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PRCTICA 7: OBTENCIN DE EXTRACTO PROTEICO

1. OBJETIVO
Obtener el extracto proteico de un cultivo bacteriano empleando
bolitas de vidrio.

2. MATERIALES Y REACTIVO. CLCULOS
MATERIALES
Tubos Eppendorf.
Tubos de ensayo de 10 ml
Centrfuga.
Vrtex.
Mcropipetas y puntas.
Mechero.

REACTIVOS
Muestra BL 21(estirpe de E.Coli sin plsmido)
Medio LB
Preparacin de 50 ml de medio LB
Medio LB:
10 g Bactotriptona, 5 g extracto de levadura, 5 g de NaCl, 1 L
de agua. Disolver y autoclavar.
Para 800 ml: 8 g de triptona, 4 g de extracto de levadura, 4 g de
NaCl
Ampicilina 50 mg/mL.
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Tampn TrisHCl 100 mM, NaCl 100 mM, glicerol 10% pH 7,5
(fro).
Preparamos primero disoluciones concentradas de 1 M, y a partir de
ellas las otras diluidas. Si queremos preparamos 100 ml de TrisHCl 1
M y NaCl 1 M. Se calcula la cantidad de soluto de cada uno y se
diluye en por ejemplo 30 ml de agua destilada. Se mide el pH con el
pHmetro, y se le aade HCl concentrado diluido en agua hasta
alcanzar pH 7,8.
Con estas disoluciones concentradas preparamos la disolucin TrisHCl
100 mM, NaCl 100 mM, glicerol 10% (50ml).
C * V = C* V
1000 mM * V = 100 mM * 50 ml
V = 5 ml
En una probeta de 50 ml aadimos 5 ml de TrisHCl 1 M, 5 ml de NaCl,
35 ml de agua destilada y 5 ml de glicerol.

3. PROCEDIMIENTO
1. Partimos de un cultivo joven, realizamos una resiembra y con el asa de
siembra inoculamos en 50 mL de medio LB con la estirpe de E.Coli
correspondiente e incubamos o/n a 37C. Cogemos 100 l de cultivo
o/n, centrifugar y eliminar el sobrenadante y guardar a -20C para
visualizarlo en un gel de SDS-PAGE.
2. Tarar un tubo de centrfuga de 10 mL (los de tapn verde) y anotar
su peso Recoger el cultivo en ese tubo (4000 rpm 3 minutos). Se
realiza esta operacin 5 veces hasta centrifugar los 50 ml
inoculados.
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3. Lavar con 10 ml de la disolucin de TrisHCl, NaCl, glicerol pH 7,5
fra. Centrifugar 3 minutos a 4000 rpm y eliminar bien el
sobrenadante y pesar el tubo. Por diferencia (T
2
T
1
) se calcula el
peso del pellet.
4. Resuspender en el tampn anterior a razn de 2,5 ml/g de clula.
Primero se resuspende en el vrtex, se le aade un poco de tampn y
se vuelve a resuspender as hasta el volumen total de tampn
calculado.
5. Aadir 4 cucharadas de perlas de vidrio y romper las clulas
mediante 10 ciclos de 30 segundos vrtex-hielo.
6. Pasar a un tubo Eppendorf y centrifugar 5 minutos a 14.000rpm y
transferir el sobrenadante (protenas solubles) a un tubo Eppendorf
nuevo.
7. Este extracto se va a cuantificar mediante el mtodo 8radford y se
va a visualizar en un gel de SOS-PAGE. Cargaremos 20 l de muestra
y 4 l de tampn de carga.

4. RESULTADOS E INTERPRETACIN
Clculo del peso del pellet
Tubo sin muestra = 6,7643
Tubo con pellet = 6,8038
Masa del pellet = 0,0395 g


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Tras la rotura se utilizan tampones de extraccin para solubilizar las
protenas. Pueden utilizarse como tales disoluciones acuosas de tampones
especficos para protenas solubles o bien que contengan adems
detergentes si se pretende purificar protenas asociadas a membranas, si
bien en este caso hay que cuidar que la enzima no se desnaturalice.
Una vez que la protena se ha extrado de su entorno natural est
expuesta a muchos agentes que pueden desnaturalizarla: Los cambios
bruscos de pH, cidos y bases fuertes, temperaturas extremas y la accin
de las proteasas (enzimas que hidrolizan los enlaces peptdicos).
Para evitar o minimizar estos factores la manipulacin de las
protenas durante el proceso de purificacin suele llevarse a cabo en
disoluciones tamponadas, a bajas temperaturas (4C) y se procura que el
proceso sea lo ms corto posible. En ocasiones es necesario aadir al tampn
de extraccin agentes protectores de grupos funcionales especficos de la
protena o bien inhibidores de proteasas. Por ejemplo el glicerol le confiere
estabilidad a las protenas sobre todo cuando se congelan
El resultado de todos estos tratamientos es un lisado u homogenado
que contiene una mezcla de enzimas, membranas y clulas rotas. Esta
preparacin se somete a centrifugacin (10.000-5.000 rpm) para eliminar
los restos celulares y separar, el sobrenadante, que contiene las protenas
solubles, del precipitado que adems de restos celulares tambin contienen
protenas asociadas a membranas y que para solubilizarlas requiere un
tratamiento adicional con detergentes.
La fase soluble constituye el extracto crudo donde se encuentra la
protena de inters objeto de la purificacin.