MEDIOS DE AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO

Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos,
etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de
ellos frente a otros m.o. que los acompaen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de
cultivo y condiciones de incubacin (atmsfera, temperatura, pH) considerando las caractersticas
fisiolgicas del m.o. buscado, para otorgarle ventaas frente al resto de m.o. de ese ecosistema.
!retendemos in"ibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no
interfieran durante el aislamiento de los que s interesan.
#n esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificacin de m.o. es el siguiente$
%ebemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo
de m.o. y simult&neamente minimizar la interferencia de otros$
Muestra
'legir la muestra adecuadamente. 'l m.o. que se est& buscando debe ser factible de estar
presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante.
%ebemos considerar si es (til someter la muestra a un tratamiento previo. )uanto mayor seleccin
se realice en este paso inicial, menos selectivos deber&n ser los medios de cultivo a utilizar.
*%ebemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente+ Si el m.o. que
deseamos aislar est& en un bao n(mero, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que
favorezca su multiplicacin (enriquecimiento). )uando un enriquecimiento se realiza en un medio
formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompaantes no deseados, se denomina
enriquecimiento selectivo. )uando el m.o. deseado est& en alto n(mero, no se necesita realizar un
enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio slido adecuado directamente.
Medio de cultivo
%ebemos realizar una formulacin adecuada de los medios de cultivo empleados. 'n general en
las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos. %ic"a selectividad se puede determinar
ya sea, a) agregando un in"ibidor de la flora acompaante, o b) "aciendo el medio restrictivo al
incluir un nutriente que slo el m.o. deseado sea capaz de utilizar.
%ebemos utilizar las condiciones de incubacin adecuadas$ temperatura, luz, atmsfera (aerobia o
anaerobia, atmsfera con concentracin de ),-, etc.).
.os componentes del medio de cultivo que se pueden manear son$
/uente de carbono. 0 modo de eemplo, se podran quitar todos los compuestos org&nicos
para permitir el crecimiento de m.o. auttroos que son capaces de obtener su fuente de
carbono del ),- (que difunde de la atmsfera al medio o por agregado de bicarbonato). ,
incluir e1clusivamente una fuente de carbono particular, por e, fenol si queremos aislar
degradadores de ese compuesto.
/uente de nitr!eno. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (org&nica u
inorg&nica) para permitir el crecimiento de fiadores libres de nitrgeno, que son capaces
de obtener su fuente de nitrgeno del 2- atmosf3rico.
/uente de ener!"a# Si no se agrega ning(n compuesto capaz de ser utilizado como fuente
de energa y se incuba a la luz, slo crecer&n los m.o. fotosint3ticos que usan la luz como
fuente de energa.
Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento
(vitaminas, amino&cidos, &cidos nucleicos, &cidos grasos, etc.) seg(n se necesiten o no.
!&g.
/uente de inculo

)aldo de enriquecimiento

0islamiento

4dentificacin
$RUE%AS %IOQU&MICAS
INDOL
Introduccin
'l indol es uno de los productos de degradacin metablica del amino&cido triptofano. .as
bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de "idrolizar y desaminar el triptofano con
produccin de indol, &cido pir(vico y amonaco. .a produccin de indol es una caracterstica
importante para la identificacin de muc"as especies de m.o.
$rinci'io
.a prueba de indol est& basada en la formacin de un compleo roo cuando el indol reacciona con
el grupo alde"do del p5dimetilaminobenzalde"do. 'ste es el principio activo del reactivo de
6ovacs descrito m&s adelante. 'l medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano.
Medios ( reactivos
)aldo triptofano
!eptona o digerido pancre&tico de casena - g
)loruro de sodio 7,8 g
0gua destilada 977 ml
:eactivo de 6ovacs
0lco"ol amlico o isoamlico 987 ml
p5dimetilaminobenzalde"do 97 g
H)l conc. 87 ml
$rocedi)iento
4nocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a ;8<) durante 9= a -> "oras. 0l
finalizar este perodo, aadir 8 gotas de reactivo por la pared interior del tubo.
Inter'retacin
'l desarrollo de un color roo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despu3s de
aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva.
)ontroles
Escherichia coli$ positivo
Klebsiella pneumoniae$ negativo (mayora de las cepas)
RO*O DE METILO + ,O-ES+$ROS.AUER /RM ,$0
$rinci'io
#na de las caractersticas ta1onmicas que se utilizan para identificar los diferentes g3neros de
enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan
por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales$ la fermentacin &cido5mi1ta y la
fermentacin del -,; butanodiol. 'n la fermentacin &cido mi1ta se forman fundamentalmente
l&ctico, ac3tico y succnico, adem&s de etanol, H- y ),-. 'n la va del butanodiol se forman
cantidades menores de &cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol,
etanol, H- y ),-.
'l roo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de virae entre ?,7 (amarillo) y >,> (roo),
que se utiliza para visualizar la produccin de &cidos por la va de fermentacin &cido mi1ta.
!&g.
'l acetil5metil5carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. 'n
medio alcalino y en presencia de o1geno la acetona es o1idada a diacetilo. 'ste se revela en
presencia de alfa5naftol dando un color roo5fucsia
Medios ( reactivos
)aldo :@AB!
!eptona C g
Dlucosa 8 g
/osfato dipot&sico 8 g
0gua destilada 9 .
pH E ?,F G 7,9
4ndicador de pH roo de metilo
:oo de metilo 7,9 g en ;77 m. de etanol F8<
0gua destilada -77 ml
:evelador B!
alfa5naftol (solucin al 8H en etanol F8<)
Solucin de 6,H al >7H en agua destilada
$rocedi)iento
4nocular el caldo :@B! con un cultivo puro de no m&s de -> "oras del m.o. en estudio. 4ncubar a
;8<) durante >= "oras. .uego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 9 m. del caldo a un
tubo limpio para B!. 'n el caldo restante revelar :@ agregando unas > 5 = gotas del indicador roo
de metilo. !ara revelar B! agregar 7,? ml (97 gotas) de alfa5naftol al 8H y 9 gota de 6,H al >7H.
0gitar cuidadosamente para e1poner el medio al o1geno atmosf3rico y dearlo reposar durante 97
a 98 minutos.
Inter'retacin
.a prueba :@ es positiva si se desarrolla un color roo estable. 'sto indica que la produccin de
&cido es suficiente para producir el virae del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de
&cido mi1ta. #n color anaranado, intermedio entre el roo y el amarillo no es considerado como
positivo.
.a prueba B! es positiva si se desarrolla un color roo5fucsia luego de 98 minutos, que indica la
presencia de diacetilo, producto de o1idacin de la acetona.
)ontroles
:@ positivo, B! negativo$ Escherichia coli
:@ negativo, B! positivo$ Enterobacter aerogenes
UTILI1ACI2N DE CITRATO
Introduccin
.a utilizacin de citrato como (nica fuente de carbono es una prueba (til en la identificacin de
enterobacterias.
$rinci'io
.a utilizacin de citrato como (nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato
como (nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. 'ste aumento
de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH C,?.
!&g.
Medios ( reactivos
@edio de Simmons
/osfato di&cido de amonio 9 g
/osfato dipot&sico 9 g
)loruro de sodio 8 g
)itrato de sodio - g
Sulfato de magnesio 7,- g
0gar 98 g
0zul de bromotimol 7,7= g
0gua destilada c.s.p. 9 .
pH E ?,F
$rocedi)iento
Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. #tilizar un cultivo de ->
"oras en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir
falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. 4ncubar a ;8<) durante >
das.
Inter'retacin
'l ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de
un virae del indicador al azul.
)ontroles
!ositivo$ Klebsiella spp.
2egativo$ E.coli
DESCAR%O3ILACI2N DE LISINA Y ORNITINA
Introduccin
.a descarbo1ilacin de amino&cidos es llevada a cabo por descarbo1ilasas y se forman aminas y
),-. )ada descarbo1ilasa es especfica para un amino&cido y la reaccin es completa e
irreversible. .os amino&cidos ensayados "abitualmente para la identificacin son lisina, ornitina y
arginina.
$rinci'io
'l caldo descarbo1ilasa de @oeller es el medio base m&s com(nmente usado para la
determinacin de las descarbo1ilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio
conteniendo el amino&cido a ensayar y un tubo control con medio base sin amino&cido. Se cubren
con una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para "acer el medio anaerobio de manera que
ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. %urante las primeras etapas de la incubacin en
ambos tubos se observar& virae del indicador de pH del medio al &cido, por la fermentacin de la
glucosa. .uego, si el amino&cido es descarbo1ilado, se forman aminas que provocan un retorno al
color original del medio o un virae al alcalino.
Medios ( reactivos
Iase de @oeller
!eptona 8 g
'1tracto de carne 8 g
Dlucosa 7,8 g
!irido1al 7,778 g
!(rpura de Iromocresol 7,79 g
:oo de cresol 7,778 g
0gua destilada c.s.p. 9 .
!&g.
pH final E ?,7
)aldo .isina o ,rnitina de @oeller$ !reparar igual al medio base y agregar 97 g del amino&cido (9H
de concentracin final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del amino&cido ya que
solo la levo es activa). 0gregar aceite mineral para formar una capa de 9 cm de espesor.
$rocedi)iento
4nocular con un cultivo puro de -> "oras un tubo de base de @oeller con el amino&cido a estudiar
(lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin amino&cido). 4ncubar a ;8<) durante 9= a ->
"oras.
Inter'retacin
'l ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y virae del indicador al
amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite la
activacin de las descarbo1ilasas. 'l retorno al color azul5violeta en el tubo que contiene el
amino&cido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarbo1ilacin.
)ontroles
%escarbo1ilacin de lisina positiva$ Enterobacter aerogenes
%escarbo1ilacin de lisina negativa$ Enterobacter cloacae
%escarbo1ilacin de ornitina positiva$ Serratia spp
%escarbo1ilacin de ornitina negativa$ Klebsiella spp.
4ENILALANINA DESAMINASA
Introduccin
.a fenilalanina es un amino&cido que por desaminacin o1idativa forma un ceto&cido, el &cido
fenilpir(vico. Slo los g3neros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que
permite diferenciarlas del resto de las 'nterobacterias.
$rinci'io
.a prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del &cido fenilpir(vico luego del desarrollo del
m.o. en un medio que contiene fenilalanina. !ara eso se agrega cloruro f3rrico que forma un
compleo de color verde con el &cido fenilpir(vico. 'l medio de cultivo no puede contener e1tractos
de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina.
Medios ( reactivos
0gar fenilalanina
%. fenilalanina - g
'1tracto de levadura ; g
)loruro de sodio 8g
/osfato de sodio 9 g
0gar 9- g
0gua destilada c.s.p. 9 .
pH E C,;
)loruro f3rrico
)loruro f3rrico 97 g
H)l concetrado -,8 g
0gua destilada c.s.p. 977 ml
!&g.
$rocedi)iento
4nocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de -> "oras e incubar a ;8<) durante 9=5->
"oras. .uego de transcurrido el perodo de incubacin, agregar > o 8 gotas de reactivo de cloruro
f3rrico, directamente sobre la superficie del agar.
Inter'retacin
.a aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de &cido fenilpir(vico y una
prueba positiva.
)ontroles
!ositivo$ Proteus
2egativo$ Escherichia coli
TSI /TRI$LE SU-AR IRON0
Introduccin
'l agar triple az(car "ierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de
produccin de &cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un (nico medio. Jambi3n
permite la deteccin de la produccin de H-S. 's un medio (til para la identificacin de
enterobacterias.
$rinci'io
'l agar se prepara en forma de pico de flauta. 'sto determina que
e1istan dos c&maras de reaccin dentro del mismo tubo. .a porcin
inclinada (pico) e1puesta en toda su superficie al o1geno es aerobia
y la porcin inferior (fondo) est& protegida del aire y es relativamente
anaerobia.
0l crecer un m.o. en el JS4, el pico tiende a virar al pH alcalino (color
roo por el roo fenol) por la produccin de aminas, debido a la
utilizacin aerobia de las peptonas. 'n el fondo del tubo 5donde no "ay o1geno5 la degradacin de
peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la produccin de
pequeas cantidades de &cido (color amarillo por el roo fenol). Si se inoculan m.o. no
fermentadores no se formar&n &cidos, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medio
quedar& roo.
.a glucosa en el JS4 est& en una proporcin 97 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el JS4
es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la
cantidad de &cido producida por fermentacin ser& baa (porque la cantidad de glucosa inicial es
baa). 'n las primeras "oras (97 a 9? "s) de incubacin se producir& virae del indicador al amarillo
en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar& al roo por
la produccin de aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita.
Si el m.o. fermenta la lactosa yAo la sacarosa, como las concentraciones de estos az(cares son 97
veces mayores a la glucosa, se producir& gran cantidad de &cido (que no puede ser neutralizado
por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virar& al color
amarillo (&cido).
.a produccin de H-S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro
ferroso (negro). )omo esta reaccin se da preferencialmente en medio &cido, un ennegrecimiento
del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee
como fermentacin de algunos de los az(cares del medio. 0dem&s puede observarse la
produccin de gas (H- y ),-), ya sea como burbuas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o
desplazamiento del mismo "acia la superficie.
!&g.
Medios ( reactivos
JS4
'1tracto de carne ; g
'1tracto de levadura ; g
!eptona 98 g
!roteosa peptona 8 g
.actosa 97 g
Sacarosa 97 g
Dlucosa 9 g
)loruro de sodio 8 g
Sulfato ferroso 7,- g
Jiosulfato de sodio 7,; g
0gar 9- g
:oo fenol 7,7-> g
0gua destilada 9 .
pH E C,> G 7,-
$rocedi)iento
4nocular los tubos de JS4 con punta (alambre recto). !ara eso introducir la punta "asta ; a 8 mm
del fondo del tubo. Jras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento "acia uno y otro
lado. 4ncubar a ;8 <) durante 9=5-> "s, pero no m&s de -> "s..
Inter'retacin ( Controles
!ara el JS4 siempre se informa el resultado en el siguiente orden$ pico, fondo, produccin de gas y
H-S.
!ico alcalinoAfondo alcalino (0lcA0lcAgas5AH-S5)
2o "ay fermentacin de az(cares. )aracterstica de bacterias no fermentadoras como '.
Pseudomonas sp
!ico alcalinoAfondo &cido (0lcA0Agas5A H-S5)
Dlucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. 2o "ay produccin de gas ni de H-S.
'. Shigella spp.
!ico alcalinoAfondo &cido (0lcA0Agas5A H-SK)
Dlucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. 2o "ay produccin de gas, si de H-S.
'. Salmmonella typhi.
!ico alcalinoAfondo negro (0lcA0AgasKAH-SK)
Dlucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de &cido
sulf"drico. '. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella).
!ico &cidoAfondo &cido (0A0)
Dlucosa y lactosa yAo sacarosa fermentadas. !uede producirse H-S o no. E.coli (0A0AH-S 5)
0 estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. '. 0A0AgasKAH-S5.
!&g.
LIA /LYSINE IRON A-AR0
Introduccin
'ste ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarbo1ilacin o desaminacin de la
lisina. Se puede detectar adem&s la produccin de H-S. 's muy utilizado en las t3cnicas de
b(squeda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de
aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo.
$rinci'io
%urante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar& el indicador de pH del medio al &cido
(amarillo) por la fermentacin de glucosa. .uego, si el amino&cido es descarbo1ilado se formar&n
aminas que provocan un retorno al color original del medio o "acia un virae al b&sico (color
violeta).
'n la desaminacin se produce un &cido carbo1lico y 2H; y se visualiza en la superficie la
aparicin de un color roo intenso. .a produccin de H-S a partir de tiosulfato se visualiza por la
precipitacin de sulfuro ferroso de color negro.
Medios ( reactivos
!eptona 8 g
'1tracto de levadura ; g
Dlucosa 9 g
.5lisina H)l 97 g
)itrato f3rrico amnico 7,8 g
Jiosulfato de sodio 7,7> g
!(rpura de bromocresol 7,7- g
0gar 98 g
0gua destilida 9 .
pH E ?,C 7,-
Inter'retacin ( controles
pico alcalinoAfondo alcalinoAH-S K, descarbo1ilacin de lisina positiva. '.$ Salmonella choleraesuis.
pico rooAfondo &cidoAH-S5, desaminacin de lisina positiva, descarbo1ilacin de lisina negativa. '.$
Proteus mirabilis.
pico alcalinoAfondo &cidoAH-S5 descarbo1ilacin de lisina negativa. '. E. coli
pico alcalinoAfondo &cidoAH-SK descarbo1ilacin de lisina negativa, produccin de H-S. '.
Citrobacter freundii.

