimiento se repiti dos
veces de forma que pudiramos
asegurarnos de que el resultado
obtenido era el correcto.


Fig7 Resultado del test de la coagulasa a travs del
test de ltex.
En ambas ocasiones el test result
negativo para la coagulasa de manera
que segn la Fig1 podemos descartar que
la muestra problema sea un
Staphylococcus aureus.
e) Test de susceptibilidad a agentes
microbianos: cuando el anlisis con
coagulasa deriva en una bacteria no
coagulasa, el test de susceptibilidad a
antibitico debe contener al
antimicrobiano Novobiocina.

Fig8 Test de susceptibilidad a agentes microbianos
para la muestra problema N5.
En la fig8 se observa claramente que no
hubo un crecimiento bacteriano
homogneo en toda la extensin del
agar. Los valores obtenidos para los
antibiticos utilizados se muestran en la
siguiente tabla.
Tabla N2: Halo de inhibicin de los antimicrobianos
utilizados sobre la muestra problema.
Halo de inhibicin
Novobiocina 30mm.
Eritromicina 5mm
Penicilina 5mm
Oxacilina 5mm
Clindomicina 9mm

Todos los halos de inhibicin anteriores
se calcularon, con un papel milimetrado,
tomando dos mediciones
perpendiculares del halo y luego
promedindolas.
Ejemplo para Clindomicina:
mm
mm mm MedicinII MedicinI
9
2
8 10
2

En el caso de los antimicrobianos que

presentan un halo de inhibicin igual a
5mm., son aquellos que no formaron
halos visibles, y se reporta slo el
dimetro del disco.
A continuacin se muestra una tabla con
los valores estndares que deben tener
los halos de inhibicin, para realizar una
clasificacin, de cada antibitico utilizado
con respecto a Staphylococo.
Tabla N3: Valores tericos de halos de inhibicin
de los antimicrobianos utilizados sobre la muestra
problema para hacer una clasificacin.
Halo
de
inhibi
cin
Conte
nido
del
disco
Sensib
le
(mm)

Inter
medi
a
(mm)

Resist
ente
(mm)
Novobi
ocina
30m
m.
5g 16 - 16
Eritromi
cina
5mm 15 g 23 14-
22
13
Penicili
na
5mm 10 U 29 - 28
Oxacilin
a
5mm 1 g 13 11-
12
10
Clindo
micina
9mm 2 g 21 15-
20
14
Los valores destacados en rojo son los
que se obtuvieron. De esta manera
podemos determinar que la muestra
problema es, resistente a todos los
antibiticos y sensible a Novobiocina. Si
seguimos el anlisis con la Fig. 1
podemos decir que la muestra problema
corresponde a un Staphylococcus
Coagulasa negativo no Saprophyticus.
f) Anlisis de la hemlisis: Se observ el
cultivo de la muestra problema que se
muestra en la Fig. 4 y se determin que
este produjo unas hemlisis .
3) Anlisis de siembras de flora
bacteriana normal.
a) Anlisis macroscpico: Se observ una
colonia representativa de cada uno de los
cultivos obtenidos de la flora normal.
Cultivo en agar sangre:
Tabla N4, Anlisis macroscpico de cultivo de
flora normal en agar sangre.
Muestra problema
Tamao Grande
Forma Irregular
Elevacin Elevada
Margen Ondulado
Color Crema
Superficie Cremosa
Densidad Opaca
Adems como se muestra en la Fig 2, el
cultivo presenta una clara hemlisis ,
caracterizada por el halo verdusco a su
alrededor.
Cabe destacar que la colonia tena una
consistencia firme, como fibrosa, al
tomarla con el asa se tomaba la colonia
completa y era difcil separarla.
Cultivo en agar corriente: La elevacin
de la colonia as como su consistencia no
se pudieron reportar debido a que su
tamao era muy reducido.
Tabla N5 Anlisis macroscpico de cultivo de
flora normal en agar corriente.
Muestra problema
Tamao Pequeo
Forma Circular
Elevacin -
Margen Entero
Color Amarillo
Superficie Cremosa
Densidad Transparente