$RODUCCI2N DE $I-MENTOS $ARA PSEUDOMONAS SP#
Introduccin
.a capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluorescena) y piocianina es una
caracterstica importante para la identificacin de especies de Pseudomonas. 0lgunas de ellas
elaboran slo fluorescena (e. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (e. Ps. aeruginosa). .a
piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie
la producen. Se "an diseado medios de cultivo que potencian la elaboracin de uno de los
pigmentos e in"iben la formacin del otro.
$rinci'io
'l medio 6ing 0 (o !seudomonas 0gar !) potencia la elaboracin de piocianina mientras que el
6ing I (o !seudomonas 0gar /) potencia la elaboracin de fluorescena e in"ibe parcialmente la
de piocianina. 'stos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. .a piocianina es un
pigmento azul5verde mientras que la fluorescena es amarillo5verdoso y fluoresce cuando es
e1puesto a la luz #B (E-8> nm). '1isten pigmentos amarillo5verdosos producidos por algunas
especies de !seudomonas que no fluorescen.
!&g.
Medios ( reactivos
6ing 0 6ing I
!eptona -7 g !roteosa !eptona -7 g
Dlicerol 97 g Dlicerol 97 g
6
-
S,
>
97 g 6
-
H!,
>
9,8 g
@g)l
-
9,> g @gS,
>
.CH
-
, 9,8 g
0gar 98 g 0gar 98 g
0gua 9 . 0gua 9 .
.os medios se reparten en tubos, se esterilizan a 9-9L) durante 98 minutos y se dean solidificar
inclinados.
$rocedi)iento
4nocular los tubos por estras. 4ncubar a ;8L) durante -> "s.
Inter'retacin
,bservar al #B, la produccin de pigmento azul5verdoso en el medio 6ing 0 y la de pigmento
amarillo5verdoso, en el 6ing I
)ontroles
Pseudomonas aeruginosa$ 6ing 0 K
P. fluorescens$ 6ing 0 5
P. fluorescens$ 6ing I K
P. stutzeri$ 6ing I 5
DNASA + DESO3IRRI%ONUCLEASA
Introduccin
.a actividad deso1irribonucleasa (%20sa) se "a demostrado fundamentalmente en los g3neros
Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el 0%2 a fracciones de menor
peso molecular. 'sta caracterstica se "a utilizado para identificar las especies de Serratia
marcescens y Staphylococcus aureus. MecNman y )atlin demostraron la estrec"a correlacin entre
la produccin de %20sa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la produccin de coagulasa.
$rinci'io
.os m.o. %20sa positivos degradan el %20 cuando son incubados en un medio que lo contiene.
'sto puede ser visualizado de diferentes maneras$ ya sea inundando las placas crecidas con H)l
7,9 2 y observando zonas transparentes alrededor de las estras o incorporando al medio
indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo).
Medios ( reactivos
%20sa agar
Jriptosa -7 g
0%2 - g
2a)l 8 g
0gar 98 g
0zul de toluidinaO 7,9 g
0gua c.s.p. 9 .
O o verde de metilo
!&g.
$rocedi)iento
'striar la superficie de la placa e incubar a ;8<) durante 9=5-> "oras. ,bservar el virae del
indicador a rosado alrededor de las estras.
Inter'retacin
#n resultado positivo est& dado por el virae del indicador en la zona de la estra a rosado.
)ontroles
!ositivo$ S.aureus y Serratia marcescens
2egativo$ S.epidermidis$
COA-ULASA
Introduccin
.a coagulasa es una enzima proteica con actividad semeante a la protrombina, capaz de
transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un co&gulo visible en un sistema
analtico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio
de infeccin estafilocccica. 'n el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza m&s com(nmente
para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Stap"ylococcus.
$rinci'io
.a coagulasa se "alla presente en dos formas, PlibreQ y PfiaQ, cada una de las cuales posee
diferentes propiedades que requieren el uso de t3cnicas de determinacin diferentes$
)oagulasa fia (prueba en portaobetos)$ la coagulasa fia est& unida a la pared celular bacteriana.
.os "ilos de fibrina formados entre las c3lulas suspendidas en plasma (que contiene fibringeno)
provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobetos.
)oagulasa libre (prueba en tubo)$ la coagulasa libre es una enzima e1tracelular que se "alla
presente en los filtrados de cultivos. )uando una suspensin de bacterias productoras de
coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un co&gulo
visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera
similar a cuando se aade trombina.
Medios ( reactivos
!lasma coagulasa (%ifco, o II.)
)ultivo de Stap"ylococcus de -> "oras en un agar nutriente o caldo nutriente.
$rocedi)iento
!rueba en portaobetos
)olocar una gota de agua destilada sobre un portaobetos
'mulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una
suspensin cargada "omog3nea. 0gregar una gota de plasma reconstituido unto a la gota de la
suspensin del m.o. @ezclar bien con el ansa. 4nclinar el portaobetos "acia uno y otro lado,
observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos.
!rueba en tubo
)olocar as3pticamente 7,8 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo est3ril.
0adir 7,8 ml de cultivo de -> "oras (o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa).
@ezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido.
)olocar en bao de agua a ;C<) y observar cada "ora "asta > "oras y luego a las -> "oras, la
formacin de un co&gulo visible.
!&g.
Inter'retacin
!rueba en portaobetos$ una reaccin positiva se detecta usualmente en 98 a -7 segundos por la
aparicin de un precipitado granular. .a prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin
en - a ; minutos. 'sta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos
o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de
Stap"ylococcus aureus no producen coagulasa fia.
!rueba en tubos$
9K$ pequeos co&gulos no organizados.
-K$ pequeos co&gulos organizados.
;K$ gran co&gulo organizado.
>K$ todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo.
Se consideran positivos los grados ;K y >K
)ontroles
!ositivo$ S.aureus
2egativo$ S.epidermidis$
$RUE%A DE LA %ILIS ESCULINA
Introduccin
.a prueba de la bilis5esculina est& basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los
estreptococos del grupo %, de "idrolizar la esculina en presencia de bilis al 9 o >H. .a esculina es,
qumicamente, un derivado de la cumarina (?5b5glucsido5C5"idro1icumarina), que por su estructura
pertenece a los glucsidos. !or definicin, 3stos est&n constitudos por dos restos unidos por un
puente de o1geno. 'n el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la C5
"idro1icumarina (que no es un "idrato de carbono, y es denominado aglucona).
!&g.
$rinci'io
.as bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambi3n "idrolizar esculina, producen glucosa y
esculetina (C,C di"idro1icumarina) y 3sta puede visualizarse en un medio con una sal de "ierro, por
formacin de un compleo marrn oscuro o negro.
0lgunos medios bilis5esculina incluyen tambi3n azida sdica para in"ibir el desarrollo de
organismos Dram negativos, transform&ndose en selectivos para estreptococos.
Medios ( reactivos
@edio bilis5esculina
!eptona 8 g
'1tracto de carne ; g
Iilis de buey >7 g
'sculina 9 g
)itrato f3rrico 7,8 g
0gar 98 g
0gua destilada 9 .
$rocedi)iento
Se estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis5esculina. Se
incuba a ;C<) durante -> "oras.
Inter'retacin
.a esculetina difunde "acia el medio de agar por ser "idrosoluble. .a reaccin es positiva si se
observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un "alo marrn oscuro o negro alrededor de las
colonias en placa.
)ontroles
!ositivo$ streptococo del grupo %
2egativo$ estreptococo no del grupo %
UREASA
Introduccin
.a urea es una diamida del &cido carbnico que puede ser "idrolizada con liberacin de amonaco
y di1ido de carbono.
$rinci'io
.a ureasa es una enzima que poseen muc"as especies de m.o. que pueden "idrolizar urea de
acuerdo a la siguiente reaccin qumica$

'l amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, produci3ndose alcalinizacin
y aumento de pH del medio.
Medios ( reactivos
'l caldo urea y agar urea de )"ristensen son los dos medios mas com(nmente usados en los
laboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o.
!&g.
#rea K -H-, ),- K H-, K -2H;
)aldo de Stuart
'1tracto de levadura 7,9 g
/osfato monopot&sico F,9 g
/osfato disdico F,8 g
#rea -7 g
:oo fenol 7,79 g
0gua 9 .
pH E ?,=
0gar urea de )"ristensen
!eptona 9 g
Dlucosa 9 g
)loruro de sodio 8 g
/osfato monopot&sico - g
#rea -7 g
:oo fenol 7,79- g
0gar 98 g
0gua 9 .
pH E ?,=
$rocedi)iento
4nocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del
agar. 4ncubar a ;8<) durante -> "s.
Inter'retacin
.os m.o. que "idrolizan urea r&pidamente pueden producir reacciones positivas en 9 a ; "s. .as
especies mas lentas pueden requerir ; o mas das.
)aldo$ una coloracin roiza indica alcalinazacin e "idrlisis de urea
0gar$ una coloracin roiza en el medio indica "idrlisis de urea positiva. .os degradadores lentos
producen coloracin parcial (generalmente el pico), los r&pidos producen coloracin en todo el
tubo. Si no "ay "idrlisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa
crecimiento.
)ontroles
!ositivo$ Proteus sp
2egativo$ Escherichia coli
!&g.
$RO%LEMAS TE2RICOS
-ENERALIDADES
.a identificacin de una cepa bacteriana requiere comparar las caractersticas de esa cepa con las
caractersticas de las especies conocidas descritas. 'sta descripcin se encuentra en el IergeyRs
@anual of %eterminative Iacteriology.
.as propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del @anual
de Iergey) son las morfolgicas, el tipo de pared y la tolerancia al o1geno. 'sas son generalmente
las caractersticas por donde se comienza la identificacin de una bacteria. !uede ocurrir que esta
sea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas slo podremos decir que se
parece muc"o a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma.
'n la mayora de los an&lisis de rutina en un laboratorio de microbiologa el problema que se
presenta no es identificar una bacteria a(n no descrita, sino determinar si una cepa aislada
pertenece o no a una especie de inter3s. 'l conocimiento de las propiedades de esa especie de
inter3s se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadas
caractersticas. !or e. si se quiere determinar si en una muestra de agua est&n presentes
estreptococos fecales (cocos Dram positivos anaerobios facultativos) utilizar& medios y
condiciones de incubacin tales que e1cluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocos
Dram positivos anaerobios estrictos y durante su an&lisis incubar& aerbicamente.
.a informacin de la ecologa del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, as como el
proceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles.
!or ello, en el proceso de identificacin es posible que no necesite analizar todas las
caractersticas que indica el @anual de Iergey.
,tra razn por la cual el n(mero de caractersticas a analizar puede reducirse es que en la mayora
de los an&lisis microbiolgicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a una
especie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de inter3s, no es necesario identificarla. !or e.
si en una muestra dada para la cual se e1ige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla una
bacteria que pertenece al g3nero Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no es
necesario determinar a que especie del g3nero pertenece.
$roble)a I /E.coli)
0ntecedentes
.as bacterias de la especie Escherichia coli son bastones Dram negativos que no reducen sulfato
cuyo "&bitat natural es el intestino "umano y de animales de sangre caliente. .as cepas de E. coli
generalmente no son patgenas, sino indicadores de contaminacin fecal. Su presencia en una
muestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patgenos, pueden estar presentes en
la misma. Slo algunas cepas de E.coli son agentes etiolgicos de infecciones gastrointestinales.
'stas cepas patgenas ent3ricas se diferencian entre si y de las no patgenas por su biotipo,
generalmente asociado a la presencia de pl&smidos.
'n los procedimientos de rutina de an&lisis de especialidades farmac3uticas y de alimentos se
determina la presencia o el n(mero de bacterias de la especie E.coli pero no se determina si esas
cepas son potenciales patgenos ent3ricos. )uando "ay sospec"a de presencia de E.coli
patgena se realiza una serotipificacin de un numero determinado de cepas aisladas yAo se
envan a )entros de referencia.
.a contaminacin fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboracin de un
producto o por contaminacin durante o posteriormente al proceso de elaboracin. 'l n(mero de
bacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento que
se realizar& para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. 'l otro factor que determina
el procedimiento de aislamiento es la flora acompaante$ la proporcin relativa de E.coli a las
dem&s bacterias presentes y las propiedades fisiolgicas de esas otras bacterias.
'n muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminacin fecal
(como medicamentos preparados a partir de materias primas sint3ticas) o en muestras en las
cuales despu3s de su preparacin se "a realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana
(alimentos pasteurizados) se podra esperar un n(mero muy bao de E.coli. 'n esas muestras se
!&g.
realiza un procedimiento de b(squeda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento se
aumenta el n(mero de bacterias para despu3s realizar su aislamiento e identificacin.
'n muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como lec"e no
pasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podra esperar un n(mero mas alto de
estas bacterias. 'n ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente se
cuenta el n(mero de estas bacterias empleando un m3todo de recuento de bacterias viables en un
medio selectivo para E.coli.
'n ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a la
especie E.coli. .os procedimientos oficiales para su deteccin en alimentos y medicamentos
generalmente llegan a esta etapa despu3s del aislamiento en medios selectivos y diferenciales.
.os medios selectivos mas comunes utilizan in"ibidores para las bacterias de origen fecal que
acompaan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. .os medios
slidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios lquidos que se emplean
para el recuento por n(mero m&s probable de coliformes en alimentos y agua ()aldo .auril Sulfato,
)aldo .actosa Iilis Berde Irillante y caldo 'sc"eric"ia coli) contienen lauril sulfato de sodio o sales
biliares y verde brillante. 'stos medios son generalmente diferenciales porque tienen adem&s
lactosa 5 E.coli fermenta lactosa y glucosa5 y un modo para detectar su fermentacin (indicadores
de cambio de pH) o la produccin de gas en medio lquido (campanas de %ur"am).
.as colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el
in"ibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos.
Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. 'n el
reaislamiento se debe observar si "ay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el
an&lisis slo con las colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie
que se busca aislar.
'2 'SJ0 ),@, '2 )#0.S#4': ,J:0 4%'2J4/4)0)4,2 'S 4@!,:J02J' S#' ),2,T)0
.0S )0:0)J':4SJ4)0S !:42)4!0.'S U%' 0)#':%, 0. @02#0. %' I':D'V5 %'.
@4):,,:D024S@, S#' 42J'2J0 4%'2J4/4)0:.
!roblema
'n arabes preparados a partir de e1tractos naturales de plantas la /armacopea 'uropea e1ige
ausencia de E.coli en 9 m. de arabe. !ara realizar dic"o an&lisis se realiza un enriquecimiento en
caldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio @ac )onNey incubado entre >;5>87)$ 9)
colonias roas con "alo de precipitacin alrededor, -) colonias incoloras sin "alo de precipitacin.
*)u&les son las colonias que podran pertenecer a la especie E. coli+
#d. recibir& un reaislamiento de una colonia sospec"osa en medio 0gar .actosa :oo /enol.
*)mo crecera una cepa de E. coli en ese medio+
*Sue ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio de
cultivo debe realizar en el momento para determinar si dic"a colonia puede ser E. coli+
*Sue otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento+ %e acuerdo a ellas, la cepa
que tiene en ese reaislamiento podra pertenecer a la seccin en la cual el @anual de Iergey ubica
a E.coli+ *'n que /amilia se ubica a E. coli+ *Sue propiedades debera determinar para distinguir
esa /amilia de las otras de la misma seccin+
*'n que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro+
*!uede continuar con las etapas de identificacin+ Si no puede, *que procedimiento realizara+
%e acuerdo a la /armacopea 'uropea, la cepa sospec"osa que #d. tiene "asta a"ora (colonias
tpicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. !ara la confirmacin se
recomienda el test para la produccin de indol y otras pruebas bioqumicas.
*'n qu3 consiste la prueba de indol+
*Su3 resultado espera para esta prueba si fuese E.coli+ #tilice la tabla de pruebas bioqumicas
para 'nterobacterias resumida del @anual de Iergey. (recuerde que el n(mero que aparece en la
tabla es el H de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas)
!&g.
!odra PperderseQ alguna cepa de E.coli si realizara slo esta prueba+ 's decir una cepa que,
siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en la
produccin de indol.
.a recomendacin de la 0merican !ublic Healt" 0ssociation (0!H0) para el an&lisis de alimentos
incluye tres pruebas adem&s del indol$ :oo de @etilo, Boges U!rosNauer y )itrato. .as > pruebas
se resumen en la sigla 4@Bi) (4ndol, @etilo, Boges, )itrato).
*Su3 cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas+
*'n qu3 consisten estas pruebas+ *Su3 resultados espera para E.coli+
.os manuales de m3todos del 0!H0 dan por identificada una cepa como Ecoli si el resultado de las
pruebas 4@Bi) es KK55 (4ndol y :oo de @etilo positivos, B! y )itrato negativos) o si es 5K55.
*!odra PperderseQ una cepa de E.coli en este caso+
*!odra darse el caso al rev3s, es decir que identifique como E.coli una cepa que no es+
$roble)a II /Salmonella)
0ntecedentes
.as bacterias del g3nero Salmonella son bastones Dram negativos que no reducen sulfato cuyo
"abitat es el intestino "umano y de animales. 0unque no todas las especies de Salmonella son
igualmente patgenas, todas son importantes para la salud p(blica, y por tanto el procedimiento de
an&lisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este g3nero.
'n especialidades farmac3uticas y alimentos Ua diferencia de muestras clnicas5 se espera
un n(mero bao de estas bacterias, que adem&s pueden estar fisiolgicamente daadas debido al
procesamiento y almacenamiento de la muestra. %ebido a ello en el an&lisis de estas muestras se
incluyen siempre etapas de enriquecimiento. 'l aislamiento generalmente se realiza en mas de un
medio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio slido). .os
medios selectivos m&s comunes utilizan in"ibidores como el colorante verde brillante o sales
biliares para bacterias que no son de origen fecal. Barios de estos medios son diferenciales porque
tienen adem&s lactosa o 1ilosa y un modo para detectar su fermentacin (indicadores de cambio de
pH) o lisina y la deteccin de la decarbo1ilacin. .a etapa siguiente es determinar si las colonias
aisladas pertenecen o no al g3nero Salmonella. .as pruebas bioqumicas y la serologa se usan de
rutina para la identificacin presuntiva en laboratorios de an&lisis microbiolgico. .a identificacin
definitiva se realiza en centros de referencia por serologa.
:ecuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros
debido a que el in"ibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en un
medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. 'n el reaislamiento se debe
observar si "ay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el an&lisis slo con las
colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie que se busca aislar.
!roblema
'n preparaciones farmac3uticas que contienen plantas medicinales la /armacopea 'uropea e1ige
ausencia de Salmonella en 97 g de la preparacin. !ara realizar dic"o an&lisis se realizan dos
etapas de enriquecimiento$ una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo con
tetrationato, bilis y verde brillante. 0 partir de all se aislan colonias en mas de un tipo de medio de
cultivo selectivo$ en uno de ellos, el 0gar Berde Irillante (que tiene adem&s lactosa, sacarosa y roo
fenol), crecen dos tipos de colonias$ 9) colonias que viran el medio a amarillo, -) colonias incoloras
que no viran el medio a su alrededor.
*)u&les colonias podran pertenecer al g3nero Salmonella+
#d. recibir& un reaislamiento de una colonia sospec"osa en medio 0gar .actosa :oo /enol.
*)mo crecera una cepa de Salmonella en ese medio+
*Su3 ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio de
cultivo debe realizar en el momento para determinar si dic"a colonia puede ser una especie de
Salmonella+
!&g.
*Su3 otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento+ %e acuerdo a ellas, *la cepa
que tiene en ese reaislamiento podra pertenecer al grupo de bacterias en el cual el @anual de
Iergey ubica a las especies de Salmonella+
*'n qu3 /amilia se ubica a las especies de Salmonella+ *Sue propiedades debera determinar
para distinguir esa /amilia de las otras de la misma seccin+
*'n qu3 caso puede afirmar que tiene un cultivo puro+
*!uede continuar con las etapas de identificacin+ Si no puede, *que procedimiento realizara+
%e acuerdo a la /armacopea 'uropea, la cepa sospec"osa que #d. tiene "asta a"ora (colonias
tpicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del g3nero Salmonella.
.a identificacin presuntiva se realiza con la prueba bioqumica llamada Jripe Sugar 4ron (JS4).
*'n que consiste esta prueba+
*Sue resultados espera para las distintas especies del g3nero Salmonella+ #tilice la tabla de
pruebas bioqumicas para 'nterobacterias resumida.
*!odra PperderseQ alguna cepa de Salmonella+ 's decir una cepa que, siendo Salmonella sp., no
la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en esta prueba.
.a /armacopea 'uropea recomienda la realizacin de otras pruebas bioqumicas y pruebas
serolgicas para la identificacin definitiva.
.a recomendacin de la 0merican !ublic Healt" 0ssociation (0!H0) para el an&lisis de alimentos
sigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebas
bioqumicas como la produccin de indol, y la descarbo1ilacin de lisina entre otras. :ecuerde
adem&s que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificacin las cepas no fermentadoras
de lactosa. *Sue cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas+
*'n que consisten estas pruebas+ Sue resultados espera para las especies de Salmonella+
*!odra PperderseQ alguna cepa de Salmonella en este caso+
*!odra darse el caso al rev3s, es decir que identifique como una especie del g3nero Salmonella a
una cepa que no lo es+
$roble)a III /P. aeruginosa0
0ntecedentes
'n el curso de una investigacin epidemiolgica de varios casos de infeccin por Pseudomonas
aeruginosa en una sala de atencin de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes o
reservorios de la bacteria en el ambiente.
#d. recibir& una placa de 0gar )etrimide sembrada con uno de los antis3pticos analizados,
cultivada durante -> "oras a ;C), en aerobiosis. Se solicita que determine si el antis3ptico pudo
ser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provoc los casos de
infeccin.
*Su3 tipo de medio de cultivo es el 0gar )etrimide+ *.as bacterias que crecen en 3l requieren
factores de crecimiento+ *:equiere altas concentraciones de 2a)l+