b) Anlisis microscpico: Se realizaron 2
veces las tinciones de Gram para ambas
colonias seleccionadas. En ninguna de las
ocaciones pudo obtenerse una
microscopa clara de la tincin. El
resultado era, las colonias teidas, de un
fuerte color rosado, pero al observar al
microscopio, slo se observaba una
mancha del mismo color.
En el caso de la colonia seleccionada
desde el agar corriente se pudo observar
una pequea cantidad de bacterias con
forma de cocaceas. Con respecto a la
agrupacin no se puede asumir que tiene
una o la otra ya que eran muy pocas
bacterias con una organizacin al parecer
en cadena.










Fig9Microscopa ptica con aumento 1000X, de
una colonia aislada del cultivo en agar corriente
para flora normal preparada con tincin de Gram.
En ambos casos se observaba algo como
esto luego de hacer el frotis, para la
tincin de Gram, a simple vista.







Fig 10, aspecto de los portaobjetos con la tincin
de Gram.
En el caso de la colonia proveniente del
agar sangre, al ser esta muy difcil de
separar, quedaban grandes porciones de
bacterias al mezclarla con la gota de
agua. Se consider que ambas colonias
eran Gram negativas por el color rosado
que se pudo observar, y que la bacteria
del agar corriente es una cocacea, pero el
que sean Gram negativas es una
suposicin ya que no pudo observarse
correctamente.
c) Test de la catalasa: El test de la
catalasa, dio resultados muy rpidos. Al
momento del contacto de la bacteria
proveniente del cultivo en agar sangre
con el agua oxigenada, comenzaron a
formarse burbujas. Considerndose
positivo para sta. Para la colonia
obtenida del agar corriente no se
present reaccin de manera que
asumimos es catalasa negativa, o en
otras palabras no contiene a la enzima.

No se realizaron mas ensayos para los
cultivos ya que no haba prueba alguna
de que se trataran de cocaceas en ambos
casos y de si fueran Gram positivas o
Gram negativas de manera clara.





















Discusiones:
Actividad 2, identificacin de la muestra
problema: La informacin obtenida en
los resultados es:
Catalasa positiva
Coagulasa negativa
Sensible a Novobiocina
Segn estos parmetros y un posterior
anlisis bibliogrfico podemos decir que
la muestra problema probablemente
corresponda a un Staphylococcus
epidermidis.
Ya que se caracteriza por ser coagulasa
negativo y Novobiocina sensible. No
fermenta el manitol ni tolera el cloruro
de sodio.
9
































Tabla N6 comparacin de muestra problema con
caractersticas de S.epidermidis.
MP S.epidermidis
Color blanco blanco grisceo
Tamao en
cultivo
pequeo pequeo
Catalasa positivo positivo
Coagulasa negativo negativo
Sensibilidad a
Novobiocina
presenta presenta
Hemlisis no presenta

En el caso de la muestra problema se
obtiene una hemlisis , pero este
anlisis fue realizado por nosotras de
manera que puede ser errneo. La
bacteria S.epidermidis no presenta
hemlisis.























Staphylococcus epidermidis es una
bacteria que habita normalmente en la
piel, es un patgeno oportunista de baja
A continuacin se muestra una figura comparativa de diferentes cultivos de S.epidermidis
encontrados en la bibliografa y el cultivo de la muestra problema. A
10
, B y C
11
, la figura D
corresponde a la muestra problema.


incidencia y que requiere un umbral
bastante grande en la baja de las
defensas para producir alguna patologa,
est asociado comnmente a infecciones
intrahospitalarias.
12,13

Posee una hemolisina diferente de las
de S. aureus, denominada "psilon."
14

En la actividad e, de la parte 2, del test de
antimicrobioanos, se explica el
crecimiento no homogneo de la
bacteria debido a que no se sembr
correctamente la cantidad de veces ni de
la forma ptima.