*0 cu&l seccin del @anual Iergey corresponde la o las bacterias en estudio+
*!odra tratarse de una bacteria aerobia estricta+ )omo "ara para confirmar que se trata de una
bacteria aerobia estricta+
*)u&l es el fundamento de los ensayos 6ing 0 y 6ing I+ Si una cepa creciera en 0gar )etrimide
con produccin de un pigmento difusible de color azul, realizara ambos ensayos+
!&g.
*'s el antis3ptico analizado un posible reservorio de la cepa que caus las infecciones en los
pacientes+
'l antis3ptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solucin de un compuesto de amonio
cuaternario. *'s posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa+
$roble)a I, /S. aureus)
0ntecedentes
.as bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Dram positivos, que
pueden ser patgenos para el "ombre. .as principales afecciones que producen son into1icacin
alimentaria, por produccin de una to1ina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel.
'1isten seres "umanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloa en narinas y piel. 0
partir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferacin constituye un riesgo
potencial para la salud p(blica por la posible produccin de enteroto1inas.
.as siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o el
n(mero de c3lulas de S. aureus:
0) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria.
I) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos
enteroto1ig3nicos
)) demostrar contaminacin post5proceso, que generalmente se debe a contacto "umano con
alimentos procesados.
.os alimentos que se sospec"a fueron vectores de una to1iinfeccin alimentaria debida a S.
aureus frecuentemente presentan altos n(meros de c3lulas del m.o.. 'n cambio, si se sospec"a
una contaminacin post proceso, puede esperarse una poblacin menor. 'n general S. aureus no
es el (nico m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para su
aislamiento y recuento.
.as especialidades farmac3uticas tambi3n se analizan para detectar S. aureus, debido a la
posibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. 'n este tipo de muestras, por lo general se
e1ige ausencia de S. aureus en 9 g de producto.
.os medios selectivos contienen in"ibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo de
otras especies. .os agentes selectivos m&s com(nmente usados en medios para S. aureus son
2a)l (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 8.8H y 97H) y telurito de
potasio (6-Je,;, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otros
cloruro de litio, polimi1ina, azida de sodio y neomicina.
%ebe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa in"ibicin de
otros m.o., como por eemplo miembros de los g3neros Bacillus, icrococcus, Streptococcus y a(n
levaduras. !or esta razn, la aparicin de colonias tpicas no es suficiente y debe confirmarse si
dic"as colonias tpicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a la
especie S. aureus.
!roblema
#na familia presenta sntomas de to1iinfeccin alimentaria - a > "oras despu3s de comer, con
n&usea, vmitos, diarrea y dolor abdominal. 'sta sintomatologa puede deberse al desarrollo de
elevados n(meros de S. aureus y formacin de to1ina en el alimento ingerido. Se decide analizar
una muestra remanente de queso artesanal que form parte de la comida, de modo de determinar
si el m.o. responsable fue S. aureus.
*Su3 m3todo puede usarse para aislar S. aureus de dic"a muestra si el m.o. estuviera presente en
n(meros altos+
!&g.
0 #d. se le entregar& una placa de @S0 proveniente de esta muestra. )onsiderando que las
bacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. *'s posible afirmar
que en la muestra "aba S. aureus+ *!or qu3+
'n caso de que "aya que continuar el an&lisis$
*)mo determinara si las colonias tpicas corresponden a S aureus o no+ *Su3 morfologa y
reaccin al Dram presenta el g3nero Staphylococcus!
*)mo se clasifican las bacterias de este g3nero seg(n sus relaciones con el o1geno+
*)mo puede diferenciarse el g3nero Staphylococcus de otros relacionados+ (%eber& recurrir a
Jablas del @anual de Iergey que tendr& para consulta en clase)
*)mo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del g3nero Staphylococcus+
!&g.
DETERMINACIONES CUANTITATI,AS DE LA %IOMASA + RECUENTOS
Se propone la siguiente clasificacin$
5# Recuentos /deter)inacin del n6)ero de )icroor!anis)os0
:ecuento en placa ya sea en superficie o incorporado
@3todo de las diluciones m(ltiples o del 2(mero @&s !robable (2@!)
/iltracin por membrana e incubacin de 3sta sobre medio de cultivo slido
:ecuento microscpico directo de los m.o., ya sea en frotis o en c&maras
/iltracin por membrana, coloracin del filtro, y conteo al microscopio .
)onteo electrnico, usando contadores de partculas.
7# Deter)inacin de la )asa celular
@edida de la masa
@edida del volumen
%eterminacin del contenido de 2
Jurbidimetra y nefelometra
8# Deter)inacin de la actividad celular
%eterminacin de una actividad enzim&tica
%eterminacin de un metabolito
@edida del consumo de o1geno
@edida de 0J!
)alorimetra
@edida de impedancia
:adiometra (de ),-)
0l momento de elegir la t3cnica de recuento a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestra
sobre la que se va a trabaar, porque es posible que algunos de los m3todos no sean aplicables.
)uando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparacin de la muestra se realiza de la
manera descrita anteriormente (toma de muestra). 'n las descripciones que siguen se denominar&
"omogeneizado a la muestra preparada para su an&lisis microbiolgico.
!&g.
RECUENTOS
RECUENTO EN $LACA
!ermite determinar indirectamente el n(mero de m.o. presentes en una muestra en base a que se
desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. !or lo tanto se determinan por este
m3todo slo las c3lulas microbianas B40I.'S en las condiciones de trabao (nutrientes, atmsfera,
temperatura). )omo las colonias pueden originarse tanto de una c3lula como de un grupo de
c3lulas, se utiliza el t3rmino$ #24%0%'S /,:@0%,:0S %' ),.,240S (u.f.c.) 0dem&s, a los
efectos de que todas las c3lulas que est&n en una placa tengan una adecuada disponibilidad de
nutrientes, y que la incertidumbre del m3todo sea menor, se establece que las condiciones ptimas
de recuento se dan cuando desarrollan entre ;7 y ;77 colonias por placa. 'sta regla general se
usa siempre que no "aya una especificacin diferente. !ara alimentos se utilizan el rango de
colonias ptimas entre -8 a -87 ufc por placa. Si fuera posible y necesario se puede repetir el
recuento para obtener placas con un n(mero de colonias ptimas.
$rocedi)iento
.a preparacin de la muestra se realiza como para cualquier m3todo utilizando diluyentes
adecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relacin muestraAvolumen de dilucin 9
en 97), partiendo en general de 97 g o m. de muestra en F7 m. de diluyente para la primera
dilucin (9A97 o 97
59
). !ara la segunda dilucin (9A977 o 97
5-
) se toma 9 m. de la 97
59
y se descarga
en F m. de diluyente y as sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga.
)ada vez que se prepara una dilucin en necesario "omogeneizarla adecuadamente para lograr
una distribucin de los m.o. en todo el volumen de dilucin. 'sto se logra por agitacin (si es un
frasco con tapn "erm3tico se realiza con agitacin durante -8 veces, formando un arco de apro1.
;7 cm y si es un tubo con agitacin con Borte1). Jambi3n puede cargarse y descargarse un
determinado volumen de la dilucin con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomar
el volumen deseado .
Seg(n la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar.
)uando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas '.$ 9$97
(97
59
), 9$977 (97
5-
), 9$9777 (97
5;
).
#na vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 98 minutos siguientes .
!&g.
02J'S %' !:,)'%': 0 .0 S4'@I:0 S' :,J#.02 .0S !.0)0S ),2 .,S S4D#4'2J'S
%0J,S$
4dentificacin de la muestra$ 2ombre yAo cdigo
%ilucin, Bolumen sembrado
Superficie o incorporado
/ec"a
,perador
SIEM%RA INCOR$ORADA
Se deposita 9 m. de cada dilucin en placas est3riles, vacas, por duplicado. Se puede emplear la
misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la m&s diluida. !osteriormente, se
agrega a cada placa 98 a -7 m. del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y
termostatizado a >8L) (en bao o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de
la mesa con movimiento circular, "orario y anti"orario yy "acia delante y "acia atr&s.
'n algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no m&s de ; m. por
placa.
SIEM%RA EN SU$ER4ICIE
Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 7.9 m. de cada
dilucin. Se realiza duplicado para cada dilucin. Se puede emplear la misma pipeta para todas las
diluciones si se comienza por la m&s diluida. .uego de realizada la descarga de la muestra, se
procede a e1tenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo
est3ril.
@edio de cultivo
Se elige seg(n el tipo de m.o. que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no
selectivos.
4ncubacin
#na vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso de
recuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde seg(n los
m.o. a contar, durante el tiempo propuesto en la t3cnica correspondiente.
INTER$RETACI2N
/inalizado el perodo de incubacin se observa con buena luz a efectos de visualizar todas las
colonias y diferenciarlas de cualquier partcula de muestra que pueda confundir. )ontar todas las
colonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un l&piz de tinta indeleble. Se cuentan
como colonias individuales todas aquellas que disten de las colonias pr1imas una distancia al
menos igual al di&metro de la colonia m&s pequea.
)uando se utilizan medios 2, S'.')J4B,S se procede de la siguiente forma$
9) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre ;7 y ;77 colonias (o -8 U -87). Se
"ace el c&lculo multiplicando por la inversa de la dilucin y luego se promedian Usi
corresponde5 los valores de las distintas placas y diluciones. !ara el informe final se toma en
cuenta solo los valores de estas placas.
Si no "ay placas que contengan entre ;7 y ;77 colonias proceder de la siguiente manera$
-) Si slo "ubieran placas con menos de ;7 colonias, se "ace el c&lculo multiplicando por la
inversa de la dilucin y se informa igualmente el resultado, e1pres&ndolo por g o m. de
muestra. 'n este caso se informa el resultado como 'SJ4@0%,.
Si no "ubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como$ @enor que 9 o 97 (seg(n
sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilucin menor.
!&g.
;) Si en todas las placas "ubiera m&s de ;77 colonias, se estima el resultado. Si no es
posible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar el
resultado como mayor de ;77 por la inversa de la dilucin mayor. Si es posible distinguir
colonias individuales y est&n "omog3neamente distribuidas, se cuentan las colonias en una
superficie conocida de la placa y luego se e1trapola a la superficie total de la placa$ ?8 cm
-
para las de vidrio comunes, o 8C cm
-
para las de pl&stico.
Se siguen las siguientes reglas$
Si "ay menos de 97 colonias por cm
-
, se cuentan 9; cuadrados de 9 cm de lado$ C
consecutivos "orizontales y ? consecutivos verticales. 'l total de colonias contadas se
multiplica por 8 o >.> seg(n el tipo de placa, para estimar el n(mero de colonias en
toda la placa. 'n este caso se informa el resultado como 'SJ4@0%,
Si "ay m&s de 97 colonias por cm
-
, se cuentan > cuadrados de 9 cm de lado, y el
promedio se multiplica por ?8 o 8C seg(n el tipo de placa. 'n este caso se informa el
resultado como 'SJ4@0%,
Si "ay m&s de 977 colonias en 9 cm
-
, no se cuentan sino que se estima el
resultado como mayor de ?877 o 8C77 por placa.
#na vez estimado el n(mero de colonias por placa, se aplica el factor de conversin para
e1presar el resultado por gramo o m. de muestra, de acuerdo al m3todo (incorporado o
superficie), y a las diluciones sembradas.
's frecuente que desarrollen colonias e1tendidas sobre la superficie o el fondo y bordes de la
placa, o que se den cadenas de colonias unidas. 'ste tipo de crecimiento se denomina WspreadersW
y se cuentan como una. )uando el spreader cubre m&s del 87H de la placa, esta no debe
contarse. )uando el spreader cubre una superficie menor del 87H, se cuentan las colonias en el
resto de la placa, S,., si est&n uniformemente distribuidas.
Si en todas las placas "ay spreaders se informa $ Spreaders
Jodas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos
anteriores, (e.$ contaminacin, mal funcionamiento del medio), se informa como$ W0ccidente de
laboratorioW
)uando se emplean medios S'.')J4B,S, el n(mero de colonias que se considera ptimo para
contar, suele ser menor de ;77, es necesario referirse a la t3cnica correspondiente (de referencia)
a los efectos de la interpretacin de los resultados.
B'2J0X0S V %'SB'2J0X0S %' 0@I,S @YJ,%,S$
Incor'orado Su'ericie
@ayor cantidad de muestra. @enor cantidad de muestra
@ayor precisin @enor precisin
@eor aprovec"amiento de nutrientes !eor aprovec"amiento de nutrientes
%ificultades al subcultivar colonias /acilidad para subcultivar colonias
Bisualizacin de colonias dificultosa /&cil visualizacin
Jemperatura del agar puede afectar la
viabilidad de algunos m.o.
2o se afectan los m.o. termosensibles
Se desarrollan m.o. microaerofilicos
'n aerobiosis slo crecen aerobios y anaerobios
facultativos
!&g.
'1presin de los resultados$
Se informan los resultados de recuento con slo DOS CI4RAS SI-NI4ICATI,AS, redondeando los
valores cuando corresponda. :edondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si la
tercera cifra es ? ,C, = o F. :edondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si la
tercera cifra es 9, -, ; y >. Si la tercera cifra es 8 redondear "acia arriba si la segunda cifra es
impar y "acia abao si es par
'.$ 9;C se informa 9>7 9,> 1 97
-
9>8777 se informa 9,> 1 97
8
'n el informe de un recuento en placa se e1presa,$
:ecuento de ..............(tipo de microorganismo)$ Z u.f.c. Ag o m.
NUMERO MAS $RO%A%LE /NM$0 O METODO DE LOS TU%OS MULTI$LES
Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de m.o. (en funcin
de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio), en cantidades
decrecientes de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de
la muestra cada vez menores inoculadas en un medio lquido. !or eemplo, se utilizan un total de
nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 7,9 g. de muestra, en tres 7,79
g y en los otros tres restantes 7,779 g. .uego de la incubacin, se observan y cuenta el n(mero de
tubos positivos.
Seg(n el tipo de m.o que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo o medios
nutrientes. 'n funcin de esto se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que$
9) Hubo crecimiento que se detecta como aparicin de turbidez (siempre que la muestra
sembrada no enturbie el medio).
-) %eteccin de productos del metabolismo del m.o.
a) produccin de gas que se observa en una campanita invertida (%ur"am) en el tubo.
c) virae de indicador (de pH, de potencial redo1, etc).
d) produccin de pigmento.
e) otros (reduccin de 2,;
5
, produccin de indol, "idrlisis de una protena, etc)
,casionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente
positivos a placa, o a otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo.
'l n(mero de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de
esta etapa de confirmacin, siendo el valor anterior slo un valor presuntivo. .a interpretacin de
los resultados, se "ace en base a una distribucin de tipo !oisson, y en general se emplean tablas
preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos.
'emplo 9$
2L de tubos sembrados$ ; ; ;
Bolumen por tubo (m.) 9 9 9
%ilucin de la muestra$ 97
5-
97
5;
97
5>
'quivalente en g de muestra 7,79 7,779 7,7779
Jubos positivos ; 9 7
'l resultado ;5957 se busca en tabla 444 y se obtiene un valor de >;Ag m., cuando en la primer
serie de tubos se siembra 7,9 g. )omo en nuestro caso no estamos en condiciones "ay que
realizar la conversin. 'n este caso resulta claro que estamos sembrando diez veces menos en la
!&g.
primera serie de tubos (7,79 g), por lo tanto el factor a utilizar es multiplicando el resultado de tabla
por diez. 'l resultado a informar es entonces$ 2@! de (tipo de m.o) E >;Ag.
#na manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de la
dilucin sembrada en la serie del medio. '$
'emplo -$
2L de tubos sembrados$ 8 8 8
Bolumen de muestra en cAu (m.)$ 97 9 7,9
2(mero de tubos positivos$ - 7 7
(dos tubos positivos para la primera dilucin, ninguno en las siguientes)
%e la tabla 4B surge el valor$ 8Am.. )omo la siembra no esta realizada en las condiciones de la
tabla debe aplicarse el factor de correccin.
'l resultado final se informa$ 2@! de .... (tipo de m.o)$E 8 1 9A97
7
E 7,78Am. 8A977 m.
977
Si la muestra es agua es "abitual informar el resultado por 977 m..
!&g.
; 9 7 en Jabla 444 >;Ag
2@! de tipo de m.oAm. E >; 1 9Adilucin de la serie del medio E >; 1 9A97
5;
E >;7Ag >,; 1 97
-
Ag
977 977
's de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que est3 construida para
condiciones similares a las de trabao, que sea para igual n(mero de tubos por serie, y para
cantidades de muestra que sean m(ltiplo o subm(ltiplo ya que "ay variedad de tablas seg(n el
n(mero de tubos y diluciones a sembrar.
.a correccin se "ace utilizando proporcionalidad inversa. 'n todos los casos el valor informado se
considera un ndice de la carga microbiana, y se conocen los lmites de confianza para cada valor.
%ado que la distribucin de las c3lulas obedece una distribucin de !oisson puede calcularse el
n(mero de c3lulas promedio de la dilucin sembrada cuando no se trabaa en las condiciones m&s
comunes para las que e1isten tablas, usando la siguiente ecuacin$
2@!Ag o m. E [[[[[[[[[[[2L de tubos positivos[[[[[[[[[[[[[[[[[[[[

(m. o g de muestra Z m. o g de muestra)
en tubos negativos en todos los tubos
B'2J0X0S V %'SB'2J0X0S %'. @YJ,%,$
!uede emplearse para aquellos m.o. que no crezcan en medio slido y para aquellos m.o. de
crecimiento lento (paras los cuales se evidencia el crecimiento por una reaccin y no por turbidez)
'ste m3todo es especialmente (til para determinar cargas microbianas baas, menores de 97 por
gramo para slidos o menores a 9 por 97 m. para lquidos, pero puede igualmente emplearse para
cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas.
0simismo, es el (nico m3todo a utilizar en el caso de muestras como por eemplo polvos
insolubles, en los que no es aplicable el m3todo de filtracin ni es recomendable el recuento en
placa debido a la presencia de partculas.
Se prefiere tambi3n este m3todo cuando los m.o. son de lento crecimiento, o cuando "an sido
sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.)
's posible enumerar tambi3n por este m3todo m.o. anaerobios utilizando en los tubos medio
prerreducido, que se tapan con vaselina5parafina luego de inocular, e incuban en condiciones
aerobias.
4ILTRACION $OR MEM%RANA
'ste m3todo consiste en "acer pasar un volumen determinado de muestra lquida, o solucin en
agua o en solvente apropiado est3ril a trav3s de un filtro de membrana est3ril (di&metro 87 mm,
poro 7,>8 m), colocado en un equipo de filtracin.
.uego de enuagar con soluciones est3riles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la
superficie de una placa de !etri con el medio de cultivo a utilizar e incuba.
.os filtros pueden ser de distintos materiales\ en microbiologa se emplean de nitrato o acetato de
celulosa generalmente, y pueden tener bordes "idrofbicos, que minimizan la adsorcin de
conservadores y antimicrobianos.
.uego de transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se
considera que las condiciones ptimas del m3todo se dan cuando desarrollan entre -7 y -77
colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y e1isten reglas para el conteo$
!&g.
9) Si "ay 9 o - colonias por cuadrado del retculo, o menos, se cuentan todas.
-) Si "ay entre ; y 97 por cuadradito, se cuentan 97 cuadrados, y se promedia, multiplicando
por 977 para obtener el n(mero de colonias en el filtro (se multiplica por 977 porque el &rea
del cuadrado representa la cent3sima parte del &rea total del filtro).
;) Si "ay entre 97 y -7 se cuentan 8 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 977.
>) Si "ay m&s de -7 se considera ]-777 por filtro
Joda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como 'SJ4@0%,.
Bentaas y desventaas$
Sirve para determinar cargas muy baas, pues se puede filtrar vol(menes de 977 y "asta 9777 m..
's adem&s el m3todo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentes
antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos.
'1presin de los resultados$
#na vez conocido el n(mero de colonias por filtro, se e1presa el valor en u.f.c. al igual que el
recuento en placa e1pres&ndolo por gramo, o mililitro de muestra.
RECUENTO MICROSCO$ICO DIRECTO
'ste m3todo permite determinar el n(mero de c3lulas microbianas, por observacin en el
microscopio. .a muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida como lec"e o cultivos puros en
medio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros m3todos de
recuento.
Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, c&maras
del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente diseadas para contar "ongos en alimentos
como la c&mara de Ho^ard.
Se determina el n(mero J,J0. de c3lulas presentes (B40I.'S V 2, B40I.'S) ,casionalmente
se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las c3lulas. !or
eemplo en un recuento en c&mara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden
distinguir las c3lulas B40I.'S (no absorben el colorante, se ver&n transparentes) de las 2,
B40I.'S (absorben el colorante y se ver&n azules).
Recuento sobre rotis coloreado
Se marca sobre un portaobetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 9 cm de lado. Sobre la
superficie opuesta del portaobetos, se deposita en el centro 7,79 m. de muestra ya sea con ansa
calibrada o con micropipeta. Se e1tiende por todo el cuadrado con ansa. Se dea secar en posicin
"orizontal. Se fia y colorea, ya sea por Dram o con azul de metileno 9 minuto (m3todo de Ireed
para lec"e).
Se observa por inmersin, contando los m.o. en cada uno de varios campos. 'l n(mero de campos
a contar depende del n(mero de m.o. por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla
que se propone para el recuento directo en lec"e (Standard @et"ods for t"e '1amination of %airy
!roducts 0!H0)
2(mero de campos a contar seg(n el factor del microscopio y el n(mero de microorganismos$
!&g.

@icroorganismos por campo
/actor del microscopio
;77777 >77777 877777 ?77777
@enos de 9 ;7 >7 87 ?7
9 a 97 -7 -7 -7 ;7
@&s de 97 97 97 97 -7
)&lculo del factor del microscopio
)on obetivo de >7 1, o 977 1, se mide el radio del campo utilizando un portaobetos calibrado, o el
retculo de una c&mara cuenta glbulos. Si se utiliza el de >7 1, luego debe "acerse la correccin
utilizando el factor >7A977 para llevarlo al aumento de trabao.
Se calcula el &rea del campo$ r
-

'l n(mero de campos por cm
-
es$ 9 A r
-
Si se e1tendi en 9 centmetro cuadrado 7,79 m. de muestra, el n(mero de campos por mililitro,
llamado /actor del @icroscopio (/@), se calcula de la siguiente forma$
/@ E 977 A r
-
donde r se e1presa en cm, o /@ E 97777A r
-
con r en mm.
'1presin de resultados
#na vez contado el n(mero de m.o. en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica por
el /actor del microscopio\ de esa forma se obtiene el resultado que se e1presa en t3rminos de$
:ecuento microscpico directo E 2 microorganismos por m.
Recuento en c9)ara de Neubauer
's una c&mara que se utiliza para contar glbulos ('n ' se cuentan eritrocitos y en . los
leucocitos) y est& diseada de manera de contener una cantidad fia de lquido. )onsta de un
cuadrado central de 9 mm de lado dividido en -8 cuadraditos. )ada uno de ellos est&, a su vez,
dividido en 9? cuadrados.
Se coloca un cubreobetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos "ombros laterales de
manera que cuando "ay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 7.9 mm entre el
cubreobetos y la c&mara. 'sto determina que el lquido quede contenido en un volumen de 7.9
mm
;
.
Bentaas del m3todo$
's r&pido
.os frotis se pueden guardar
.as e1igencias de equipo son mnimas
Se pueden observar las diferentes morfologas de los m.o.
Se observan tanto los m.o. viables como los no viables
%esventaas del m3todo$
.a cantidad de muestra analizada es poca
!rovoca cansancio del operador
Slo sirve para muestras con cargas superiores a 97.777 por m..
's difcil distinguir los m.o. de las partculas de muestra
#na inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobetos puede ocasionar
serios errores.
!&g.
DETERMINACI2N DE LA MASA CELULAR
J#:I4%4@'J:_0
'ste m3todo da informacin sobre el contenido de macromol3culas, y no sobre el n(mero de
c3lulas.
'n el laboratorio de microbiologa se usa un colormetro, o un espectrofotmetro y se mide la
absorbancia de la suspensin de m.o. en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado,
y sin sembrar. )uanto mayor es el n(mero de c3lulas en suspensin, tanto menor es el porcentae
de luz que atraviesa el medio.
Se cumple una ley similar a la de .ambert5Ieer y
e1presando la relacin en t3rminos de masa microbiana y
absorbancia, la ecuacin es la siguiente$
0E N 1 M$
donde$ 0bsorbancia
N$ constante
M$ masa celular
.a gr&fica correspondiente construida con valores reales
muestra una desviacin a medida que aumenta la masa microbiana.
!ara utilizar la medida de la absorbancia como m3todo de recuento, es necesario "acer para cada
m.o. una curva de calibracin, midiendo el n(mero de m.o. por otro m3todo de recuento. 'l m3todo
se emplea fundamentalmente para preparar inculos, cuando se trabaa con cultivos puros.
'S)0.0 %' @0) /0:.02%
!&g.
0
M
'1iste la posibilidad de estimar cargas altas de m.o., comparando a simple vista con una escala
formada por tubos numerados de 9 a 97 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario.
Se conoce la cantidad apro1imada de c3lulas bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esa
forma se puede estimar la cantidad de m.o. presentes. 'ste m3todo slo da una estimacin del
n(mero de m.o. (viables y no viables) y sirve slo para cargas altas. Jiene la ventaa de ser muy
r&pido y no es necesaio disponer de espectrofotmetro.
Jubo @illones de bacteriasA m.
9 ;77
- ?77
; F77
> 9.-77
8 9.877
? 9.=77
C -.977
= -.>77
F -.C77
97 ;.777
!&g.
AL-UNAS A$LICACIONES DE RECUENTOS
MICROOR-ANISMOS INDICADORES
.os m3todos usados para el aislamiento y el recuento de los m.o. patgenos en agua, alimentos,
etc. pueden no ser eficaces debido a que dic"os m.o. se encuentren en muy baa cantidad, sobre
todo en presencia de n(meros altos de otros m.o. Jambi3n puede ocurrir que tengan una
distribucin irregular en la muestra. 0(n cuando se cuenta con m3todos sensibles, en general son
largos y costosos\ adem&s, "ay patgenos que no pueden determinarse en laboratorios no
especializados, como, por eemplo, el virus de la "epatitis 0. 'stas dificultades "an impulsado a
que se utilicen grupos de m.o. de deteccin y enumeracin m&s f&ciles y cuya presencia en cierto
n(mero se considera como una indicacin de que la muestra estuvo e1puesta a condiciones que
pudieron determinar la llegada a la misma de m.o. peligrosos yAo permitir la proliferacin de
especies patgenas. 'stos grupos de m.o. se denominan indicadores.
Se usan como m.o. indicadores aquellos cuya relacin con los patgenos "a sido
estudiada.
.os indicadores utilizados m&s frecuentes son$
5 mesfilos aerobios totales o "etertrofos
5 'nterobacterias
5 )oliformes totales y fecales
5 'streptococos fecales y 'nterococos
5 )lostridios sulfito5reductores
A-UA
'l an&lisis microbiolgico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de 3sta y su
aptitud para distintos usos. 'n general, los m3todos utilizados est&n diseados de modo de
detectar el grado de contaminacin del agua con desec"os de origen "umano yAo animal.
Jradicionalmente se "an usado ensayos para la determinacin de m.o. indicadores m&s que para
la determinacin de patgenos.
'l grupo de bacterias coliformes "a sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos
tipos de agua\ el n(mero de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminacin y
por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma.
.os coliformes son bastones Dram (5), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa
con formacin de gas cuando se incuban >= "oras a ;8L). 4ncluye los g3neros 'sc"eric"ia,
'nterobacter, 6lebsiella y especies lactosa positivas de otros g3neros. Jambi3n interesa la
determinacin de coliformes fecales que representan la fraccin de coliformes que provienen de
intestinos y materias fecales de "ombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes).
'sto provee informacin importante sobre la fuente y el tipo de contaminacin presente.
#n m3todo muy utilizado para el recuento de coliformes en agua "a sido siempre el 2@!, pero "an
ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las t3cnicas de manera de obtener cada vez
mayor sensibilidad y precisin "asta "acerlo aceptable como m3todo est&ndar. .os distintos
m3todos de 2@! para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una seleccin de los
m.o. que producen gas de lactosa a ;8L). !or ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos
de alg(n caldo lactosado, con tubo de fermentacin para recoger el gas que pueda producirse. 0
esto sigue una confirmacin en un medio lquido selectivo yAo una determinacin de los coliformes
!&g.
fecales cuya diferenciacin se realiza en base al "ec"o de que pueda producir gas de lactosa en
un medio apropiado cuando se incuba a >>,8L) mientras que los dem&s coliformes no.
Jambi3n es muy utilizado el m3todo de filtracin por membrana para el recuento de bacterias
coliformes totales y fecales. 's un m3todo altamente reproducible, puede usarse para analizar
vol(menes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el
2@!. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones.
Jambi3n se encuentra entre los m3todos est&ndar. 0 los efectos de la filtracin por membrana debe
replantearse la definicin de coliformes$ bastones Dram 5, aerobios o anaerobios facultativos, que
dan colonias oscuras con brillo met&lico en medio 'ndo, luego de -> "s. de incubacin a ;8L). .a
determinacin de coliformes fecales por filtracin puede "acerse a partir de las colonias
desarrolladas en 'ndo o directamente incubando la membrana en medio m5/) e incubando a
>>,8L).
!ara la deteccin simult&nea de coliformes totales y 'sc"eric"ia coli se puede utilizar la prueba de
sustrato enzim&tico. 'n este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas las
bacterias que presentan la enzima beta5%5galactosidasa, que "idroliza el sustrato cromog3nico (por
eemplo, ,2!D) liberando el cromgeno. )omo '. coli se incluyen todas las bacterias que dan
positiva la reaccin de coliformes totales y que tienen actividad beta5glucuronidasa, que "idroliza el
sustrato fluorog3nico (por eemplo, @#D), liberando el fluorgeno.
Jambi3n se usa como indicador de contaminacin fecal el grupo 'streptococos fecales que
incluyen especies de 'streptococos grupo % de .ancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium,
Streptococcus e"uinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo S (Streptococcus
avium). 'l grupo 'nterococos estara includo dentro de estreptococos fecales y comprende las
especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen "umano) y tambi3n se usa
como indicador de contaminacin fecal en agua.
'l "&bitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del "ombre y los animales de sangre
caliente, por lo tanto son indicadores de contaminacin fecal, sobre todo en muestras de lagos,
estuarios, ros, etc. .a identificacin de las especies puede proporcionar informacin sobre la
fuente de contaminacin debido a que algunas especies son especficas de sus "u3spedes\ por
eemplo, una predominancia de S. bovis o S.e"uinum indicara una contaminacin por "eces no
"umanas.
'l recuento de "etertrofos totales consiste en un m3todo estandarizado para determinar la
densidad de bacterias "etertrofas, mesfilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. 0s se
obtiene informacin (til que se estudia unto con el ndice de coliformes\ tambi3n se le usa para
controlar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego de
recorrer toda la red de distribucin.
Jambi3n interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tipos
de agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.)
,tro grupo de indicadores que "a comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. .os
colifagos son bacterifagos de coliformes que se encuentran siempre que "aya coliformes totales y
fecales. %e acuerdo a estudios de correlacin entre n(mero de colifagos y coliformes en agua, se
podra utilizar el ndice de colifagos como ndice de calidad sanitaria de agua. 0dem&s, como son
m&s resistentes a la cloracin que los coliformes, pueden ser meores indicadores de desinfeccin
que 3stos (ltimos.
'l m3todo de enumeracin se basa en la formacin de playas de lisis. .os colifagos (bacterifagos)
infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. 'sto provoca la lisis celular de esas
bacterias y liberacin de partculas virales que infectar&n a las c3lulas bacterianas adyacentes. 0
medida que 3stas bacterias se vayan lisando, se formar&n zonas claras, conocidas como Pplayas
!&g.
de lisisQ, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. .a cepa utilizada en los ensayos es
una cepa de '. coli sensible a la infeccin por colifagos (0J)) 9;C7?). .a metodologa empleada
est& descripta en el PStandards @et"ods for t"e e1amination of ^ater and ^aste^aterW.
I4I.4,D:0/_0
.os m3todos de referencia para los an&lisis antedic"os se pueden encontrar en$
5 WStandard @et"ods for t"e '1amination of Mater and Maste^aterW, 0!H050MM05M!)/, -7
t"
'd.
2ormas #24J$ =8?5F9, =8C5F9, =8=5F9, =F;5F9, =F>5F9, F>-5F;, F>;5F;.
2ormas 4S, (varias)
.as normas vigentes en nuestro pas respecto a la calidad microbiolgica de los diversos tipos de
agua se pueden encontrar en$
5 2ormas de calidad de agua potable...````` ,S'
5 :eglamento Iromatolgico 2acional ````` ,rdenanza !.'. ;98AF>
5 ,rdenanza Iromatolgica @unicipal ...................4.@.@ (%ecreto -C-;8)
5 2orma =;;AF7....................`````````...#24J
5 %ecreto -8;ACF (9-A=F).....```````...........!oder 'ecutivo
5 %ecreto 9?-;8 (9FC>)....```````..............Xunta de Becinos de @ontevideo
!ara el an&lisis de diferentes tipos de muestras, y los lmites aconseados se puede consultar$
5 Standard @et"ods for t"e e1amination of %airy !roductsW, 0!H0, 9? t" 'd., 9FF-.
5 #.S. /ood and %rug 0dministration Iacteriological 0nalytical @anual, 0,0),Dait"ersburg, @%,
=t" ed., 9FF8..
5 ,fficial @et"ods of 0nalysis of t"e 0ssociation of ,fficial 0nalytical )"emists, 9?
t"
'd., 9FF8.
5 @icroorganisms in foods 9 a -W 4)@S/.
5 #S! -=.
5 :eglamento Iromatolgico 2acional
5 2ormas #24J (varias)
5 ,rdenanza Iromatolgica @unicipal (4@@)
5 )ompendium of @et"ods for t"e @icrobiological '1amination of /oods, 9FF-, ;
rd
'd.
5 /armacopea 'uropea y suplementos
5 2ormas 4S, (varias)
!&g.
E*ERCICIOS DE RECUENTOS
9) Se realiza un recuento en placa de una muestra slida por siembra incorporada de 7,8 m. en
cada placa en B:I0 de las diluciones que se indican. Se incuba -> "s a ;8 L). Se cuentan las
colonias roas desarrolladas. 4nforme claramente los recuentos para los siguientes resultados$