Actividad 3, identificacin de de una
colonia a partir del cultivo de flora
normal en agar corriente y agar sangre:
Como se dijo en los resultados no se
obtuvieron las tinciones de Gram para
ninguno de los dos salvo que para la
colonia del agar corriente se identific
que era una cocacea y que ambas tal vez
eran Gram negativas debido a la
coloracin aparente del frotis.
Sera muy difcil identificar a la bacteria
con tan pocos datos pero es importante
mencionar que la colonia tomada de
cultivo hecho en agar sangre presenta
hemlisis de manera que podemos
disminuir el grupo de bacterias posibles.
La cavidad oral es uno de los hbitats
microbianos ms complejos y
heterogneos del cuerpo.
15

En ella habitan streptococos de la
variedad viridans que se caracterizan por
producir hemlisis del tipo .
16

Algunos de ellos son:
Streptococcus mitis
Streptococcus mutans
Streptococcus sanguis
Streptococcus pneumoniae, se
caracteriza por tener hemlisis
Todas las bacterias mencionadas son
catalasa negativo, al realizar la prueba de
la catalasa para esta colonia se obtuvo un
resultado positivo de manera que no
debera ser ninguna de stas a menos
que la prueba haya sido mal realizada.
Otra opcin es que la bacteria sea del
gnero Neisseria, ya que stas si
presentan una prueba de catalasa
positiva
17
y en el caso de Neisseria
meningitidis en los seres humanos son
las membranas mucosas, su hbitat
natural, especficamente de la
nasofaringe
18
la cual es comnmente
colonizada sin produccin de sntomas de
la enfermedad. sta no produce
hemlisis
19
de manera que tampoco es
probable que se encuentre en el cultivo.
No puede ser Staphilococcus epidermidis
ya que ste no presenta hemlisis.
En ltimo caso nos encontramos con un
microorganismo anaerobio denominado
fusobacterium que debe su nombre a su
forma alargada y delgada con extremos
en forma de huso
20
. Esta es tipo de
bacteria Gram negativa anaerbica que
se encuentra normalmente en la boca.
21

Es importante considerar que los cultivos
eran mixtos y que de ninguna manera se
encontraba puro, lo que hace ms difcil
su deteccin. Adems de que se pueden
haber cometido errores durante los
anlisis.
Para la muestra en agar corriente la nica
informacin obtenida es que se trataba
de una coccea que al parecer era
negativa, para tincin de Gram y la
prueba de la catalasa. Existen muchas
especies bacterianas Gram negativas que
se desarrollan en la boca desde que
somos bebs.
21
Sin una mayor
informacin no es posible identificar
stos cultivos.

Con respecto a las tinciones, podemos
atribuir la no obtencin de las tinciones
de Gram a un mal procedimiento de la
tincin, a que se hayan lavado las
bacterias al no realizar correctamente el
frotis o que se haya lavado todo el
colorante con un reactivo no adecuado,
por ejemplo lavar con agua en vez de
mezcla alcohol-acetona primero.

Conclusiones

Se llevaron a cabo todas las actividades y
pruebas bioqumicas para la
identificacin de cocceas Gram
positivas, a partir de esto podemos
concluir que:
La bacteria de la muestra problema
es un Staphylococcus coagulasa
negativo, no saprophyticus. Segn
stas caractersticas la muestra
podra corresponder a
Staphylococcus epidermidis.
La flora normal de la boca presenta
una heterogeneidad muy amplia,
aun as es posible realizar pruebas
bioqumicas para la identificacin de
muestras.














Bibliografa

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parasitologa medica. Editorial
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(6)http://www.higiene.edu.uy/cefa/L
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(7)http://www.higiene.edu.uy/cefa/L
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(8)http://faculty.mc3.edu/jearl/ML/
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http://archive.microbelibrary.org/AS
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http://www.scielo.org.pe/scielo.php?
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www.idap.com.mx/apuntes/Microbio
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