@uestra
%ilucin sembrada y n(mero de ufc
97
5-
97
5;
97
5>
9 7 7 7
- 9F7 -= 7
; ] ;77 99> F
> 8 7 7
-) Se realizaron recuentos por 2@! en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se
sembraron tres tubos por dilucin, (9 m. de dilucin por tubo) y se incub a ;8L) durante >=
"oras. *)mo informara los recuentos si obtuvo los siguientes resultados+$

@uestra
%ilucin sembrada y tubos positivos
97
5-
97
5;
97
5>
0 ;A; 9A; 7A;
I ;A; ;A; ;A;
;) %isear un m3todo de recuento para cada uno de los siguientes casos$

a) %eterminar la aceptacin o rec"azo de una muestra de carne a la que se le acepta un
lmite de S aureus de 97
>
Ag.
b) %eterminar la aceptacin o rec"azo de una muestra de "arina a la que se le e1ige menos
de 977 microrganismos aerobios mesfilos por gramo.
>) 'n una muestra de almidn se e1ige una carga bacteriana menor de 97
8
Ag. *)u&l de los
siguientes m3todos utilizara para el an&lisis y cu&les no+ /undamente su eleccin y disee el o los
e1perimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin).
:ecuento en placa
:ecuento microscpico directo
2@!
Jurbidimetra
8) '1plique que m3todo (vol(menes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin)
utilizara para "acer el recuento de coliformes en agua potable si la e1igencia es de 7A977 m..
!&g.
?) Se realiz el recuento en una muestra de agua de pozo por filtracin. Se filtraron 97m. de la
dilucin 9A97 (59), se coloc la membrana en una placa de JS0 y se incub por >="s, se contaron
;7 colonias en la placa. *)mo se e1presa el resultado+
C) *)mo informara el recuento por 2@! de las siguientes muestras de agua de playa con los
siguientes resultados+
@uestra 9. (se sembr 9 m. de cada dilucin se incubaron los tubos a ;8<) por >= "s.)
@edio
%ilucin sembrada y tubos positivos
59 5- 5;
).J ;A; ;A; -A;
).IBI (subcultivo) 9A; 7A; 7A;
@uestra -. (se sembr 9 m. de cada dilucin se incubaron los tubos de ).J a ;8<) por
>= "s. y ') a >>,8 <) por -> "s.)
@edio
%ilucin sembrada y tubos positivos
5- 5; 5>
).J -A; 9A; 7A;
') (subcultivo) 7A; 7A; 7A;
=) .as normas vigentes para la calidad microbiolgica del pescado fresco indican$
nE 8, cE;, mE97
?
@E97
C
Hetertrofos mesfilos.
nE 8, cE;, mE97
>
@E97
?
Hetertrofos psicrfilos.
nE 8, cE;, mE97
;
@E-197
;
Staphylococcus aureus.
nE 8, cE;, mE> @E>77 )oliformes fecales.
*)mo "ara cada recuento+ 'specificar el m3todo, las diluciones, medios de cultivo y temperatura
de incubacin.
F) .as normas de calidad microbiolgica de un producto farmac3utico lquido de uso oral indican$
un lmite de 877 ufcAm. para bacterias "etertrofas.
Se realiza el recuento del producto en JS0 de dic"o producto (que contiene parabenos) sembrando
9 m. (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados$
%ilucin sembrada y n(mero de ufc
7 59 5-
; >7 8
%e acuerdo a estos resultados *qu3 puede concluir+
!&g.
Se realiza la validacin del procedimiento e1puesto en el eercicio anterior. !ara ello se prepara
una suspensin de un cultivo de E. coli . Se realiza el recuento de esta suspensin de E. coli y se
obtiene$
:ecuento en placa (JS0) en superficie (7,9m.)
!ara realizar la validacin, se inocula 9 m. de la dilucin UC de la suspensin de E. coli preparada
anteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del producto
lquido (7, 59 y 5-) y se obtiene el siguiente resultado$
*Se considera el m3todo validado+
*Su3 recomendaciones "ara para analizar esta muestra+ *!odra utilizar otro m3todo+.
!&g.
%ilucin sembrada y n(mero de ufc
58 5? 5C
;8= C7 ?
%ilucin sembrada de producto (K suspensin) y
n(mero de ufc
7 59 5-
88 99; C8
MUESTREO $ARA ANALISIS MICRO%IOLO-ICO
.a primera etapa del an&lisis microbiolgico es la e1traccin de la o las muestras de un lote y
cualquier resultado carece de significado si la muestra no "a sido apropiadamente tomada. 's
responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizar& es
representativa del lote y rec"azarla antes de realizar el an&lisis si se tiene indicios de que no lo es.
Deneralmente en los te1tos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las
&reas clnicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en
primera instancia. 0qu sealaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres
(ltimas &reas.
'l lote es el n(mero de unidades o la cantidad de un producto que "a sido sometido a las mismas
condiciones durante un proceso determinado. 'sta es una consideracin terica puesto que es
difcil asegurar la uniformidad durante la mayora de los procesos conocidos. !or e. en una
esterilizacin por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin
embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia
constituyen un lote.
Se considera que una muestra o un conunto de muestras son representativas de un lote cuando
reflean, tanto como sea posible, la totalidad del lote.
!ara determinar que la muestra es representativa y que no se "a alterado despu3s de la e1traccin
deben tenerse en cuenta las etapas de$ recoleccin, transporte y preparacin para el an&lisis
propiamente dic"o.
50 Recoleccin
.os planes de muestreo determinan el n(mero, tamao y zonas de recoleccin de la muestra. Se
disean por criterios estadsticos teniendo en cuenta adem&s algunas caractersticas del producto
tales como$
5 riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el n(mero de
muestras para dismimuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada
5 facilidad de "omogeneizar el lote. Si la produccin es en batc" y el producto es f&cilmente
mezclable, como un lquido, se requiere menor n(mero de muestras que si no lo es\ si el lote es un
conunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se e1traer&n
muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos
crticos (en el eemplo del autoclave 3stos seran las zonas donde se alcanza menor temperatura).
0 su vez deber considerarse la "omogeneidad dentro de la unidad o envase, p.e. en un alimento
congelado "ay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que
la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento.
5 posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual "a sido sometido el producto\
cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento "a sido correcto para la totalidad del lote, se
requiere menor n(mero de muestras.
%ebe tenerse en cuenta que el aumento del n(mero de muestras est& restringido por el costo del
an&lisis y porque e1iste un lmite por encima del cual no "ay un aumento significativo de los
intervalos de confianza.
!&g.
.a muestra se e1trae de unidades cuyo envase e1terno est3 inalterado. .a e1traccin se realiza en
forma as3ptica para evitar la contaminacin de la muestra y del resto del contenido del envase. .a
muestra debe identificarse con un n(mero, fec"a, origen, contenido e iniciales del e1tractor.
70 Trans'orte
!ara un producto almacenado en batc" la muestra se toma y transporta en recipientes previamente
esterilizados y "erm3ticos. 'l transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de
almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (7L5>L)) por no mas de
->"s. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento.
'l recipiente de transporte no debe llenarse completamente ("asta un C8H de su capacidad) para
permitir "omogenizar.
80 $re'aracin 'ara el an9lisis
Se debe realizar la observacin macroscpica de la muestra y del envase de transporte y registrar
cualquier particularidad. Se procede a la "omogeneizacin de la muestra mediante manipulacin
as3ptica.
Si es un slido o una pasta se diluye en buffer o agua peptonada est3riles y se mezcla en una
licuadora o en bolsas de pl&stico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.e. una
pomada) se termostatiza en el diluyente a ;8L) para lograr una emulsin.
Si el an&lisis se realizar& por filtracin es necesario disolver el producto en un solvente org&nico
inocuo para los m.o. (p.e.miristato de isopropilo).
!ara alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 97 g y que la relacin con el diluyente
sea 9$97. 'sta dilucin debe prepararse inmediatamente antes del an&lisis.
0!.4)0)4,2'S.
4) @uestreo de equipos y utensilios.
Se puede realizar por varios m3todos$
a) 'nuagado$ consiste en enuagar el equipo con un vol(men medido de medio de cultivo o de
buffer, el cual es sometido al an&lisis microbiolgico.
b) )ontacto de superficie$ consiste en pasar un "isopo embebido en buffer por un &rea
determinada del equipo y posteriormente descargar el "isopo en un vol(men medido de diluyente
el cual es analizado. 'ste m3todo es recomendado para zonas de difcil acceso, en cambio para
&reas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con un cilindro de agar
del di&metro de una placa de !etri el cual se corta as&pticamente, y se e1presa el resultado por
&rea de contacto (:eplicate ,rganism %irect 0gar )ontact !lates).
c) 4nmersin$ los utensilios se sumergen en un vol(men determinado de diluyente y se determina el
n(mero de m.o. por unidad.
44) @uestreo de aire.
a) Sedimentacin$ se e1ponen placas de agar durante 98b a -" dependiendo de la contaminacin
del &rea a analizar. Se detectan slo los m.o. que est&n ad"eridos a partculas sedimentables.
!&g.
b) 4mpacto$ se "ace pasar un vol(men determinado de aire mediante aplicacin de vaco a trav3s
de una serie de tamices que retienen distinto tamao de partcula. .os tamices son incubados
sobre agar y se puede determinar el n(mero de m.o. asociados a partculas de distinto tamao.
c) 4mpregnacin de lquidos$ consiste en "acer burbuear un vol(men determinado de aire a trav3s
de un diluyente est3ril el cual retiene los m.o. presentes.
Iibliografa
5 )ompendium of @et"ods for t"e @icrobiological '1amination of /oods. 0!H0 (0merican !ublic
Healt" 0ssociation), 9FC?. 'd.SpcecN,@.
5 @icroorganismos in /oods -$ Sampling for microbiological analysis, !rinciples and specific
applications.
4)@S/ (4nternational commision on @icrobiological Specifications for /oods), 9FC>. 'd. 4ngram,@.
5 Standard @et"ods for t"e '1amination of Mater and Maste^ater 0!H0, 9FC?. 9>t". ed.
'd.:and,@.
!&g.
,ALIDACI2N
CONCE$TOS
Balidar un proceso cualquiera significa verificar que el procedimiento seguido es el adecuado para
obtener el fin propuesto. !or eemplo para validar un proceso de llenado as3ptico de ampollas
inyectables se prepara un lote en el que se sustituye el producto con medio de cultivo. Se incuba
entonces las ampollas y se observa si "ay o no crecimiento, lo que validar& o no, el procedimiento
de llenado.
!ara validar un proceso de esterilizacin de un producto en un envase dado, se prepara un lote de
envases llenos con medio de cultivo inoculado con una cepa adecuada. .uego del ciclo de
esterilizacin se incuba y se observa el crecimiento.
'ste concepto se puede aplicar a un proceso analtico. !or eemplo, si se busca yodo en una sal de
mesa, se ensaya la t3cnica de an&lisis en una muestra adicionada de determinada cantidad de
yodo demostrando as que con la t3cnica empleada se puede detectar el yodo en la concentracin
buscada.
'l concepto de validacin es de especial inter3s en el an&lisis microbiolgico.
Balidar la b(squeda de un m.o. en determinada cantidad de una muestra dada, significa demostrar
que si "ubiera estado presente dic"o m.o. en determinada concentracin, se "ubiera encontrado
con la t3cnica empleada.
Balidar el recuento de m.o. en una muestra determinada, significa demostrar que si "ubieran
estado presentes en determinado n(mero, se "ubiera determinado ese n(mero por el m3todo
aplicado
$ROCEDIMIENTO DE ,ALIDACION
!ara validar los procedimientos en si mismos, se parte del medio de cultivo de enriquecimiento (en
el caso de una b(squeda) o del disolvente inicial (si se trata de un recuento) inoculado con el m.o.
adecuado.
!ara validar la aplicabilidad de dic"o procedimiento a una muestra dada se parte de la muestra en
cuestin inoculada con el m.o. que se desee. Jericamente, se debe validar para cada m.o. que se
busque o se quiera contar. )omo no siempre esto resulta pr&ctico, se pueden seleccionar uno o
dos m.o. que se consideren representantes de los distintos grupos fisiolgicos. !or eemplo, al
efectuar un test de esterilidad se recomienda validar con un m.o. esporulado, una levadura, y un
m.o. anaerobio el medio tioglicolato y con un m.o. esporulado y una levadura el medio JSI.


*Su3 n(mero de m.o. se agrega+
%epender& de la sensibilidad e1igida al m3todo que a su vez es funcin de la muestra. 'n general
debemos pensar que si las muestras fueron sometidas a alguna condicin dr&stica, por eemplo
calor, si los m.o. est&n presentes lo estar&n en bao n(mero.
!or lo tanto, se debe demostrar que el procedimiento empleado es capaz de recuperar m.o. a(n si
se encuentran en bao n(mero. 0l validar un procedimiento de b(squeda "abitual (con 97 g de
muestra en F7 m. de caldo de enriquecimiento) se suele agregar de 97 a 977 c3lulas del m.o.
adecuado.

INTER$RETACION DE RESULTADOS
a) Se considerar& que el procedimiento de b(squeda o recuento est& validado si se detecta el m.o.
o se determina en el n(mero esperado con la t3cnica en cuestin.
b) Si se detecta el m.o. empleando la t3cnica sobre la muestra inoculada se concluye que el
procedimiento en cuestin es aplicable a dic"o tipo de muestra.
!&g.
'n caso de obtener resultados negativos en a) "ay que analizar cada paso del procedimiento
seguido, medios de cultivo empleados, condiciones de incubacin, etc. 'n general, estos factores
est&n bao control en un laboratorio de rutina, y se emplean procedimientos ya descriptos.
's m&s frecuente el caso de que no valide b), o sea que un procedimiento ya descripto en la
bibliografa y v&lido en si mismo no resulta adecuado para determinado tipo de muestra. .a causa
m&s frecuente de no validacin es la presencia de poder in"ibitorio en la muestra analizada. 's
decir la muestra presenta la propiedad de in"ibir el desarrollo de m.o., ya sea por contener agentes
conservadores, declarados o no, por su pH u otros motivos.
Se debe estudiar entonces, "asta donde sea posible, la composicin de la muestra. Si se conoce la
presencia de conservadores se debe eliminar su accin. 'sto se puede conseguir de tres maneras
fundamentales$

a) !or neutralizacin qumica, esto es, agregando una sustancia capaz de anular la accin del
agente antimicrobiano. !or eemplo la accin de penicilinas puede neutralizarse empleando c5
lactamasas.

A!ente in:ibidor Neutrali;ante
Hipoclorito Jiosulfato de sodio
Vodo Jiosulfato de sodio
!arabenos J^een
)omp. amonio cuaternario J^een K lecitina
)omp. mercuriales Jioglicolato o cisteina
b) !or dilucin, llev&ndolos a concentraciones subin"ibitorias. 'sto se consigue disminuyendo la
toma de muestra o aumentando el volumen del medio inicial.
c) !or filtracin, removiendo mec&nicamente el conservador. Se efect(a la filtracin por
membranas con un tamao de poro definido que retendr&n los m.o. Su uso se limita a muestras
lquidas o solubles.



%I%LIO-RA4IA

5 #S! ZZ44, @icrobial .imit Jests. !reparatory Jesting, p.9>CF.
5 #S! ZZ44, Sterility Jests. Dro^t" !romotion Jest
Iacteriostasis and /ungistasis, p.9>=>
5'uropean !"armacopeia.9FFC.pag =>
5 Iritis" !"armacopeia, 9F==. Jest for @icrobial )ontamination. Balidity of t"e test for especified
microorganisms and Balidity of t"e counting met"ods, 0pendi1 ZB4 I
5 @icrobial 0pplications of t"e 4nactivation of 0ntimicrobial 0gents, 0.%. :ussell and col., revie^ of
t"e Xournal of 0pplied Iacteriology, 9FC=.





Jabla 44 e1trada del artculo$ PIioc"emical 4dentification of 2e^ Species and Iiogroups of
!&g.
'nterobacteriaceae 4solated from )linical SpecimensQ. #ournal of Clinical icrobiology, Xan. 9F=8,
p. >?5C? Bol. -9, 2o. 9. X. X. /armer et al.
!&g.
Tabla III< &ndice de NM$ ( l")ite de conian;a del =>? 'ara varias co)binaciones de
resultados 'ositivos 'ara una serie de 8 tubos cada uno con @<5< @<@5 ( @<@@5 ! )L de
)uestra#
)ombinacin
de tubos
positivos
2@!Ag
m.
.mites de confianza
del F8H
)ombinacin
de tubos
positivos
2@!Ag
m.
.mites de confianza
del F8H
4nferior Superior 4nferior Superior
75757 d; 5 5 ;5757 -; > 9-7
75759 ; d 7,8 F ;5759 ;F C 9;7
75957 ; d 7,8 9; ;575- ?> 98 ;=7
95757 > d 7,8 -7 ;5957 >; C -97
95759 C 9 -9 ;5959 C8 9> -;7
95957 C 9 -; ;595- 9-7 ;7 ;=7
95959 99 ; ;? ;5-57 F; 98 ;=7
95-57 99 ; ;? ;5-59 987 ;7 >>7
-5757 F 9 ;? ;5-5- -97 ;8 >C7
-5759 9> ; ;C ;5;57 ->7 ;? 9;77
-5957 98 ; >> ;5;59 >?7 C9 ->77
-5959 -7 C =F ;5;5- 9977 987 >=77
-5-57 -9 > >C ;5;5; ]->77 5 5
-5-59 -= 97 987


!&g.
Tabla I,# &ndice de NM$ ( l")ite de conian;a del =>? 'ara varias co)binaciones de
resultados 'ositivos 'ara una serie de > tubos cada uno con @<5< @<@5 ( @<@@5 ! )L de
)uestra#
.mites de
confianza del F8H
.mite de confianza
del F8H
)ombinacin
de tubos
positivos
2@!Ag
m.
4nferior Superior
)ombinacin
de tubos
positivos
2@!Ag
m.
4nferior Superior
75757 d- 55 >5;57 -C F =7
75759 - d7,8 C >5;59 ;; 99 F;
75957 - d7,8 C >5>57 ;> 9- F;
75-57 > d7,8 99 85757 -; C C7
95757 - d7,8 C 85759 ;9 99 =F
95759 > d7,8 99 8575- >; 98 997
95957 > d7,8 99 85957 ;; 99 F;
95959 ? d7,8 98 85959 >? 9? 9-7
95-57 ? d7,8 98 8595- ?; -9 987
-5757 8 d7,8 9; 85-57 >F 9C 9;7
-5759 C 9 9C 85-59 C7 -- 9C7
-5957 C 9 9C 85-5- F> -= --7
-5959 F - -9 85;57 CF -8 9F7
-5-57 F - -9 85;59 997 ;9 -87
-5;57 9- ; -= 85;5- 9>7 ;C ;>7
;5757 = 9 9F 85;5; 9=7 >> 877
;5759 99 - -8 85>57 9;7 ;8 ;77
;5957 99 - -8 85>59 9C7 >; >F7
;5959 9> > ;> 85>5- --7 8C C77
;5-57 9> > ;> 85>5; -=7 F7 =87
;5-59 9C 8 >? 85>5> ;87 9-7 9777
>5757 9; ; ;9 85857 ->7 ?= C87
>5759 9C 8 >? 85859 ;87 9-7 9777
>5957 9C 8 >? 8585- 8>7 9=7 9>77
>5959 -9 C ?; 8585; F-7 ;77 ;-77
>595- -? F C= 8585> 9?77 ?>7 8=77
>5-57 -- C ?C 85858 ]->77 55
>5-59 -? F C=
!&g.
TEST DE ESTERILIDAD
INTRODUCCION
'l test de esterilidad se aplica a productos que deben ser est3riles y se realiza para verificar que
efectivamente est&n libres de contaminacin microbiana.
%eben ser est3riles los productos suministrados por va parenteral (inyectables, sueros), los
materiales que est3n en contacto con el medio interno (apsitos, suturas, fluidos para irrigaciones,
material quir(rgico) y los productos oft&lmicos. 0 medida que los avances tecnolgicos permiten
obtener productos de meor calidad, esta e1igencia se va e1tendiendo a otros materiales tales
como los de aplicacin tica o alg(n tipo de mucosas.
'l test de esterilidad se encuentra descrito en las /armacopeas donde debe ser estudiado como
complemento de este trabao.
!or esterilidad se entiende ausencia de cualquier forma de vida. 'l t3rmino esterilidad es absoluto.
'l proceso mediante el cual se logra este estado se denomina WesterilizacinW y se define como Wel
proceso de eliminar toda forma de vidaW. 'ste proceso est& diseado para minimizar la probabilidad
de que "aya microorganismos sobrevivientes. !or lo tanto, siempre e1iste una probabilidad finita de
que quede alg(n microorganismo vivo.
.4@4J0)4,2'S %'. J'SJ %' 'SJ':4.4%0%
9) 'l test de esterilidad es un procedimiento destructivo, por lo tanto slo se puede aplicar a una
parte del lote del material a analizar. !or esta razn no puede asegurarse la esterilidad de todo el
lote.
'mpleando conceptos estadsticos se recurre a un plan de muestreo que establece para un nivel
de confianza dado, que el porcentae de contaminacin del lote est& por debao de cierto lmite. !or
eemplo$ para un resultado negativo (ausencia de crecimiento) en -7 muestras de un lote dado, se
asegura con un nivel de confianza del F8H, que el nivel de contaminacin del lote est& por debao
del 8H. !ara asegurar que ese lote tiene un nivel de contaminacin menor que el 9H, con un nivel
de confianza del FFH, sera necesario analizar 877 muestras, lo que resultara impracticable. )omo
se observa, tal como est& diseado el m3todo slo permite detectar una contaminacin grosera.
-) 'l ensayo no garantiza la deteccin de todos los microorganismos conocidos. 's imposible
disear un m3todo que permita recuperar todos los posibles microorganismos contaminantes. .os
medios de cultivo empleados y las condiciones de incubacin limitan el n(mero de m.o. a
recuperar, a un cierto grupo. Suedan e1cluidos por eemplo los m.o. e1igentes, los anaerobios
estrictos y los virus.
0 ello se agrega el "ec"o de que si el material fue sometido a un proceso de esterilizacin, los
microorganismos sobrevivientes se encuentran WestresadosW y aunque no se recuperen en las
condiciones de realizacin del test, podran proliferar en medios m&s ricos como el medio interno.
;) !ara darle confiabilidad a un resultado positivo del test (desarrollo de m.o.) "abra que
asegurarse de que la contaminacin no fue introducida durante la realizacin del ensayo (falso
positivo). 0unque se "an meorado las condiciones de realizacin del mismo, todava siguen siendo
un factor importante de fuente de error. 'sto se contrapone a la idea de que se debe aumentar el
n(mero de muestras para aumentar la confiabilidad del test, porque tambi3n aumenta la posibilidad
de tener falsos positivos.
!&g.
@YJ,%,S %' '2S0V,
a) 4noculacin directa
)onsiste en la transferencia directa del producto a ensayar desde su recipiente de origen al medio
de cultivo apropiado.
b) /iltracin por membrana
)onsiste en la filtracin del producto a ensayar o una dilucin del mismo a trav3s de una
membrana de porosidad adecuada (7.>8 5 7.- m). .os microorganismos quedan retenidos en la
membrana. Ysta se coloca as3pticamente en los medios de cultivo y se incuba.
Se aplica a formas lquidas y a productos que puedan solubilizarse en disolventes apropiados
(esterilizables e inocuos para los microorganismos). !ermite ensayar un volumen mayor de
muestra. 's particularmente apropiado para productos con propiedades bacteriost&ticas o
fungist&ticas. 's el m3todo de eleccin siempre que sea posible.
%4S'e, 'Z!':4@'2J0.
50 Muestreo
.as /armacopeas establecen el n(mero de unidades a ensayar y la toma seg(n el contenido de
cada unidad. 'n general se recomienda "acer el ensayo sobre -7 unidades.
!ara la seleccin de las muestras es conveniente conocer el proceso de esterilizacin, de manera
de ensayar las unidades que tienen mayor riesgo de no "aber quedado esterilizadas\ por eemplo,
en una esterilizacin por calor "(medo se ensayan las unidades que est&n en los Wpuntos frosW del
autoclave.
,bviamente, el producto esterilizado debe estar contenido en un envase que conserve su
esterilidad, por lo tanto si esto no se cumple carece de sentido realizar el test de esterilidad.
)02J4%0% %' @#'SJ:0 0 '2S0V0: U /,:@0S ._S#4%0S U #S! -8
Contenido del envase
,olu)en )"ni)o a
to)ar de cada
unidad
,olu)en )"ni)o de cada )edio
de cultivo /)L0 NA de
unidades
'or
)edio
Inoculacin
directa
4iltracin 'or
)e)brana
@enos de 97 m. 9 m. 98 977 -7
97 a 87 m. 97 m. >7 977 -7
87 a 977 m. 97 m. =7 977 -7
87 a 977 m. (va 4.B.) )ontenido total 5 977 97
977 a 877 m. )ontenido total 5 977 97
@&s de 877 m. 877 m. 5 977 97
70 Medios de cultivo
.os medios de cultivo fueron seleccionados para favorecer el desarrollo del m&s amplio espectro
de microorganismos posible. .os recomendados actualmente son$ Caldo $ripticasa So%a (JSI o
Jryptic Soy Irot") y Caldo tioglicolato.
'l JSI se propone para recuperar bacterias aerobias, "ongos y levaduras, y se incuba a -75-8L).
'l Jioglicolato favorece el crecimiento de microorganismos anaerobios por ser un medio de bao
potencial redo1, aunque permite tambi3n el desarrollo de microorganismos aerobios. Se incuba a
;75;8L). 'l bao potencial redo1 se logra con el agregado de reductores (cistena y &cido
tiogliclico) y un bao porcentae de agar que disminuye la difusin del o1geno. 'l medio incluye
!&g.
resazurina como indicador del potencial redo1. Se considera que el medio est& apto para el uso
cuando no m&s del tercio superior del volumen total est& o1idado (rosado).
.os medios deben ser sometidos a dos tipos de controles$
a) confirmar su esterilidad, para ello se incuba un n(mero representante de cada partida (control
negativo) en las mismas condiciones del ensayo.
b) Jest de promocin de crecimiento$ se debe demostrar que el medio es capaz de promover el
desarrollo de microorganismos. !ara ello se inocula dos unidades de cada lote de medio con 97 a
977 c3lulas del tipo de microorganismo establecido y se verifica el crecimiento de los mismos
dentro del plazo previsto para el desarrollo del test (control positivo).
Jest de promocin de crecimiento U #S! -8
@edio @icroorganismo
Jemperatura de
incubacin (L))
Jioglicolato
Bacillus subtilis 0J)) 2L ??;; o
icrococcus luteus 2L F;>9
;7 5 ;8
Candida albicans 0J)) 2L 97-;9 ;7 5 ;8
Bacteroides vulgatus 0J)) 2L =>>- o Clostridium
sporogenes 0J)) 2L 99>;C
;7 5 ;8
JSI
Bacillus subtilis 0J)) 2L ??;; -7 5 -8
Candida albicans 0J)) 2L 97-;9 -7 5 -8
80 Deter)inacin de la 'resencia o ausencia de in:ibidor en el 'roducto a anali;ar
0ntes de realizar el test de esterilidad se debe verificar que el producto a ensayar no eerce
propiedades bacteriost&ticas o fungist&ticas en las condiciones del ensayo. !ara ello se compara el
crecimiento desarrollado en el medio de cultivo, luego de inoculado con una cantidad conocida de
microorganismos, en ausencia y presencia del producto (m3todo de inoculacin directa) o de la
membrana usada para filtrar el producto (m3todo por fitracin). 'l crecimiento debe ser similar.
Si se comprueba presencia de in"ibidor se debe agregar un agente neutralizante o austar la
relacin toma de muestra$medio de cultivo "asta que se verifique que no e1iste in"ibicin.
B0 $rocedi)iento
a) )ondiciones de realizacin. )abe recordar que en este ensayo una contaminacin accidental
sera crtica. Se debe e1tremar las precauciones en el maneo de la t3cnica as3ptica y trabaar en
una cabina de fluo laminar. .a cabina de fluo laminar consiste en una cabina en la cual "ay una
corriente constante y de velocidad uniforme (en forma laminar) de aire filtrado a trav3s de filtros de
alta eficiencia (H'!0 E Hig" 'fficiency !articulate 0ir). 'stos filtros tienen una eficiencia del FF,FCH
en remover todas las partculas mayores o iguales a 7.; m. 'l fluo puede ser vertical (brinda
mayor proteccin al operador) u "orizontal.
'l personal que realiza el ensayo tambi3n puede ser fuente de contaminacin por s mismos, por
su vestimenta o por las manipulaciones. Se recomienda utilizar vestimenta adecuada (t(nica,
tapabocas, cofia y guantes esterilizados) y realizar el menor n(mero de movimientos posibles.
Deneralmente se controla la contaminacin durante la realizacin del test por e1posicin de placas
con medio nutriente que luego se incuban.
b) 0pertura de los envases y toma de muestra. Se limpia la superficie e1terior de los envases con
una solucin de un desinfectante adecuado y se e1trae el contenido en forma as3ptica. Si se trata
de viales o ampollas conteniendo un lquido se "ace la toma con eringa o pipeta est3ril y se
transfiere a los medios de cultivo o directamente al vaso de filtracin de la unidad filtrante (si el
volumen es muy pequeo o la solucin es viscosa, diluir la muestra con un disolvente adecuado
antes de filtrar).
!&g.
Si se trata de productos oleosos solubles en miristato de isopropilo se puede aplicar el m3todo de
filtracin. !ara los slidos se busca un disolvente adecuado o se aplica el m3todo de inoculacin
directa.
'n el caso de paquetes conteniendo artculos esterilizados (algodn, gasa, equipo quir(rgico, etc)
se debe abrir y e1traer as3pticamente parte de su contenido. 'n los dispositivos terap3uticos que
requieren la condicin de esterilidad slo para el interior del mismo (por eemplo c&nulas), se "ace
fluir los medios de cultivo a trav3s del lumen.
c) J3cnica de filtracin por membrana. .a unidad filtrante consta b&sicamente de un vaso de
filtracin un soporte para la membrana, un embudo y un Nitasato. .a filtracin se realiza por
aspiracin con bomba de vaco.
.a membrana de filtracin est& constituda generalmente por polmeros de 3steres de celulosa.
0ct(a como filtro de superficie con un tamao de poro definido y limitado. 'n el test de esterilidad
se emplean membranas de 7.>8 o 7.- m de di&metro de poro, lo que permite retener las bacterias
en su superficie. !ueden adquirirse esterilizadas o pueden esterilizarse unto a la unidad de
filtracin.
%espu3s de filtrar el producto, especialmente si 3ste tiene propiedades bacteriost&ticas o
fungist&ticas, se lava la membrana con lquido de enuague. 'n este caso pueden emplearse
tambi3n membranas con bordes "idrofbicos, que impiden que la parte de m&s difcil acceso a las
soluciones de enuague (bordes de la membrana) quede embebida de agente in"ibidor.
Se desarma la unidad y as3pticamente se retira la membrana, se corta a la mitad y se introduce
cada una en los medios JSI y Jioglicolato. Se incuban durante C das.
d) J3cnica de inoculacin directa. Se transfiere directamente y en forma as3ptica la toma desde
cada unidad a un tubo conteniendo JSI y a un tubo conteniendo caldo Jioglicolato. Se incuba y se
observa si "ay evidencia de crecimiento microbiano al tercer, s3ptimo y d3cimocuarto da. Si el
producto por s mismo dea el medio turbio, subcultivar entre el tercer y el s3ptimo da a nuevos
medios. )ontinuar la incubacin de los medios originales y los subcultivos "asta que se cumplan
9> das de la inoculacin original.
e) 4nterpretacin e informe de resultados. 'n este p&rrafo se dan los lineamientos de la #S! -8, en
otras farmacopeas pueden aparecer ligeras variantes.
.uego de concludo el perodo de incubacin se e1amina los medios de cultivo en b(squeda de
evidencia de crecimiento microbiano.
Si no "ay evidencias de crecimiento como desarrollo de turbidez yAo crecimento superficial,
se informa que el producto Ccu)'le el test de esterilidad se!6n ar)aco'ea #####C
Si "ay crecimiento en cualquiera de los caldos empleados se informa Cno cu)'le el test
de esterilidad se!6n ar)aco'ea #####C
Si "ay evidencia de crecimiento y una revisin del proceso seguido para realizar el test,
indica que pudieran "aber fallas en los controles negativos o en la t3cnica as3ptica
seguida, se puede declarar no v&lido el primer ensayo y repetir el procedimiento (primer
reensayo).
2o se prescribe en forma oficial, pero se recomienda aislar y caracterizar 3l o los m.o. que
crecieron en los medios de cultivo. 'l "ec"o de que los microorganismos aislados en cada ensayo
sean iguales puede ser una evidencia de que provienen de la muestra y por lo tanto de que el
producto no cumple con el test de esterilidad.
'. J'SJ %' 'SJ':4.4%0% V ,J:,S ),2J:,.'S %' 'SJ':4.4T0)4,2
'l control de un proceso de esterilizacin puede realizarse sobre el producto esterilizado (test de
esterilidad) y sobre el proceso mismo. .os controles del proceso pueden ser fsicos (temperatura,
presin, "umedad), qumicos (virae de alg(n indicador, concentracin del agente esterilizante) o
biolgicos (bioindicadores). 0ctualmente, el criterio general es emplear un combinacin de 3stos ya
que los ensayos en el producto final no aseguran, por s solos, la esterilidad del mismo.
!&g.
Se considera que la esterilidad, como parte de la calidad de un producto, debe ser proyectada y
construida y no solo inspeccionada sobre el producto final.
!&g.